ANÁLISE DO POLIMORFISMO C>514T DO GENE DA LÍPASE
HEPÁTICA EM MULHERES SOB REPOSIÇÃO ESTROGÊNICA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina – para obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo Programa de Pós-Graduação em Ginecologia
Orientador: Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Co-orientadores: Prof.a D.ra Ana Maria Massad Costa
Prof. Dr. Adagmar Andriolo
Pulchinelli Jr, Alvaro
Análise do polimorfismo C>514T do gene da Lípase Hepática em mulheres sob reposição estrogênica./ Alvaro Pulchinelli Jr. -- São Paulo, 2012.
xii, 61f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina, Programa de Pós-graduação em Ginecologia.
Título em inglês: Positive association of the hepatic lipase gene polymorphism c.514C>T with estrogen replacement therapy response.
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
Coordenador do Curso de Pós-Graduação:
ANÁLISE DO POLIMORFISMO C>514T DO GENE DA LÍPASE
HEPÁTICA EM MULHERES SOB REPOSIÇÃO ESTROGÊNICA
Presidente da Banca
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Adagmar Andriolo
Prof. a D ra. Ana Maria Massad Costa
Prof. Dr. Fábio Lopes Teixeira Filho
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Pro Andræ fiant eximia.
Ao Prof. Dr. Ismael D. C. Guerreiro da Silva, exemplo de médico e cientista, que
orientou não somente para uma tese, mas para toda a carreira.
Ao Prof. Dr. Adagmar Andriolo que abriu (e abre) muitas portas, mas
principalmente porque abriu a mais importante: a primeira.
À Prof.a D.ra Ana Maria Massad Costa que sempre pontuou caminhos áridos com
sua incomensurável ternura.
À minha família pelo apoio, compreensão e paciência pelo tempo ausente.
Ao Prof. Dr. Manoel Girão, que desde o início apoiou e propiciou as condições
para a realização deste trabalho.
Aos colegas do Centro Alfa pelo suporte e apoio e, em especial, agradecemos a:
Abrão Cury, Fábio Lopes Teixeira Filho, Paulo Roberto Cesarini e Roberto Vlainich.
À Karim Martin dos Santos, secretária da disciplina, que de forma dedicada e
presente, trabalha para que tudo dê certo.
Ao Prof. Dr. Daniel Takeshi Ito, brilhante jovem cientista, que com sua visão
clara e profunda, ajudou a dar forma a este trabalho.
Aos Dr. Paulo Campana e D.ra Eliana Borges Nogueira pelo incentivo e reflexões
sobre a profissão.
E a Deus por tudo.
Este estudo foi parcialmente financiado por uma bolsa da Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e AFIP - Associação Fundo de
Incentivo à Pesquisa.
Página Dedicatória
Agradecimento Lista de figuras Lista de tabelas Lista de abreviaturas Resumo
1. Introdução
1.1. Metabolismo dos lípides
1.1.1. Transporte dos Lipídeos nas Lipoproteínas 1.2. Lipase Hepática
1.2.1. Caracterização e metabolismo
1.2.2. Papel pró e antiaterogênico da Lipase Hepática 1.3. Aspectos da Terapia de Reposição Hormonal (TRH) 2. Objetivos
3. Pacientes e Métodos 3.1. Pacientes
3.2. Métodos
3.2.1. Coleta do material
3.2.2. Determinação laboratorial dos Lípides e das Lipoproteínas 3.2.2.1 Determinação laboratorial dos Lípides
3.2.2.2 Determinação laboratorial das Lipoproteínas 3.2.3. Determinação Laboratorial dos Polimorfismos
3.2.3.1. Extração de DNA
3.2.3.2. PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 3.2.4. Análise Estatística
3.2.4.1. Análise Preparatória 3.2.4.2. Análise dos Dados 4. Resultados
4.1 Análise comparativa antes e após tratamento
6. Conclusões 7. Referências Abstract
Anexos
Dados brutos
Aprovação Comitê de Ética em Pesquisa Apresentação Congresso Internacional Publicação
39 40
Figura 1 Composição esquemática das Lipoproteínas
Figura 2 Absorção e metabolismo dos Lípides exógenos
Figura 3 Distribuição periférica dos Lípides endógenos
Figura 4 Transporte reverso do Colesterol pela HDL-C
Figura 5 Ilustração esquemática da função clássica de HL como uma enzima lipolítica
Figura 6 Ilustração esquemática dos múltiplos papéis da HL no metabolismo de lipoproteínas e absorção de lipídios no fígado e por macrófagos presentes na parede do vaso
Figura 7 Ilustração esquemática da HL como proteína ligadora que facilita a interação entre lipoproteínas e receptores de superfície celular e proteoglicanos
Figura 8 Papel central da lipase hepática no metabolismo lipídico
Figura 9 Papel da HL nas vias direta e indireta do transporte reverso de colesterol
Figura 10 Esquema extração DNA
Figura 11 Fragmentos DNA obtidos após eletroforese
.
Tabela 1 Descrição do primer, temperatura de anelamento (T.oC), fragmentos de amplificação (Bp) e enzima de restrição do gene estudado.
Tabela 2 Teste para a normalidade da distribuição dos dados (pré-tratamento)
Tabela 3 Teste para a normalidade da distribuição dos dados (pós-tratamento)
Tabela 4 Resultados das variáveis do perfil lipídico estudado (média e desvio padrão) e teste t de Student para amostras pareadas, antes e após o tratamento
Tabela 5 Número de amostras observado e esperado, para cada um dos três genótipos de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg
Tabela 6 Média e desvio padrão dos níveis basais de variáveis do perfil lipídico de acordo com o genótipo
Tabela 7 Teste ANOVA comparando os níveis basais médios do perfil lipídico em três genótipos diferentes (ie, do tipo selvagem, heterozigoto e mutante)
Tabela 8 Resultados da amostra teste t pareado para as variáveis antes e depois do tratamento e de acordo com o genótipo
Tabela 9 Teste t para as amostras pareadas das variáveis antes e depois do tratamento de acordo com os genótipos agrupados (CT e TT)
Tabela 10 Teste de ANOVA comparando a média basal de níveis do perfil lipídico entre os alelos C e T
Tabela 11 Resultados do teste t para amostras pareadas de lipoproteínas antes e após o tratamento, separados por alelo
aa Aminoácido AG Ácidos graxos ANOVA Análise de Variância ApoA Apolipoproteína A ApoA-1 Apolipoproteína A-1 ApoB Apolipoproteína B ApoC Apolipoproteína C CE Colesterol esterificado
CETP Cholesterylester transfer protein DAC Doença Arterial Coronariana DNA Ácido Desoxirribonucleico HDL-C Lipoproteína de alta densidade HL Lípase Hepática
IDL-C Lipoproteína de densidade intermediária IMC Índice de massa corporal
LCAT Lecitina Colesterol Aciltransferase LDL-C Lipoproteína de baixa densidade LPL Lípase Lipoproteica
PCR Reação em cadeia da polimerase SNP Polimorfismo de nucleotídeo único TG Triglicérides
TRE Terapia de Reposição Estrogênica TRH Terapia de Reposição Hormonal VLDL-C Lipoproteína de muito baixa densidade
A lípase hepática (HL) é uma enzima presente nos sinusoides hepáticos, responsável pela lipólise de lipoproteínas. Contém quatro sítios polimórficos: G-250A, T-710C, 763G-A, e C-514T single-nucleotide polymorphism (SNPs). O último
polimorfismo é o foco do presente estudo. Os genótipos associados com o polimorfismo C-514T são CC (homozigoto normal - W), CT (heterozigoto - H) e TT (alelo homozigoto menor - M). A atividade da HL é, significativamente, diminuída nos
indivíduos dos genótipos TT e CT. Um total de 58 mulheres pós-menopausas foi estudado. As participantes eram histerectomizadas e submetidas à terapia de reposição hormonal, consistindo de 0,625 mg de estrogênio equino conjugado, uma
vez ao dia. Os critérios de inclusão foram: menopausa de até há três anos, resultados de exames de sangue, radiografias, citologia cérvico-vaginal e densitometria óssea
normais. O DNA foi extraído a partir de células da mucosa bucal e de células de sangue periférico de todas as pacientes, utilizando-se um conjunto comercialmente disponível (GFX ® - Amersham-Pharmacia, EUA). Resultados: foram encontradas
reduções estatisticamente significativas nos triglicérides (t = 2,16; n = 58, p = 0,03), mas não nos níveis de colesterol total (t = 0,14; n = 58, p = 0,89) após o tratamento. Este grupo de bons respondedores eram portadores do alelo T; os genótipos CT e TT
estavam presentes com frequência significativamente maior do que no grupo de não-respondedores (p = 0,02 ou p = 0,07, respectivamente). No entanto, nenhuma diferença significativa nos níveis de HDL-C (t = 0,94; n = 58, p = 0,35) ou LDL-C (t =-
0,83; n = 58, p = 0,41) foi encontrada nestas pacientes. Conclusões: as variações no perfil lipídico associadas ao polimorfismo C-514T são significativas e o alelo T é
associado à melhor resposta à TRE.
1. Introdução
A enzima Lípase Hepática (HL), presente fundamentalmente nos sinusoides hepáticos, tem papel importante no metabolismo lipídico e consequentes implicações no desenvolvimento da aterosclerose e da doença arterial coronariana (DAC).
A incidência de doença arterial coronariana é, significativamente, maior nas faixas etárias mais elevadas, o que, nas mulheres, significa o período pós-menopausa. Desta associação (período pós-menopausa com maior incidência de eventos coronarianos) surge a teoria dos efeitos protetores dos estrogênios e se propõe, a partir daí, a Terapia de Reposição Hormonal (TRH) como profilaxia de eventos coronarianos.
Este trabalho nasce da confrontação destas duas ideias iniciais, ou seja, averiguarmos como se dá a interação entre o metabolismo da Lípase Hepática, verificado pelo estudo de seus polimorfismos genéticos, mais especificamente C>-514T sobre o perfil lipídico em mulheres sob terapêutica de reposição estrogênica (TRE).
1.1. Metabolismo dos lípides
O colesterol presente, quase exclusivamente nos animais e componente fundamental da membrana celular, se apresenta de duas formas na circulação: esterificada (60 a 70% do total) e não esterificada (30 a 40%) e esta proporção é, geralmente, constante.
Estes compostos são agregados em estruturas proteicas, as lipoproteínas.
As lipoproteínas plasmáticas transportam, essencialmente, todo o colesterol e lípides esterificados nos sangue. As quatro principais classes de lipoproteínas são: Quilomícrons. lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL -C– very low densitylipoproteins); lipoproteínas
de baixa densidade (LDL-C - low density lipoproteins) e lipoproteínas de alta densidade
(HDL-C , high density lipoprotein). Outras lipoproteínas quantitativamente menores como a
Lipoproteína (a) e a lipoproteína de densidade intermediária (IDL-C), presentes no organismo, não serão discutidas aqui, pois fogem aos propósitos deste estudo. A proporção relativa de colesterol e triglicérides, bem como as principais apolipoproteínas presentes nas diferentes lipoproteínas estão mostradas na figura 1:
QUIILOMICRON VLDL-C LDL-C HDL-C
Composição TG>>>CE TG >> CE CE > TG CE > TG
Apolipoproteínas ApoB ApoC ApoB ApoA
ApoB
Figura 1 Composição esquemática das Lipoproteínas.
1.1.1. Transporte dos Lipídeos nas Lipoproteínas
A função das Lipoproteínas é transportar os triglicérides e o colesterol do intestino (lípides de origem exógena) e do fígado (lípides endógenos) até o local de uso ou reserva. Os lípides chegam à circulação oriundos do intestino na forma de Quilomícrons e VLDL-C. Quando o colesterol e os triglicérides são endógenos, circulam na forma de VLDL-C. Estas partículas (VLDL-C e Quilomícrons) diferem entre si no tamanho, na proporção de triglicérides e pela presença de diferentes apolipoproteínas.
Assim que estas partículas entram na circulação, começam a sofrer a ação da Lípase Liproteica. Esta enzima é ativada pela Apolipoproteina C e hidrolisa os triglicérides. Com a perda de 95% dos triglicérides, os quilomícrons se transformam em quilomícrons remanescentes e são retirados de circulação pelo fígado. A absorção hepática é mediada pela Apolipoproteína E. (Figura 2)
Lípides dieta
intestino
QM
QM remanescentes
LPL LPL LPL
endotélio
Fígado
Figura 2 Absorção e metabolismo dos Lípides exógenos.
transforma em LDL-C sob ação da Lecitina Colesterol Aciltransferase (LCAT) e da
Cholesterylester transfer protein (CETP).
O LDL-C, por sua vez, é o maior transportador de colesterol para os tecidos periféricos. O LDL-C é internalizado (endocitose) nos tecidos periféricos e no fígado em processo mediado pelos receptores de LDL-C presentes nas membranas celulares destes tecidos. Sua metabolização se dá por hidrólise lisossomal e, logo após sua lise, os receptores celulares são liberados e retornam novamente para a membrana celular. (Figura 3)
endotélio
VLDL IDL
LDL Fígado
Tecido periférico
LPL LPL LPL
HL
LCAT, CETP
Figura 3 Distribuição periférica dos Lípides endógenos.
O HDL-C é liberado pelo fígado e pelo intestino, onde há presença de grande quantidade de apolipoproteína A1. O papel do HDL-C, no transporte reverso, consiste no transporte do excesso de colesterol dos tecidos periféricos para o fígado, onde o colesterol é reutilizado ou excretado na bile. A enzima LCAT atua no sentido de transferir os ésteres de colesterol ligados ao VLDL-c e IDL–C para o HDL-C e, posteriormente, são retirados da circulação. O HDL-C também pode liberar estes ésteres de colesterol diretamente no fígado. [1,2] Figura 4
Fígado Tecido
periférico
LDL VLDL
HDL
LCAT
Figura 4 Transporte reverso do colesterol pela HDL-C.
1.2. Lípase Hepática
1.2.1. Caracterização e metabolismo
Lípase hepática (HL), enzima presente nos sinusoides hepáticos, é responsável pela lipólise de lipoproteínas. Embora também seja expressa em outros tecidos, mais de 95% da atividade total da HL são encontrados no fígado [3]. A HL é composta de 499 resíduos, sendo um peptídeo líder com 22 aa, portanto sendo secretada uma proteína com 477 resíduos. Possui quatro sítios de glicosilação (posições 20, 56, 340 e 375) e seu peso molecular é de 65 kDa. Nas glândulas adrenais, a atividade da HL é presente na parede dos vasos e é estimulada por corticotrofina. Nos ovários, é encontrada no corpo lúteo e sua atividade é, fortemente, correlacionada com níveis plasmáticos de progesterona. [4]
Figura 5 Ilustração esquemática da função clássica de HL como uma enzima lipolítica. Hidrolisa triglicérides e fosfolipídios. Adaptado da referência 3.
Figura 6 Ilustração esquemática dos múltiplos papéis da HL no metabolismo de lipoproteínas e absorção de lipídios no fígado e macrófagos presentes na parede do vaso. Adaptado da referência 3.
A HL também auxilia na ligação das lipoproteínas aos receptores celulares. (Figura 7) Estudos in vitro demonstraram que a HL facilita a ligação e a entrada dos quilomícrons,
Figura 7. Ilustração esquemática da HL como proteína ligadora que facilita a interação entre
lipoproteínas e receptores de superfície celular e proteoglicanos. Adaptada da referência 3.
Pacientes com deficiência de HL, geralmente, apresentam hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia e aumento dos níveis de VLDL-C, de quilomícrons remanescentes, de IDL-C, de LDL-C ricas em TG e de HDL-C [12-14]. No entanto, devido a nem todos os pacientes com deficiência da HL mostrarem estas alterações metabólicas, tal condição é, por vezes, confundida com outras doenças genéticas. [15]
A HL altera o conteúdo de fosfolípides, de TG e de colesterol em várias classes de lipoproteínas pela sua atividade de fosfolipase A1 e trigliceridase. Também altera o metabolismo de lipoproteínas, pois auxilia na ligação destas com receptores celulares. [16]
C-514T ocorrer na região promotora do gene HL, tem sido sugerido que este polimorfismo possa influenciar a atividade metabólica da enzima [16,19,20], mas não influenciaria sua a transcrição [21]. Alguns autores encontraram que os polimorfismos não causariam alterações fenotípicas no sexo feminino, embora tenha sido notada uma diferença na concentração de HDL-C em homens [21,22]. Como a atividade da HL também pode ser controlada pelo estrogênio circulante [16], é provável que novos estudos dos polimorfismos do gene da HL forneçam as informações genéticas adicionais que possam ser úteis no desenvolvimento de terapias de reposição hormonal mais bem sucedidas. [23]
Uma meta-análise de 24.000 casos com polimorfismo C-514T demonstrou que a atividade da HL é, significativamente, mais baixa em indivíduos com os genótipos TT e CT do que em indivíduos com o genótipo CC [23]. Apesar de sua associação com níveis elevados de colesterol HDL, a presença do alelo T resulta em risco ligeiramente aumentado de aterosclerose. [10]
1.2.2. Lípase Hepática: Papel pró e antiaterogênico
sugere que outros fatores possam contribuir para o desenvolvimento da DAC. Devido ao fato de a HL hidrolisar fosfolipídios e triglicérides, liberando ácidos graxos (AG) de fosfolipídios e triglicérides [29], o aumento da expressão de HL poderia disponibilizar maior quantidade de colesterol, promovendo, assim, a fagocitose por macrófagos e a entrada de LDL-C nas células e depósitos subendoteliais, aumentando o risco de lesões ateroscleróticas. (figuras 6 e 8)
Figura 8 Papel central da lípase hepática (HL) no metabolismo lipídico. Os painéis ovais representam as principais vias de transporte lipídico no plasma que sofrem influência da HL. Adaptado da referência 16.
Em humanos, o papel da HL é amplo e ambíguo. Se, por um lado, distribui as subclasses de LDL-C, por outro, afeta a concentração de HDL-C, convertendo HDL2 em HDL3. Estudos In vitro têm demonstrado que a HL facilita a ligação e a entrada de Quilomicrons,
Figura 9 Papel da HL nas vias direta e indireta do transporte reverso de colesterol. Na via direta, que envolve a HL (representada em vermelho), o fígado absorve HDL-C diretamente. Na via indireta, HDL-C é primeiro transferido para lipoproteínas contendo apolipoproteína (apo) B, em troca de TG. Adaptado da referência 16.
mecanismo primário responsável pelo desenvolvimento de doença aterosclerótica [33-37]. Ainda há, portanto, grande controvérsia na literatura com relação ao papel pró-e antiaterogênico de HL. [35]
1.3. Aspectos da Terapia de Reposição Hormonal - TRH
Vários tipos de evidências epidemiológicas sugerem que a proteção das mulheres no menacme contra a doença coronária se explicaria pelo estrogênio. As principais observações que justificariam tais achados são: 1) DAC é rara em mulheres antes da menopausa, 2) a doença é mais comum em mulheres que têm menopausa precoce, ou naquelas ooforectomizadas e 3) a doença é menos comum em mulheres que fazem terapia de reposição hormonal após a menopausa. [42]
Porém, uma série de estudos recentes não comprovou a eficácia de terapia de reposição hormonal [43-46]. Iniciado em 1993, o Heart and Estrogen/Progestin Replacement Study - HERS foi o primeiro grande ensaio clínico especificamente desenhado para avaliar se
terapia com estrogênio e progesterona reduziria o risco de eventos em mulheres pós-menopausa já portadoras de doença coronária. O estudo, que fora conduzido por Hulley e cols.[43], teve seus dados publicados em 1998. Por estes resultados, não se recomenda o uso de TRH para prevenção secundária da doença arterial coronariana. No entanto, devido aos bons desfechos de DAC em mulheres que fizeram uso de TRH durante vários anos e pela melhora nos níveis de HDL-C e LDL-C [42], esta terapia poderia continuar a ser usada [43]. Um recente estudo concluiu que o uso de estrogênio, em média durante 5,9 anos, não foi associado a qualquer alteração no risco de DAC das mulheres [47]. Outros estudos têm sugerido que a terapia de reposição hormonal pode causar suscetibilidade a fenômenos pró-trombóticos em mulheres com doença aterosclerótica prévia [48].
2. Objetivos
Objetivo Geral
Avaliar o polimorfismo do gene codificador da enzima Lípase Hepática e
sua eventual associação com a resposta à reposição hormonal na
menopausa.
Objetivo específico
Análise do polimorfismo C>514T no gene da Lípase Hepática e sua
eventual associação aos níveis de colesterol total, HDL-C, LDL-C e
triglicérides após 1 ano de reposição hormonal estrogênica da
3. Pacientes e Métodos
3.1. Pacientes
A população da pesquisa foi derivada de um estudo maior de terapia de reposição hormonal em mulheres na pós-menopausa. O estudo maior incluiu um total de 200 pacientes de um ambulatório de hospital terciário (Ambulatório do Climatério – Disciplina de Ginecologia – UNIFESP-EPM).
Foram formados dois grupos. O primeiro com 100 mulheres submetidas à histerectomia por miomas e que receberam TRH composta de uma dose única diária (0,625 mg) de estrogênio equino conjugado. O segundo grupo, com 100 mulheres não-histerectomizadas, recebeu terapia de reposição hormonal que consistia de uma combinação diária de 0,625 mg de estrogênio e 2,5 mg de medroxiprogesterona (terapia de reposição de estrogênio e progesterona).
Apenas as pacientes que receberam TRE (estrógeno equino conjugado) exclusivamente e que apresentavam perfil lipídico dentro do intervalo de referência foram incluídas em nosso estudo. No total, 58 pacientes com média de idade de 54 anos (44 a 58 anos) foram selecionadas para a extração de DNA e o estudo subsequente do polimorfismo do gene C-514T HL, tanto antes como depois da TER.
Os critérios de inclusão foram os seguintes: 1) história de três anos, no máximo, de menopausa; 2) informações completas dos exames de sangue anuais (hemograma, colesterol total e frações, triglicérides, ureia, creatinina, glicemia, estradiol, progesterona, FSH, LH e cujos resultados estivessem dentro do intervalo de referência desde o início da menopausa; 3) mamografia bilateral com classificação BI-RADS 1 ou 2; 4) ultrassonografias abdominais e pélvicas, com resultados normais; 5) exames de citologia cérvico-vaginal que estivessem normais pela classificação Bethesda e 6) densitometria óssea (com resultados dentro de um
Mulheres que não concordaram com o tratamento proposto de reposição hormonal foram excluídas do estudo, assim como aquelas que não atendiam aos critérios acima mencionados.
Informações sobre o uso de álcool e fatores de estilo de vida, como atividade física e quantidade de gordura saturada na dieta, não foram coletados. As pacientes não foram instruídas a seguir qualquer orientação específica de dieta. Todas as pacientes deram seu consentimento livre e esclarecido para participar, e o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo, sob o número CEP 1114/08.
3.2. Métodos
3.2.1. Coleta do material
Amostras de células da mucosa bucal foram obtidas com escova cytobrush. As
3.2.2. Determinação Laboratorial dos Lípides e das Lipoproteínas
O jejum é detalhe importante na preparação para a coleta de amostras para a dosagem de lípides. Períodos inferiores a 12 horas não devem ser admitidos em estudos clínicos ou epidemiológicos [54]. Isto se explica, pois o clareamento total do Quilomícrons remanescentes gira em torno de 9 horas. Durante este período, podemos ter, também, diminuição transitória de HDL-C e VLDL-C. O encontro de Quilomícrons é considerado anormal em amostras coletadas após 12 horas de jejum.
A posição de coleta (sentado, deitado) deve ser padronizada, pois variações da mesma podem levar a alterações que variam de 10% (HDL-C) a 50% (TG) explicado pela hemoconcentração. Em nossas pacientes, observamos a coleta em posição sentada.[1,2,54]
3.2.2.1. Determinação laboratorial dos lípides
Para a determinação do colesterol total foi usado o método de colesterol oxidase. A fração HDL-C foi medida por método direto em um ensaio homogêneo. Triglicérides foram medidos utilizando-se método colorimétrico enzimático (Advia 1650; Bayer ®, EUA). A concentração de LDL-C foi obtida usando-se a fórmula de Friedwald [55]. Os coeficientes intraensaios de variação foram inferiores a 5%.
A determinação laboratorial do colesterol e das lipoproteínas é feita, atualmente, por métodos enzimáticos, que substituem com vantagens os métodos químicos anteriores.
Éster de colesterol + H20
→
colesterol + ácidos graxos (Eq 1)Éster de colesetril hidrolase
colesterol + O2
→
colest-4-em-3-ona + H2O2 (Eq 2)colesterol oxidase
H2O2 + fenol + 4-aminoantipirina
→
corante quinoneimina +H2O (Eq 3)Peroxidase
A leitura é feita por espectrofotometria em 500 nm.
Como interferentes possíveis a esta determinação, podemos citar: ácido ascórbico e bilirrubina (interferentes negativo e positivo respectivamente).
Os triglicérides, por sua vez, também são determinados por métodos enzimáticos, em que a reação está baseada na hidrólise de TG, com formação de glicerol e ácidos graxos, seguindo-se a sequência de reações abaixo:
Triglicérides
→
glicerol + ácidos graxos (Eq 4)lipase
glicerol + ATP
→
glicerofosfato + ADP (Eq 5)gliceroquinase
glicerofosfato desidrogenase
NADH + corante tetrazólio
→
formazana + NAD+ (Eq 7)diaforase
A leitura feita por espectrofotometria na faixa de 500-600 nm.
3.2.2.2. Determinação laboratorial das lipoproteínas
Vários métodos podem ser utilizados na estimativa de lipoproteínas. O método de referência ainda é a ultracentrifugação, mas esta não é utilizada rotineiramente em laboratório clínico. Os métodos ditos como homogêneos (ou seja, aquele que ocorrem em uma só fase) são os métodos de escolha. Estes métodos são baseados na precipitação seletiva de lipoproteínas por poliânions (Ca, Mg, Mn).
A eficácia deste método (precipitação seletiva) de determinação de HDL-C é maior em relação à separação e em detrimento das outras lipoproteínas. Após a precipitação seletiva das demais lipoproteínas, o HDL-C é medido no sobrenadante. [1,2]
A medida do LDL- C pode ser feita por ultracentrifugação, métodos homogêneos e cálculo pela fórmula de Friedwald (55). O LDL-C calculado é o método de escolha, devido não só à nossa amostra ser formada por pacientes sem dislipidemia, bem como seu baixo custo e boa reprodutibilidade. A fórmula é assim descrita, quando os triglicérides são expressos em mg/dL:
3.2.3. Determinação Laboratorial dos Polimorfismos
O polimorfismo de interesse utilizado neste estudo foi a translocação da base C pela base T na posição 514. A metodologia utilizada foi a RFLP (restriction fragment length polymorphism – Clivagem por enzima de restrição). Basicamente, esta técnica consiste dos
seguintes passos: coleta do material, extração do DNA, amplificação do material por PCR, com posterior quebra em fragmentos por enzimas de restrição e separação das bandas por eletroforese em gel para identificação dos fragmentos e caracterização dos alelos.
3.2.3.1. Extração de DNA
Figura 10 Esquema extração DNA. Adaptado referência 56.
3.2.3.2. PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
O DNA das células da mucosa bucal foi analisado usando um kit comercialmente disponível PCR (GFX ®; Amersham-Pharmacia, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.
Nas reações, foram usados 200ng do DNA genômico em um volume final de 25l de reação, contendo: 5pmol/l de cada primer foward e reverse, 10l de mix Promega (50UN/ml
400M de dGTP, 400M de dT e 3mM de MgCl2; Promega Coorporation, Madison, WI, USA) e 12l H2O nuclease-free Promega. A eletroforese foi em gel de agarose 3% e corado por brometo de etídio. Os primers, temperatura de anelamento do primer e padrões de
amplificação estão descritos na tabela abaixo.
Tabela 1: Descrição do primer, temperatura de anelamento (TC), fragmentos de amplificação (Bp) e enzima de restrição do gene estudado.
Descrição Primer T(C) Bp
Enzima de Restrição
** Bp
S (C/C) 274 Sense 5’-TCA CTT GGC AAG GGC ATC TTT G-3’
H (C/T) 274,226,48 LIPASE
(Somekawa et al. 2002)
Anti-sense 5’-AGG TCG GGG TAG GTG GCT TCC A-3’
56,5 274 Nla III
M (T/T) 226,48 ** S= Homozigoto Selvagem (C/C); H= Heterozigoto (C/T); M= Homozigoto Mutado (T/T)
A PCR foi realizada utilizando primers para detectar a alteração C-T, como descrito
por Somekawa et al. [57]. Os seguintes primers foram utilizados neste estudo:
LipR, 5'-TCACTTGGCAAGGGCATCTTTG-3', e
LipF, 5'-GGTCGGGGTAGGTGGCTTCCA-3'.
O protocolo de PCR incluiu 35 ciclos a 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 60 s e 72 º C por 90 s, depois de 2 minutos de desnaturação a 95oC.
Os produtos da PCR foram incubados em um volume final de 10l a 37C por 4 horas, contendo: 3 unidades de enzima de restrição, 1l do “buffer” e 8l do produto do PCR.
Fragmentos de PCR foram digeridos com 1,5 unidades da enzima de restrição NiaIII, seguido de eletroforese em gel de agarose 3% baixo ponto de fusão que foram, então, corados com brometo de etídio. O tamanho do fragmento amplificado foi 274 bp. Fragmentos de 226 bp e 48 foram obtidos para T alelo, e fragmentos de 274 bp foram obtidos para o alelo C.
Os genótipos foram expressos como CC (alelo homozigoto maior (W), 274 bp), CT (heterozigoto (H), 274 , 226 e 48 bp) e TT (alelo homozigoto menores (M), 226 e 48 bp). (Figura 11)
C
C
C
T
T
T
274 bp
226 bp 48 bp
3.2.4. Análise Estatística
3.2.4.1. Análise Preparatória
Como os dados a serem comparados são provenientes dos mesmos indivíduos, ou seja, são dados relacionados, deve-se usar um teste estatístico que leve esse fator em consideração. Para comparação de dados quantitativos, utiliza-se o teste t para amostras pareadas (paired sample t test). Um equivalente ao test t, porém para amostras relacionadas.
Entretanto, esse teste exige que os dados apresentem uma distribuição normal.
Assim, inicialmente, foi utilizado o teste conhecido como Kolmogorov-Smirnov test
para verificar se os dados a serem analisados estão distribuídos de acordo com os padrões de normalidade. Se o valor de p, identificado na tabela como Asymp.Sig (2 tailed) for >0,05, então
dizemos que os dados têm uma distribuição normal.
Tabela 2: Teste para a normalidade da distribuição dos dados (pré-tratamento).
58 58 58 58
210,3103 58,9483 120,0517 138,0690 45,47458 13,44961 38,71371 65,39673
,107 ,109 ,100 ,126
,107 ,109 ,100 ,126
-,081 -,045 -,069 -,065
,813 ,830 ,764 ,960
,523 ,495 ,603 ,315
N Média DP Parâmetros normais a,b Absoluta Positiva Negativa Diferenças Extremas Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (bicaudal)
ColTot HDL LDL Trig
Distribuição do teste é Normal. a.
Calculado a partir dos dados b.
Tabela 3: Teste para a normalidade da distribuição dos dados (pós-tratamento).
Para todas as variáveis em análise, o valor de p foi >0,05, ou seja, todas apresentam
distribuição normal. (Tabelas 3 e 4)
3.2.4.2. Análise dos dados
Como cada indivíduo tinha mais de um conjunto de observações, foi utilizado o teste t de amostras pareadas para comparar os dados quantitativos. Este teste é equivalente ao teste t de Student padrão, mas é projetado, especificamente, para amostras relacionadas. Ele exige que os dados tenham uma distribuição normal. Assim, inicialmente, foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov para verificar se os dados estavam distribuídos normalmente. O valor de p da hipótese de não-normalidade foi> 0,05 para todas as variáveis. Os resultados são
apresentados como média e desvio padrão.
Para determinar se o genótipo influenciou os níveis de base de alguma das variáveis, utilizou-se análise de variância (ANOVA). Foram comparados os valores médios para os três genótipos nas amostras colhidas antes e após o tratamento com TRE. As variáveis foram: idade, colesterol total, HDL-C, LDL-C e TG. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi verificado para a totalidade da amostra.
teste Kolmogorov-Smirnovt amostragem simples
58 58 58 58
209,4138 57,7586 125,5172 122,0690 43,19155 14,43596 38,07713 66,50151
,094 ,112 ,074 ,165
,094 ,112 ,074 ,165
-,054 -,070 -,051 -,123
,719 ,852 ,566 1,255
,679 ,462 ,905 ,086
N Média DP Parâmetros normais a,b Absoluta Positiva Negativa Diferenças estremas Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (bicaudal)
ColTot2 HDL2 LDL2 Trig2
Distribuição do teste é Normal. a.
4. Resultados
4.1. Análise comparativa antes e após tratamento
Os resultados são apresentados como a média e o desvio padrão das
variáveis estudadas. A Tabela 4 mostra a influência do tratamento de reposição
estrogênica sobre o grupo como um todo. Os valores para o colesterol, HDL-C,
LDL-C e triglicérides foram analisados independentemente do genótipo para as
condições de pré e pós-tratamento.
Tabela 4 Análise comparativa das variáveis em estudo antes e depois do tratamento,
avulso do genótipo.
Grupos N t p
Coltotal 58 210,31 45,47
ColTotal2 58 209,41 43,19
HDL-C 58 58,95 13,45
HDL-C2 58 57,76 14,44
LDL-C 58 120,052 38,71
LDL-C2 58 125,52 38,08
TG 58 138,07 65,40
TG2 58 122,07 66,50
0,14 0,94 -0,83 2,16 Resultados 0,89 0,35 0,41 0,03
O equilíbrio de Hardy-Weinberg (também princípio de Hardy-Weinberg, ou lei
de Hardy-Weinberg) é a base da genética de populações. Afirma que, em uma
população mendeliana, as frequências alélicas permanecerão constantes com o
passar das gerações, independentemente de um gene ser raro ou frequente. Todos
os genótipos estudados estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg. (Tabela 5)
Tabela 5: Análise do Equilíbrio de Hardy Weinberg.
CC CT TT QuadradoQui- p*
observado 15 29 14 0,000005 0,998
esperado 15,00 28,99 14,00
CC (maior-alelo homozigoto); CT (heterozigoto); TT (minor-alelo homozigoto)
4.2. Análise comparativa dos diferentes genótipos pré e pós-tratamento
Para avaliar se os valores basais de qualquer uma das variáveis foram
influenciados pelos genótipos, a Tabela 6 mostra o perfil lipídico pelo genótipo
(alelo-maior homozigoto, heterozigoto e alelo-minor homozigoto).
Tabela 6: Influência dos genótipos nos níveis basais das variáveis em estudo.
Genótipo Variável N Média Desvio Padrão teste t P
C/C Coltotal 15 216,27 47,36 0,15 0,89
C/T Coltotal 29 205,41 44,03 0,08 0,94
T/T Coltotal 14 214,07 48,65 0,03 0,98
C/C HDL-C 15 57,87 12,56 1,31 0,21
C/T HDL-C 29 57,17 12,18 0,21 0,84
T/T HDL-C 14 63,79 16,44 0,36 0,72
C/C LDL-C 15 134,40 42,83 -0,09 0,93
C/T LDL-C 29 118,21 31,19 -0,14 0,89
T/T LDL-C 14 108,50 45,96 -1,26 0,23
C/C TG 15 132,60 45,50 1,07 0,30
C/T TG 29 136,41 70,19 1,20 0,24
T/T TG 14 147,36 76,01 1,71 0,11
Média e Desvio Padrão dos níveis basais das variáveis em estudo de acordo com o
Para continuarmos a estudar esta potencial influência, a Tabela 7 compara as
médias das variáveis pelos genótipos (mostra os resultados dos ensaios). Para esta
finalidade, nós usamos um modelo de ANOVA e comparamos as médias por grupo.
Tabela 7 Modelo ANOVA comparando os níveis basais médios de lipídios por genótipo (alelo-maior homozigoto, heterozigoto e alelo- minor homozigoto).
ANOVA
Somas de quadrados
df média quadrados
F Sig
Coltotal entre grupos 1425.517 2 712.759 0.337 0.716 dentro de grupos 116446.9 55 2117.216
Total 117872.4 57
HDL-C entre grupos 436.616 2 218.308 1.216 0.304 dentro de grupos 9874.228 55 179.531
Total 10310.845 57
LDL-C entre grupos 5054.986 2 2,527.493 1.73 0.187 dentro de grupos 80373.859 55 1461.343
Total 85428.845 57
TG entre grupos 1735.875 2 867.938 0.197 0.822 dentro de grupos 242037.8 55 4400.688
Total 243773.7 57
Também foram analisados os níveis de lipídios antes e depois da TER. Estes
resultados estão apresentados de acordo com o genótipo na Tabela 8. Na presente
Tabela 8 Influência do genótipo na variação observada pré e pós-tratamento.
Genótipo Variável N Resultados teste t P
Coltotal 15 216.27 47.36 CC
ColTotal2 15 214.60 39.09 0.15 0.89 Coltotal 29 205.41 44.03
CT
ColTotal2 29 204.66 39.76 0.08 0.94 Coltotal 14 214.07 48.65
TT
ColTotal2 14 213.71 55.03 0.03 0.98 HDL-C 15 57.87 12.56
CC
HDL-C 2 15 54.87 15.47
1.31 0.21
HDL-C 29 57.17 12.18 CT
HDL-C 2 29 56.76 13.38 0.21 0.84 HDL-C 14 63.79 16.44
TT
HDL-C 2 14 62.93 15.16 0.36 0.72 LDL-C 15 134.40 42.83
CC
LDL-C2 15 135.40 34.27 -0.09 0.93 LDL-C 29 118.21 31.19
CT
LDL-C2 29 19.62 38.01 -0.14 0.89 LDL-C 14 108.50 45.96
TT
LDL-C2 14 127.14 42.28 -1.26 0.23
TG 15 132.60 45.50
CC
TG2 15 121.13 44.02
1.07 0.30
TG 29 136.41 70.19
CT
TG2 29 121.83 73.78 1.20 0.24
TG 14 147.36 76.01
TT
Coltotal colesterol total pré-tratamento; HDL-C: lipoproteína de alta densidade pré-tratamento; LDL-C: lipoproteína de baixa densidade pré-tratamento; TG: triglicérides pré-tratamento; Coltotal2 colesterol total pós-tratamento; HDL-2: lipoproteína de alta densidade pós-tratamento; LDL-C2: lipoproteína de baixa densidade pós-tratamento; TG2: triglicérides pós-tratamentoC/C (maior-alelo homozigoto); C/T (heterozigoto); T/T (minor-alelo homozigoto).
A Tabela 9 apresenta a influência do alelo T sobre o perfil lipídico e a resposta ao tratamento de estrogênio. Nenhuma diferença estatisticamente significativa nos
níveis de colesterol total, HDL-C, ou LDL-C foi encontrada após o reagrupamento
dos genótipos em CT e TT.
Tabela 9 Teste t para amostras pareadas, antes e depois do tratamento para
as variáveis em estudo, apenas no grupo de genótipos agrupados (C/T e T/T).
Coltotal colesterol total pré-tratamento; HDL-C: lipoproteína de alta densidade pré-tratamento; LDL-C: lipoproteína de baixa densidade pré-tratamento; TG: triglicérides pré-tratamento; Coltotal2 colesterol total pós-tratamento; HDL-2: lipoproteína de alta densidade pós-tratamento; LDL-C2: lipoproteína de baixa densidade pós-tratamento; TG2: triglicérides pós-tratamento.
diferenças pareadas
95% intervalo de confiança
(mg/dL) Média DP
Erro Médio
Padrão inferior superior t DF Sig (bi-caudal)
Par 1 Coltotal=Coltotal2 0.62791 50.96685 7.77237 -15.05738 16.31319 0.081 42 0.936
Par 2 HDL-C – HDL-C-C2 0.55814 9.9506 1.51745 -2.5042 3.62048 0.368 42 0.715
Os níveis pré e pós-tratamento das outras variáveis em estudo não diferiram
entre os genótipos, mesmo após o agrupamento dos genótipos C/T e T/T. Todos os
valores de p (Sig. (2-tailed)) são maiores que 0,05.
Para verificar se a presença de um dos alelos influenciou os níveis basais das
variáveis, utilizou-se o teste de análise de variância (ANOVA), comparando-se as
médias dos valores dos indivíduos com o alelo C versus indivíduos com alelo T.
A Tabela 10 resume os dados e mostra as correlações entre os alelos C e T e
os valores de lipídicos basais. Um modelo de ANOVA foi utilizado para comparar os
Tabela 10 Teste ANOVA comparando as médias dos níveis basais entre os dois
alelos (C e T).
ANOVA
Somas de quadrados
df
média quadrados
F Sig
Coltotal entre grupos 46.432 1 46.432 0.022 0.881 dentro de grupos 235698.4 114 2067.53
Total 235744.8 115
HDL-C entre grupos 243.083 1 243.083 1.36 0.246 dentro de grupos 20378.607 114 178.76
Total 20621.69 115
LDL-C entre grupos 4901.112 1 4901.112 3.367 0.069 dentro de grupos 165956.6 114 1455.759
Total 170857.7 115
TG entre grupos 1551.263 1 1551.263 0.364 0.548 dentro de grupos 485996.2 114 4263.124
Total 487547.4 115
Não foi observada diferença significativa para os níveis basais de nenhuma
das variáveis em estudo: valor de p, ou valor de Sig >0,05. Os níveis basais são
A Tabela 11 mostra a influência dos alelos C e T nos níveis de lipoproteínas
dos pacientes que receberam reposição hormonal com estrogênio. Um modelo de
ANOVA multivariada foi utilizado para comparar as médias das pacientes com os
alelos C e T. Em seguida, compararam-se as alterações de lipoproteínas em
resposta ao tratamento, de acordo com o genótipo.
Tabela 11 Resultados das variáveis em estudo e os valores provenientes do teste t para amostras pareadas, antes e depois do tratamento, separado por alelo.
Influência alélica na variação observada pré e pós-tratamento.
Alelo Variável N Média Resultados p
Coltotal 59 210,93 45,26
C
ColTotal2 59 209,71 39,06
0,20 0,85
Coltotal 57 209,67 45,68
T
ColTotal2 57 209,11 47,08
0,08 0,93
HDL-C 59 57,53 12,16
C
HDL-C2 59 55,80 14,24
1,37 0,18
HDL-C 57 60,42 14,52
T
HDL-C2 57 59,79 14,35
0,50 0,62
LDL-C 59 126,44 37,70
C
LDL-C2 59 127,64 36,44
-0,20 0,84
LDL-C 57 113,44 38,62
T
LDL-C2 57 123,32 39,58
-1,39 0,17
TG 59 134,47 58,15
C
TG2 59 121,47 59,69
1,85 0,07
TG 57 141,79 71,95
T
TG2 57 122,68 72,88
Coltotal colesterol total pré-tratamento; HDL-C: lipoproteína de alta densidade pré-tratamento; LDL-C: lipoproteína de baixa densidade pré-tratamento; TG: triglicérides pré-tratamento; Coltotal2 colesterol total pós-tratamento; HDL-2: lipoproteína de alta densidade pós-tratamento; LDL-C2: lipoproteína de baixa densidade pós-tratamento; TG2: triglicérides pós-tratamentoC/C (maior-alelo homozigoto); C/T (heterozigoto); T/T (minor-alelo homozigoto).
Os resultados mostram que a presença do alelo T está associada a uma
redução significativa nos níveis de triglicérides, enquanto a presença do alelo C não
está. Esses resultados são, de certa forma, traduzidos nos genótipos. A presença do
alelo T (agrupamento dos genótipos C/T e T/T) mostra uma redução importante,
5. Discussão
Foi observada diferença estatisticamente significativa nos níveis de triglicérides, após TRE em relação aos valores basais (Tabela 4). Para examinar a eficácia da TRE, não diferenciamos os indivíduos por genótipo. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos níveis de lipoproteínas estudados. Os valores de p para as concentrações de lipoproteínas, antes e após o tratamento foram p = 0,89 e p = 0,35 para HDL-C e LDL-C, respectivamente. Em outras palavras, HDL-C e LDL-C não se alteraram significativamente após o tratamento. Estes achados estão, provavelmente, relacionados ao fato de que os substratos principais de HL são TG e HDL-C e não LDL-C. [20, 29,30]
Quando os três genótipos foram analisados separadamente, não houve mudanças significativas dos triglicérides após TRE. Além disso, esta redução foi, primeiramente, observada nos portadores do alelo T (Tabela 8). Para explorar a hipótese de que o alelo T possa ter influenciado os resultados, os genótipos foram re-classificados como CT ou TT. Apesar de uma redução das lipoproteínas serem observadas, não foi estatisticamente significativa (t = 1,889, p = 0,06).
A diminuição significativa de triglicérides, observada na primeira análise, foi observada apenas nos genótipos CT (t = 1,20, p = 0,24) e TT (t = 1,71, p = 0,11). Diminuição significativa dos triglicérides (t = 3,22, p = 0,02) em portadores do alelo T também foi encontrada quando os genótipos CT e TT foram agrupados. Em contraste, aqueles com o genótipo CC não apresentaram diminuição significativa nos triglicérides após o tratamento (t = 1,07, p = 0,30). [58]
HDL-C e LDL-C não foram diferentes entre os genótipos antes e após o tratamento, mesmo após termos dividido a análise dos genótipos CT e TT separadamente (Tabela 9). Todos os valores bicaudais de p associados a essas comparações foram superiores a 0,05. Há especulações acerca das relações entre o metabolismo de HDL-C e os polimorfismos da HL. No entanto, estes polimorfismos resultam em apenas variações pouco significativas nos níveis de HDL-C [59], que é consistente com nossos achados.
O alelo T foi associado com uma redução significativa nos triglicérides. Triglicérides reduzidos após TRE foram observados em indivíduos de ambos os genótipos TT e CT, mas a redução foi mais significativa nos portadores do alelo T do que nos portadores do alelo C. Estes resultados são expressos indiretamente em relação ao genótipo; a comparação dos pacientes CT e TT mostrou uma tendência em direção a um nível semelhante de redução de triglicérides (t = 1,889, p = 0,06) (Tabela 11). Estes resultados indicam que o mecanismo da TRH difere daquele típico de drogas hipolipemiantes, pois se o mecanismo fosse o mesmo, seria esperado que o tratamento tivesse maior efeito sobre aquelas com o alelo C. [10,11,58]
A limitação do nosso estudo é o número relativamente pequeno de pacientes. No entanto, a força está no fato de ser um estudo prospectivo da população brasileira, comparando-se as mesmas mulheres antes e após a TRH para enfrentar a questão de saber se os níveis de lipídeos estão associados com os alelos C ou T.
6. Conclusões
Nosso estudo concluiu que o polimorfismo do gene da enzima Lípase
Hepática influi no metabolismo lipídico e esta é maior nas pacientes carreadoras do
Referências bibliográficas
1 Rifai N, Warnick R, Remaley A T. Lipidios, Lipoproteínas Apolipoprteínas e Outros Fatores de Risco Cardiovascular. In: Burtis C A, Ashwood E R, Bruns D E. Tietz, Fundamentos de Química Clínica. 6a ed. Rio de Janeiro. Elsevier. 2008. p. 413-441
2 Bachorik P S, Denk M A, Stein E A, Rifkind, B M. Lipidios e Dislipoproteinemias.
In:Henry J B. Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais. 20a ed. Barueri, SP. Manole. 2008. p. 259-287.
3. Santamarina-Fojo S, Gonzalez-Navarro H, Freeman L, Wagner E, Nong Z: Hepatic lipase, lipoprotein metabolism, and atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol
2004, 24:1750-1754.
4 Perret B, Mabile L, Martinez L, Tercé F, Barbaras R, Collet X.Hepatic lipase: structure/function relationship, synthesis,and regulation. J Lipid Res. 2002 Aug;
43(8):1163-9
5. Shafi S, Brady SE, Bensadoun A, Havel RJ: Role of hepatic lipase in the uptake and processing of chylomicron remnants in rat liver.J Lipid Res 1994, 35:709-720.
6. Krapp A, Ahle S, Kersting S, Hua Y, Kneser K, Nielsen M, Gliemann J, Beisiegel U:
Hepatic lipase mediates the uptake of chylomicrons and VLDL into cells via the LDL receptor-related protein (LRP).J Lipid Res 1996, 37:926-936.
study using reconstituted HDL particles of defined phospholipid composition. J Lipid Res 1994, 35:373-384.
8. Lambert G, Chase MB, Dugi K, Bensadoun A, Brewer HB Jr, Santamarina-Fojo S:
Hepatic lipase promotes the selective uptake of high density lipoprotein-cholesteryl esters via the scavenger receptor B1.J Lipid Res 1999, 40:1294-1303.
9. Diard P, Malewiak M-I, Lagrange D, Griglio S: Hepatic lipase may act as a ligand in the uptake of artificial chylomicron remnant-like particles by isolated rat hepatocytes.Biochem J 1994, 299:899-894.
10. Zambon A, Deeb SS, Pauletto P, Crepaldi G, Brunzell JD: Hepatic lipase: a marker for cardiovascular disease risk and response to therapy. Current Opinion in Lipidology
2003, 14:179-189.
11. Deeb SS, Zambon A, Carr MC, Ayyobi AF, Brunzell JD: Hepatic lipase and dyslipidemia: interactions among genetic variants, obesity, gender, and diet. J Lipid Res 2003, 44:1279–1286.
12. Jansen H, Verhoeven AJ, Weeks L, Kastelein JJ, Halley DJ, van den Ouweland A, Jukema JW, Seidell JC, Birkenhäger JC: Common CtoT substitution at position -480 of the hepatic lipase promoter associated with a lowered lipase activity in coronary artery disease patients.Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997, 17:2837-2842.
14. Breckenridge WC, Little JA, Alaupovic P, Wang CS, Kuksis A, Kakis G, Lindgren F, Gardiner G: Lipoprotein abnormalities associated with a familial deficiency of hepatic lipase.Atherosclerosis 1982, 45:161-179.
15. Ruel IL, Couture P, Gagne C, Deshaies Y, Simard J, Hegele RA, Lamarche B:
Characterization of a novel mutation causing hepatic lipase deficiency among French Canadians.J Lipid Res 2003, 44:1508-1514.
16. Jansen H, Verhoeven AJ, Sijbrands EJ: Hepatic lipase: a pro- or anti-atherogenic protein? J Lipid Res 2002, 43:1352-1362.
17. Datta S, Luo CC, Li WH, VanTuinen P, Ledbetter DH, Brown MA, Chen SH, Liu SW, Chan L: Human hepatic lipase. Cloned cDNA sequence, restriction fragment length polymorphisms, chromosomal localization, and evolutionary relationships with lipoprotein lipase and pancreatic lipase.J Biol Chem 1988, 263:1107-1110.
18. Ameis D, Stahnkel G, Kobayashi J, McLean J, Lee G, Biischerl M, Schotz MC, Will H:
Isolation and characterization of the human hepatic lipase gene.J Biol Chem 1990,
265:6552-6555.
19. Srivastava N, Chowdhury PR, Averna M, Srivastava RA: Estrogen increases hepatic lipase levels in inbred strains of mice: A possible mechanism for estrogendependent lowering of high density lipoprotein. Mol Cell Biochem 2001,
220:87-93.
20. Deeb SS, Peng R: The C-514T polymorphism in the human hepatic lipase gene promoter diminishes its activity.J Lipid Res 2000, 41:155-158.
21. Isaacs A, Aulchenko YS, Hofman A, Sijbrands EJ, Sayed-Tabatabaei FA, Klungel OH, Maitland-van der Zee AH, Stricker BH, Oostra BA, Witteman JC, van Duijn CM:
high-density lipoprotein cholesterol levels. J Clin Endocrinol Metab 2007, 92:
2680-2687.
22. Guerra R, Wang J, Grundy SM Cohen JC A hepatic lipase (LIPC) allele associated with high plasma concentrations of high density lipoprotein cholesterol. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94:4532-4537.
23. Isaacs A, Sayed-Tabatabaei FA, Njajou OT, Witteman JC, van Duijn CM: The -514 C->T hepatic lipase promoter region polymorphism and plasma lipids: a meta-analysis.
J Clin Endocrinol Metab 2004, 89:3858-3863.
24. Santamarina-Fojo S, Haudenschild C, Amar M: The role of hepatic lipase in lipoprotein metabolism and atherosclerosis.Curr Opin Lipidol 1998, 9:211-219.
25. Dugi KA, Brandauer K, Schmidt N, Nau B, Schneider JG, Mentz S, Keiper T, Schaefer JR, Meissner C, Kather H, Bahner ML, Fiehn W, Kreuzer J: Low hepatic lipase activity is a novel risk factor for coronary artery disease. Circulation 2001, 104:3057–3062.
26. Shohet RV, Vega GL, Anwar A, Cigarroa JE, Grundy SM, Cohen JC: Hepatic lipase (LIPC) promoter polymorphism in men with coronary artery disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999, 19:1975–1978.
27. Zambon A, Deeb SS, Brown BG, Hokanson JE, Brunzell JD: Common hepatic lipase gene promoter variant determines clinical response to intensive lipid-lowering treatment.Circulation 2001, 103:792-798.
29. Yasuda T, Ishida T, Rader DJ: Update on the role of endothelial lipase in high-density lipoprotein metabolism, reverse cholesterol transport, and atherosclerosis.Circ J 2010, 74:2263-2270.
30. Zambon A, Bertocco S, Vitturi N, Polentarutti V, Vianello D, Crepaldi G: Relevance of hepatic lipase to the metabolism of triacylglycerol-rich lipoproteins Biochem Soc Trans 2003, 31:1070-1074.
31. Saxena U, Klein MG, Vanni TM, Goldberg LI: Lipoprotein lipase increases low density lipoprotein retention by subendothelial cell matrix. J Clin Invest 1992,
89:373–380.
32. Babaev VR, Patel MB, Semenkovich CF, Fazio S, Linton MF: Macrophage lipoprotein lipase promotes foam cell formation and atherosclerosis in low density lipoprotein receptor-deficient mice.J Biol Chem 2000, 275:26293–26299.
33. von Eckardstein A, Nofer JR, Assmann G: High density lipoproteins and arteriosclerosis. Role of cholesterol efflux and reverse cholesterol transport.
Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001, 21:13–27.
34. von Eckardstein A, Nofer JR, Assmann G: Acceleration of reverse cholesterol transport.Curr Opin Cardiol 2000, 15:348–354.
35. Jansen H: Hepatic lipase: friend or foe and under what circumstances? Curr Atheroscler Rep 2004, 6:343-347.
37. Annema W, Tietge UJ: Role of hepatic lipase and endothelial lipase in high-density lipoprotein–mediated reverse cholesterol transport. Curr Atheroscler Rep 2011,
13:257-265.
38. Anderson JL, Carlquist JF: Genetic polymorphisms of hepatic lipase and cholesteryl ester transfer protein, intermediate phenotypes, and coronary risk. J Am Coll Cardiol 2003, 41:1990-1993.
39. Ordovas JM, Corella D, Demissie S, Cupples LA, Couture P, Coltell O, Wilson PW, Schaefer EJ, Tucker KL: Dietary fat intake determines the effect of a common polymorphism in the hepatic lipase gene promoter on high-density lipoprotein metabolism: evidence of a strong dose effect in this gene-nutrient interaction in the Framingham study.Circulation 2002, 106:2315-2321.
40. Nie L, Wang J, Clark LT, Tang A, Vega GL, Grundy SM, Cohen JC: Body mass index and hepatic lipase gene (LIPC) polymorphism jointly influence postheparin plasma hepatic lipase activity.J Lipid Res 1998, 39:1127–1130.
41. Carr MC, Hokanson JE, Zambon A, Deeb SS, Barrett PH, Purnell JQ, Brunzell JD: The contribution of intraabdominal fat to gender differences in hepatic lipase activity and low/high density lipoprotein heterogeneity. J Clin Endocrinol Metab 2001,
86:2831-2837.
42 Barrett-Connor E. Clinical review 162: cardiovascular endocrinology 3: an epidemiologist looks at hormones and heart disease in women. J Clin Endocrinol Metab. 2003 ;88(9):4031-42.
43. Hulley S, Grady D, Bush T, Furberg C, Herrington D, Riggs B, Vittinghoff E:
heart disease in postmenopausal women. Heart and Estrogen/progestin Replacement Study (HERS) Research Group. JAMA 1998, 280:605-613.
44. Herrington DM, Reboussin DM, Brosnihan KB, Sharp PC, Shumaker SA, Snyder TE, Furberg CD, Kowalchuk GJ, Stuckey TD, Rogers WJ, Givens DH, Waters D: Effects of estrogen replacement on the progression of coronary-artery atherosclerosis. N Engl J Med 2000, 343:522-529.
45. Herrington DM, Klein KP: Randomized clinical trials of hormone replacement therapy for treatment or prevention of cardiovascular disease: a review of the findings.Atherosclerosis 2003, 166:203-212.
46. Grodstein F, Stampfer MJ, Manson JE, Colditz GA, Willett WC, Rosner B, Speizer FE, Hennekens CH: Postmenopausal estrogen and progestin use and the risk of cardiovascular disease.N Eng J Med 1996, 335:453 –461.
47. LaCroix AZ, Chlebowski RT, Manson JE, Aragaki AK, Johnson KC, Martin L, Margolis KL, Stefanick ML, Brzyski R, Curb JD, Howard BV, Lewis CE, Wactawski-Wende J; WHI Investigators: Health outcomes after stopping conjugated equine estrogens among postmenopausal women with prior hysterectomy.JAMA 2011, 305:1305-1314.
48. Mosca L, Collins P, Herrington DM, Mendelsohn ME, Pasternak RC, Robertson RM, Schenck-Gustafsson K, Smith SC Jr, Taubert KA, Wenger NK; American Heart Association: Hormone replacement and cardiovascular disease: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association. Circulation 2001,
104:499-503.
metabolism with plasma concentrations of remnant lipoproteins and HDL subpopulations before and after hormone therapy in postmenopausal women.Clin Endocrinol (Oxf) 2010, 72:169–175.
50. Mosca L, Benjamin EJ, Berra K, Bezanson JL, Dolor RJ, Lloyd-Jones DM, Newby LK, Piña IL, Roger VL, Shaw LJ, Zhao D, Beckie TM, Bushnell C, D'Armiento J, Kris-Etherton PM, Fang J, Ganiats TG, Gomes AS, Gracia CR, Haan CK, Jackson EA, Judelson DR, Kelepouris E, Lavie CJ, Moore A, Nussmeier NA, Ofili E, Oparil S, Ouyang P, Pinn VW, et al: Effectiveness-based guidelines for the prevention of cardiovascular disease in women—2011 update: a guideline from the american heart association.Circulation 2011, 123:1243-1262.
51. Lamon-Fava S, Herringtonb DM, Reboussinc DM, Sherman M, Horvath K, Schaefer EJ, Asztalos BF: Changes in remnant and high-density lipoproteins associated with hormone therapy and progression of coronary artery disease in postmenopausal women.Atherosclerosis 2009, 205:325-330.
52. Chamberlain AM, Folsom AR, Schreiner PJ, Boerwinkle E, Ballantyne CM: Low-density lipoprotein and high-density lipoprotein cholesterol levels in relation to genetic polymorphisms and menopausal status: the atherosclerosis risk in communities (ARIC) study.Atherosclerosis 2008, 200:322-328.
53. Vega GL, Gao J, Bersot TP, Mahley RW, Verstraete R, Grundy SM, White A, Cohen JC:
The -514 polymorphism in the hepatic lipase gene (LIPC) does not influence androgen mediated stimulation of hepatic lipase activity.J Lipid Res 1998, 39:
1520-1524.
evaluation and, treatment of high blood cholesterol in adults final report.
Circulation 2002, 106:3143-3421
55. Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS: Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge.Clin Chem 1972, 18:499-502.
56 Invitrogen, Easy-DNATM Kit For genomic DNA isolation (texto na Internet). 2003 EUA. Disponível em www.invitrogen.com
57. Somekawa Y, Umeki H, Kobayashi K, Tomura S, Aso T, Hamaguchi H: Effects of hormone replacement therapy and hepatic lipase polymorphism on serum lipid profiles in postmenopausal Japanese women. J Clin Endocrinol Metab 2002,
87:4766–4770.
58. Zambon A, Deeb SS, Brown BG, Hokanson JE, Brunzell JD: Common hepatic lipase gene promoter variant determines clinical response to intensive lipid-lowering treatment.Circulation 2001:792–798.
59. Couture P, Otvos JD, Cupples LA, Lahoz C, Wilson PW, Schaefer EJ, Ordovas JM:
Association of the C-514T polymorphism in the hepatic lipase gene with variations in lipoprotein subclass profiles: The Framingham Offspring Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000, 20:815-822.
61. Fan YM, Dastidar P, Jokela H, Punnonen R, Lehtimäki T: Hepatic lipase C480t genotype-dependent benefit from long-term hormone replacement therapy for atherosclerosis progression in postmenopausal women. J Clin Endocrinol Metab
ABSTRACT
Background: Hepatic lipase (HL), an enzyme present in the hepatic sinusoids, is
responsible for the lipolysis of lipoproteins. Human HL contains four polymorphic
sites: G-250A, T-710C, A-763G, and C-514T single-nucleotide polymorphism
(SNPs). The last polymorphism is the focus of the current study. The genotypes
associated with the C-514T polymorphism are CC (normal homozygous – W), CT
(heterozygous – H), and TT (minor-allele homozygous – M). HL activity is
significantly impaired in individuals of the TT and CT genotypes. A total of 58
post-menopausal women were studied. The subjects were hysterectomized women
receiving hormone replacement therapy consisting of 0.625 mg of conjugated equine
estrogen once a day. The inclusion criteria were menopause of up to three years and
normal blood tests, radiographs, cervical-vaginal cytology, and densitometry. DNA
was extracted from the buccal and blood cells of all 58 patients using a commercially
available kit (GFX® - Amersham-Pharmacia, USA). Results: Statistically significant
reductions in triglycerides (t=2.16; n=58; p=0.03) but not in total cholesterol (t=0.14;
n=58; p=0.89) were found after treatment. This group of good responders were
carriers of the T allele; the CT and TT genotypes were present significantly more
frequently than in the group of non-responders (p=0.02 or p=0.07, respectively).
However, no significant difference in HDL-C (t=0.94; n=58; p=0.35) or LDL-C
(t=-0.83; n=58; p=0.41) was found in these patients. Conclusions: The variation in lipid
profile associated with the C-514T polymorphism is significant, and the T allele is
Keywords: Hepatic lipase gene; Menopause; Hormone replacement therapy; Lipid
metabolism, SNP
Palavras chave: gene Lipase Hepática, menopausa, terapia de reposição hormonal,
Dados Brutos
Homozigotas alelo maior
Idade Lipase Col tot.2 HDL-C2 LDL-C2 TG2 Col tot. HDL-C LDL-C TG
020-MFA 46 CC 248 40 164 219 298 47 214 183 023-ARC 52 CC 180 47 115 92 181 50 116 73 033-MHO 56 CC 276 61 187 139 260 62 178 101 044-MMV 54 CC 189 60 101 142 236 58 157 103 056-MIS 51 CC 278 63 174 206 261 43 173 226 069-MMM 55 CC 180 41 103 181 158 34 100 119 073-MTD 47 CC 200 59 129 86 229 52 144 164 076-EDC 56 CC 209 54 133 109 222 50 145 137 078-IBG 50 CC 320 68 222 151 183 59 107 86 082-MEO 50 CC 218 63 173 90 201 52 129 100 083-OIS 51 CC 189 62 113 68 194 53 124 84 088-MZS 49 CC 226 71 134 105 231 64 137 148 103-MCS 58 CC 213 52 128 165 199 61 113 124 112-LCJ 54 CC 183 86 70 137 206 101 84 103 113-MLS 50 CC 135 41 70 99 160 37 110 66
Homozigotas alelo menor
Idade Lipase Col tot.2 HDL-C2 LDL-C2 TG2 Col tot. HDL-C LDL-C TG
Heterozigotas
Idade Lipase Col tot.2 HDL-C2 LDL-C2 TG2 Col tot. HDL-C LDL-C TG
