MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÉVERTON DO NASCIMENTO ALENCAR
Avaliação da atividade antimicrobiana de sistemas emulsionados contendo óleos naturais para o tratamento de infecções cutâneas
ÉVERTON DO NASCIMENTO ALENCAR
Avaliação da atividade antimicrobiana de sistemas emulsionados contendo óleos naturais para o tratamento de infecções cutâneas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos
Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa de Egito Coorientador: Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves
Dedico este trabalho:
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Graça e Manoel, pelo apoio incondicional que sempre me deram.
Às minhas irmãs, Clélia e Lidiane, pelo importante papel que tem na minha vida. Aos meus sobrinhos Hanry, Ravana e Derick pela felicidade que sempre me trouxeram.
Aos amigos Gutemberg, Arion, Maria Luiza, Janaina, Deyse, Aline, Karídia e Leonardo pelos momentos de conversas, conselhos e alegrias.
Aos que fazem parte do Laboratório de Sistemas Dispersos, Nednaldo, Rafael, Thales, Scheyla, Laura, Izabel, Alexandrino, Cybelle, Sarah, Christian Assunção, André e demais que compartilham alegrias e conhecimentos no dia-a-dia.
Aos amigos e companheiros de equipe, Andreza, Lucas, Christian Melo, Teresa, Renata e em especial a Junior Xavier, pela orientação.
À Elizabeth, por toda a disponibilidade e ensinamento no que diz respeito às bactérias utilizadas neste trabalho.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte pelo excelente ensino e pela estrutura fornecida para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Arnóbio Silva, Coordenador do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, através do qual agradeço a todos os professores e funcionários do programa.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates pelos conhecimentos, correções e suporte financeiro em aquisição de materiais necessários.
Ao Prof. Dr. Guilherme Maranhão, meu co-orientador, pelo apoio, interesse e correções. Assim como a seus alunos de pós-graduação Mariana e Plínio pelo apoio no Laboratório de Micologia Médica e Molecular.
LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E SIGLAS
® Registrado
% Porcentagem
µg Micrograma
µL Microlitro µm Micrômetro A/O Água em óleo
A/O/A Água em óleo em água AC Amostra Clínica AnfB Anfotericina B ANOVA Análise de Variância
ATCC American Type Culture Collection BHI Brain Heart Infusion
C1 Primeira fração obtida na bioautografia do óleo de copaíba C2 Segunda fração obtida na bioautografia do óleo de copaíba CCD Cromatografia em camada delgada
Cet Cetoconazol
CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a detector de espectrometria de massa CIM Concentração Inibitória Mínima
Clor Cloranfenicol
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DMSO Dimetilsulfóxido
EHL Equilíbrio hidrofílico-lipofílico EOC Emulsão de óleo de copaíba
EOEC Emulsão de óleo essencial de copaíba EOR Emulsão de óleo de rã-touro
HPTLC High performance thin layer chromatography ICA Intercellular adhesion gene cluster
IL-4 Interleucina 4 m2 Metros quadrados
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milímetro
mOC Óleo de copaíba metilado
mOEC Óleo essencial de copaíba metilado mOR Óleo de rã-touro metilado
mR1 Fração metilada obtida na bioautografia do óleo de rã-touro mRC Fração resina do óleo de copaíba metilada
NIST National Institute of Standards and Technology O/A Óleo em água
O/A/O Óleo em água em óleo OC Óleo de copaíba ºC Graus Celcius
OEC Óleo essencial de copaíba OR Óleo de rã-touro
p/p Peso/peso
R1 Fração obtida na bioautografia do óleo de rã-touro RC Fração Resina do óleo de copaíba
S80 Span 80® T20 Tween 20®
LISTA DE FIGURAS
Pág. Figura 1- Árvore de Copaíba (Copaifera langsdorffii)... 18 Figura 2- Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw)... 20 Figura 3- Corte histológico da pele apresentando as três camadas e
estruturas anexas (a). Disposição da epiderme, monócitos basais e vasos sanguíneos na derme (b)... 22 Figura 4- Cultivo de S. aureus ATCC 29213 em ágar manitol salgado... 25 Figura 5- Cultivo de S. epidermidis ATCC 12228 em ágar manitol salgado.. 26 Figura 6- Cultivo de P. aeruginosa ATCC 27853 em ágar cetrimida... 27 Figura 7- Espécies de Candida diferenciadas em meio cromogênico
CHROMagar Candida... 29 Figura 8- Esquema dos diferentes tipos de emulsão, O/A (A), A/O/A (B),
A/O (C) e O/A/O (D)... 32 Figura 9- Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo-resina de copaíba; B:
óleo-resina de copaíba metilado; C: óleo essencial de copaíba; D: óleo essencial de copaíba metilado; E: fração resina metilada do óleo de copaíba obtido como resíduo da extração de óleo essencial... 41 Figura 10- Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo de rã-touro; B: óleo
de rã-touro metilado... 44 Figura 11- Perfil cromatográfico dos óleos de copaíba e rã-touro em
Cromatografia de Camada Delgada. Adsorvente: Sílica; FM: Hexano: Acetato de etila (9:1); Revelador: Vanilina Sulfúrica...
53
Figura 12- Cromatograma obtido por CG-EM da primeira fração (Rf 0,2) de óleo de copaíba obtida pela Bioautografia... 53 Figura 13- Cromatograma obtido por CG-EM da segunda fração (Rf 0,15) de
óleo de copaíba obtida pela Bioautografia... 54 Figura 14- Cromatograma da fração (Rf 0,6) de óleo de rã-touro obtida pela
Bioautografia... 56 Figura 15- Cromatograma da fração (Rf 0,6) metilada de óleo de rã-touro
Figura 16- Formação de biofilme na presença de óleos de copaíba e emulsões contendo estes óleos... 58 Figura 17- Formação de biofilme na presença de óleo de rã-touro e emulsão
LISTA DE TABELAS
Pág. Tabela 1- Porcentagem dos compostos terpênicos majoritários das amostras
de Copaíba (Copaifera langsdorffii)... 43
Tabela 2- Porcentagem dos compostos majoritários das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)... 45
Tabela 3- Caracterização físico-química das emulsões... 46
Tabela 4- Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antibacteriana... 47
Tabela 5- Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antifúngica... 48
Tabela 6- Concentração Inibitória Mínima dos óleos de copaíba e das emulsões contendo estes óleos (mg/L)... 50
Tabela 7- Concentração Inibitória Mínima dos óleos de rã-touro e da emulsão contendo este óleo (mg/L)... 52
RESUMO
Os óleos naturais vêm chamando atenção da comunidade científica devido a suas atividades farmacológicas e seu caráter renovável. Os óleos de copaíba (Copaifera langsdorffii) e de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) ganham destaque, especialmente devido a ampla utilização na medicina popular como anti-inflamatórios e antimicrobianos. Sistemas emulsionados a base destes óleos podem ser produzidos com a finalidade de melhorar o odor e a palatabilidade dos mesmos, além de potencializar ação e reduzir toxicidade dos seus componentes. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antimicrobiana de emulsões contendo óleos de copaíba (óleo-resina e óleo essencial) e óleo de rã-touro frente a cepas de micro-organismos causadores de infecções cutâneas. Inicialmente, foi realizada a extração de óleo essencial e sua caracterização química por cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massas. Em seguida, foram produzidas emulsões, ensaios de triagem microbiológica, microdiluição para determinação de concentração inibitória mínima, bioautografia para determinação dos componentes antimicrobianos e avaliação da atividade antibiofilme. Foram utilizadas cepas da American Type Culture Collection (ATCC) e clínicas de Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis. Foi observado que os sistemas emulsionados de óleo-resina de copaíba e óleo essencial de copaíba contribuíram na potencialização da atividade antimicrobiana, especialmente contra cepas do gênero Staphylococcus e Candida resistentes aos azóis. A emulsão de óleo de rã-touro assim como o óleo puro, apresentou menor atividade que as amostras de copaíba, porém exibiu significativa ação antibiofilme, demonstrando que este sistema é um potencial inibidor da adesão de micro-organismos. Deste modo, pode-se inferir que as emulsões a base destes óleos são promissores sistemas para o tratamento de infecções cutâneas fúngicas e bacterianas.
ABSTRACT
Natural oils have shown a scientific importance due to its pharmacological activity and renewable character. The copaiba (Copaifera langsdorffii) and Bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oils are used in folk medicine particularly because the anti-inflammatory and antimicrobial activities. Emulsion could be eligible systems to improve the palatability and fragrance, enhance the pharmacological activities and reduce the toxicological effects of these oils. The aim of this work was to investigate the antimicrobial activity of emulsions based on copaiba (resin-oil and essential-oil) and bullfrog oils against fungi and bacteria which cause skin diseases. Firstly, the essential oil was extracted from copaiba oil-resin and the oils were characterized by gas chromatography coupled to a mass spectrometry
(GC-MS). Secondly, emulsion systems were produced. A microbiological screening test with all products was performed followed (the minimum inhibitory concentration, the bioautography method and the antibiofilm determination). Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei and C. tropicalis American Type Culture Collection (ATCC) and clinical samples
were used. The emulsions based on copaiba oil-resin and essential oil improved the antimicrobial activity of the pure oils, especially against Staphylococcus e Candida resistant to azoles. The bullfrog oil emulsion and the pure bullfrog oil showed a lower effect on the microorganisms when compared to the copaiba samples. All the emulsions showed a significant antibiofilm activity by inhibiting the cell adhesion. Thus, it may be concluded that emulsions based on copaiba and bullfrog oils are promising candidates to treatment of fungal and bacterial skin infections.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 REVISÃO DA LITERATURA 16
2.1 ÓLEOS NATURAIS NO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS MEDICAMENTOS 16
2.1.1 O óleo de copaíba 17
2.1.2 O óleo de rã-touro 20
2.2 A PELE 22
2.3 MICRO-ORGANISMOS CAUSADORES DE INFECÇÕES CUTÂNEAS 23
2.3.1 Staphylococcus aureus 24
2.3.2 Staphylococcus epidermidis 25
2.3.3 Pseudomonas aeruginosa 26
2.3.4 Candida albicans 27
2.3.5 Candida parapsilosis 28
2.3.6 Candida tropicalis 28
2.3.7 Candida krusei 29
2.3.8 Candida glabrata 30
2.4 SISTEMAS EMULSIONADOS 30
3 OBJETIVOS 33
3.1 OBJETIVO GERAL 33
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 33
4 MATERIAIS E MÉTODOS 34
4.1 MATERIAIS 34
4.1.1 Substâncias químicas 34
4.1.2 Micro-organismos 34
4.2 MÉTODOS 35
4.2.1 Extração do óleo essencial de copaíba 35
4.2.2 Análise da composição química dos óleos 35
4.2.3 Preparo e caracterização das emulsões 36
4.2.4 Triagem antimicrobiana 36
4.2.5 Concentração Inibitória Mínima (CIM) 37
4.2.6 Bioautografia 38
4.2.7 Atividade antibiofilme 39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 40
5.1 EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS 40
5.2 PRODUÇÃO DOS SISTEMAS EMULSIONADOS 45
5.3 TRIAGEM MICROBIOLÓGICA 46
5.4 CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) 49
5.5 BIOAUTOGRAFIA 52
5.6 AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DE BIOFILME 56
6 CONCLUSÕES 61
7 REFERÊNCIAS 63
1 INTRODUÇÃO
A pele é constantemente exposta a inúmeros micro-organismos patogênicos por apresentar contato com o meio externo e atuar como barreira física de proteção do organismo humano. Porém, fatores como imunodeficiência, alta virulência dos micro-organismos ou abrasões locais podem facilitar a instalação de diversas infecções podendo-se destacar as infecções fúngicas ou bacterianas nesse órgão (BHAGAVATULA; POWELL, 2011).
Dentre os micro-organismos causadores das infecções de pele estão as bactérias gram-positivas do gênero Staphylococcus, gram-negativas como Pseudomonas aeruginosa e fungos leveduriformes do gênero Candida (ROSENTHAL et al., 2011b; DAWSON; DELLAVALLE; ELSTON, 2012a).
Os óleos naturais são utilizados como antimicrobianos na medicina popular desde séculos passados (SALEEM et al., 2010a). Devido ao crescente número de micro-organismos resistentes aos fármacos utilizados na terapêutica, estes óleos estão sendo reconhecidos cientificamente, o que incentiva a inserção de novos produtos de origem animal e vegetal no mercado (SALEEM et al., 2010a). Dentre estes, o óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) e o óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii) são amplamente utilizados na medicina popular.
O óleo de copaíba é extraído de árvores conhecidas como Copaibeiras (Copaifera spp.) que estão distribuídas pela América do Sul e África. O óleo-resina de copaíba é utilizado tradicionalmente pela medicina popular por suas atividades anti-inflamatória e antimicrobiana (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). No cenário atual, a este óleo é dado grande destaque devido uma série de propriedades farmacológicas e cosméticas já elucidadas na literatura (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b; PIERI; MUSSI; MOREIRA, 2009a).
O óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) é extraído através do processo de aproveitamento biotecnológico de descartes dos tecidos adiposos em ranários. Assim como a carne e a pele, seu óleo é rico em ácidos graxos poli-insaturados do tipo ômega, bastante importantes para sua atividade farmacológica (GONÇALVES; OTTA, 2008a; LOPES, V. D. S. et al., 2010).
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1ÓLEOS NATURAIS NO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS
MEDICAMENTOS
A resistência de patógenos humanos a fármacos é um dos problemas mais relevantes durante a atualidade. O consumo exagerado e sem orientação adequada de antimicrobianos resulta na resistência de populações bacterianas, causando sérios problemas de saúde pública (SALEEM et al., 2010a).
Apesar dos intensos estudos e pesquisas nos últimos anos, poucos novos antimicrobianos sintéticos têm sido aprovados para comercialização. Diante deste contexto, a busca por novas substâncias antimicrobianas a partir de fontes naturais, incluindo óleos animais e vegetais, de forma sustentável e sem prejudicar a biodiversidade, tem ganhado importância nas companhias farmacêuticas. Além disto, o uso de óleos com atividade farmacológica para desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos também tem sido almejados, visto que estes visam a potencialização da atividade terapêutica, redução dos padrões de resistência e diminuição de toxicidade (SALEEM et al., 2010a).
2.1.1 O óleo de copaíba
O óleo de copaíba é extraído das copaibeiras (Copaifera spp.), pertencentes à família Fabaceae (Leguminosae), subfamília Caesalpinioideae. A família Fabaceae é de distribuição cosmopolita, na qual estão incluídas cerca de 18000 espécies divididas em 650 gêneros. Esta família é uma das maiores representantes das Angiospermas em todo o mundo. No Brasil, aproximadamente 1500 espécies de plantas são pertencentes a esta família. Os ecossistemas naturais brasileiros possuem dentre suas principais famílias, a Fabaceae. Destaca-se na região de cerrado a presença de barbatimão (Stryphnodendron spp.) e copaíba (Copaifera langsdorffii) (SOUZA; LORENZI, 2008).
São conhecidas 43 espécies do gênero Copaifera e estas estão amplamente distribuída na América do Sul (37 espécies), na América Central (4 espécies) e na África ( 4 espécies). Dentre as espécies Sul-americanas, 28 delas encontram-se presentes em território brasileiro (DWYER, 1951; NASCIMENTO et al., 2012). Embora as primeiras descrições das árvores de copaíba datem de próximo ao descobrimento do Brasil, a primeira espécie, Copaifera officinalis, foi oficialmente descrita em 1760 e somente em 1821 o francês Desfontaines adicionou a espécie C. langsdorffii ao gênero (Figura 1) (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b).
A espécie Copaifera langsdorffii é citada na literatura como a principal espécie brasileira do gênero Copaifera de uso medicinal. No Brasil, ela ocorre em seu habitat mais favorável, Amazonas, assim como em outros estados, entre eles Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais, Pará, São Paulo, na floresta da bacia do Paraná e nas partes mais úmidas da região Nordeste do País (LOZENZI; MATOS, 2008).
Figura 1 – Árvore de Copaíba (Copaifera langsdorffii). (Fonte: PIERI; MUSSI; MOREIRA, 2009).
O óleo de copaíba encontra-se nos canais secretores presentes em todo o tronco da árvore. Os canais secretores são formados a partir de espaços intercelulares (meatos) e são responsáveis por liberar exsudados em situação de lesão ou como defesa do vegetal a agentes externos (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). Sendo assim, o óleo é responsável pela desintoxicação da árvore e atividade contra fungos, bactérias e insetos (BRITO et al., 2005).
A extração sustentável do óleo-resina é realizada através de perfurações com dois cilindros no tronco da árvore, demodo que o primeiro furo seja feito a 1 metro da base do vegetal e o segundo a 1,5 metros do anterior (RIGAMONTE-AZEVEDO; WADT; WADT, 2006). A coleta do óleo é realizada pelo furo inferior com auxílio de um cilindro e para cessar o escoamento do óleo o furo superior deve ser obstruído. A obstrução dos furos pode ser realizada com material vedante plástico a fim de reduzir a chance de contaminação por fungos e bactérias. Esta medida se faz importante para que não seja necessário realizar novos furos na próxima coleta (RIGAMONTE-AZEVEDO; WADT; WADT, 2006).
dentre eles a espécie, as condições climáticas, de solo, entre outros fatores (HERRERO-JAUREGUI et al., 2011).
Entre seus principais componentes, o óleo de copaíba é composto por
sesquiterpenos como: -cariofileno, α-bisaboleno, α-humuleno (α-cariofileno), α e
-selineno, α-bisabolol, -elemeno, ciclosativeno, α-copaeno, -elemeno, cis- α
-bergamoteno, α-guaieno, -muuroleno, dentre outros (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b). Além destes componentes, os diterpenos contidos na porção resinosa descritos na literatura são: ácido hardwíckico, colavenol, ácido copaiférico ou copaífero, ácido copaiferólico, ácido calavênico, ácido patagônico, ácido copálico, entre outros, sendo este ultimo utilizado como um dos principais marcadores para identificação de óleo de copaíba. Estes componentes são normalmente comuns às várias espécies de copaíba, porém, quantitativamente há variações nas proporções dos componentes de acordo com estas diferentes espécies (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b; HERRERO-JAUREGUI et al., 2011; NASCIMENTO et al., 2012).
Os óleos essenciais são constituídos de compostos mono e sesquiterpênicos, além de fenilpropanóides, que dispõem de relevantes atividades farmacológicas. Estes óleos são a fração volátil do Bálsamo (óleo-resina) de copaíba. Por concentrarem a maioria dos compostos sesquiterpênicos os óleos essenciais são conhecidos por sua elevada atividade farmacológica quando comparadas às partes dos quais são extraídos. Este processo extrativo é usualmente realizado por arraste a vapor das folhas, flores e óleos-resina de diversas espécies vegetais (BIZZO; HOVELL; REZENDE, 2009).
Desde o período pré-colombiano os índios brasileiros já costumavam utilizar o óleo de copaíba externamente para tratamento de doenças de pele e proteção contra picadas de insetos. Após a introdução deste óleo em compêndios oficiais como antiblenorrárigo, seu uso como cicatrizante, antiinflamatório, antimicrobiano, diurético e expectorante passou a ser difundido popularmente. Além disto, comercialmente este óleo vem sendo utilizado em estabelecimentos farmacêuticos de manipulação na produção de sabonetes e outros cosméticos para tratamento de acnes e processos inflamatórios faciais (EL-NUNZIO, 1985).
et al., 1988) cicatrizante (COMELLI JÚNIOR et al., 2010), antinociceptiva (GOMES et al., 2007), larvicida (SILVA; ZANON; SILVA, 2003), antineoplásica (GOMES NDE et al., 2008), entre outras (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002b).
Diante do descrito, a atividade antimicrobiana destaca-se devido à necessidade da inserção de novos medicamentos que apresentem potencial atividade contra fungos e bactérias. Atualmente, pesquisas vêm trazendo resultados preliminares de atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae dentre outros micro-organismos, porém os parâmetros de resistência envolvidos, a cinética de morte e o mecanismo de ação ainda precisam ser elucidados (LIMA et al., 2011; PIERI et al., 2012a).
2.1.2 O óleo de rã-touro
A rã-touro é um anfíbio da espécie Rana catesbeiana Shaw, que também é chamada de Lithobates catesbeianus, pertencente à ordem Anura e família Ranidae. Esta família possui mais de 9 gêneros e 300 espécies identificadas. As espécies desta família abrangem os anfíbios menores (Asiáticos) e os de porte maior (Americanos). Após a deposição dos ovos e a liberação dos girinos, estes passam por cerca de 2-4 anos nesta forma até atingir a idade adulta (ZUG; VITT; CALDWELL, 2001). A rã-touro (Figura 2) vive preferencialmente em ambientes aquáticos ou terrestres úmidos, é nativa da América do Norte e foi trazida ao Brasil por volta de 1935 (NÓBREGA et al., 2007).
Figura 2 - Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw). (Fonte: GONÇALVES; OTTA, 2008).
pois, quando a alimentação ocorre numa faixa de temperatura ótima, ocorre maior consumo de alimentos e absorção de nutrientes, possibilitando maior ganho de massa e aumento do tecido adiposo (BRAGA; LIMA, 2001). Esta espécie tem sido cada vez mais requerida no mercado internacional no ramo alimentício, estimulando assim, seu cultivo em países Latino-americanos e Asiáticos (OLVERA-NOVOA; ONTIVEROS-ESCUTIA; FLORES-NAVA, 2007). A criação da rã-touro tem buscado reduzir as perdas na produção de modo que seus músculos são utilizados para fins alimentícios, o couro é utilizado pela indústria de bolsas e sapatos, a carcaça e patas são requeridas para produção de ração para girinos da mesma espécie. A carne de rã vem se tornando cada vez mais apreciada, não só pelo seu sabor, mas também por ser fonte de proteína de alto valor biológico (GONÇALVES; OTTA, 2008a).
O tecido adiposo das rãs, material de descarte nos ranários, vem sofrendo aproveitamento biotecnológico e crescendo o seu uso para fins científicos, através da extração do óleo. A extração do óleo pode ser realizada com diferentes parâmetros, porém destaca-se que o uso de temperaturas mais brandas (aproximadamente 80 ºC) confere uma melhor relação de rendimento/características físico-químicas adequadas do óleo quando comparado a processos extrativos a temperaturas elevadas (200 ºC) ou temperaturas baixas (35 ºC) (MÉNDEZ et al., 1998a; LOPES, V. D. S. et al., 2010).
Estudos de caracterização química do óleo demonstram seu potencial farmacológico, devido a presença de 62 compostos de ácidos graxos, dentre eles, ácido oleico (ômega 9), ácido linoleico (ômega 6), ácido linolênico (ômega 3), além dos ácidos esteárico, palmítico, mirístico (MÉNDEZ et al., 1998a; LOPES, V. D. S. et al., 2010).
O óleo de rã-touro é utilizado pela população do estado do Rio Grande do Norte, Brasil, no tratamento de processos alérgicos e asma (LOPES, V. D. S. et al., 2010). Além disto, sua atividade antioxidante e reguladora de ácidos graxos vem sendo estudada (SILVA et al., 2004), assim como a atividade antiedematogênica, porém não são encontrados relevantes relatos científicos de sua atividade antimicrobiana. Entretanto, os estudos realizados até então demonstram elevada concentração de ácidos graxos do tipo ômega e estes são citados como responsáveis por exercer atividade antimicrobiana em alguns produtos (ISAACS; LITOV; THORMAR, 1995b; MÉNDEZ et al., 1998a; LOPES, V. D. S. et al., 2010).
novos compostos antimicrobianos e para seu uso no tratamento de infecções. No entanto, este óleo possui algumas desvantagens quando utilizado na forma in natura, dentre elas a baixa espalhabilidade, o odor desagradável e a baixa absorção cutânea. Sendo assim, se lança a possibilidade de desenvolvimento de sistemas emulsionados com base em óleos naturais, que almejam diminuir estes problemas e proporcionar uma liberação modificada dos princípios ativos.
2.2A PELE
A pele é um órgão humano que corresponde a cerca de 15 % do peso total do corpo de um indivíduo adulto e possui uma área de superfície em torno de 2 m2 (Figura 3). Sua camada mais externa é a epiderme, formada principalmente por queratinócitos (95 %), além de melanócitos e células do sistema imune. A epiderme pode ser subdividida em camadas de acordo com o grau de maturação dos queratinócitos e é de grande importância para o estudo dos quadros infecciosos, visto que alguns micro-organismos possuem os queratinócitos como alvo de instalação e de nutrição (CANDI; SCHMIDT; MELINO, 2005).
Figura 3 - Corte histológico da pele apresentando as três camadas e estruturas anexas (a). Disposição da epiderme, monócitos basais e vasos sanguíneos na derme (b). (Fonte: LAI-CHEONG; MCGRATH, 2009).
e celulares, como os fibroblastos, células dendríticas e histiócitos. Além disso, a derme é irrigada por vasos sanguíneos, linfáticos e terminações sensoriais. A camada mais profunda da pele é a hipoderme, que é formada especialmente por adipócitos e constitui a grande reserva de tecido adiposo do organismo (LAI-CHEONG; MCGRATH, 2009).
A pele é um órgão constantemente exposto a diferentes micro-organismos, a maioria dos quais vive comensalmente, embora outros sejam extremamente patogênicos e causem infecções em todo o organismo (BHAGAVATULA; POWELL, 2011). Os organismos comensais, de acordo com o status imunológico do hospedeiro, podem provocar infecções oportunistas (SLAVIN; CHAKRABARTI, 2012).
As bactérias dos gêneros Staphylococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Micrococcus, Streptococcus, Brevibacterium, Acinetobacterium e Pseudomonas são descritas por alguns estudos como gêneros de bactérias residentes da pele humana. Além das bactérias, algumas leveduras do gênero Candida vivem comensalmente nas superfícies de mucosas. Os indivíduos em situações de imunodepressão e hiperglicemia são predispostos a desenvolverem quadros de infecção cutânea na presença dessas leveduras (UENO et al., 2011).
2.3 MICRO-ORGANISMOS CAUSADORES DE INFECÇÕES CUTÂNEAS
As infecções de pele podem ser causadas por agentes bacterianos, fúngicos e virais, as quais têm como fatores determinantes do seu prognóstico o micro-organismo causador, as camadas e as estruturas da pele afetadas (FLEISCHER; FELDMAN; RAPP, 2000). As bactérias são as causas mais recorrentes de infecções de pele e mucosas. Todavia, os fungos também são de alta recorrência e de difícil tratamento, quando comparados às bactérias. As infecções virais são de difícil erradicação e nos casos mais comuns, o vírus se mantém em estado latente e após eventos de diminuição da imunidade do indivíduo este retorna ao estado ativo e os sintomas se tornam evidentes novamente (DAWSON; DELLAVALLE; ELSTON, 2012).
Os fungos filamentosos e os leveduriformes também são causadores de infecções de pele e mucosas. Infecções superficiais são comumente causadas por dermatófitos dos gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Além destes, as leveduras do gênero Malassezia e, especialmente, as do gênero Candida são grande causadoras de infecções oportunistas da pele e mucosas (UENO et al., 2011).
As espécies de Candida são comensais dos humanos, mas em quadros de imunossupressão agem como agentes oportunistas e causam infecções de pele, mucosa, unhas e até infecção disseminada, denominada de candidemia. Os fatores de virulência são importantes na conversão de agentes comensais em causadores de infecções. Destacam-se como fatores de virulência, a adesão a células epiteliais e endoteliais, formação de hifas (fenômeno conhecido como morfogênese), formação de biofilme,
produção de fosfolipases e proteinases, além do “phenotypic switching” (JAYATILAKE; TILAKARATNE; PANAGODA, 2009).
2.3.1 Staphylococcus aureus
S. aureus é uma bactéria extracelular gram-positiva causadora da maioria das doenças infecciosas de pele. Dentre elas, destacam-se impetigo que é de localização superficial, além das mais invasivas como celulites, foliculites e abscessos subcutâneos (KRISHNA; MILLER, 2012).
Figura 4 - Cultivo de S. aureus ATCC 29213 em ágar manitol salgado (Fonte: autoria própria).
Um dos fatores mais relevantes na instalação de uma infecção cutânea por S. aureus é sua fixação a componentes como fibrinogênio, fibronectina e citoqueratinas através do reconhecimento de moléculas matriciais adesivas. Esse mecanismo tem grande relevância em pacientes com dermatites, pois a resposta celular a essa patologia é mediada por citocinas Th2 (como IL-4) que aumentam a quantidade de fibrinogênio e fibronectina no local da inflamação, propiciando condições ideais para a instalação de S. aureus (CHO et al., 2001).
Além disso, esta bactéria produz superantígenos (enterotoxinas A e B, toxina 1 da síndrome do choque tóxico) que escapam da resposta mediada por citocinas Th2, ação que favorece ainda mais a instalação do micro-organismo (WEIDENMAIER; GOERKE; WOLZ, 2012).
2.3.2 Staphylococcus epidermidis
mais difíceis de serem tratadas. Os biofilmes são ricas comunidades microbianas, constituídas de células sésseis embebidas em uma matriz exopolimérica, assim os micro-organismos permanecem protegidos da alta quantidade de antimicrobianos, em contrapartida se mantêm constantemente expostos a baixas concentrações dos fármacos antimicrobianos, gerando um mecanismo de resistência frente à maioria dos medicamentos (VUONG et al., 2004).
Na figura 5 são observadas colônias de S. epidermidis ATCC 12228 em ágar manitol salgado. De modo semelhante aos outros Staphylococcus, S. epidermidis é capaz de crescer em ambiente com grande concentração salina, no entanto, difere-se de S. aureus por não provocar fermentação do D-manitol (STOAKES et al., 2006).
Figura 5 - Cultivo de S. epidermidis ATCC 12228 em ágar manitol salgado. (Fonte: autoria própria).
2.3.3 Pseudomonas aeruginosa
provocada pela produção de piocianina e pioverdina (BREIDENSTEIN; DE LA FUENTE-NÚÑEZ; HANCOCK, 2011).
Figura 6 - Cultivo de P. aeruginosa ATCC 27853 em ágar cetrimida. (Fonte: autoria própria).
2.3.4 Candida albicans
C. albicans é a espécie mais estudada do gênero e apresenta todo seu genoma
sequenciado. Adicionalmente, essa espécie é a mais prevalente em infecções. Em condições normais, C. albicans é predominantemente encontrada na mucosa gastrointestinal. Nas mucosas, este fungo tem seu crescimento controlado pela microbiota residente, sistema imune inato e pelas barreiras epiteliais (GOW; HUBE, 2012).
Até o início da década de 90, C. albicans ainda era a espécie mais isolada de infecções causadas por Candida spp, sendo responsável por cerca de 80% dos casos (FIDEL; VAZQUEZ; SOBEL, 1999). Desde o início dos anos 2000, as espécies de Candida não-C.albicans vem ganhando mais destaque nos estudos clínicos (KRCMERY; BARNES, 2002), visto que os estudos apresentam uma redução de infecções por C. albicans para cerca de 40% conforme a população avaliada e sítios de infecção (KRCMERY; BARNES, 2002). Deste modo, sabe-se que é importante o estudo de outras espécies diferentes de Candida devido ao elevado índice de mortalidade em casos de candidemia e maior padrão de resistência a antifúngico.
rugosa e C. guilliermondii vem sendo cada vez mais estudadas e novas espécies sendo descobertas (TAVANTI et al., 2005).
2.3.5 Candida parapsilosis
Apesar de C. albicans continuar sendo a espécie mais isolada dentre as demais do gênero, C. parapsilosis tem sido a segunda mais encontrada em isolados sanguíneos de indivíduos da América Latina e Ásia (TAVANTI et al., 2005).
Estudos vêm demonstrando que esta espécie é a mais heterogênea geneticamente dentro do gênero. A espécie vem sendo aos poucos identificada como complexo Candida parapsilosis, em que existem três grupos distintos: o grupo I (C. parapsilosis), grupo II (C. orthopsilosis) e grupo III (C. metapsilosis). A nomenclatura do grupo foi feita por analogia aos compostos químicos aromáticos. Visto que já existia a espécie com prefixo -para, as demais foram nomeadas -ortho e -meta. Clinicamente esta nova nomenclatura ainda não está sendo levada em consideração, porém, à medida que o número de casos de pacientes infectados pelas novas espécies se aproximar dos casos de infecções por C. parapsilosis, espera-se que as diferentes espécies sejam levadas em consideração, visto que a diversidade genética influencia nos parâmetros de virulência e resistência (TAVANTI et al., 2005).
2.3.6 Candida tropicalis
Candida tropicalis é uma espécie frequentemente encontrada em pacientes
2.3.7 Candida krusei
Candida krusei é uma espécie emergente que tem ganhado relevância em casos
de infecções em pacientes leucêmicos e transplantados, em sua maioria, associadas ao uso de Fluconazol como profilaxia, sendo raras em pacientes cirurgiados e neonatos. Sabe-se ainda que cerca de 30% das cepas reportadas como resistentes aos azólicos, são resistentes a Anfotericina B (KRCMERY; BARNES, 2002). Dentre as demais espécies mais prevalentes de Candida, suas características macroscópicas são diferenciadas especialmente pelo aspecto rugoso das colônias, além disso, em meio cromogênico CHROMagar as colônias apresentam coloração rosa claro (Figura 7).
2.3.8 Candida glabrata
Dentre o gênero Candida, a espécie C. glabrata é a única espécie das mais estudadas que não forma pseudo-hifas em temperaturas acima de 37ºC. Seus blastoconídeos são considerados menores que os de C. albicans e suas colônias em ágar Saboraud Dextrose são semelhantes, de modo que a diferenciação macroscópica pode ser auxiliada pelo semeio em CHROMagar Candida, em que o crescimento de C. glabrata tem coloração rosa escuro (Figura 5) (FIDEL; VAZQUEZ; SOBEL, 1999).
No âmbito hospitalar esta espécie vem se tornando relevante devido ao crescente número de infecções proporcionadas pela diminuída sensibilidade aos antifúngicos azólicos (FIDEL; VAZQUEZ; SOBEL, 1999).
2.4SISTEMAS EMULSIONADOS
As emulsões podem ser definidas como sistemas constituídos da mistura de, no mínimo, dois líquidos imiscíveis, um disperso no interior de outro, formando gotículas de aproximadamente 1µm relativamente estabilizadas pela presença de um sistema tensoativo. Estes sistemas são utilizados para diversas finalidades, dentre elas para produção de cosméticos, alimentos, sistemas contendo imunobiológicos e fármacos insolúveis (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999).
Os tensoativos são substâncias anfifílicas que interagem com as fases interna e externa diminuindo a tensão interfacial entre os líquidos, favorecendo a emulsificação e melhorando a estabilização do sistema (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999). Usualmente a quantidade de tensoativos utilizada para gerar emulsões varia de 1 a 10 %. Como consequência dos componentes deste sistema e da estabilização gerada pelos tensoativos, o comportamento de fases deste tipo de sistema disperso é de extrema importância. Este comportamento de fases é uma propriedade relativa ao equilíbrio termodinâmico que ocorre nos sistemas formados e depende das variáveis relacionadas ao sistema, isto é, natureza dos diferentes componentes, temperatura, pressão e outros (SJÖBLOM, 2006).
As emulsões apresentam-se geralmente como Óleo em Água (O/A), Água em Óleo (A/O) e ainda como Emulsões Múltiplas (O/A/O ou A/O/A) como esquematizado na figura 8 (FERRARI et al., 2008). Do mesmo modo que outros coloides, as emulsões exibem propriedades características do grupo: movimento Browniano, transição de fases reversível que pode ser gerada por forte alteração na interação das gotículas e ainda transições de fase irreversíveis levando a desestabilização e colapso do sistema (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999). Relativo à sua formação e estabilidade, sabe-se também que, as emulsões possuem melhor estabilidade quando a mistura de tensoativos atinge o equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL) requerido pela fase oleosa da emulsão usada no sistema (GRIFFIN, 1949; FERREIRA et al., 2010).
Figura 8 - Esquema dos diferentes tipos de emulsão, O/A (A), A/O/A (B), A/O (C) e O/A/O (D). (Fonte: autoria própria)
Os parâmetros de tamanho de gotícula, distribuição das populações de gotículas, EHL e o potencial zeta são essenciais para a formulação de uma emulsão estável. Além destes, pH e condutividade podem ser utilizados objetivando auxiliar na identificação do tipo de sistema obtido. Quando estes parâmetros não são bem estudados e aplicados a emulsão pode não vir a ser formada ou pode se desestabilizar com maior facilidade devido a uma série de fenômenos (BIBETTE; CALDERON; POULIN, 1999).
As emulsões estão sujeitas a fenômenos como cremagem, floculação, coalescência, separação de fases e pontes de Ostwald podem ocorrer nesses sistemas. A cremagem ocorre quando constituintes da emulsão sedimentam ou flutuam, levando a formação de uma porção mais opaca e cremosa na superfície do sistema, isto pode ocorrer devido a grandes diferenças de densidade dos componentes (ROLAND et al., 2003). No fenômeno de floculação, gotículas se aproximam formando agregados, porém estas são separadas por uma fina camada de constituintes da fase externa. A coalescência é caracterizada por grandes distribuições de tamanhos de gotícula devido à fusão das gotículas inicialmente formadas (ROLAND et al., 2003). No processo de instabilidade por pontes de Ostwald, pequenas gotículas com restrita solubilidade na fase externa tendem a se agregar a maiores gotículas, levando ao aumento das mesmas. Por fim, a separação de fases ocorre quando não é possível reverter o quadro de instabilidade do sistema (ROLAND et al., 2003).
Os sistemas emulsionados tornam-se alternativas viáveis como sistemas de liberação de óleos naturais, visto que quando administrados in natura estes apresentam problemas de espalhabilidade, biodisponibilidade, além de odor e sabor muitas vezes desagradáveis (XAVIER-JÚNIOR et al., 2012).
3 OBJETIVOS
3.1OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antimicrobiana de emulsões contendo óleo de rã- touro e óleos de copaíba (óleo-resina e essencial) frente a leveduras e bactérias.
3.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter óleo essencial de copaíba a partir de extração do óleo-resina;
Realizar a caracterização química dos óleos do estudo através de Cromatografia Gasosa acoplada a detector de Espectroscopia de Massa;
Obter sistemas emulsionados a base de óleo de rã-touro e óleos resina e essencial de copaíba;
Realizar testes de triagem microbiológica dos sistemas e dos óleos puros frente a diferentes cepas clínicas e de referência da American Type Culture Collection (ATCC), dentre elas, leveduras oportunistas, bactérias negativas e gram-positivas;
Conhecer a Concentração Inibitória Mínima dos sistemas que apresentarem atividade na triagem microbiológica;
Identificar as frações e compostos antimicrobianos dos óleos de copaíba e de rã-touro através de Bioautografia e CG-EM;
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1MATERIAIS
4.1.1 Substâncias químicas
O óleo de copaíba (Copaifera langsdorffii) foi adquirido pela Flores & Ervas (Piracicaba, SP, Brasil), o óleo de rã-touro foi doado pela Asmarana Produtos Naturais (Natal, RN, Brasil), o Span 80® (sorbitan 80 monooleate) foi adquirido da Sigma Aldrich Inc (St Louis, MO, USA), Tween 20® (polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate) pela VETEC (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Os meios de cultura: Ágar Mueller-Hinton, Ágar Saboraud Dextrose, Caldo BHI (Brain Heart Infusion) e Caldo Mueller Hinton foram obtidos da Himedia (Mumbai, MU, India). Todos os reagentes utilizados foram de grau farmacêutico.
4.1.2 Micro-organismos
4.2MÉTODOS
4.2.1 Extração do óleo essencial de copaíba
O óleo-resina de copaíba foi submetido à hidrodestilação com água deionizada por um período de 4 horas a 100 ºC utilizando o Clevenger. O óleo essencial obtido após extração foi seco com sulfato de sódio anidro e filtrado com uma membrana porosa (GALVÃO et al., 2012). Além do óleo essencial foi obtida fração resinosa remanescente do processo de hidrodestilação.
4.2.2 Análise da composição química dos óleos
As amostras de óleo-resina de copaíba, óleo essencial de copaíba e óleo de rã-touro foram submetidas à análise de sua composição. Adicionalmente, foram realizadas análises das amostras metiladas, objetivando a melhor investigação dos componentes dos óleos, visto que o processo facilita a melhor separação e volatilização dos componentes que possuem ácidos carboxílicos. A derivatização das amostras foi realizada através de um processo utilizando diazometano, em que os óleos a serem derivatizados foram diluídos em acetato de etila, seguido da adição do diazometano e posterior evaporação, obtendo assim a amostra metilada.
As análises foram realizadas em um cromatógrafo à gás Hewlett-Packard 6890 acoplado a detector seletivo de massas HP-5975 (CG-EM). A coluna utilizada para realização das análises foi a HP-5MS capilar (30 m x 0.25 mm x 0,25 µm). Para a amostra de óleo essencial de copaíba as condições cromatográficas foram as seguintes: a temperatura inicial da coluna foi de 60 ºC, com posterior aquecimento de 3 ºC/min até 240 ºC mantendo essa temperatura por 7 min. As temperaturas do Detector e Injetor foram 250 ºC e 220 ºC, respectivamente. As condições para as demais amostras foram: temperatura inicial da coluna: 110 ºC, seguido de aquecimento de 5 ºC/min até 280 ºC (26 min). Temperaturas do detector e injetor foram 300 ºC e 250 ºC, respectivamente. O volume injetado de cada amostra foi de 1 µL e a vazão do gás de arraste (Hélio super seco) foi 1,0 mL/min, independente do método.
respectivos índices de retenção com a literatura. A determinação quantitativa foi baseada na área dos picos analisados.
4.2.3 Preparo e caracterização das emulsões
Foram preparadas três emulsões distintas conforme desenvolvidas a partir de estudos anteriores, em que a fase oleosa foi óleo-resina de copaíba, óleo essencial de copaíba e óleo de rã-touro. As emulsões óleo em água continham a seguinte formulação: 5 % (p/p) de óleo, 93 % (p/p) de água, 1,56 % (p/p) de Tween 20® e 0,44 % (p/p) de Span 80® (XAVIER-JÚNIOR et al., 2012). Os sistemas foram preparados conforme a técnica de inversão de Fases (YU et al., 1993). A quantidade requerida de Span 80® foi dispersa na fase oleosa. Enquanto que o Tween 20® foi disperso na fase aquosa. As fases foram aquecidas separadamente a 70 ºC e em seguida, para formação do sistema, e em seguida foram homogeneizadas utilizando Ultra-Turrax® T 25 (IKA, Staufen, Germany) a 13.000 rpm por 10 minutos.
Após um período de 24 horas do preparo das amostras, as análises de propriedades físico-químicas foram realizadas à temperatura de 25 ± 2 °C. O pH foi mensurado utilizando um pHmetro PG-2000 (GEHAKA, Morumbi, SP, Brasil). A condutividade elétrica foi avaliada utilizando um condutivímetro DM-32 (Digicrom Analytical, Campo Grande, SP, Brasil). Adicionalmente, as amostras foram diluídas em água deionizada numa proporção de 1:100 e foram avaliadas as medidas de tamanho de gotícula, polidispersividade e potencial zeta utilizando um ZetaPlus (Holtsville, NY, USA).
4.2.4 Triagem antimicrobiana
por poço fosse equivalente a dos discos padronizados (CLSI, 2009b; a). As emulsões somente foram avaliadas na investigação da concentração inibitória mínima após a determinação dos resultados desta triagem. As bactérias utilizadas tiveram crescimento prévio de 24 h em ágar BHI e as leveduras de 48 h em ágar Saboraud Dextrose.
A avaliação inicial da atividade antibacteriana e antifúngica foi realizada utilizando a adaptação para poços do teste de susceptibilidade com Agar Muller-Hinton para bactérias e Ágar Mueller-Hinton + Glicose 2% e 0,5 µg/mL de Azul de metileno para as leveduras (CLSI, 2009b; a). Uma quantidade de 20 µL de cada amostra foi adicionada aos poços no ágar após o semeio dos micro-organismos. O experimento em triplicata foi repetido três vezes a fim de garantir a confiabilidade dos resultados. As placas foram incubadas a 35 ± 2 ºC por 24 h e 48 h para as bactérias e fungos, respectivamente. A avaliação foi feita pela medição dos halos de inibição, considerando a medida inicial a partir de 5 mm, visto que esse é o diâmetro do poço.
4.2.5 Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A determinação da CIM foi realizada após a triagem dos micro-organismos com os óleos diluídos em DMSO a 1 % e as emulsões contendo estes óleos. O procedimento com os óleos e emulsões de copaíba foi feito com os micro-organismos que se demonstraram sensíveis na triagem, enquanto para as amostras de rã-touro foi determinada a CIM frente aos micro-organismos de referência (ATCC). As bactérias utilizadas tiveram crescimento prévio de 24 h em ágar BHI e as leveduras de 48 h em ágar Saboraud Dextrose.
4.2.6 Bioautografia
Para a realização da bioautografia, somente foram utilizados o óleo de rã e o óleo-resina de copaíba frente aos seguintes micro-organismos: S. aureus ATCC 29213, S. epidermidis ATCC 12228, P. aeruginosa ATCC 27853, C. albicans ATCC 90027, C. parapsilosis ATCC 22019, C. glabrata ATCC 2001, C. krusei ATCC 6258 e C. tropicalis ATCC 13803. As bactérias utilizadas tiveram crescimento prévio de 24h em ágar BHI e as leveduras de 48h em ágar Saboraud Dextrose.
Foram realizadas cromatografias de camada delgada (CCDs) utilizando placas de HPTLC (High performance thin layer chromatography) com uma mistura de hexano/acetato de etila (9:1), como fase móvel. As amostras de óleo (copaíba e rã-touro) foram diluídas em metanol (2:8) e aplicadas com capilares na placa cromatográfica.
A corrida cromatográfica foi de 5,0 cm, realizada com revelação por vanilina sulfúrica em estufa a 100 ºC por 5 min (Placa 1). Este revelador foi preparado conforme padrões farmacopéicos (ANVISA, 2010). Posteriormente, esta cromatografia foi replicada para cada micro-organismo, onde foram introduzidas em placas de Petri estéreis e colocadas em contato com o meio de cultura contendo a cepa em estudo (Placas 2), uma terceira CCD foi realizada para extrair os compostos das bandas cromatográficas , seguindo a caracterização por CG-MS da fração que apresentou atividade (Placas 3).
O procedimento de bioautografia foi realizado conforme seguinte metodologia: Em tubos cônicos (Falcon) de 50 mL foram preparados os inóculos conforme escala de turvação 0,5 de McFarland em ágar fundido estéril a temperatura de aproximadamente 50 ºC. As bactérias foram inoculadas em ágar Mueller-Hinton, enquanto as leveduras foram inoculadas em ágar Mueller-Hinton acrescido de glicose 2 % e azul de metileno 0,5 µg/mL, conforme recomendação do CLSI para teste de sensibilidade (CLSI, 2009b; a).
Depois de inocular cada micro-organismo com as placas de CCD (Placas 2) houve incubação a 35 ºC por 24 h para bactérias e 48 h para as leveduras.
das áreas de inibição das placas 3, com o mesmo valor de Rf das placas 2, foram raspadas para cada micro-organismo. Para extração dos componentes do óleo, foi pesado 20 mg das amostras em sílica e foi adicionado 1,0 mL de acetato de etila seguido de 25 minutos de agitação em banho de ultrassom e filtração. Posteriormente, estas frações antimicrobianas foram submetidas a análises em Cromatografia Gasosa acoplada a detector de Espectrometria de Massas (CG-EM), conforme metodologia no tópico 4.2.2.
4.2.7 Atividade antibiofilme
Os mesmos micro-organismos submetidos a analise da CIM foram analisados na avaliação da atividade antibiofilme frente aos óleos e emulsões previamente utilizados no teste de determinação da CIM. As cepas foram inoculadas em Caldo Mueller-Hinton e ajustadas conforme escala 0,5 McFarland. As amostras foram diluídas em Caldo Mueller-Hinton nos poços (12,5 %) e em seguida as suspensões de micro-organismos foram adicionadas. As microplacas foram incubadas a 35 ± 2ºC em agitador horizontal a 150 rpm por 24 h e 48 h para as bactérias e leveduras, respectivamente. Em seguida, o sobrenadante dos poços foi removido e os poços lavados com água estéril para remoção dos micro-organismos não aderidos. O conteúdo de micro-organismos aderidos foi corado com 200 µL de cristal violeta por 20 minutos. As placas foram lavadas com água corrente estéril e deixadas para secar, posteriormente, foram adicionados 200 µL de etanol PA e a Densidade Óptica foi medida em um leitor de ELISA (BioTek, µQuant) a 570 nm. Cetoconazol 2,5 mg/mL e Cloranfenicol 1,5 mg/mL foram utilizados como antimicrobianos de referência para fungos e bactérias, respectivamente.
4.2.8 Análises estatísticas
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS
O óleo essencial de copaíba extraído pelo método de hidrodestilação apresentou um rendimento de aproximadamente 10% em relação ao óleo-resina utilizado para extração, indicando que a fração volátil compõe uma parcela do óleo de copaíba. O percentual de óleo essencial obtido a partir do óleo-resina foi superior ao encontrado em outro estudo desta mesma espécie (Copaifera langsdorffii), em que o rendimento foi de aproximadamente 7,3% (GRAMOSA; SILVEIRA, 2005). Sendo assim, esse resultado nos permite sugerir que os parâmetros utilizados na metodologia de extração foram significantes para obtenção de um bom rendimento na extração do óleo essencial a partir de óleo-resina de copaíba.
As análises dos óleos de copaíba demonstraram que os compostos terpênicos presentes apresentam menor tempo de retenção no óleo-resina de copaíba, quando comparados aos mesmos compostos no óleo essencial de copaíba (Figura 9), de modo que pode ser observado um deslocamento de todos os picos para a direita. Estes picos característicos dos compostos terpênicos podem ser observados em diversos estudos que analisaram a constituição química de óleos de copaíba (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002; BARRETO JÚNIOR et al., 2005).
Figura 9 - Cromatograma obtido por CG-EM. A: resina de copaíba; B: óleo-resina de copaíba metilado; C: óleo essencial de copaíba; D: óleo essencial de copaíba metilado; E: fração resina metilada do óleo de copaíba obtido como resíduo da extração de óleo essencial. (Fonte: autoria própria).
2006). Assim, a metilação mostrou-se de grande utilidade na investigação de diterpenos ácidos, assim como ácidos graxos.
Conforme observado após a metilação do óleo de copaíba e da fração resinosa, permitiu-se a formação de dois grupos de picos cromatográficos, visto que após a metilação, é possível detectar com mais facilidade os terpenos ácidos, responsáveis pelo segundo grupo de picos cromatográficos (Figuras 9).
Conforme demonstrado, o óleo de copaíba exibiu o primeiro grupo de picos no intervalo de 7 a 14 minutos e o segundo grupo entre 21 a 30 minutos (Figura 9). Estas faixas de tempo entram em concordância com o que está descrito para o óleo de copaíba em estudos de revisão deste gênero, ressalvando pequenas variações que podem ser ocasionalmente geradas pela diferença de espécies, conservação da amostra, do processo de extração ou ainda do equipamento (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002).
Por outro lado, o óleo essencial metilado não apresentou o mesmo comportamento das amostras anteriores (Figura 9). Sabendo-se que o óleo essencial contém principalmente hidrocarbonetos terpênicos, não há a evidente formação de um segundo grupo de picos cromatográficos. Em contrapartida, o resíduo resinoso obtido após extração do óleo essencial, apresenta poucos compostos sesquiterpênicos restantes e maior quantidade de terpenos ácidos (segundo grupo de picos) (Figura 9).
As análises dos cromatogramas do óleo-resina de copaíba sugerem que o -bisaboleno foi o composto majoritário identificado. Essa informação pode ser melhor visualizada na Tabela 1, que demonstra além do composto majoritário, outros componentes. O -cariofileno e α-bermagoteno são os outros componentes que demonstram apresentar maior percentual. A porção resinosa obtida como resíduo após extração do óleo essencial apresentou menor quantidade de componentes sesquiterpênicos que o óleo-resina e o óleo essencial, além disso, outros componentes não se mostraram mais presentes, conforme exibido na Tabela 1.
Tabela 1 - Porcentagem dos compostos terpênicos majoritários das amostras de Copaíba (Copaifera langsdorffii).
TR (min): Tempo de retenção em minutos; OC: Óleo de copaíba; mOC: Óleo de copaíba metilado; mRC: Fração resina de copaíba metilada; OEC: Óleo essencial de Copaíba; mOEC: Óleo essencial de copaíba metilado.
Nascimento et al (2012) realizaram um estudo da composição química de diferentes amostras de óleos essenciais de Copaifera langsdorffii extraídos das folhas,
Composição química TR
(min) OC mOC mRC
TR
(min) OEC mOEC
δ-elemeno 6,90 0,37 0,15 - 21,17 0,63 0,47 (+)-ciclosativeno 7,52 0,45 0,16 - 22,31 0,67 0,45
α-copaeno 7,66 0,93 0,35 0,06 22,76 1,39 1,08
β-elemeno 7,92 1,44 0,61 0,17 23,46 2,41 1,93
β-cariofileno 8,57 18,30 7,72 2,34 24,62 21,68 21,14
α-bergamoteno 8,74 15,61 6,97 2,26 25,29 20,53 18,90
α-guaieno 8,83 1,17 0,51 0,20 25,38 0,88 0,95
β-farneseno 9,03 1,61 0,75 0,30 26,11 1,56 1,66
α-cariofileno 9,22 2,80 1,25 0,53 25,95 2,85 2,82
τ-muuroleno 9,60 0,82 0,38 0,20 26,88 0,53 0,50
β-cubebeno 9,75 4,83 2,25 0,99 27,06 1,72 3,12
β-selineno 9,88 4,34 2,03 1,10 27,27 6,16 5,55
α-selineno - - - - 27,62 2,31 2,62
τ-gurjeneno - - - - 27,78 0,89 0,56
β-camigreno 10,04 5,63 2,72 1,52 - - -
β-bisaboleno 10,21 24,76 12,13 7,14 28,24 23,67 24,26
β-sesquifelandreno 10,55 2,44 1,19 0,82 - - -
α-curcumeno 12,29 0,35 0,17 0,20 - - -
α-cedreno 12,85 0,53 0,07 0,08 - - -
β-cedreno - - - - 28,76 1,40 2,12
α-himacaleno 13,01 1,74 - - 33,39 0,46 0,43
para obter este componente volátil. Pode ser observado que não há uma manutenção nas proporções dos componentes no óleo essencial quando se compara as diferentes fontes de obtenção do mesmo. Outros estudos com a espécie C. langsdorffii demonstraram concordância na presença da maioria dos componentes aqui apresentados, porém, foram observadas algumas divergências em relação aos componentes majoritários, estas podem ter sido apresentadas em decorrência da origem da amostra, data e condições climáticas na época de extração deste óleo-resina (GELMINI et al., 2013).
O cromatograma do óleo de rã-touro apresentou poucos picos bem definidos, mostrando a prevalência de poucos compostos isolados (Figura 10), evidenciando que a análise direta de ácidos graxos não possibilita uma boa resolução de picos e separação ideal dos componentes.
Figura 10 - Cromatograma obtido por CG-EM. A: óleo de touro; B: óleo de rã-touro metilado. (Fonte: autoria própria).
O processo de metilação o qual foi submetido o óleo rã-touro propiciou a melhor separação dos picos, bem como revelou a presença de ácidos graxos em sua forma esterificada que não haviam sido identificados anteriormente (Figura 10).
Na tabela abaixo é possível observar que o monooleato de glicerila apresenta-se como composto majoritário das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw). Após processo de metilação da amostra, componentes esterificados com a adição de grupamento metila foram encontrados, dentre eles, palmitoleato de metila, palmitato de metila, linoleato de metila e oleato de metila. Conforme mencionado anteriormente, estes ésteres encontrados após metilação correspondem aos ácidos graxos presentes no óleo de rã-touro.
Tabela 2 - Porcentagem dos compostos majoritários das amostras de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)
Composição química TR (min) OR mOR
Palmitoleato de metila 18,25 - 2,23
Palmitato de metila 18,65 - 5,87
Linoleato de metila 21,84 - 4,79
Oleato de metila 21,94 - 9,26
1,2-dipalmitoil de glicerol 25,32 15,31 - Monooleato de glicerila 28,22 55,08 7,59
TR (min): Tempo de retenção em minutos; OR: Óleo de touro; mOR: Óleo de rã-touro metilado.
Estes resultados também se encontram em conformidade com o que foi observado por Lopes et al. (2010), que realizaram diferentes metodologias de extração de óleo de rã-touro e também observou a predominância dos ácidos oléico, linoléico e palmítico através da presença de seus ésteres.
5.2PRODUÇÃO DOS SISTEMAS EMULSIONADOS
todas os sistemas foi cerca de 0,2 µm, assim como apresentaram baixa polidispersividade, indicando que durante a produção destes sistemas são formadas poucas populações de tamanhos distintos.
As análises de potencial zeta demonstraram valores distintos para os sistemas, conforme mostrados na Tabela 3. Esta variação aconteceu, provavelmente, devido a variação da composição dos óleos. O potencial zeta da emulsão de oleo de rã (- 11,86 ± 1,99) pode ser modificado através da adição de sais para que este esteja conferindo a estabilidade adequada à formulação final.
Tabela 3 - Caracterização físico-química das emulsões
EOC EOEC EOR
pH 3,40 3,48 3,22
Condutividade (µS) 187,51 226,20 220,30 Tamanho (µm) 0,20 ± 0,00 0,28 ± 0,01 0,26 ± 0,00 Polidispersividade 0,24 ± 0,01 0,14 ± 0,02 0,27 ± 0,01 Potencial Zeta - 34,37 ± 2,50 - 27,08 ± 0,89 - 11,86 ± 1,99
EOC: Emulsão de óleo-resina de copaíba; EOEC: Emulsão de óleo essencial de copaíba; EOR: Emulsão de óleo de rã-touro.
5.3TRIAGEM MICROBIOLÓGICA
As análises microbiológicas realizadas para verificar se as amostras de óleo de copaíba apresentavam atividade antibacteriana frente às linhagens descritas demonstraram que cerca de 44 % das cepas estudadas foram inibidas por algumas das amostras de óleo de copaíba (Tabela 4). Os ensaios para testar o efeito antifúngico dos óleos de copaíba demostraram ação de inibição frente a 40 % das leveduras testadas, sendo as cepas de C. glabrata e C. krusei clínicas e ATCC as que se demonstraram mais sensíveis (Tabela 5).
demonstram halos de inibição em torno de 7,0 mm para cepa de S. aureus, assemelhando aos nossos resultados obtidos pelos óleos da espécie C. langsdorffii, em que o óleo-resina exibiu halo de inibição de 6,22 mm e o óleo essencial provocou inibição em torno de 9,0 mm para a cepa em questão (MENDONÇA; ONOFRE, 2009).
Tabela 4 - Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antibacteriana
(-): Não houve inibição; OC: Óleo de copaíba; RC: Fração resina de copaíba; OEC: Óleo essencial de copaíba; OR: Óleo de rã-touro; Clor: Cloranfenicol 1,5 µg/mL.
Os ensaios de triagem para testar atividade antimicrobiana com óleo de rã-touro não demonstraram nenhuma atividade significante. Contudo, os dados encontrados podem nortear futuras pesquisas com esse óleo. Além disso, estudos baseados nos testes de sensibilidade por difusão em ágar não são conclusivos, visto que são requeridos testes posteriores de maior sensibilidade a fim de obter a confirmação dos dados obtidos (OSTROSKY et al., 2008).
Embora a ação do óleo de rã-touro seja pouco investigada, estudos já avaliaram a ação antimicrobiana de peptídeos obtidos da rã-touro (Rana catesbeiana). Sabe-se que estes peptídeos foram isolados do estômago do anfíbio e em seguida foram quimicamente modificados. Além disso, a estrutura destes peptídeos serviu de base para a construção de peptídeos sintéticos. Estes compostos purificados e concentrados
Micro-organismos OC RC OEC OR Clor
S. aureus ATCC
29213 6,66 ± 1,32 6,00 ± 1,50 9,88 ± 2,14 - 27,78 ± 2,04
S. aureus AC1 - - - - 22,11 ± 2,31
S. aureusAC2 - - - - 22,44 ± 2,06
S. epidermidis
ATCC 12228 5,44 ± 0,72 5,44 ± 0,72 14,00 ± 2,39 - 35,11 ± 3,68 S. epidermidis
AC1 - - 11,89 ± 1,96 - 27,89 ± 3,14
S. epidermidis
AC2 - - 13,11 ± 3,14 - 24,44 ± 6,34
P. aeruginosa
ATCC 27853 - - - - 5,11 ± 0,33
P. aeruginosa
AC1 - - - - 15,78 ± 2,77
P. aeruginosa
exibiram atividade frente a cepas de Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Escherichia coli, além de fungos como Candida albicans e Cryptococcus neoformans (MINN; KIM; KIM, 1998).
Tabela 5 - Medidas dos halos de inibição (mm) da triagem antifúngica
Micro-organismos OC RC OEC OR Cet AnfB
C. albicans ATCC
90027 - - - - 38,11 ± 2,61 20,89 ± 1,69
C. albicans 14 (AC) - - - - 40,00 ± 2,55 21,78 ± 3,63
C. glabrata ATCC
2001 6,33 ± 2,06 - 12,89 ± 6,03 - 28,33 ± 2,50 20,44 ± 2,45 C. glabrata 15V3C
(AC) - - 9,88 ± 0,78 - 28,11 ± 2,08 21,89 ± 3,48 C. krusei ATCC 6258 - - 13,67 ± 3,42 - 24,67 ± 2,87 17,00 ± 3,50
C. krusei LMM54
(AC) - - 13,78 ± 3,23 - 24,22 ± 4,35 18,33 ± 2,17 C. parapsilosis ATCC
22019 - - - - 24,22 ± 4,38 25,00 ± 1,73
C. parapsilosis 73
(AC) - - - - 29,78 ± 2,02 18,56 ± 1,94
C. tropicalis ATCC
13803 - - - - 29,56 ± 1,33 17,00 ±1,11
C. tropicalis 67A (AC) - - - - 43,56 ± 3,90 25,00 ± 3,84
(-): Não houve inibição; OC: Óleo de copaíba; RC: Fração resina de copaíba; OEC: Óleo essencial de copaíba; OR: Óleo de rã-touro; Cet: Cetoconazol 2,5 µg/mL; AnfB: Anfotericina B 5 µg/mL.
Os ensaios com os óleos vegetais descritos no trabalho apresentaram resultados diferentes. Esse comportamento pode estar associado a sua composição diferenciada, conforme descrito em alguns estudos (SANTOS et al., 2008). Em seu estudo, foi realizada uma triagem microbiológica com poucos micro-organismos frente a diferentes óleos-resina obtidos de várias espécies de copaíba. A partir desta triagem foi observado que independente da composição química e das variadas espécies os óleos de copaíba foram mais ativos frente aos micro-organismos gram positivos, em concordância com os resultados obtidos neste estudo.
