UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIACAMPUS DE ARAÇATUBA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
Cryptosporidium
spp. EM BEZERROS BUBALINOS DO ESTADO DE SÃO
PAULO, SP
Monally Conceição Costa de Aquino
Médica Veterinária
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIACAMPUS DE ARAÇATUBA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
Cryptosporidium
spp. EM BEZERROS BUBALINOS DO ESTADO DE SÃO
PAULO, SP
Monally Conceição Costa de Aquino
Orientadora: Prof. Adj. Katia Denise Saraiva Bresciani
Co-orientador: Prof. Adj. Marcelo Vasconcelos Meireles
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba – Unesp, Campus de Araçatuba, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal).
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
“Even the smallest person can change the course of the future”
Aos meus pais, Suelange e Aquino, pela dedicação e incentivo constantes.
À minha amada avó (in memorian), pelo amor mais puro que já conheci.
Ao meu querido esposo, Rafael,por me apoiar em todas as decisões.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser uma presença constante em minha vida, dando-me forças para superar momentos de dificuldades e inspirando-me na busca dos meus sonhos.
Aos meus queridos pais, pelo amor, educação e esforço contínuo em me tornar uma pessoa melhor.
Aos meus adorados irmãos, pela amizade e convívio.
Ao meu amado esposo, meu porto seguro, por me amar e cuidar de mim, pela amizade, cumplicidade e por me incentivar na busca desse título.
À minha grande amiga Amanda, mesmo tão longe está sempre presente, participando e torcendo pelo meu sucesso.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, pela oportunidade oferecida para a realização do curso de Mestrado.
À minha querida orientadora, Prof.ª Katia Bresciani, pela dedicação, por ser um exemplo de humildade e competência, sempre de bom humor e com pensamento positivo. Agradeço pela oportunidade, por acreditar e confiar em mim.
Ao meu co-orientador, Prof. Marcelo Vasconcelos Meireles, pelos ensinamentos, paciência, colaboração e por permitir a utilização do Laboratório de Ornitopatologia durante o desenvolvimento dessa pesquisa.
À professora Suely, minha figura materna em Araçatuba, sempre ajudando a solucionar os problemas de todos os “seus filhos”, sou grata pelo carinho, dedicação e amizade oferecidos durante todo esse tempo.
Aos colegas e colaboradores dessa pesquisa: Anaiza Simão Zucatto (grande companheira de PCR), Milena Araúz Viol, Sandra Valéria Inácio, Alex Nakamura e Willian Marinho pelo apoio e o bom trabalho desenvolvido.
Ao amigo Marquinhos, sempre muito prestativo, obrigada pela ajuda durante a edição final da dissertação.
Ao laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, na pessoa da técnica Dra. Agda Facincani, que realizou o sequenciamento das amostras com rapidez, organização e pontualidade.
Ao amigo Bruno Fermino, que pacientemente me ajudou na análise das sequências de nucleotídeos.
À Prof.ª Caris Maroni Nunes, Prof. Carlos Noriyuki Kaneto, Prof. Jancarlo Ferreira e Prof.ª Suely Regina Mogami Bomfim, por participarem da minha banca de qualificação e defesa, colaborando imensamente com sugestões e auxiliando na correção do artigo científico.
À Prof.ª Sílvia Perri pela realização da análise estatística, pela paciência e boa vontade.
Aos estagiários do Laboratório de Parasitologia, André Aguirre, Fernando Corona e Edvânia Nunes pelo auxílio no processamento das amostras.
Aos Produtores Rurais de Alambari, SP, pela generosidade em colaborar com a realização dessa pesquisa.
A todos os amigos que fiz durante essa caminhada, com os quais compartilhei momentos de alegrias e descontração.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado durante o primeiro ano do curso.
À FAPESP, pela concessão do auxílio financeiro (processo número 2010/52542-3) e pela bolsa de Mestrado (processo número 2010/13146-5).
SUMÁRIO
Página
RESUMO ABSTRACT
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS . . . 13
1 INTRODUÇÃO . . . . . . 13
2 REVISÃO DE LITERATURA . . . 15
2.1 Características do agente etiológico . . . 15
2.2 Biologia . . . 16
2.3 Patogenia . . . . . . 17
2.4 Sinais Clínicos . . . 17
2.5 Diagnóstico . . . 18
2.5.1 Métodos parasitológicos diretos . . . 18
2.5.2 Métodos imunológicos . . . 19
2.5.3 Métodos moleculares . . . .. . . 19
2.6 Criptosporidiose em bubalinos . . . 20
3 OBJETIVO . . . 22
REFERÊNCIAS . . . 23
CAPÍTULO 2 – OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptosporidium EM BEZERROS BUBALINOS NO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL. . . 35
RESUMO 1 INTRODUÇÃO . . . 36
2 MATERIAL E MÉTODO . . . 37
2.1 Colheita das amostras . . . 37
2.3 Extração de DNA genômico . . . 38
2.4 Caracterização molecular. . . . 38
2.5 Análise filogenética. . . . 40
2.6 Análise estatística. . . 40
3 RESULTADOS . . . 40
4 DISCUSSÃO . . . 43
5 CONCLUSÃO . . . 45
APÊNDICE
APÊNDICE A- Árvore filogenética de sequências do gene 18S rRNA identificadas neste estudo e de outras espécies ou genótipos de Cryptosporidium disponíveis no GenBank e árvore consenso utilizando o método de agrupamento de vizinhos . . . . 53 APÊNDICE B- Árvore filogenética da sequências do gene da actina
OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptosporidium spp. EM BEZERROS BUBALINOS DO ESTADO DE SÃO PAULO, SP
RESUMO – Com o objetivo de determinar a ocorrência e caracterizar molecularmente a infecção por Cryptosporidium spp. em bezerros bubalinos do Estado de São Paulo, Brasil, foram colhidas 222 amostras fecais de animais da raça Murrah, com até seis meses de idade. As amostras foram avaliadas pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada e por meio da reação em cadeia da polimerase tipo nested (nPCR) para amplificação de fragmentos de DNA da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico e sequenciamento dos fragmentos amplificados. Pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada, foi detectada positividade de 8,1% (18/222), e pela nPCR, foi observada amplificação em 48,2% (107/222) das amostras, das quais 63 foram sequenciadas. A análise das sequências obtidas mostrou que a espécie mais frequente nesses animais foi Cryptosporidium ryanae, em bezerros bubalinos a partir de cinco dias de idade. A espécie zoonótica Cryptosporidium parvum foi detectada em apenas um animal e um genótipo incomum, similar a Cryptosporidium sp. W20486, foi encontrado, pela primeira vez em búfalos.
OCCURRENCE AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF
Cryptosporidium spp. IN BUFFALOES CALVES FROM SÃO PAULO STATE
ABSTRACT – With the aim of determining the occurrence and molecularly characterizing infection by Cryptosporidium spp. in buffalo calves from São Paulo State, Brazil, 222 fecal samples were collected from Murrah animals aged up to six months. The samples were assessed by means of modified Ziehl-Neelsen technique and nested polymerase chain reaction (nPCR) for amplification of DNA fragments from subunit 18S of the gene of ribosomal RNA and sequencing of the amplified fragments. The modified Ziehl-Neelsen technique indicated 8.1% positivity (18/222), while nPCR revealed amplification for 48.2% (107/222) samples, of which 63 were sequenced. The analysis of the obtained sequences showed that the most frequent species in these animals was Cryptosporidium ryanae, present in buffalo calves from five days of age. The zoonotic specie Cryptosporidium parvum was detected in only one animal, and an uncommon genotype, similar to that of Cryptosporidium sp. W20486, was found for the first time in buffaloes.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1 INTRODUÇÃO
Protozoários do gênero Cryptosporidium são parasitos intracelulares obrigatórios que pertencem ao filo Apicomplexa, capazes de parasitar as microvilosidades das células epiteliais do trato gastrintestinal de hospedeiros vertebrados, incluindo o homem (XIAO et al., 2004).
Em relação à sua importância em Saúde Pública, com o surgimento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, na década de 1980, relatos de infecções emergentes foram associados à criptosporidiose e este parasito passou a ser considerado um importante patógeno em seres humanos, estando as infecções mais graves associadas geralmente a situações de imunodeficiência e imunocomprometimento (FAYER, 2010; XIAO; FAYER, 2008).
A criptosporidiose humana é causada, principalmente, por Cryptosporidium hominis e Cryptosporidium parvum (XIAO et al., 2004; SMITH et al., 2006), embora outras espécies com potencial zoonótico, além de C. parvum, já tenham sido identificadas, como C. meleagridis (MCLAUCHLIN et al., 2000; MORGAN et al., 2000), C. canis, C. felis (CAMA et al., 2003;
PEDRAZA-DIAS et al.,2000;PIENIAZECK et al., 1999), C. muris (GATEI et al., 2006; PALMER et al., 2003) C. suis (LEONI et al., 2006; XIAO et al., 2002), C. ubiquitum(ONG et al., 2002) e C. cuniculus (CHALMERS et al., 2009).
A partir de 1990, C. parvum deixou de ser a única espécie capaz de infectar seres humanos, pois com o uso de ferramentas de genotipagem, dois genótipos de C. parvum foram identificados (I e II), e classificados como C. hominis e C. parvum (XIAO et al., 2004).
diversas formas, como por contato direto com pessoas (antroponótica) ou animais (zoonótica) infectados e ingestão de alimentos ou água contaminados (XIAO, 2010).
Infecções humanas são mais frequentes em países em desenvolvimento, afetando particularmente crianças desnutridas (BERRILLI et al., 2012).
Este protozoário ganhou reconhecimento público em 1993, a partir de um surto na cidade de Milwaukee (EUA), que resultou em mais de 400.000 casos suspeitos e 5.000 casos confirmados de criptosporidiose humana (CORSO et al., 2003; MACKENZIE et al., 1994).
Numerosos surtos causados pela contaminação de alimentos ou água (potável ou de recreação) por oocistos de Cryptosporidium já foram relatados em diversos países (SMITH; NICHOLS, 2010). A transmissão dessa infecção por veiculação hídrica é particularmente importante, devido à resistência dos oocistos aos tratamentos convencionais de água e pela capacidade de distribuição em massa à população a partir de água de beber (KARANIS et al., 2007).
Devido à estreita relação deste protozoário com o saneamento básico deficiente e com o baixo poder aquisitivo populacional, Cryptosporidium foi incluído na Iniciativa das Doenças Negligenciadas da Organização Mundial da Saúde (SAVIOLI et al., 2006).
2 REVISÃO DE LITERATURA
Em 1907, Ernest Edward Tyzzer relatou, pela primeira vez, Cryptosporidium muris isolado de glândulas do estômago de camundongos (TYZZER, 1907). Mais tarde, publicou uma descrição mais detalhada do ciclo biológico deste parasito e observou o envolvimento do mesmo organismo no epitélio do intestino delgado de coelhos (TYZZER, 1910) e em camundongos (TYZZER, 1912) e o nomeou C. parvum.
Nos últimos 20 anos, houve uma rápida expansão das pesquisas envolvendo o gênero Cryptosporidium, em grande parte relacionada a estudos moleculares, propiciando a descrição de várias espécies, genótipos e subtipos do parasito (PLUTZER; KARANIS, 2009).
A caracterização molecular de isolados de diferentes origens (animal, humana e ambiental) tem sido amplamente usada para investigar o potencial zoonótico das espécies deste protozoário (XIAO; FAYER, 2008).
2.1 Características do agente etiológico
Quanto à sistemática de Cryptosporidium, a taxonomia do gênero é ainda insatisfatória (PLUTZER; KARANIS, 2009), baseada em algumas características morfológicas, biológicas e bioquímicas, foi observada proximidade com a subclasse Gregarina (CARRENO et al., 1999). A similaridade entre os referidos parasitos inclui o ciclo de vida monoxênico, oocistos com quatro esporozoítos e parede dupla, gamontes extracelulares e localização no trato gastrointestinal do hospedeiro (HIJJAWI et al., 2004).
ordem Eimeriina (com formação de macrogametas e microgametas), Família Cryptosporidiidae (um oocisto com quatro esporozoitos e sem esporocistos) e gênero Cryptosporidium (PLUTZER; KARANIS, 2009).
Atualmente, são descritas mais de 20 espécies e mais de 40 genótipos de Cryptosporidium (XIAO, 2010; FAYER et al., 2010). Alguns desses genótipos foram nomeados espécies quando informações suficientes a respeito de sua morfologia, biologia e características genéticas foram esclarecidas (XIAO; FAYER, 2008).
Algumas características particulares distinguem esse gênero de outros coccídeos, como a localização que ocupam na célula do hospedeiro, a capacidade de autoinfecção e sua resistência a muitos antiparasitários (PLUTZER; KARANIS, 2009).
Oocistos de Cryptosporidium, geralmente, apresentam morfologia subesférica a ovoide, com diâmetro polar e equatorial de 5,0 x 4,5 µm e 4,9 x 5,2 µm para C. parvum e C. hominis, respectivamente (MARTINEZ et al., 2011).
2.2 Biologia
As formas de transmissão documentadas são de animais para o homem, de pessoa para pessoa, ingestão de água potável ou destinada a lazer que são contaminados direta ou indiretamente com resíduos fecais (SMITH et al., 2006).
com formação de macrogametas e microgametas que, após a fecundação, resultam na formação de oocistos. Estes podem ser de parede espessa, que são eliminados nas fezes, ou de parede delgada, que se rompem no intestino delgado e são responsáveis pelos casos de autoinfecção. A esporogonia ocorre no interior do hospedeiro, assim, estas formas evolutivas são imediatamente infectantes quando liberadas no meio ambiente (TZIPORI; GRIFFTHS, 1998; THOMPSON et al., 2008).
Essas formas infectantes são altamente resistentes em condições ambientais e à ação de produtos químicos, o que é atribuído à sua parede, que consiste de uma complexa barreira protetora formada por uma dupla camada de matriz lipoproteica e carboidratos (PLUTZER; KARANIS, 2009; THOMPSON et al., 2008).
2.3 Patogenia
A patogenia e o quadro clínico da doença são influenciados por vários fatores que incluem entre eles espécie do parasito, idade, competência imunológica do indivíduo infectado e a associação com outros patógenos (RADOSTITS et al., 2000).
A infecção por Cryptosporidium causa atrofia, fusão das vilosidades intestinais e inflamação, resultando em perda da superfície absortiva e transporte desequilibrado de nutrientes (THOMPSON et al., 2008).
A diarreia por má absorção resulta da interação entre produtos parasitários, como as proteinases, que rompem a barreira epitelial e a resposta imunológica e inflamatória do hospedeiro (THOMPSON et al., 2008).
2.4 Sinais Clínicos
imunocompetentes (AL-BRAIKEN et al., 2003) e, em pacientes imunocomprometidos, pode se desenvolver a forma crônica da doença, podendo resultar em óbito (ABRAHAMSEN et al., 2004).
Em muitos animais, as infecções não são associadas a sinais clínicos; em outros, pode haver diarreia aguda autolimitante. Em animais imunossuprimidos, a infecção é frequentemente crônica, podendo ser letal (XIAO et al., 2004).
2.5 Diagnóstico
2.5.1 Métodos parasitológicos diretos
Os métodos tradicionalmente utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium consistem na detecção direta do parasito por meio de microscopia óptica. No entanto, as características morfológicas para uma correta identificação dessas formas infectantes são insuficientes, sendo que o diagnóstico, baseado apenas nesses métodos, não é confiável e relativamente demorado (FALL et al., 2003).
As técnicas mais empregadas para essa finalidade são: coloração por Kinyoun (MA; SOAVE, 1983), Ziehl-Neelsen modificado (HENRIKSEN; POHLENZ, 1981), safranina azul de metileno (BAXBY et al., 1984) e coloração negativa de verde-malaquita (ELLIOTet al., 1999). Embora úteis, essas técnicas apresentam baixa sensibilidade e/ou especificidade, principalmente quando existem poucos oocistos nas amostras (MORGAN et al., 1998).
Outro método comumente utilizado para detecção de formas evolutivas infectantes a partir de amostras fecais consiste na técnica de centrífugo-flutuação em solução de Sheather (CURRENT, 1990). Os oocistos podem ser visualizados utilizando-se microscopia óptica de campo claro ou de contraste de fase (XIAO; FENG, 2008).
Oocistos de Cryptosporidium são muito pequenos (4-8 ȝm), com uma
espécies, sem esporocistos e de difícil visualização (FALL et al., 2003; FAYER et al., 2000). Dessa forma, a identificação da espécie, se baseada apenas em critérios morfométricos, pode ser pouco discriminatória (MORGAN et al., 1998).
2.5.2 Métodos imunológicos
Como métodos imunológicos, oocistos fecais podem ser detectados pela reação de imunofluorescência indireta (BIALEK et al., 2002; JEX et al., 2008) e teste imunoenzimático (ELISA) (FAYER et al., 2000; JEX et al., 2008; SILVA et al., 2003; KUHNERT-PAUL et al., 2012). Esses métodos apresentam vantagens sobre o diagnóstico parasitológico direto, com bons resultados de sensibilidade e especificidade (JOHNSTON et al. 2003; ZIMMERMAN; NEEDHAM, 1995).
Alguns testes imunoenzimáticos são capazes de detectar a infecção em animais que ainda não estão eliminando oocistos nas fezes (pré-patente) (SMITH; NICHOLS, 2007); outra vantagem é que podem ser empregados de maneira rápida para triagem de um grande número de animais (GARCIA et al., 2003) e como limitações dessas técnicas imunológicas, não é possível a determinação da espécie ou genótipo de Cryptosporidium envolvidos na infecção.
2.5.3 Métodos moleculares
Dada a limitação na detecção de espécies de Cryptosporidium a partir dos métodos diretos e imunológicos, o diagnóstico baseado em técnicas moleculares, como a PCR e suas variantes, seguida de sequenciamento automático de ácidos nucleicos, oferece uma alternativa eficiente para a diferenciação desses organismos (JEX et al., 2008).
1997) e glicoproteína GP-60 (PENG et al., 2001; PENG et al., 2003). Este último tem demonstrado um elevado grau de polimorfismo entre isolados de espécies de Cryptosporidium, com identificação de diversos subgenótipos e subtipos (PLUTZER; KARANIS, 2009).
Técnicas moleculares apresentam alta sensibilidade e especificidade (JEX et al., 2008; MORGAN et al., 1998), no entanto, devido ao alto custo, quando comparada às outras técnicas de detecção de oocistos, esse método não tem sido rotineiramente utilizado em laboratórios de diagnóstico (MEIRELES, 2010).
2.6 Criptosporidiose em bubalinos
A infecção por C. parvum é considerada uma causa comum de doença intestinal em ruminantes jovens (O HANDLEY; OLSON, 2006). Os animais podem desenvolver um quadro de diarreia aquosa profusa, letargia, anorexia e desidratação (FAYER et al., 1998). Os Sinais clínicos tornam-se evidentes após três a cinco dias do início da infecção e sua duração pode variar entre quatro a 18 dias (OLSON et al., 2004).
A diarreia é acompanhada pela excreção de um grande número de formas evolutivas infectantes, acima de 107 oocistos por grama de fezes (FAYER et al.,1998). A severidade da doença é influenciada por fatores como a dose do inóculo, estado imune do hospedeiro, infecções concomitantes, nutrição e espécie do parasito (OLSON et al., 2004).
A importância da infecção por Cryptodporidium em animais de produção é traduzida, não só pelo potencial zoonótico de algumas espécies, como também pela perda econômica que ela promove (OLSON et al., 2004).
Este protozoário já foi observado em fezes de búfalos em países como Cuba (RODRIGUEZ-DIEGO et al., 1991), Índia (BHAT et al., 2012; DUBEY et al., 1992), Brasil (ARAÚJO et al., 1996, RIBEIRO et al., 2000), Espanha (GOMÉZ-COUSO et al., 2005), Itália (CACCIÓ et al., 2007, CONDOLEO et al., 2007, RINALDI et al., 2007), Egito (EL-KHODERY; OSMAN, 2008), Venezuela (MANZANILLA, 2009) e Nepal (FENG et al., 2012), com a prevalência da infecção por Cryptosporidium variando entre 9,4% a 37%.
Ribeiro et al. (2000) verificaram presença de oocistos de C. parvum em búfalos, mais frequentemente na 6ª semana de idade e com maior positividade em animais sem sinais de distúrbio gastrointestinal, sugerindo que bezerros não sintomáticos são potenciais fontes de infecção. Ao contrário, El-Khodery; Osman (2008) observaram que a faixa etária mais predisponente é de um a quinze dias e que a diarreia está significativamente associada à infecção.
Por meio da técnica de ELISA, Rinaldi et al. (2007) verificaram a ocorrência de 19,8% (35/177) de coproantígenos de C. parvum em búfalos com idade entre dois e 60 dias de vida, provenientes de 47 fazendas da região central da Itália. Em estudo semelhante, Condoleo et al. (2007) constataram uma ocorrência de 14,7% (51/347) de coproantígenos em animais assintomáticos com idade entre uma a nove semanas, em 90 propriedades rurais e observaram uma associação positiva entre a infecção e o número elevado de búfalos na propriedade (quando maior que 100 animais).
No Brasil, Araújo et al. (1996) avaliaram a ocorrência da infecção por Cryptosporidium em 120 alíquotas fecais de bubalinos da região do Amapá, por meio da técnica de Sheather, constatando a presença de oocistos em 10% (12/120) das amostras. A identificação da espécie foi baseada em critérios morfométricos, sendo visualizados oocistos de C. parvum e C. muris.
indistinguíveis de C. parvum. Posteriormente, a caracterização molecular revelou Cryptosporidium parvum genótipo “pig”.
Outro estudo que utilizou a ferramenta molecular para identificação de espécies de Cryptosporidium em búfalos, foi efetuado por Cacció et al. (2007), que demonstraram 14% (8/57) de positividade por meio do teste de ELISA. A investigação molecular de seis dessas amostras revelou 100% de homologia com C. parvum, sugerindo que estes animais podem representar fontes de infecção deste parasito.
Feng et al. (2012), detectaram pela primeira vez a presença de C. ryanae nessa espécie animal, a partir da análise do gene 18S do rRNA. Outro estudo realizado na Índia, também verificou o envolvimento dessa mesma espécie em bezerros bubalinos (VENU et al., 2012).
A maioria das pesquisas sobre Cryptosporidium em búfalos foram baseados na identificação morfológica de oocistos nas fezes ou por meio de métodos imunológicos. Embora ambas as técnicas possam fornecer dados sobre a prevalência generalizada deste parasito, somente a biologia molecular é capaz de identificar as espécies ou genótipos do referido gênero, o que é relevante do ponto de vista de saúde pública (FAYER, 2010).
3 OBJETIVO
REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 2 – OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptosporidium spp. EM BEZERROS BUBALINOS NO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL
RESUMO – Com o objetivo de determinar a ocorrência e caracterizar molecularmente a infecção por Cryptosporidium spp. em bezerros bubalinos do Estado de São Paulo, Brasil, foram colhidas 222 amostras fecais de animais da raça Murrah, com até seis meses de idade. As amostras foram avaliadas pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada e por meio da reação em cadeia da polimerase tipo nested (nPCR) para amplificação de fragmentos de DNA subunidade 18S do gene do RNA ribossômico e sequenciamento dos fragmentos amplificados. Pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada foi detectada positividade de 8,1% (18/222) e pela nPCR foi observada amplificação em 48,2% (107/222) das amostras, das quais 63 foram sequenciadas. A análise das sequências obtidas mostrou que a espécie mais frequente nesses animais foi Cryptosporidium ryanae, em bezerros bubalinos a partir de cinco dias de idade. A espécie zoonótica Cryptosporidium parvum foi detectada em apenas um animal e um genótipo incomum, similar a Cryptosporidium sp. W20486, foi encontrado pela primeira vez em búfalos.
1 INTRODUÇÃO
Cryptosporidium spp. é um importante enteropatógeno em seres humanos e animais. Nos últimos anos, houve uma rápida expansão das pesquisas envolvendo esse gênero, em grande parte relacionada a estudos moleculares, propiciando a descrição de várias espécies, genótipos e subtipos do parasito (PLUTZER; KARANIS, 2009). Atualmente, são descritas mais de 20 espécies e mais de 40 genótipos de Cryptosporidium (FAYER et al., 2010; XIAO, 2010).
A infecção em seres humanos pode resultar de transmissão zoonótica ou antroponótica (XIAO, 2010). Dessa forma, a caracterização molecular de isolados de diferentes origens (animal, humana e ambiental) tem sido amplamente usada com o intuito de investigar o potencial zoonótico das espécies ou genótipos do protozoário (XIAO; FAYER, 2008).
Bovinos são comumente infectados por quatro espécies: Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium bovis, Cryptosporidium ryanae e Cryptosporidium andersoni (FAYER et al., 2008; FENG et al., 2007; SANTÍN et al., 2008; XIAO, 2010); C. parvum é apontado como um importante agente causador de diarreia neonatal em ruminantes (O’HANDLEY; OLSON, 2006) e um dos principais responsáveis pela criptosporidiose humana (XIAO; FENG, 2008). Assim, os ruminantes têm sido considerados importantes reservatórios da infecção zoonótica (XIAO; FAYER, 2008; WANG et al., 2011).
et al., 2012). No Brasil não existem dados sobre as espécies ou genótipos que infectam búfalos.
Este trabalho teve como objetivo a determinação da ocorrência de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de bezerros bubalinos da região Centro-Sul do Estado de São Paulo, Brasil, por meio de microscopia, utilizando a técnica de coloração de Ziehl-Neelsen modificada e caracterização molecular, seguida do sequenciamento dos fragmentos amplificados para identificação da espécie de Cryptosporidium.
2 MATERIAL E MÉTODO
2.1 Colheita das amostras
Durante o período de abril a maio de 2010, foram colhidas amostras fecais de 222 bezerros bubalinos da raça Murrah, com idade entre cinco dias e seis meses, provenientes de 10 leiterias com manejo semi-extensivo, localizadas na região Centro-Sul do Estado de São Paulo, Brasil. As amostras fecais foram obtidas diretamente da ampola retal e divididas em duas alíquotas, uma destinada à análise pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada e a outra, corrrespondente a 200 mg, foi congelada “in natura”, a -20ºC.
As fezes foram classificadas de acordo com a consistência fecal em normais (consistência sólida ou semi-sólida) e diarreicas (pastosa, semilíquida ou líquida).
2.2 Exame parasitológico direto
fezes, observado em aumento de 1000X, foi adotada a seguinte classificação: raro (até quatro oocistos/campo); pouco a moderado (entre cinco e 10 oocistos/campo) e acentuado (11 ou mais oocistos/campo).
2.3 Extração de DNA genômico
O DNA genômico dos oocistos foi extraído utilizando-se o QIAamp DNA Stool Mini Kit® (Qiagen), seguindo-se o protocolo descrito pelo fabricante, após diluição da amostra em tampão ASL e 5 etapas de congelamento em nitrogênio líquido, por 1 minuto, e descongelamento em termomixer, por 3 minutos, a 99ºC. O DNA foi eluído em 50 microlitros de tampão AE e conservado a -20°C.
2.4 Caracterização molecular
Para amplificação de fragmento parcial do gene 18S rRNA foi utilizada a técnica de reação em cadeia da polimerase tipo nested (nPCR) com os oligonucleotídeos iniciadores 5´ TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG 3’ e 5’ CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA 3’ para a reação primária (1325 bp) e 5’ GGAAGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG 3’ e 5´ AAG GAG TAA GGA ACA ACC TCC A 3´ para a reação secundária (826-840 bp) (XIAO et al., 2000).
As seguintes condições de reação foram utilizadas: preparação de 25µL de solução contendo 2,5 µL de tampão para PCR 1 x, MgCl2 a 2,5 mM, 1 U de
Taq DNA polimerase, 200 µM de cada desoxiribonucleotídeo, 100 nM de cada
Amostras classificadas inicialmente como Cryptosporidium suis-like pela análise do gene 18S rRNA foram posteriormente submetidas à nPCR para amplificação de fragmento parcial do gene da actina, seguida do sequenciamento dos fragmentos amplificados.
A PCR para amplificação de fragmento parcial do gene da actina foi realizada utilizando os oligonucleotídeos iniciadores 5’ ATG RGW GAA GAA GWA RYW CAA GC 3’ e 5’ AGA ARC AYT TTC TGT GKA CAA T 3’, para a reação primária (~1095bp) e 5’ CAA GCW TTR GTT GAY AA 3’ e 5’ TTT CTG TGK ACA ATW SWT GG 3’ para a reação secundária (~1066bp), nas seguintes condições de reação: preparação de 25µL de solução contendo 2,5 µL de tampão para PCR 1x, MgCl2 a 3,0 mM, 1 U de Taq DNA polimerase, 200 µM de cada desoxiribonucleotídeo, 200 nM de cada oligonucleotídeo iniciador e
2,5 µL de DNA alvo nas duas reações. As amostras foram submetidas à desnaturação inicial do DNA a 94º C por 5 minutos, seguida de 35 ciclos, cada um consistindo em desnaturação por 45 segundos a 94º C, 45 segundos de anelamento a 45ºC e 60 segundos de extensão a 72º C, com extensão final a 72ºC, por 10 minutos (SULAIMAN et al., 2002).
Como controles positivo e negativo de ambas as reações foram utilizados DNA genômico de Cryptosporidium galli e água ultra-pura, respectivamente.
Amostras que apresentaram amplificação intensa do fragmento de DNA, visualizadas por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo, foram purificadas utilizando-se o kit QIAquick® Gel Extraction (Qiagen), e submetidas a sequenciamento com utilização do ABI Prism® Dye Terminator Cicling Sequence kit (Applied Biosystems®) em seqüenciador automático ABI 3730XL (Applied Biosystems). As reações de sequenciamento foram feitas nas duas direções, com os oligonucleotídeos iniciadores da reação secundária.
por PCR foi feito com o auxílio dos programas Clustal W (THOMPSON et al., 1997) e BioEdit Sequence Alignment Editor (HALL, 1999), tomando-se como base sequências homólogas disponíveis no GenBank.
As sequências de nucleotídeos geradas a partir deste estudo estão depositadas no GenBank sob os números de acesso JX559846 a JX559851.
2.5 Análise Filogenética
As sequências amplificadas neste estudo foram alinhadas com sequências de nucleotídeos homólogas, obtidas a partir de outras espécies e genótipos de Cryptosporidium, utilizando Clustal W (THOMPSON et al., 1997). A análise neighbor-joining foi realizada com base no modelo de Kimura 2-parâmetros, usando a versão MEGA 5.1 (KUMAR et al., 2004), com valores de bootstrap obtidos a partir de 1000 repetições.
2.6 Análise estatística
A associação entre a ocorrência de Cryptosporidium spp., determinada pela nPCR e a consistência fecal das amostras analisadas foi avaliada pelo teste Qui-Quadrado. O Teste de McNemar e o coeficiente de concordância Kappa foram utilizados para avaliar a concordância entre as técnicas de Ziehl-Neelsen modificada e nPCR. O nível de significância adotado foi de 5% e a análise estatística foi efetuada empregando-se o programa Statistical Analysis System (SAS), versão 9.2 (2008).
3 RESULTADOS
(5/18) moderado e em 22% (4/18) acentuado (Figura 1). Todas as amostras positivas por microscopia também mostraram positividade pela nPCR, que detectou 48,2% (107/222) de positividade. Desse total, foi possível o sequenciamento em 63 amostras. A análise das seqüências do gene 18S rRNA possibilitou a identificação de C. ryanae em 60 amostras, Cryptosporidium sp. geneticamente similar ao isolado W20486 (GenBank HQ822146) em duas amostras e C. parvum em uma amostra (Tabela 1). C. ryanae estava presente em todas as leiterias e C. parvum e Cryptosporidium sp. estavam restritos a uma e duas leiterias, respectivamente.
Não houve diferença estatística entre a positividade e a consistência fecal (Tabela 2). Pelo teste de McNemar foi observada diferença significativa (p<0,0001) (PEREIRA, 2001) entre as técnicas estudadas em relação à positividade para Cryptosporidium spp. Pelo teste Kappa, houve baixa concordância entre as técnicas (Kappa = 0,1732).
Tabela 1 - Distribuição das espécies de Cryptosporidium detectadas por meio da nPCRe sequenciamento, de acordo com a faixa etária.
Faixa etária
(dias) Número de amostras
Número de positivos – nPCR (%)
Identificação das espéciesa
5 – 30 26 12 (46,2)
C. ryanae (4) Cryptosporidium spp. (2)
C. parvum (1)
31 – 60 85 39 (45,9) C. ryanae (20)
61 – 120 98 53 (54,1) C. ryanae (34)
121 – 180 13 3 (23,1) C. ryanae (02)
Total 222 107 (48,2)
C. ryanae (60) Cryptosporidium sp. (2)
C. parvum (1)
a A identificação das espécies foi realizada apenas em amostras que
Tabela 2 - Ocorrência da infecção por Cryptosporidium spp. pela nPCR de acordo com a consistência fecal.
Consistência fecal Número de animais Número de positivos – nPCR (%) P(1)
Normal 156 70 (44,9)
0,1273
Diarreica 66 37 (56,1)
(1) teste χ2
FIGURA 1 - Aspecto microscópico (aumento de 1000X) dos graus de eliminação de oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de bezerros bubalinos (A- rara; B- moderada; C e D- acentuada).
D
4 DISCUSSÃO
Resultados semelhantes aos obtidos pelo exame microscópico neste trabalho, foram observados por Ribeiro et al. (2000) e Araújo et al. (1996), no Brasil, por meio da técnica de Sheather. Por sua vez, El-Khodery and Osman (2008) e Feng et al. (2012), detectaram pela técnica de Ziehl- Neelsen modificada, ocorrência mais elevada que a evidenciada neste trabalho.
Em outras pesquisas envolvendo o diagnóstico molecular de Cryptosporidium em bubalinos, foi utilizado um método de triagem precedente à PCR, dessa forma, a caracterização molecular foi feita apenas em amostras positivas no primeiro teste (BHAt et al., 2012; CACCIÓ et al., 2007; FENG et al., 2012; GOMÉZ-COUSO et al., 2005), o que nos impossibilita tecer comparações entre a positividade encontrada pela nPCR, neste experimento, com os resultados previamente publicados.
Na maioria dos animais foi constatada infecção por C. ryanae, que em bovinos causa quadros assintomáticos (FAYER et al., 2008). Embora 66 animais do nosso estudo tenham apresentado diarreia, não foi observada associação entre a positividade para Cryptosporidium e a consistência das fezes.
Embora em bovinos a presença de C. ryanae tenha sido detectada por métodos moleculares em vários países (FAYER et al., 2008; FAYER et al., 2010b; MEIRELES et al., 2011; MUHID et al., 2011; MURAKOSHI et al., 2012; ROBINSON et al., 2011; WANG et al., 2011;), em búfalos essa espécie foi observada apenas por Feng et al. (2012), no Nepal e por Venu et al. (2012) na Índia. C. parvum, apesar de ser comumente observado em bovinos (XIAO; FENG, 2008), foi descrito em búfalos somente por Cacciò et al. (2007) e em somente um animal, neste experimento. No Brasil, este é o primeiro relato de C. ryanae e C. parvum na espécie bubalina.
observada a presença de C. ryanae nessa faixa etária e, com menor frequência, de C. parvum e Cryptosporidium sp.
Na faixa etária após 2 meses de idade, foi observada infecção também por C. ryanae, espécie que já foi descrita por Feng et al. (2012) em bezerros bubalinos, com idade entre dois a sete meses. Em bovinos, C. ryanae é encontrado com mais frequência em bezerros desmamados (três meses a 11 meses) (FAYER et al., 2008; XIAO; FAYER, 2008), embora haja relatos de presença de C. ryanae em animais com idade inferior a dois meses (FENG et al., 2007; KHAN et al., 2010; MUHID et al., 2011).
O alinhamento das seqüências do gene 18S rRNA de C. ryanae com outras seqüências dessa espécie, evidenciou substituições nas posições 40 e 418 (GenBank AY587166) (Figura 2) e 100% de similaridade genética com as seqüências de C. ryanae tipos 2, 3 e 4 descritas por Feng et al. (2012), em búfalos.
FIGURA 2 - Alinhamento das sequências de C. ryanae com sequências
depositadas no Genbank.
A nPCR para amplificação do gene da actina foi realizada nas duas amostras de bezerros bubalinos similares a Cryptosporidium suis-like, pela análise do gene 18S rRNa, sendo possível observar que se tratava do mesmo genótipo encontrado por Robinson et al. (2011), com somente uma substituição do nucleotídeo C por T, na posição 678 (GenBank W20486). Esta é a primeira descrição deste genótipo em búfalos.
5 CONCLUSÃO
A infecção por Cryptosporidium foi detectada em bezerros bubalinos de cinco a seis meses de idade, com predomínio de C. ryanae. No Brasil, este é o primeiro estudo de caracterização molecular de Cryptosporidium em búfalos, com identificação de C. ryanae e C. parvum, e representa o primeiro relato do genótipo Cryptosporidium sp. W20486 nessa espécie animal.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP pelo suporte financeiro concedido a este projeto (Processo n. 52542-3) e a bolsa de mestrado (Processo n. 2010/13146-5) concedida à aluna AQUINO, M. C. C.
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APÊNDICE A- Á identificadas nest Cryptosporidium d método de agrupam
Árvore filogenética de sequências do e estudo, e de outras espécies isponíveis no GenBank e árvore con mento de vizinhos.
APÊNDICE B- Árvo neste estudo, e disponíveis no G agrupamento de viz
ore filogenética da sequência do gene d de outras espécies ou genótipos d GenBank e árvore consenso utilizan
zinhos.
