UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CAMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO DA MATURIDADE PULMONAR DE CABRITOS
NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS PELA ANÁLISE
CITOLÓGICA, TESTE DE CLEMENTS E CONTAGEM DE
CORPOS LAMELARES DO LÍQUIDO AMNIÓTICO
Gabriel Isola Braga
Médico Veterinário
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CAMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO DA MATURIDADE PULMONAR DE
CABRITOS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS
PELA ANÁLISE CITOLÓGICA, TESTE DE CLEMENTS E
CONTAGEM DE CORPOS LAMELARES DO LÍQUIDO
AMNIÓTICO
Gabriel Isola Braga
Orientador: Prof. Adjunto Francisco Leydson F. Feitosa
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária – Unesp, Câmpus de Araçatuba, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Fisiopatologia Médica e Cirúrgica)
Catalogação na Publicação(CIP)
Serviço de Biblioteca e Documentação – FMVA/UNESP
Braga, Gabriel Isola
B730a Avaliação da maturidade pulmonar de cabritos nascidos a termo e prematuros pela análise citológica, teste de clements e contagem de corpos lamelares do líquido amniótico / Gabriel Isola Braga.
Araçatuba: [s.n], 2015
47f. il.; CD-ROM
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária, 2015
Orientador: Prof. Adjunto Francisco Leydson F. Feitosa
1.Ruminates. 2. Neonatologia. 3.Caprinos 4.Prematuros 5. Técnicas de diagnóstico. I. T.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
GABRIEL ISOLA BRAGA – Nascido em Brasília no dia 11 de junho de 1982.
“A educação é a arma mais poderosa que se pode usar para mudar o mundo. E tudo é considerado impossível até acontecer.”
Dedico a conquista de mais essa etapa da minha vida, a Deus e à minha família, meus pais Henio Braga Junior e Silvia Isola Braga. À minha esposa Regiane Santana Claudino, ao meu filho Cauã Claudino Braga e ao meu irmão Thiago Isola Braga. Todos me incentivaram muito, cada um ao seu modo, para a conclusão desse trabalho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a deus por mais essa conquista em minha vida, sem ele nada seria possível.
À Minha esposa pelo incentivo, por sempre acreditar que tudo daria certo, e por me acompanhar em todas as etapas da minha vida, com dedicação de esposa e mãe maravilhosa. Ao meu filho que mesmo sem saber, me encoraja e com certeza me faz uma pessoa melhor. À minha mãe pela dedicação, torcida e conselhos, tendo sempre uma palavra de incentivo para que eu superasse minhas dificuldades e os obstáculos que vinham a surgir. Ao meu pai por todo o suporte em todos esses anos, mostrando que o esforço e dedicação são a chave para alcançar nossos objetivos.
À Faculdade de Medicina Veterinária, Campus de Araçatuba (FMVA/UNESP), pelo acolhimento e oportunidade de concluir esse trabalho.
À FAPESP, pela concessão do financiamento do projeto (2012/21416-8) e da bolsa de estudos (2012/21967-4), tornando possível a condução deste trabalho.
Ao meu orientador Francisco Leydson Formiga Feitosa, pela confiança e amizade durante todo o processo.
Aos professores da Faculdade de Medicina Veterinária, Campus de Araçatuba (FMVA/UNESP), Luiz Cláudio Mendes, Paulo Sérgio Patto, Flávia Lucas, Sueli Mogami Bomfim, Luciana Ciarlini, Mario Jefferson Louzada, Gisele Fabrino, Guilherme de Paula Nogueira, que pela disponibilidade, ensinamentos, ou ainda pelos laudos e processamento de materiais em seus laboratórios, contribuíram de maneira significativa nesse trabalho.
Aos funcionários Teresa e José Augusto do Departamento de microscopia eletrônica da USP de Ribeirão Preto-SP, pela paciência e excelente atendimento prestado.
Aos alunos de iniciação científica, Murilo Ferraz, Juliana Vacarri, Daniela Danaddai e Eduardo Panelli pela dedicação e comprometimento no projeto. Aos residentes do setor de grandes animais Rafaela, Caio e Fernanda pela ajuda com os animais durante o projeto.
Aos meus amigos e companheiros da pós-graduação, Jefferson Alcindo, Thomas Alexander, Natalia Cristina, Fernanda Bovino, Juliane Teramachi, Luis Gustavo, Renata Figueiredo, Mauricio Desk, Diogo Camargo, Arthur Araujo e Mariana Aparecida pela parceria fundamental em todas as etapas do projeto, pela amizade, e por fazer tudo parecer ser mais fácil e prazeroso durante essa trajetória.
SUMÁRIO
RESUMO ... 9
Palavras-chave ... 9
ABSTRACT ... 10
Keywords: ... 10
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 12
Objetivos ... 17
Objetivo geral: ... 17
Objetivos específicos: ... 17
REFERÊNCIAS ... 17
CAPÍTULO 2 – COLHEITA E ANÁLISE DO LIQUIDO AMNIIOTICO DE CABRITOS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS. ... 21
RESUMO ... 21
Palavras-chave: ... 21
ABSTRACT ... 22
Key-words: ... 22
Introdução ... 23
Materiais e Métodos ... 30
Resultados e Discussão ... 37
CONCLUSÃO ... 46
REFERÊNCIAS ... 46
CAPÍTULO 3 – ANÁLISE DO ESCORE APGAR, DOS PARÂMETROS VITAIS E DOS VALORES GLICÊMICOS E DE LACTATO DE CABRITOS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS... 55
RESUMO ... 55
Palavras-Chave: ... 55
ABSTRACT – ... 56
Keywords: ... 56
Materiais e Métodos ... 61
Análise Estatística ... 63
Resultados e Discussões ... 63
Conclusão ... 77
REFERÊNCIAS ... 78
CAPÍTULO 4 – ANÁLISE HEMOGASOMÉTRICA, DE CORTISOL, HEMOGLOBINA, VOLUME GLOBULAR E ACHADOS RADIOGRÁFICOS DE CABRITOS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS ... 86
RESUMO- ... 86
Palavras-Chave: ... 86
ABSTRACT... 87
Keywords: ... 87
Introdução ... 88
Materiais e Métodos ... 89
Análise Estatística ... 92
Resultado e Discussão ... 92
CONCLUSÃO ... 103
AVALIAÇÃO DA MATURIDADE PULMONAR DE CABRITOS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS PELA ANÁLISE CITOLÓGICA, TESTE DE CLEMENTS E CONTAGEM DE CORPOS LAMELARES DO LÍQUIDO AMNIÓTICO
RESUMO - O objetivo do estudo foi avaliar a maturidade pulmonar de cabritos, por meio do teste de Clements, da análise citológica pela coloração de Azul de Nilo e Shorr, e da contagem de corpos lamelares no líquido amniótico de cabras. Utilizando- se também a avaliação do escore Apgar, dos parâmetros vitais, dos valores glicêmicos e de lactato, dos parâmetros hemogasométricos, dos valores de cortisol, de hemoglobina e volume globular, bem como os achados radiográficos de cabritos nascidos a termo e prematuros. Obtendo-se assim uma avaliação completa quanto ao grau de maturidade pulmonar desses animais. Para tanto, foram utilizados 44 animais (20 cabras e 24 cabritos), divididos em três grupos, a saber: Grupo I: constituído por oito cabras, com gestação de 149 dias, e por oito cabritos nascidos de cesarianas; grupo II: composto por seis cabras, com 143 dias de gestação, e por oito cabritos nascidos de cesarianas; e, grupo III : constituído por seis cabras com 143 dias de gestação e que receberam 20mg/cabra de dexametasona, por via intramuscular, 36 horas antes da cirurgia eletiva, e por oito cabritos delas nascidos. Foi observado que a citologia pela coloração de Shorr, assim como o a contagem de corpos lamelares mostraram ser meios diagnósticos eficazes para a avaliação da maturidade pulmonar em neonatos caprinos. Enquanto o teste de Clements modificado no presente estudo, apresentou um alto índice de resultados inconclusivos. As análises clínicos-laboratoriais evidenciaram que os animais do presente estudo estavam perfeitamente adaptados as 48 horas de vida, ao meio extrauterino. Cabritos com idade gestacional de 143 dias são perfeitamente viáveis, contrariando o relato de alguns autores. O tratamento materno com dexametasona não mostrou resultados significativos em relação à maturidade fetal nos cabritos do presente estudo.
EVALUATION OF LUNG MATURITY OF FULL-TERM AND PREMATURE GOAT KIDS USING CYTOLOGIC ANALYSIS, CLEMENTS TEST AND AMNIOTIC FLUID LAMELLAR BODY COUNT
ABSTRACT – The study aimed to evaluate lung maturity of goat kids using Clements test, cytologic analysis through Nile Blue and Shorr staining, and lamellar body count from the amniotic fluid of goat does. In addition, evaluation of Apgar score, vital parameters, blood glucose and lactate, blood gas parameters, cortisol, hemoglobin and packed cell volume, as well as radiographic findings of full-term and premature goat kids were carried out in order to obtain a complete assessment of the degree of lung maturity of these animals. Forty-four animals (20 does and 24 kids) were enrolled in the study and divided into three groups: Group I: constituted by eight does with 149 days of gestation, and eight kids delivered by cesarean section; Group II: constituted by six does with 143 days of gestation, and eight kids delivered by cesarean section; and Group III: constituted by six does with 143 days of gestation, which received intramuscular dexamethasone (20mg/doe) 36 hours prior to elective cesarean section, and their eight kids. It was observed that the staining of cytological Shorr, as well as the a count of lamellar bodies found to be effective diagnostic tools for assessing the lung maturity in goats neonates. While the shake test modified in this study showed a high rate of inconclusive results. The clinical-laboratory tests showed that the animals in this study were perfectly adapted to the 48 hours of life, in half extrauterino. Goats with gestational age of 143 days are perfectly feasible, contrary to the reports of some authors. Maternal treatment with dexamethasone did not show significant results in relation to fetal maturity in goats in this study.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
O rebanho caprino brasileiro é estimado em 10,3 milhões de cabeças, com cerca de 92% localizados na Região Nordeste, constituindo um rebanho com aproximadamente 9,5 milhões de animais, dos quais 1,6 milhões de caprinos encontram-se no Estado de Pernambuco (CÂMARA et al., 2012).
Em termos de dinâmica regional, observa-se a Região Nordeste é a detentora da maior parte dos caprinos do Brasil e concentra cerca de 93% do rebanho caprino brasileiro. A Região Norte mais que dobrou sua participação, subindo para o quarto lugar no efetivo do rebanho caprino nacional. A Região Centro Oeste também aumentou o percentual de animais, sendo as Regiões Sudeste e Sul as que apresentaram uma pequena diminuição em suas participações no efetivo total do rebanho caprino nacional. O rebanho caprino aumentou em quase todas as regiões brasileiras, exceto na Região Sul, fato este que apontam para um cenário em que a tendência da atividade é aumentar a sua importância e contribuição para a composição do produto interno bruto (PIB) do agronegócio brasileiro (CARVALHO et al., 2010).
Apesar de a caprinocultura estar evoluindo de uma atividade considerada essencialmente extrativista, baseada em sistema de criação extensivo, para procedimentos mais racionalizados, ainda registram-se perdas significativas decorrentes de elevados índices de mortalidade perinatal nos sistemas tradicionais de criação de caprinos (YANAKA, 2009).
dias de vida. Sendo a distocia, a inanição e a hipotermia, responsáveis por 50 a 60% dessas perdas (VAALA; HOUSE, 2006).
Dentre as causas de mortalidade perinatal que atuam individualmente ou em conjunto, incluem-se: abortamentos decorrentes de agentes infecciosos, estresse intenso ou deficiência nutricional, malformações resultantes da exposição de fêmeas gestantes a vírus, erro de manejo dos neonatos, entre outros. Em caprinos criados na Paraíba, as distorcias corresponderam a 12,71% da mortalidade perinatal, sendo superada apenas pelas infecções neonatais com 50% (CÂMARA et al., 2012).
As prevalências de mortalidade perinatal de caprinos são bastante variáveis. Sendo importante uma avaliação criteriosa nessa categoria animal. Sabendo-se que a abordagem emergencial dos neonatos difere marcadamente do paciente crítico adulto pela fisiologia e pelos parâmetros hemodinâmicos particulares. Após o nascimento, inicia-se um período crítico chamado de “período de transição”, que engloba a adaptação do neonato da vida intrauterina para a extrauterina. Nesta fase, os sistemas corporais promovem ajustes fisiológicos considerados cruciais para o neonato. Sob condições não fisiológicas, relacionadas, em especial, aos partos distócicos e ao nascimento prematuro, estabelecem-se os quadros de asfixia precoce e tardia. A vulnerabilidade do neonato às condições adversas do meio relacionadas à imaturidade dos sistemas compensatórios e regulatórios orgânicos, bem como a ineficácia dos mecanismos de defesa intrínsecos ao período inicial do desenvolvimento, faz dessa categoria animal tópico especial na terapêutica veterinária. Neste prisma, pode-se pressupor que a adaptação e a vulnerabilidade ao meio externo são, indubitavelmente, ainda mais instáveis e desafiadores em animais prematuros.
O parto prematuro representa um grande número de eventos que determinam a ativação uterina prematura, incluindo contratilidade do miométrio (ROMERO et al., 2006), e eventos endócrinos que levam ao trabalho de parto (GIBB et al., 2002).
têm sido observados nos casos de parto prematuro, sendo considerados como potenciais marcadores da síndrome da angustia (SAR) respiratória, apesar de
sua utilidade clínica como
marcadores preditivos permanecer incerta (CHALLIS et al., 2005; FIELD et al., 2008). Evidências sugerem que os processos patológicos que culminam no parto precoce geralmente começam semanas antes do aparecimento dos sinais clínicos, e, por conseguinte, a avaliação de marcadores no início da síndrome (SAR) pode ser útil (TORRICELLI et al., 2009).
A neonatologia de animais pecuários ainda é área que caminha a passos lentos. Na pediatria, consegue-se, com certa facilidade, não somente a sobrevivência de pacientes de alto risco, como também, a quase certeza de que estes fetos prematuros terão, futuramente, qualidade de vida satisfatória. Atualmente, crianças nascidas prematuras, de mães com seis meses de gestação e pesando cerca de 600 g geralmente conseguem sobreviver sem qualquer tipo de complicação, fato improvável há alguns anos. Em veterinária, cabritos e cordeiros nascidos com apenas seis dias antes da data prevista para o parto apresentam enorme risco de morrerem antes mesmo das primeiras 24 horas de vida.
Grande parte dos avanços ocorridos nas últimas décadas, com relação à assistência perinatal e neonatal, relacionam-se com a função respiratória, visto que a capacidade funcional pulmonar é imprescindível para a sobrevivência do neonato. A maturidade fetal pode ser clinicamente caracterizada, entre outros fatores, pela insuficiência respiratória. Dentro deste contexto é de grande importância para o clínico avaliar o grau de maturidade pulmonar fetal, sendo que qualquer problema na formação de algum componente pulmonar ou o nascimento prematuro dos cabritos pode acarretar problemas respiratórios ao neonato, como a síndrome da angústia respiratória (SAR). Evitar o nascimento prematuro constitui a principal medida preventiva para reduzir os riscos e sequelas da morbidade respiratória neonatal (LOBATO, 2011; TABORDA et al., 1998).
além de anormalidades genéticas e outras doenças (KJELDSBERG & KNIGHT, 1993).
A análise do surfactante, utilizado por diversos métodos diagnósticos para prever a maturidade pulmonar, é extremamente importante, levando em consideração este componente ser imprescindível para a sobrevida dos prematuros. Quando é insuficiente, a tensão superficial da membrana aéreo-líquida (sangue) se torna alta, ocasionando grande risco de colapso dos alvéolos durante a expiração. As consequências clínicas da ausência desse líquido pulmonar podem ser observadas em várias situações. Neonatos prematuros que não possuem surfactante apresentam grande dificuldade para insuflar os pulmões, especialmente nas primeiras respirações. Mesmo quando seus alvéolos são insuflados artificialmente, a tendência ao colapso espontâneo é grande por seus alvéolos serem menos estáveis sem surfactante pulmonar. Por essa razão, a ausência dessa substância ou alterações na quantidade ou qualidade dos fosfolipídios que a compõem, em um neonato prematuro, podem ser fatores importantes para desenvolvimento de SAR neonatal, também conhecida como doença pulmonar das membranas hialinas. Como consequência poderá ocorrer atelectasia progressiva, edema, alteração da relação ventilação/perfusão, levando a hipóxia tecidual (DUBIN et al., 2000; GRENACHE et al., 2006; LOBATO, 2011; WIJNBERGER et al., 2001).
A maturação do pulmão envolve não apenas a maturação do sistema surfactante, mas também o adelgaçamento da barreira capilar alveolar, diminuição na permeabilidade alveolar epitelial e a maturação da parede torácica (SMITH, 2006). As células do organismo necessitam de suprimento contínuo de oxigênio para desempenhar adequadamente suas funções, pois, por meio do processo químico de respiração celular, são capazes de gerar a energia necessária para seu perfeito funcionamento e produção de trabalho. Para isso, é necessário que as estruturas pulmonares, a integridade bioquímica e anatômica pulmonar estejam totalmente desenvolvidas, visto que são de vital importância para o estabelecimento da função respiratória após o nascimento (LOBATO, 2011; RADOSTITS, 2000).
et al. (2002) com a administração pré-natal de corticosteroides em mulheres gestantes resultou em maior concentração e menor inativação de surfactante pulmonar. Para Díaz et al. (2000) a resposta do pulmão fetal à administração de corticosteroides é variável e o impacto a outros sistemas pode contribuir para um menor resultado clínico. O tratamento materno com glicocorticoide é também utilizado para mimetizar a secreção fetal de cortisol, o que induz à disponibilidade de glicogênio e glicose (FRANKO et al., 2007).
É sabido que quase a totalidade dos trabalhos científicos desenvolvidos no Brasil e em outros países é realizada com bezerros e potros, com pouquíssima atenção para os animais das espécies ovina e caprina. Sem dúvida, os avanços da biotecnologia (Produção in vitro, clonagens) têm trazido grandes benefícios à pecuária nacional, principalmente no que tange à rápida melhoria genética dos rebanhos. Contudo, vários problemas têm sido observados em decorrência dos mesmos, tais como: maior intervenção aos trabalhos de parto em virtude da elevada taxa de distocias em fêmeas primíparas, causadas pelo seu menor diâmetro pélvico e/ou pelo grande tamanho dos produtos gerados por técnicas avançadas de concepção; e necessidade de melhor e mais intensiva assistência ao recém-nascido, pelo desenvolvimento de inúmeras alterações orgânicas e funcionais (acidose respiratória e metabólica, falha de transferência de imunidade passiva, hipertensão, arritmias cardíacas, espessamento excessivo do cordão umbilical, entre outras). Infelizmente, poucos profissionais conhecem e militam na área de neonatologia veterinária, sendo cada vez mais necessárias pesquisas que viabilizem informações importantes aos colegas, para que procedimentos, durante o período perinatal, tenham sucesso e auxiliem a reduzir a taxa de morbimortalidade de animais recém-nascidos pecuários, e, em particular, de neonatos prematuros.
Objetivos Objetivo geral:
Avaliar o grau de maturidade pulmonar de cabritos nascidos a termo e prematuros pela análise do líquido amniótico, por meio de citologia, do teste de Clements e contagem de corpos lamelares.
Objetivos específicos:
Determinar, avaliar e comparar a vitalidade (escore Apgar), a temperatura retal, a frequência cardíaca e função respiratória (frequência e padrão respiratório) de cabritos nascidos a termo e prematuros, ao longo das 48 horas de vida;
Determinar, avaliar e comparar os valores séricos do volume globular (VG) e de hemoglobina (Hb), ao longo das 48 horas de vida;
Determinar, avaliar e comparar o equilíbrio acidobásico de cabritos nascidos a termo e prematuros, ao longo das 48 horas de vida;
Determinar, avaliar e comparar os níveis séricos de cortisol, glicose e lactato de cabritos nascidos a termo e prematuros, ao longo das 48 horas de vida;
Determinar, avaliar e comparar as taxas de morbi-mortalidade de cabritos em decorrência do grau de imaturidade pulmonar.
REFERÊNCIAS
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Hemogasométricos e Imunológicos de Caprinos Recém – Nascidos. 93 f.
CAPÍTULO 2 – COLHEITA E ANÁLISE DO LIQUIDO AMNIIOTICO DE CABRITOS NASCIDOS A TERMO E PREMATUROS.
RESUMO - O objetivo deste estudo foi avaliar a maturidade pulmonar de cabritos, por meio do teste de Clements, da análise citológica pela coloração de Azul de Nilo e Shorr e contagem de corpos lamelares no líquido amniótico (LA) de cabras. Bem como avaliar a viabilidade neonatal através do escore Apgar. Para tanto, foram utilizados 44 animais (20 cabras e 24 cabritos). Na coloração de azul de Nilo não demonstrou resultados satisfatórios, propondo-se a citologia utilizando a coloração de Hematoxilina-Shorr, demonstrando resultados mais condizentes com os aspectos clínicos observados nos animais estudados. O teste de Clements não apresentou resultados positivos, propondo-se a modificação do teste, o qual resultou em positividade em 50% e 25% das amostras pertencentes aos grupos I e II, para maturidade pulmonar. A contagem de corpos lamelares evidenciou uma variação de 8.000- 83.000/µL presentes no líquido amniótico de cabras. Concluindo que as análises do líquido amniótico pela citologia com Hematoxilina-Shorr e a contagem de corpos lamelares, são métodos eficazes para avaliar a maturidade fetal e que o alto percentual de resultados inconclusivos e negativos obtidos pelo teste de Clements modificado no presente estudo, tem que ser avaliado com cautela e juntamente com outros testes para obtenção de resultados mais precisos sobre a maturidade dos neonatos. O estudo demonstrou que cabritos prematuros nascidos com 143 dias de gestação são perfeitamente viáveis e que o tratamento materno com dexametasona não mostrou resultados significativos em relação à maturidade fetal nos cabritos estudados.
EVALUATION OF LUNG MATURITY OF FULL TERM AND PREMATURE GOAT KIDS BY ANALYSIS FROM AMNIOTIC FLUID
ABSTRACT – This study aimed to evaluate lung maturity of goat kids using Clements test, cytologic analysis through Nile Blue and Shorr staining, and amniotic fluid lamellar body counts. And to evaluate the feasibility neonatal according to the score Apgar Forty-four animals (20 does and 24 kids). With regards to Blue Nile staining, no showed satisfactory results. With regards to Blue Nile staining, this technique was considered unsatisfactory. Therefore, Haematoxylin-Shorr staining was used for cytology and the results correlated more to the clinical aspects observed in the animals. Clements test did not present positive results and a modification of the test was proposed, which resulted in a positive result for lung maturity in 50% of the samples from group I, 25% of the samples from group II, and none from group III. Lamellar body count presented a variation of 8,000-83,000/µL in the amniotic fluid of the does. The amniotic fluid analysis by cytology with Haematoxylin-Shorr and lamellar body count are efficient methods to evaluate fetal maturity. In addition, the high percentage of inconclusive and negative results obtained by the modified Clements test in this study show that it must be evaluated cautiously and with the results obtained from other tests which evaluate neonatal maturity more precisely. The study demonstrated that premature kids born after 143 days of gestation are perfectly viable, and that the maternal treatment with dexamethasone did not present significant results in relation to fetal maturity.
Introdução
O crescimento fetal necessita de elementos orgânicos e inorgânicos, e com a análise dos fluidos fetais torna-se possível uma melhor compreensão de todo processo bioquímico que envolve a formação e o metabolismo do concepto. Os líquidos fetais são estudados com objetivo conhecer a fisiologia da gestação, acompanhar a viabilidade fetal, determinar o sexo do feto e possíveis aberrações cromossômicas (PIAGENTINI, 2008).
As membranas fetais compreendem o âmnion, saco vitelino, córion e alantóide. A placenta é formada quando o tecido fetal entra em contato, ou se funde, com o tecido materno para trocas fisiológicas (MOYA, 2005). Os animais domésticos possuem os líquidos alantóide e amniótico nas respectivas bolsas, diferenciando-se, assim, da mulher, que apresenta, como único líquido fetal, o fluido amniótico (GRUNERT & BIRGEL, 1984; MELO, 2008).
O âmnio é formado a partir de dobras do trofoblasto juntamente com a mesoderme avascular, e circunda completamente o embrião. Ele é constituído por dois folhetos e entre eles há o espaço amniótico contendo o líquido amniótico (ASBURYAC & LeBLANC, 1993; ZANELLA, 2008). O âmnio se apresenta intimamente ligado ao embrião sendo a primeira das membranas fetais, se considerarmos a ordem embrião-útero. Na fase gestacional em que o embrião se curva, o âmnion fica tão próximo ao mesmo que torna difícil sua remoção para estudo, sem que a manobra comprometa a morfologia do concepto (MORINI et al., 2008).
feto, a formação de urina, o fluxo de fluido através do úraco ou da uretra e das secreções fetais do pulmão e glândulas salivares.Ambos os fluídos amniótico e alantoideano diferem substancialmente na composição do que diz respeito a urina fetal (BANAN et al. 2011). Estudos sobre a composição de fluidos fetais foram feitos em bovinos, em humanos, em ovelhas, em búfalos, em porcos e em caprinos; contudo, apenas poucos fatores ao longo de um período relativamente curto de gestação foram avaliados (KHADJEH et al., 2007).
Desde a mais remota antiguidade os autores especularam a origem do líquido amniótico. Há relatos de que o líquido amniótico formava-se à custa da urina fetal, baseando-se, provavelmente, na semelhança de suas características físicas. No século XX, numerosas experiências feitas em animais e no próprio homem, com corantes, isótopos marcados e outros meios, forneceram subsídios relevantes ao conhecimento da sua dinâmica (MOYA, 2005). Existem, pelo menos, quatro locais em que podem ocorrer a absorção e a secreção: o sistema respiratório, o urinário, o digestivo e a pele (HAFEZ & HAFEZ, 2004; MELO, 2008; TONIOLLO & VICENTE, 1995).
No início da gestação, o líquido amniótico (LA) é produzido a partir de secreções do epitélio amniótico e da urina fetal. Posteriormente, com o desenvolvimento da gestação, o esfíncter vesical impede a liberação da urina fetal para a cavidade amniótica; sendo assim, a saliva e as secreções nasais fetais passando a fazer parte da composição do líquido amniótico. O líquido amniótico tem também como funções manter a temperatura corporal, proteger contra desidratação, prevenir a aderência entre o feto e o âmnio, promover a dilatação da cérvice, vagina e vulva durante o parto, facilitando a passagem do feto, além de inibir o crescimento bacteriano e participar da homeostasia de líquidos e eletrólitos (MELO, 2008; MOURA et al., 2009; VELHO et al., 2001; WINTOUR et al., 1986).
Embora escassos, os primeiros estudos em medicina veterinária para se analisar a fisiologia e o comportamento bioquímico do LA, obtido por amniocentese, foram realizados em ovinos (Mc DOUGAL, 1949; MELLOR e SLATER, 1972).
Leibo & Rall (1990). Em ovinos, Mellor e Slater (1972) indicaram a cateterização para se obter os líquidos fetais; Lovell et al. (1995) recomendaram, em caprinos, a ultrassonografia como guia da via aspirativa, entre 59 a 65 dias de gestação, como técnica ideal.. Prestes et al. (2001) determinaram os níveis de glicose, uréia, creatinina, gamaglutamiltransferase (GGT), sódio, potássio, cloro, proteínas totais e pH no LA de ovinos, utilizando a técnica com sucesso. Já na espécie canina, a amniocentese foi realizada por Barreto em 2006, o qual empregou o procedimento cirúrgico (cesariana) para obtenção dos fluidos fetais de cadelas, com o intuito de avaliar a maturidade pulmonar dos fetos desta espécie. Para obtenção de fluidos fetais, o método eleito é o da amniocentese transabdominal, sendo procedimento seguro, que pode ser realizado no ambulatório (BAETZ et al., 1976; DOMINGUEZ et al., 2006; HERVEY e SLATER, 1967; MELLO, 2008; WINTOUR et al., 1986 )
Antes do nascimento não existem alvéolos maduros. Assim, além das células endoteliais e das células epiteliais alveolares achatadas, outro tipo celular está relacionado no processo de maturação pulmonar, que são as células epiteliais alveolares tipo II, as quais produzem o surfactante, um líquido rico em fosfolipídios (dipalmitoil, fosfatidilcolina e fosfatadilglicerol), o qual é capaz de reduzir de forma significativa a tensão superficial na interface aéreo-alveolar. Sua composição é de 80% de fosfolipídeos, 8% de lipídeos e 12% de proteínas (LOBATO, 2011; SMITH, 2006).
O surfactante é sintetizado e secretado pelas células do tipo II, como resultado de uma complexa sequência de eventos bioquímicos. A síntese e secreção são iniciadas pela ventilação ao nascimento (SEZIK et al., 2007). O surfactante pulmonar tem sido estudado em animais como modelo experimental para medicina humana (CHRISTMANN et al., 2009). A partir da década de 80 pesquisadores estudaram surfactantes de várias origens (humano, suíno, bovino e sintético) e isto promoveu a disponibilização dos surfactantes para uso clínico na rotina médica humana (REBELLO et al., 2000) No entanto, poucos relatos existem sobre alterações do surfactante pulmonar, e a ocorrência natural de doenças respiratórias em animais de grande porte (CHRISTMANN et al., 2009).
Pattle descreveu as propriedades, função, e origem da camada de revestimento alveolar. Pouco tempo depois disso, a ligação entre a deficiência do surfactante e a sindrome da angustia respiratoria (SAR) em humanos foi estabelecida (ROTA et al., 2006).
As consequências clínicas da ausência desse líquido pulmonar (surfactante pulmonar) podem ser observadas em várias situações. Em humanos, neonatos prematuros que não possuem surfactante apresentam grande dificuldade para insuflar os pulmões, especialmente nas primeiras respirações. Mesmo quando seus alvéolos são insuflados artificialmente, é grande a tendência ao colapso espontâneo, por seus alvéolos serem menos estáveis sem surfactante pulmonar. Por essa razão, a ausência dessa substância ou alterações na quantidade ou qualidade dos fosfolipídios que o compõem, em um neonato prematuro, podem ser fatores importantes para desenvolvimento de síndrome da angustia respiratória (SAR) neonatal, também conhecida como síndrome da membrana hialina. Como consequência poderá ocorrer atelectasia progressiva, edema, alteração da relação ventilação/perfusão, levando à hipóxia tecidual; (DUBIN et al., 2000; GRENACHE; GRONOWSKI, 2006; LOBATO, 2011; WIJNBERGER et al., 2001).
Em 2008, a SAR esteve em oitavo lugar entre as principais causas de óbitos infantis, nos Estados Unidos (DEATHS, 2008). A probabilidade de desenvolver SAR diminui com o aumento da idade gestacional. A capacidade de prever o risco da síndrome antes do parto permite aos médicos, ou atrasar a entrega de um lactente imaturo (a fim de administrar os esteróides para acelerar o desenvolvimento pulmonar fetal) ou optar por entregar um recém-nascido prematuro cujos pulmões estão maduros (ZHAO et al., 2013).
Além disso, descobriu-se que a composição do surfactante pulmonar e sua função variam de acordo com as espécies animais (BERNHARD et al., 2001; RAU et al., 2004). Existem poucos estudos que avaliam alterações do surfactante e as doenças que ocorrem naturalmente pela sua falta em medicina veterinaria (CHRISTMANN et al., 2009).
Para análise do líquido amniótico (LA), existem diversos métodos, incluindo a medida da relação lecitina/esfingomielina (L/E), dosagem do fosfatidilglicerol (PG), teste de Clements, contagem de corpos lamelares (CCL), relação surfactante/albumina (S/A), determinação da absorbância do LA a 650nm, além da citologia do LA (COSTA et al., 2001; DALENCE et al., 1995). A maturidade fetal também é evidenciada pela citologia do LA, de acordo com a classificação do aspecto morfológico, tamanho, tipos e propriedades tintoriais das células deste líquido (GORDON et al., 1967; ZOGNO, et al., 2004).
A identificação de PG no LA oferece garantia de maturidade pulmonar ao nascimento, mas é método extremamente caro e demorado (BERTINI et al., 1992; LUZ et al., 2003; TABORDA et al., 2000).
Segundo Grenache & Gronowshi (2006) a relação S / A é um dos testes mais amplamente disponível e utilizado na medicina humana nos Estados Unidos, no entanto, pela descontinuação do teste, este, vai ter que ser substituido ao longo do tempo. Conforme dados da pesquisa a incapacidade de ordenar a relação S / A irá provavelmente aumentar solicitações para a relação L / E ou para contagem de corpos lamelares.
O surfactante pulmonar é estocado pelos corpos lamelares, os quais são estruturas carregadas para o espaço alveolar através dos movimentos respiratórios fetais e exsudação de líquido, sendo facilmente demonstradas no LA através da microscopia eletrônica. Vários estudos têm demonstrado que os corpos lamelares aumentam com o progredir da gestação e a sua determinação no LA tem boa correlação com outros indicadores de maturidade pulmonar fetal. Este teste, por ser rápido, de baixo custo, requer pequeno volume de amostra e instrumental acessível à maioria dos laboratórios, tem sido proposto como teste de triagem para avaliação da maturidade pulmonar; (COSTA et al., 2001; CARRILLO et al, 1997; DALENCE et al.,1995; DUBIN et al., 2000; LUZ et al., 2003; ROTA et al., 2006;; WIJNBERGER et al., 2001).
Aguns autores relatam que apenas se o resultado der positivo para a CCL, outro teste rápido deve ser utilizado. E que aquelas amostras que apresentarem ainda um segundo resultado positivo para maturidade fetal, deve-se finalmente ser examinada para razão de L / E e PG, e que esta técnica pode substituir a relação L / E (PIAZZE et al., 2005; ROSS et al., 2002). Greenspoon et al. (1995) e Haymond et al. (2006), demonstraram que a CCL se mostra tão eficaz quanto a relação S / A, na avaliação da maturidade fetal.
Alguns testes são usados para averiguar a quantidade de surfactante no liquido amniótico, como o Shake Test ou Teste de Clements e o Tape Test. Estes testes são considerados simples, rápidos e de baixo custo. A mensuração baseia-se na formação e estabilidade de bolhas, quando se mistura, o liquido amniótico, em diferentes diluições, com etanol. Quanto maior a estabilidade das bolhas, maior será a quantidade de surfactante presente (Barreto, 2006). O teste de Clements (CL) é o método mais amplamente utilizado na prática obstétrica diária. Constitui-se em prova rápida, simples, econômica e não apresenta, praticamente, resultados falso-positivos (BERTINI et al., 1992; LUZ et al., 2003; TABORDA et al., 2000).
Mediante o estudo citológico do LA e suas modificações em relação ao período gestacional, pode ser factível a determinação da maturidade do concepto. Na literatura, preconiza-se a classificação dos tipos celulares de acordo com o tamanho, o aspecto morfológico e as propriedades tintoriais (MOYA, 2005). As células de descamação são classificadas como elementos em suspensão e são resultantes da ação natural esfoliante da superfície fetal, principalmente da pele e da superfície do âmnio, com isso com o decorrer da gestação e como as células do epitélio amniótico são escassas e de descamação lenta, espera-se que se acumulem e “envelheçam”, permitindo seu encontro em maior número quanto mais avançado a idade gestacional (PRESTES, 2001). Levando em consideração ainda que o grau de desenvolvimento da pele fetal aconteça em momentos semelhantes ao desenvolvimento pulmonar, a citologia do líquido amniótico seja uma alternativa para predizer o grau de maturidade pulmonar. BONGSO & BASRUR (1977) já ressaltavam a importância da avaliação citológica dos fluidos fetais na espécie bovina como indicativo da maturidade fetal. Em humanos, as células alaranjadas, coradas por Azul de Nilo, presentes no líquido amniótico oferecem resultados consistentes quanto a maturidade fetal (KJELDSBERG & KNIGHT, 1993). Em ovinos, essas células alaranjadas praticamente inexistem no início da gestação, aparecendo em pequena proporção no terço médio e se proliferam até o momento do parto revelando que a análise citológica é um bom meio para predizer a idade fetal (SOUZA et al., 2000).
entre outras. Em um estudo realizado por Martins e Prestes (2003) sobre a citologia do LA de cadelas, foi comparado os métodos de colorações de Hematoxilina Shorr, Giemsa e Diff- Quick, e concluindo que apesar da coloração pelo método de Hematoxilina-Shorr ser trabalhosa e, portanto, mais lenta, permite melhor avaliação da morfologia e determina com mais exatidão o estágio de maturação fetal, em virtude de suas características tintoriais.
Em seu relatório de 2008, McGinnis e colaborades observaram um declínio no número de testes realizados para predição da maturidade fetal em 1994. Grenache & Gronowski (1996) apoia as evidências desse declínio nos testes realizados anualmente nos Estados Unidos. E que os testes diagnósticos de maturidade fetal não vão se tornar obsoleto em um futuro previsível. Ainda assim, os médicos relatam não estão prontos para abandonar esses meios, e que 92% destes médicos, não seriam capazes de fornecer suporte adequado ao paciente sem o benefício de tais testes.
Em contraste com a medicina humana o sucesso dos testes diagnósticos do liquido amniótico ou terapia de reposição de surfactante permanecem limitados na medicina veterinária. E o teste ideal para avaliar a maturidade pulmonar fetal na realidade da medicina veterinária, baseia-se no conhecimento e familiaridade do profissional envolvido, que seja de fácil execução, com gastos mínimos, e equipamentos simples.
Materiais e Métodos
O presente estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal da Faculdade de Medicina Veterinária, UNESP/Araçatuba (CEUA, 2014-00473).
mg de dexametasona (Azium®, Schering-Plough), por via intramuscular, 36 horas antes da cirurgia.
Os animais foram mantidos a pasto e suplementados com silagem e ração comercial, indicada para a espécie caprina (Figuras 1 e 2). Próximo à data prevista da realização da cesariana, transferiu-se os animais para a baia, para facilitar o manejo.
O bode utilizado como reprodutor era marcado na região peitoral com tinta a cada 36 horas, sendo a sua cor alterada a intervalos de 15 dias. Com as datas de cobertura das cabras conhecidas, realizou-se exame ultrassonográfico (DP 2200 Vet, Mindray) abdominal para confirmação da gestação entre 45 e 60 dias após a última data de cobertura.
O procedimento anestésico adotado nas cirurgias cesarianas empregou a anestesia local com bloqueio paravertebral proximal nos ramos nervosos das vértebras T13, L1 e L2, utilizando-se cloridrato de lidocaína (Xylestesin® 2%, Cristália), no volume de 5 mL em cada ponto dorsal e ventral aos processos transversos. Associou-se a anestesia peridural lombossacra (L6- S1) com sulfato de morfina (Dimorf®, Cristália) na dose de 0,1 mg/kg diluída em 5 mL de solução fisiológica. Nos casos em que a anestesia paravertebral não foi eficiente, realizou-se bloqueio infiltrativo no local da incisão com cloridrato de lidocaína. As colheitas das amostras foram realizadas em cabras submetidas à cesariana. Após a tricotomia, a fêmea permanecia na mesa cirúrgica onde realizava-se a incisão em região do flanco esquerdo. O útero era localizado e exteriorizado, verificando-se a melhor região para a realização da incisão uterina, a fim de se evitar hemorragia excessiva e a contaminação da amostra com sangue. Após a exposição placentária rompia-se delicadamente a membrana corioalantóideana e amniótica, e com uma seringa de 20 mL e agulha 40x12 retirava-se a maior quantidade de LA possível (Figuras 3 e 4).
As amostras foram mantidas refrigeradas em isopor com gelo reciclável, durante todo procedimento cirúrgico, sendo, posteriormente, separadas em alíquotas e congeladas a -18º C.
contaminações). Além da técnica de azul de Nilo, realizou-se, concomitantemente, o método de Hematoxilina–Shorr, utilizado por Moya (2005), como método alternativo. Da mesma forma, além do teste de Clements et al (1972), e o teste modificado sugerido por Barreto (2006), o presente estudo realizou modificações no teste proposto por Clements. Todos os dados obtidos foram anotados em fichas individuais (Figura 5).
FIGURA 1 e 2 - Animais utilizados no projeto
FIGURA 5 – Ficha de acompanhamento individual, onde foram anotados os dados obtidos após análises do líquido amniótico.
Método citológico pela coloração de azul de Nilo a 0,1%- Uma gota
(50uL) de LA foi colocada sobre uma lâmina de vidro e diluída em uma gota (50uL) de corante Azul de Nilo a 0,1% (Figura 6). Foi feito as lâminas em duplicata e um total de 500 células foram analisadas. Posteriormente, esta lâmina era coberta por uma lamínula e observada à microscopia óptica com objetiva de 40 vezes, para facilitar a visualização do campo para a contagem, e em outra objetiva de 100 vezes, para evidenciar as nuances celulares. As porcentagens de células orangeofílicas (alaranjadas) foram relacionadas com as cianofílicas (azuladas). A observação de proporção superior a 10% é considerada significativa para a maturidade fetal.
Método citológico pela coloração de Hematoxilina-Shorr- Foi
colocada uma gota do líquido amniótico em uma lâmina, priorizando a fração mais mucosa do liquido, e depois se realizava o esfregaço. As lâminas foram feitas em duplicata e um total de 500 células foram analisadas. Após secagem
cabr
desta lâmina, por cerca de 20 minutos, realizava-se a coloração de Hematoxilina-Shorr. As lâminas passaram por 19 fases de coloração, seguindo as recomendações de Oliveira, et.al. (2000) (Figura 7). As células foram observadas à microscopia óptica com objetiva de 40 vezes, para facilitar a visualização do campo para a contagem, e em outra objetiva de 100 vezes, para evidenciar as nuances celulares. O percentual de células orangeofílicas e cianofílicas foi avaliado.
FIGURA 6 – Preparo daslâminas coradas pela técnica Azul de Nilo
FIGURA 7 e 8 - Demonstrando lâmina com amostra do liquido amniótico e as passagens da coloração Hematoxilina- Shorr.
suporte adequado. A persistência de um anel intacto de bolhas na interface ar/líquido após 15 minutos de observação configura o resultado positivo. (CLEMENTS et al., 1972; COSTA et al., 2001; TABORDA et al., 2000). Caso ocorressem problemas, como os verificados por Barreto (2006), que ao realizar a técnica proposta por Clements não se constatou halo de espuma em nenhum dos tubos, optava-se pela não diluição das amostras com solução fisiológica (teste de Clements modificado) conforme realizado por Barreto (2006).
QUADRO 1- Diluições utilizadas para a realização do teste de Clements et al. (1972).
1°. Tubo 1,0 mL LA + 1,0 mL Etanol 95%
2°. Tubo 0,75 mL LA + 0,25 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
3°. Tubo 0,50 mL LA + 0,5 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
4°. Tubo 0,25 mL LA + 0,75 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
5°. Tubo 0,20 mL LA + 0,8 mL SF + 1,0 mL Etanol 95%
Teste de Clements modificado por Barreto (2006)- O teste de
Clements modificado por Barreto (2006) tem como base a reação de saponificação dos surfactantes presentes. Realizaram-se diluições gradativas dos fluídos com etanol a 95%, observando-se possíveis halos de espuma nos tubos de ensaio. O halo recebe valores de 0 a 4 de acordo com a sua intensidade. Como preconiza o teste, opta-se pela exclusão da diluição com um 1 mL de solução fisiológica. (BARRETO, 2006). (Quadro- 2).
QUADRO 2 - Teste de Clements modificado, proposto por Barreto (2006).
1°. Tubo 0,9 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
2° Tubo 0,8 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
3° Tubo 0,7 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
4° Tubo 0,6 mL (LA)+ 1 mL (Etanol 95%)
de resultados: (1) negativo ou "imaturo" - não-persistência de bolhas no 1º tubo ou somente nos 2 primeiros tubos e ausente no 3º, (2) inconclusivo - formação de halo até 3º tubo, e (3) positivo ou "maduro" - espuma estável até o 4º tubo.
QUADRO 3 - Teste de Clements modificado no presente estudo.
1°. Tubo 2,0 ml de LA + 0,5 ml (Etanol 95%)
2°. Tubo 1,75 ml de LA + 0,5 ml de (Etanol 95%)
3°. Tubo 1,50 ml de LA + 0,5 ml de (Etanol 95%)
4°. Tubo 1,25 ml de LA + 0,5 ml (Etanol 95%)
Contagem de corpos lamelares (CCL)- As amostras de LA foram
descongeladas em recipiente contendo água e gelo reciclável. Após o descongelamento, as amostras foram diluídas de acordo com Machado. (2008), sendo homogeneizadas durante dois minutos e testadas no analisador hematológico. no canal de plaquetas, O equipamento foi calibrado com os parâmetros utilizados para a contagem de plaquetas para as espécies (rato, camundongo e coelho), sendo passada as amostras três vezes em cada modo (espécie), chegando-se, então, a média dos valores. Como já citado a CCL foi realizada no canal de plaquetas em analisador hematológico BC-2800 VET Mindray®, por medida volumétrica e por meio da distribuição de tamanho, comparando-se a curva logarítmica (tecnologia de fluxo de arraste (FAKHOURY et al., 1994; LEWIS et al., 1999; CARRILLO et al., 1997). Necessitando-se de 0,5 mL de LA por amostra. Seis amostras de L.A, duas de cada grupo (com 2 mL, aproximadamente) foram encaminhadas ao Laboratório de Microscopia Eletrônica (Biocell) da Universidade de São Paulo – USP de Ribeirão Preto, para processamento e posterior análise por meio da microscopia eletrônica (MET JEOL JEM 100 CX II), com intuito de se avaliar a presença de corpos lamelares. A mensuração dos CL foi feita através de um programa editor de imagem denominado Image J ®
pelo teste de Bartlett. Quando os dados preenchiam os pré-requisitos, distribuição normal e variâncias homogêneas, foi utilizado o ANOVA com pós-teste de Tukey para compartivos entre grupos, e a avaliação entre os momentos dentro de cada grupo, foi realizada utilizando o ANOVA de medidas repetidas no tempo, com pós-teste de Tukey. Nos casos em que não houve normalidade e homogeneidade de variâncias, foram utilizados testes estatísticos de Kruskall-Wallis seguido do pós-teste de Dunn para compartativo entre grupos e a avaliação entre os momentos dentro de cada grupo foi realizada utilizando o teste de Friedman seguido do pós-teste de Dunn. Os testes de comparação entre medias descritos acima foram realizados utilizando o programa GraphPad-Prism (versão 6.0 para Windows, GraphPad Software, San Diego Califórnia EUA). Para avaliação dos testes de APGAR e de Clements foi utilizado o teste exato de Fisher, utilizando o pacote estatistico R versão 3.2.2. Todos os testes descritos foram realizados considerando estatisticamente diferentes as comparações com valores de p<0.05.
Resultados e Discussão
Foram acompanhados os nascimentos de 28 animais oriundos de cesarianas, sendo excluídos quatro cabritos, em decorrência de problemas encontrados durante a parturição, tais como feto enfisematoso e nascimento de trigêmeos, os quais, por terem pesos e vitalidade muito abaixo dos índices de normalidade, vieram a óbito imediatamente após o nascimento. Não foi observada mortalidade nos recém-nascidos utilizados, demostrando que cabritos prematuros oriundos de cesarianas eletivas, aos 143 dias gestação, são perfeitamente viáveis, contrariando Smith & Sherman (2009), que relatam a inviabilidade de cabritos nascidos abaixo de 144 dias.
tornando-se inviável a realização dos testes diagnósticos para maturidade pulmonar a fresco.
Rota et al. (2006) relataram que o congelamento reduziu de 18.316 / µL para 10,789 µL em amostras congeladas de líquido amniótico de éguas, tornando-se importante o estabelecimento de valores relacionados ao armazenamento das amostras.
A avaliação macroscópica do líquido amniótico das cabras dos diferentes grupos foi semelhante, evidenciando características fisiológicas normais do líquido amniótico (Tabela 1). Observou-se que na coloração por Azul de Nilo houve um percentual elevado de células cianofílicas em todas as amostras, correspondendo a 97% no grupo I, a 98% no grupo II, e a 98% no grupo III (Gráfico 1). Já o percentual de células orangeofílicas foi de 3%, 2%, e 2% nos grupos I, II e III, respectivamente. Esperava-se maior percentual de células orangeofílicas, tendo em vista o grau de maturidade apresentado pelos cabritos do presente estudo, ao contrário do que foi observado por Souza et al. (2000) para a espécie ovina e Bongso & Basrur (1975) para a espécie bovina, que obtiveram resultados satisfatórios com a técnica. Os dados do presente estudo assemelham-se com os encontrados por Moya (2005) que não obteve resultados consistentes com o uso da coloração com o Azul de Nilo para espécie bovina. Destaca-se, ainda, a subjetividade observada na execução da técnica, pois algumas células coravam-se em verde claro, o que fugia das variações das colorações preconizadas (azul e laranja), tornando a interpretação do avaliador subjetiva. Na análise das células do líquido amniótico pela coloração de Hematoxilina-Shorr os resultados se mostraram mais consistentes, levando em consideração o grau de maturidade apresentado pelos cabritos, tendo em vista maiores porcentagens de células orangeofilicas encontradas (77% no grupo I, de 69% no grupo II e de 79% no grupo III), condizentes com maturidade fetal (Gráfico 2). As porcentagens de células cianofílicas foram de 23%, 33% e 21% nos grupo I, II e III, respectivamente. Células cianofílicas e orangeofílicas coradas pelas duas técnicas utilizadas estão ilustradas nas (Figuras 8 e 9).
fidedigna do que às das colorações do tipo Romanowisk. No presente estudo não foi utilizado nenhum tipo de centrifugação para confecção das lâminas coradas pelo método Hematoxilina-Shorr. Constatou-se que quando as amostras não eram centrifugadas as lâminas apresentavam maior número celular, em virtude da porção mais mucoide do líquido amniótico. Ao se realizar a centrifugação, o muco é separado, retendo, portanto, a maior parte das células do liquido amniótico. A confecção e leitura das lâminas não ultrapassaram 60 minutos, fato importante, tendo em vista que a rapidez para que se tenha o resultado sobre a maturidade fetal é relevante do ponto de vista clínico, por propiciar rápida decisão sobre a conduta terapêutica e de reanimação mais eficiente a ser aplicada. A técnica mostrou-se exequível por necessitar apenas de lâminas, dos constituintes da coloração e de microscópio para sua realização. Esperava-se obter maiores percentuais de células cianofílicas nos grupos de animais prematuros, porém esses animais apresentavam aspectos de maturidade nas variáveis avaliadas no presente estudo, contrariando as afirmações de Pugh (2009) de que cabritos com idade gestacional inferior a 144 dias de vida não são viáveis. O grupo III (prematuros + dexametasona) apresentou o maior percentual de células orangeofílicas dentre os animais avaliados. Entretanto, faz-se necessário, maiores esclarecimento sobre o assunto, pois os animais do presente estudo demonstraram sinais de maturidade, o que torna difícil a discussão sobre os efeitos da dexametasona na maturidade fetal.
Tabela 1 - Dados individuais das características do LA pertencente aos grupos I (149 dias), II (143 dias ) e III (143 dias + Dexametasona)
AVALIAÇÃO MACROSCOPICA
Animais Volume (ml) Coloração Aspecto Viscosidade (o-5) Contaminação
C1 30 Clara Turvo 4 Ausente
C2 40 Clara Transparente 2 Ausente
C3 60 Clara Transparente 2 Ausente
GRUPO I C4 60 Clara Turvo 5 Ausente
C5 40 Clara Transparente 3 Ausente
C6 60 Clara Turvo 4 Ausente
C7 50 Clara Transparente 3 Ausente
C8 20 Clara Transparente 3 Ausente
C1 40 Amarelado Transparente 2 Mecônio +
C2 50 Clara Turvo 3 Ausente
C3 50 Clara Turvo 5 Ausente
GRUPO II C4 60 Clara Turvo 5 Ausente
C5 60 Clara Transparente 3 Ausente
C6 50 Clara Turvo 4 Ausente
C7 40 Clara Transparente 2 Ausente
C8 60 Clara Transparente 3 Ausente
C1 60 Clara Turvo 4 Ausente
C2 60 Clara Transparente 2 Ausente
C3 60 Clara Transparente 3 Ausente
GRUPO III C4 80 Clara Transparente 2 Mecônio +
C5 40 Clara Transparente 1 Ausente
C6 60 Clara Turvo 5 Ausente
C7 80 Clara Transparente 3 Ausente
C8 30 Clara Transparente 3 Ausente
FIGURA 9 - Fotomicrografia de células coradas pelo método de Hematoxilina - Shorr pertencente ao Grupo I (149 dias), em aumento de 400 vezes/campo, evidenciando maior quantidade de células orangeofílicas.
Gráficos 1 e 2- Percentuais de células cianofílicas e orangeofílicas coradas pelo método Azul de Nilo e Hematoxilina-Shorr nos grupo I (149 dias), grupo II (143 dias) e grupo III (143 dias + dexametasona).
O teste descrito por Clements et al. (1972) não evidenciou nenhum resultado positivo para maturidade pulmonar nas amostras de LA das cabras avaliadas. O mesmo foi observado com o teste de Clements modificado por Barreto (2006). Diante de tais resultados, propôs-se a realização de uma nova adequação do referido teste. Dessa forma, várias diluições foram realizadas para se obter resultados confiáveis para a espécie caprina. Analisando-se os dados obtidos (Tabela 2), verificou-se que 50% das amostras pertencentes ao
0 50 100
Grupo I Grupo II
Grupo III
Azul de Nilo
Ciano
Orange 0 50 100
Grupo I
Grupo II
Grupo III
Hematoxilina-Shorr
Ciano
grupo I e 25% das amostras do grupo II mostraram-se positivas para maturidade pulmonar (figura 10), sendo que os animais do grupo III não demonstraram resultados positivos no teste. 12,5% (grupo I), 37,5% (grupo II) e 50% (grupo III) das amostras de líquido amniótico apresentaram-se negativas para maturidade pulmonar. Os resultados inconclusivos ficaram em 37,5%, 37,5% e 50% nos grupos I, II e III, respectivamente. Segundo Luz et al. (2003), avaliando diferentes testes para predição de maturidade pulmonar do LA de mulheres, observaram que a especificidade do teste de Clements foi de 47,5%, sendo a contagem de corpos lamelares e a relação surfactante/albumina de 83,6% 93,4%, respectivamente. Amorim et al. (2003) verificaram que a acurácia do teste de Clements variou de 70 – 85%, e os resultados falso-negativos entre 12-38%. Nomura et al. (2009) obtiveram cerca de 80% de casos positivos no teste de Clements no LA de gestantes após a 38ª semana de gestação.
Os resultados do presente estudo demonstraram que os animais do grupo I obtiveram o maior percentual de resultados positivos, acreditando-se ser em decorrência da maior idade gestacional desses animais. O grupo III (prematuros + dexametasona) apresentaram os piores resultados quanto à maturidade pulmonar, com um alto percentual de resultados inconclusivos.
Tabela 2 - Percentual do Teste de Clements Modificado no presente estudo.
Teste de Clements
Grupos
I II III
N % n % n %
Positivo 4 50 2 25 0 0
Negativo 1 12,5 3 37,5 4 50
Inconclusivo 3 37,5 3 37,5 4 50
FIGURA 10 – Imagem fotográfica do Teste de Clementes Modificado no presente estudo, pertencente a um animal do grupo I, em que demonstra o halo estável de bolhas nos quatro tubos, sendo indicativo de Maturidade Pulmonar.
Seis amostras de líquido amniótico foram enviadas para análise por microscopia eletrônica, constatando-se a existência de corpos lamelares (CL). Para avaliar o tamanho dessas estruturas, utilizou-se o programa Image J (Figura 11), a média obtida foi de 0,15 µm, sendo, portanto, de menor tamanho em relação aqueles obtidos do líquido amniótico de éguas, com cerca de 1-3 µm (Castagnetti et al., 2008). Na passagem das amostras de líquido amniótico pelo analisador automático BC-2800 VET Mindray®, foi observado que somente quando o aparelho era ajustado para leitura nos modos (rato, camundongo e coelho) se obtinha a leitura. Esse fato pode ser explicado pelo fato de que esses modos estão ajustados para leitura de estruturas (plaquetas) menores, portando condizendo com o pequeno tamanho dos corpos lamelares (0,15 µm) encontrado no liquido amniótico de cabras.
FIGURA 4 – Imagem do programa editor de imagens denominado “Image J®”, utilizado para mensurar os corpos lamelares. Figura demonstrando um corpo lamelar presente no líquido amniótico de cabra, evidenciando suas lâminas concêntricas, representada por uma camada delgada de diâmetros reduzidos, acompanhados por um centro em sua estrutura.
Denotou-se variação de 8.000 a 83.000/µL na quantidade de corpos lamelares presentes no liquido amniótico de cabras (Tabela 3). Os animais do grupo I possuíam as maiores concentrações nos três modos avaliados, resultados estes compatíveis com o tempo gestacional das cabras utilizadas no presente estudo. Ao contrário do que se esperava, obtiveram-se menores valores no grupo tratado com dexametasona do que nos animais do grupo II. Castagnetti et al. (2010) constataram variação de 18.000- 127.000/µL em mães de potros saudáveis nascidos a termo de partos eutócicos, pressupondo que a contagem de corpos lamelares superior a 18.000/mL está associada ao valor preditivo positivo na relação L/E .
Rota et al. (2006) verificaram contagem de 6.900/µL em potros saudaveis, após centrifugação e congelamento. Porém, relataram valores de 5.000 / µL em 12 amostras, inferiores aos descritos para mulheres, cadelas (Vannozzi et al., 2004) e éguas (Castagnetti et al., 2004). A relação L / E quanto à concentração de corpos lamelares mostrou grande variação em potros maduros, não sendo método válido para a avaliação da maturidade pulmonar.
Lewis et al. (1999) descreveram que no líquido amniótico humano não contaminado
LA das cabras, demonstrando a necessidade do estabelecimento de valores referenciais para a espécie caprina.
Segundo Grenache & Gronowski. (2006), amostras de fluido amniótico para CCL devem ser misturadas delicadamente, mas não centrifugadas. Piazze et al. (2005) reavaliaram o valor de corte ao longo de 10 anos em amostras centrifugadas (300 G durante 10 min), obtendo valor de 22.000 / µL (sensibilidade de 73% e especificidade de 81,7%). Anteriormente, Neerhof et al. (2001) reconheceram que a centrifugação não era necessária e dever-se-ia ser abandonada por afetar os resultados do teste. Em amostras não centrifugadas, a maturidade e imaturidade na espécie humana são sugeridas quando da contagem a partir de 50.000 / µL e igual ou inferior a 15.000 / µL, respectivamente.
Tabela 3 - Média (𝒙) e desvio-padrão (S) dos valores encontrados na contagem dos corpos Lamelares, em cabritos nascidos por cesariana aos 149 dias (Grupo I), cesariana prematura aos 143 dias (Grupo II), e cesariana prematura aos 143 dias após administração de dexametasona materna (Grupo III).
Espécies
GRUPOS
I II III
n 𝒙 ± S n 𝒙 ± S n 𝒙 ± S
(x109/L) Rat 8 74,37 ± 104,05 8 37,62 ± 60,49 8 7,87 ± 19,59 Mouse 8 82,68 ± 118,46a
8 50,31 ± 72,38ab
8 7,43 ± 21,03b Rabbit 8 61,68 ± 99,06 8 46,37 ± 66,21 8 18,37 ± 33,29 Asletras diferentes na linha, diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis .
viscosidade das amostras, relatando então não haver alteração nos componentes do líquido amniótico pela diluição com o fluidificante Diotreithol.
Recentemente, Szallasi et al. (2003) compararam a CCL a partir de quatro diferentes analisadores automáticos e encontraram diferenças quanto aos resultados obtidos, chegando a conclusão da necessidade da obtenção de valores específicos para cada tipo de analisador.
Foi verificado variação considerável na CCL nas amostras de líquidos amnióticos de cabras, fato também observado naquelas obtidas de mulheres (LEWIS et al., 1999; ROSS et al., 2002; PIAZZE et al., 2005) e de éguas (Castagnetti et al, 2010; Rota et al, 2006). Apesar da variabilidade em sua contagem, mostrou-se aplicavél à espécie caprina, necessitando, porém, de mais informações de animais com SDR e como estes, comportariam-se ao teste.
CONCLUSÃO
Os métodos diagnósticos utilizados no presente trabalho visando à predição da maturidade fetal em neonatos caprinos mostram-se eficazes, com cautela ao se avaliar o teste de Clements modificado. Como os recém-nascidos não demonstraram sinais característicos de imaturidade, não é possível inferir sobre o efeito da administração de 20mg de dexametasona, em cabras, 36 horas antes da cirurgia eletiva, no que tange ao desempenho da função pulmonar de cabritos prematuros.
REFERÊNCIAS
ALVAREZ, J. G.; RICHARDSON, D.K.; LUDMIR, J. Prediction of respiratory distress syndrome by the novel dipalmitoyl phosphatidylcholine test.
