UNIVERSIDADE SAGRADO CORAÇÃO
ROBERTO VENERANDO
“POLIMORFISMO DO CÓDON 72 (ARG E PRO) DO GENE TP53 POR PCR EM TEMPO REAL EM PACIENTES PEDIÁTRICOS INFECTADOS POR
HELICOBACTER PYLORI”.
BAURU 2012
ROBERTO VENERANDO
“POLIMORFISMO DO CÓDON 72 (ARG E PRO) DO GENE TP53 POR PCR EM TEMPO REAL EM PACIENTES PEDIÁTRICOS INFECTADOS POR
HELICOBACTER PYLORI”.
Dissertação apresentada à Pró-reitora de Pesquisa e Pós-graduação como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Oral, área de concentração:
Biologia Oral, sob orientação do Prof. Dr.
Spencer Luiz Marques Payão e co- orientação da Profa. Dra. Luciana Monte Lima Rivera.
BAURU 2012
Venerando, Roberto V456p
Polimorfismo do codon 72 (ARG e PRO) do gene TP53 por PCR em tempo real em pacientes pediátricos infectados por Helicobacter pylori / Roberto Venerando -- 2012.
42f.
Orientador: Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão Co-orientadora: Prof. Dr.Luciana Monte Lima Rivera
Dissertação (Mestrado em Biologia Oral) – Universidade Sagrado Coração – Bauru – SP.
1. Helicobacter pylori. 2. Polimorfismo TP53 codon 72. 3.
PCR - Tempo Real. I. Payão, Spencer Luiz Marques. II.
Rivera, Luciana Monte Lima. III. Título.
ROBERTO VENERANDO
“POLIMORFISMO DO CÓDON 72 (ARG E PRO) DO GENE TP53 POR PCR EM TEMPO REAL EM PACIENTES PEDIÁTRICOS INFECTADOS
POR HELICOBACTER PYLORI”.
Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Oral, área de concentração: Biologia Oral, sob orientação do Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão e co-orientação da Profa. Dra. Luciana Monte Lima Rivera.
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão Universidade Sagrado Coração
Prof.a Dr.a Juliana Garcia de Oliveira Universidade Sagrado Coração
Prof. Dr. Odair Francisco Faculdades Integradas de Ourinhos
Bauru, 29 de Fevereiro de 2012.
Dedico este trabalho aos meus familiares e alunos, por sempre me apoiarem e acreditarem em meu esforço.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de dirigir as primeiras palavras deste trabalho a todos os que, durante a sua realização, me colocaram desafios e disponibilizaram diversas formas de apoio, pelo que a todos expresso o meu reconhecido agradecimento. Sem a sua ajuda, este trabalho não teria sido possível.
À Comissão Coordenadora do Programa de Pós Graduação em Biologia Oral da Universidade sagrado Coração, em especial à Profa. Dra. Leda Aparecida Francischone, por me ter permitido e incentivado à frequência neste Mestrado.
Ao Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão e a Profa. Dra. Luciana Monte Lima Rivera, pelo empenho, incentivo, pelo tempo partilhado e pela exigência constante com que orientou este estudo, reconhecendo o privilégio de ter sido seu orientando.
Ao Me. Lucas Trevizani Rasmussen, Prof. Doutor Odair Francisco e Prof.
Dr. Luciano Lobo Gatti, por me terem sempre recebido com toda a simpatia e pelos seus ensinamentos. Sem eles esta dissertação, sem dúvida, não seria possível. Um muito obrigado!
Ao Prof. Me. Bianor Costa Freire Colchesqui, diretor das Faculdades Integradas de Ourinhos e ao Prof. Me. Gustavo Teixeira Neto pelo incentivo e compreensão durante esta jornada.
A todos os funcionários do Laboratório de Genética, Hemocentro, Faculdade de Medicina de Marília (FAMEMA), pela simpatia e disponibilidade, com que acolheram e participaram neste trabalho. Em especial ao Biomédico Roger Willian de Labio.
A todas Instituições que apoiaram este trabalho, Programa de Pós- graduação em Biologia Oral da Universidade Sagrado Coração, FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Faculdade de Medicina de Marília (FAMEMA), Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO).
A minha mãe Maria Marques R. Venerando, pai Arnaldo Venerando e avó Maria Conceição Ribeiro, pela sua paciência e apoio em todos os momentos.
E em especial a minha esposa Meire Andrade Venerando e filhos (Bruna, João Otávio, Thaís e Vitória) pela dedicação, compreensão e amor. Amo vocês.
“A ignorância afirma ou nega veemente; a ciência duvida”.
Voltaire (1694 - 1778)
RESUMO
A infecção crônica pelo H. pylori é adquirida na infância, e na ausência de antibioticoterapia adequada geralmente persiste por toda a vida, sendo este o principal fator etiológico da gastrite e ulcera péptica. A infecção crônica pela bactéria induz ao aumento dos índices de apoptose, que podem acelerar a progressão para gastrite atrófica, com consequente aumento do risco para desenvolvimento de câncer gástrico. As células ainda podem sofrer apoptose em resposta a sinais internos, incluindo alterações no DNA, com a participação de genes envolvidos no controle do ciclo celular, como o gene supressor de tumor TP53. Esse gene, denominado como o “guardião do genoma”, desempenha papel importante na manutenção da integridade do DNA e na indução de apoptose, eliminando, de forma seletiva, as células danificadas, e protegendo o organismo do desenvolvimento de neoplasias. O polimorfismo do gene supressor de tumor TP53, no códon 72, tem sido investigado extensamente para verificação de sua associação com neoplasias em todo o mundo. Este trabalho teve como proposições: genotipar e determinar a frequência alélica do polimorfismo do gene TP53 no códon 72 (Arg e Pro) e correlacionar às variações polimórficas com a idade e resultados histopatológicos, em amostras de DNA extraídas anteriormente de biópsia da mucosa gástrica de pacientes pediátricos infectados e não infectados por H. pylori, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real. Trezentos e quarenta e dois pacientes participaram do estudo, o DNA da biópsia gástrica foi extraído e a detecção de H.
pylori foi realizada por PCR. A discriminação alélica do SNP rs1042522 (TP53) foi realizada pela reação em cadeia da polimerase em tempo real. Os resultados mostraram não haver diferença estatisticamente significativa entre gênero e o polimorfismo do gene TP53 quando comparado com a positividade pelo H. pylori. No entanto observou-se uma associação estatisticamente significativa entre a idade e a positividade para H. pylori. Verificou-se que pacientes com idade ≤ 10 anos foram 1,3 vezes mais propensos a ter infecção pelo H. pylori quando comparados com pacientes com idade > 10 anos.
Palavras – chave: Helicobacter pylori. Polimorfismo TP53 códon 72. PCR – Tempo Real.
ABSTRACT
Chronic infection with H. pylori is acquired in childhood, and in the absence of appropriate antibiotics usually persists for life, which is the main etiologic factor of gastritis and peptic ulcer. Chronic infection by the bacteria leads to increased rates of apoptosis, which may accelerate the progression to atrophic gastritis, with consequent increased risk for developing gastric cancer. The cells can still undergo apoptosis in response to internal signals, including DNA damage, with the participation of genes involved in cell cycle control, such as tumor suppressor gene TP53. This gene, determined as the "guardian of the genome" plays an important role in maintaining the integrity of DNA and induction of apoptosis, eliminating selectively, damaged cells, and protecting the organism from cancer development.
Polymorphism of the tumor suppressor gene TP53, codon 72, has been investigated extensively to verify its association to cancer worldwide. This work was propositions:
to determine the genotype and allele frequency of the TP53 polymorphism at codon 72 (Arg and Pro) and polymorphic variations correlate with age and histopathological findings in samples of DNA extracted earlier biopsy of the gastric mucosa of patients infected and uninfected pediatric H. pylori by polymerase chain reaction in real time.
Three hundred and forty-two patients participated in the study, DNA was extracted from gastric biopsy and detection of H. pylori was performed by PCR allelic to discrimination of the SNP rs1042522 (TP53), was performed by polymerase chain reaction in real time. The results showed no statistically significant difference between gender and TP53 gene polymorphism compared with the positivity of H.
pylori. However there was a statistically significant association between age and positive for H. pylori. It was found that patients aged ≤ 10 years were 1.3 times more likely to have infection by H. pylori when compared with patients aged> 10 years.
Keywords: Helicobacter pylori. TP53 codon 72 polymorphism. PCR – Real Time.
LISTA DE TABELAS
Table 1 Detection of Helicobacter pylori by PCR and Your possible associate with age of patients.
39
Table 2 Genotype distribution of Tp53 polymorphisms and H. pylori Childhood.
39
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
H. pylori Helicobacter pylori
DNA Ácido Desoxirribonucléico
TP53 Gene supressor de tumor p53
ARG Arginina
PRO Prolina
PCR Polymerase Chaim Reaction
SNP Single Nucleotide Polymorphism CagA Cytotoxin associated gene A VacA Vacuolating cytotoxin
BabA Blood group antigen-binding adhesin IceA Induced by contact with epithelium IL – 8 Interleucina 8
PAI Ilhas de Patogenicidade
Bcl – 2 Proteína Reguladora de Apoptose Codificada pelo Gene Bcl-2
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
HPV Papiloma Vírus Humano
PCR – Real Time Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real IDH Índice de Desenvolvimento Humano
MSH2 Gene Associado ao Câncer Colorretal Sem Polipose Tipo 1
MLH1 Gene Associado ao Câncer Colorretal Sem Polipose Tipo 2
ATM Ataxia – Telangiectasia Mutaded gene product
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 12
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1 Aspectos Gerais do H. pylori. ... 14
2.2 O Gene TP53. ... 16
2.3 Polimorfismo do Gene TP53 (rs1042522, Arg/C:Pro/G). ... 18
3. PROPOSIÇÕES ... 20
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 21
5. ARTIGO ENVIADO PARA PERIÓDICO ... 27
5.1. Comprovante de Submissão... 27
6. ANEXOS ... 40
12
1. INTRODUÇÃO
A descoberta da bactéria Helicobacter pylori (H. pylori) em 1983, proporcionou inúmeras pesquisas sobre a patogenia das afecções gástricas, principalmente no campo da oncologia.1 Haja vista que a infecção por H. pylori é uma das infecções crônicas mais comuns e acomete metade da população mundial.2
O H. pylori é adaptado para colonizar somente a mucosa gástrica, distribuindo-se de maneira focal, segmentar ou difusa no estômago, onde podem localizar-se no fundo e no corpo, sendo o antro gástrico o local onde estas bactérias são encontradas em maior densidade.3,4
A infecção por H. pylori é adquirida no inicio da vida (quase sempre antes da idade de 10 anos), e na ausência de antibioticoterapia, geralmente persiste por toda a vida.5 Estudos relatam que quanto maior o intervalo de tempo para a detecção do H. pylori , maior o risco de desenvolver câncer.6,7 A erradicação deve ser realizada imediatamente após a detecção porque após o comprometimento irreversível da mucosa gástrica o tratamento não impede a carcinogênese.2,5,8,9,10
A taxa de proliferação de células epiteliais gástricas de pacientes infectados pelo H. pylori é significativamente mais alta, quando comparada a de indivíduos não infectados. A infecção crônica pela bactéria induz aumento dos índices de apoptose, que podem acelerar a progressão para gastrite atrófica, com consequente aumento do risco para desenvolvimento de câncer gástrico.11,12
As células ainda podem sofrer apoptose em resposta a sinais internos, incluindo alterações no DNA, com a participação de genes envolvidos no controle do ciclo celular, como o gene supressor de tumor TP53. Esse gene, eleito como o
“guardião do genoma”, desempenha papel importante na manutenção da integridade do DNA e na indução de apoptose, eliminando, de forma seletiva, as células danificadas, e protegendo o organismo do desenvolvimento de neoplasias.13
Os polimorfismos genéticos são alterações naturais na sequência do DNA que ocorrem em uma frequência maior que 1% na população normal. A forma mais comum de polimorfismo caracteriza-se como aquela que envolve a substituição de uma única base em uma sequência de nucleotídeos (SNP - Single Nucleotide Polymorphism).14 Algumas dessas alterações ocorrem em sequências não
13
codificadoras do gene e, na maioria dos casos, não tem efeito em suas funções;
outras ocorrem em sequências codificadoras, podendo levar à produção de proteínas defeituosas.15 Deste modo, em alguns casos o polimorfismo genético pode aumentar a suscetibilidade ao câncer.16
O polimorfismo no códon 72 do gene supressor de tumor TP53 (rs1042522, Arg/C:Pro/G), tem sido investigado extensamente para verificação de sua associação com vários cânceres em todo o mundo.17 O códon 72 codifica um aminoácido arginina (CGC; Arg72) ou um prolina (CCC; Pro72), correspondendo aos genótipos em homozigose arginina/arginina (Arg/Arg) ou prolina/prolina (Pro/Pro) e em heterozigoze arginina/prolina (Arg/Pro).18,19 O polimorfismo ocorre por simples substituição de uma base no códon, de guanina (G) para citosina (C), que resulta em alteração estrutural, bioquímica e biológica da proteína p53.20
A possibilidade do polimorfismo do gene TP53 no códon 72 contribuir na susceptibilidade ao câncer tem sido investigada em várias neoplasias, mas os resultados são controversos. O alelo Pro pode ser associado ao câncer de pulmão, e aparecem com uma frequência aumentada em pacientes com câncer de mama. 21, 22 Em contraste, o alelo Arg pode estar relacionado ao maior risco de câncer de colo de útero associado à infecção por papiloma vírus humano (HPV).23 No câncer gástrico, os resultados em relação a este polimorfismo ainda não foram completamente elucidados.24
Este trabalho teve como proposições: genotipar e determinar a frequência alélica do polimorfismo no códon 72 do gene TP53 (rs1042522, Arg/C:Pro/G), em amostras de DNA extraídas anteriormente da mucosa gástrica de pacientes pediátricos infectados por Helicobacter pylori, da cidade de Marília e região, atendidos no Serviço de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Marília, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real.
Comparar e correlacionar as variações polimórficas do gene TP53 com a idade e os resultados histopatológicos de pacientes pediátricos infectados e não infectados pelo Helicobacter pylori.
14
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos Gerais do H. pylori.
O H. pylori observado em microscopia ótica e eletrônica apresenta-se morfologicamente como uma bactéria gram-negativa, de estrutura encurvada ou espiralada, de superfície lisa e extremidades arredondadas, móvel e não esporulada.
Mede aproximadamente 0,5µm a 0,1µm de largura e 3µm de comprimento, possuindo de quatro a seis flagelos unipolares embainhados e bulbos terminais nas extremidades lisas.25,26
A importância clínica da infecção pelo H. pylori no desencadeamento de uma série de doenças gastrointestinais, incluindo a maioria das gastrites, úlceras duodenais e gástricas, consiste nas manifestações clínicas e histológicas serem sintomáticas ou assintomáticas e concomitantemente ao fato de perdurarem ao longo da vida, determinando drasticamente maior probabilidade de risco de câncer gástrico, correlacionando tal fato a uma alta mortalidade.27, 28,29,30
A prevalência de H. pylori não é homogênea em todo o mundo.31 Entre adultos nos países em desenvolvimento a prevalência é estimada em média de 80 a 90% e em países desenvolvidos apresenta-se menor que 40%. 1
Na França, a soropositividade em indivíduos menores de 18 anos é de 7%, enquanto na Argélia e na Costa do Marfim, está em torno de 62% e 64%, respectivamente.11
No Brasil, a prevalência de H. pylori pode atingir 80% dos indivíduos adultos, enquanto que a prevalência na América do Norte e Europa normalmente atingem 30-70%.32,33,34,35,36,37
Entretanto, no estado de São Paulo a prevalência do H. pylori em adultos sadios é de 65,6%; apresentando correlação com a raça, idade, exame endoscópico prévio, áreas populosas, tipo de água, falta de saneamento durante a infância, baixa renda e educação.38
Outros estudos envolvendo pacientes pediátricos em países em desenvolvimento mostram que a prevalência em crianças com faixa etária ≤ 10 anos de idade está acima de 50%. No entanto, os países desenvolvidos e aqueles que
15
tiveram um aumento em seu Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) os valores mostram uma redução em torno de 10% para esta faixa etária.2,6,39
Não está claro se a mucosa gástrica ou cavidade oral pode ser considerada um reservatório permanente ou transitório para o H. pylori. Os resultados obtidos pelo nosso grupo de pesquisa, utilizando-se do método da reação em cadeia da polimerase (PCR) estabelecem que o micro-habitat do H. pylori é a mucosa gástrica e a cavidade oral.40,41
Apesar dessas altas taxas de infecção, os mecanismos de aquisição e transmissão de H. pylori permanecem obscuros. As vias, fecal – oral, gastro - oral e oral - oral têm sido implicadas na transmissão da bactéria.40,41
A transmissão interpessoal é, entretanto, considerada a mais importante, conforme evidenciado em estudos com famílias que moram em condições de aglomeração. Estudos utilizando tipagem de DNA confirmaram que membros de uma mesma família tendem a ser infectados pela mesma cepa de bactéria.5,28,42,43
A infecção por H. pylori é responsável pela maior parte das patologias gastrointestinais, a maioria dos pacientes infectados não desenvolve qualquer complicação e permanece livre de sintomas clínicos óbvios, isto reforça o conceito de que certas cepas são mais virulentas que outras.44,45
Os fatores de virulência da H. pylori incluem CagA (cytotoxin associated gene A), o VacA (vacuolating cytotoxin), o BabA (blood group antigen-binding adhesin) e o IceA (induced by contact with epithelium) e dupA (duodenal ulcer promoting gene A).46,47,48
A proteína CagA, codificada pelo gene cagA, é uma proteína altamente imunogênica. Constitui um marcador genético denominada ilha de patogenicidade cag (cag-PAI), esta ilha de patogenicidade da bactéria determina um aumento do estado inflamatório da mucosa gástrica, através da infiltração de células polimorfonucleares e aumento de produção de IL-8.47,48,49
As cepas podem ser divididas em dois grupos em função da presença de cag- PAI: cepas tipo I que possuem o cag-PAI, denominadas cepas cagA +, e tipo II ou cagA - . Outro fator de virulência é a citotoxina VacA, que induz a formação de vacúolos em células eucarióticas e estimula a apoptose das células epiteliais.47,48,49
16
O gene babA codifica outra proteína de membrana, uma adesina denominada de BabA que se liga ao antígeno do grupo sanguíneo Lewis B nas células gástricas.11,50 Cepas que expressam BabA aderem mais firmemente às células epiteliais gástricas, sendo evidente que este gene pode influenciar a severidade da doença. Cepas H. pylori que possuem BabA, VacA e CagA tem um elevado risco para câncer gástrico.47,48,49,50
Outro possível fator de virulência descrito é o gene iceA (induzido pelo contato com o epitélio) que compreende duas variantes iceA1 e iceA2, não se conhecendo a função do iceA2. A expressão de iceA1 é aumentada pelo contato do H. pylori com as células epiteliais gástricas e em algumas populações é associado com a úlcera péptica.48,49
Recentemente, um novo fator de virulência, dupA, mostrou-se associado com a úlcera duodenal e aumento da secreção de IL-8 pelas células epiteliais. O gene dupA está localizado na região do genoma bacteriano que codifica proteínas de superfície. Esses achados, entretanto, não foram confirmados em estudo com crianças e adultos Brasileiros, indicando possíveis diferenças geográficas. Na Bélgica, África do Sul, China e EUA, verificou-se que a presença do gene dupA não está significativamente associado com a ulceração duodenal, mas com o desenvolvimento de câncer.47, 48
Os danos ao DNA são condições básicas para a perda da homeostase tecidual, o crescimento celular desordenado e a desregulação da apoptose. As mutações no gene TP53 são as lesões genéticas mais comuns no câncer humano, presentes em mais de 50% de todos os casos da doença.5
2.2 O Gene TP53.
Cerca de mais da metade (70%) dos cânceres humanos possuem principalmente uma deficiência na função do gene TP53.51 Este gene está situado no braço curto do cromossomo 17 (17p13.1), tendo como seu produto de transcrição uma fosfoproteína nuclear de 53 KiloDaltons (KDa) denominada de p53 em consequência de seu peso molecular. Esse gene possui 20 Kb e é composto por 11
17
éxons, sendo o primeiro não codificante, e altamente conservado, apresentando homologia estrutural entre diferentes espécies.52
Desempenha a função de “guardião do genoma”, pois monitora a integridade do genoma. Atua como um sensor de dano ao DNA e auxilia o sistema de reparo do mesmo, utilizando os momentos de checkpoints para paralisar o ciclo celular ou induzir a apoptose, prevenindo, assim, que ocorra a proliferação de células com o DNA mutado.52
O TP53 é um gene supressor de tumor, inativado por mutações em cerca de metade dos casos de câncer humano, na maior parte da outra metade dos casos, é provavelmente incapacitado pela ruptura da via de ativação da proteína p53 ou p53 efetores. Em células normais, o controle da p53 é em grande parte mantida através de interações com o seu principal regulador, Mdm2. Substâncias genotóxicas, oncogenes ativados e uma variedade de condições de estresse adicional regulam a p53, geralmente através da ruptura da interação p53-Mdm2.53
Após sua ativação, a proteína p53 sofre modificações pós-translacionais, causando sua estabilização e acúmulo nuclear reforçado. No núcleo, funcionando como um fator de transcrição, p53 orquestra a resposta de centenas de genes. O desfecho desta resposta é tanto a resolução dos danos que induziram ativação da p53 (por exemplo, reparar o DNA danificado) como indução de apoptose ou senescência celular da célula em que p53 foi ativada, evitando assim a proliferação de células que podem gerar câncer.54
O p53 possibilita a apoptose através de duas vias principais, a via extrínseca, que ativa uma cascata de caspase incluindo a caspase 9, 3, 6 e 7, e da via intrínseca, que promove a formação apoptossomo através de proteínas da família Bcl-2.55.
Geralmente, a p53 pode induzir a reparação por excisão de nucleotídeos de partes de DNA danificado e mediar à síntese de outra fita, visto que os supressores mutS homolog 2 (MSH2) e mutL homolog 1 (MLH1) pode reparar incompatibilidade do DNA. A ataxia-telangiectasia mutated gene product (ATM) é um sensor geral de danos ao DNA e fosforila p53 para ativar o processo de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos do DNA em adultos. 56,57
18
A transcrição do gene TP53 é controlada por interferon de sinalização do tipo I, e a indução de TP53 participa na defesa do hospedeiro contra a infecção viral.
Além disso, p53 regula a transcrição de várias citocinas e quimiocinas envolvidos na imunidade inata e esta pode ser influenciada com a presença de diferentes cepas do H. pylori.58,59,60
Os genes supressores de tumor estão envolvidos no controle de pontos estratégicos da cadeia de eventos que controla o crescimento e a diferenciação celular. Esses genes precisam ter dois alelos alterados para induzir o câncer. A perda de uma cópia do gene decorre de mutação, enquanto a segunda cópia é perdida por deleção do outro alelo, o que se denomina perda de heterozigosidade. A perda de um alelo pode ser herdada ou adquirida. O indivíduo heterozigoto para um gene supressor de tumor não tem neoplasia, mas apresenta risco maior de desenvolver um tumor. 61
2.3 Polimorfismo do Gene TP53 (rs1042522, Arg/C:Pro/G).
Alterações genéticas têm papel decisivo no aparecimento de várias neoplasias humanas. Na maioria, essas alterações genéticas ocorrem em uma única célula somática, que então se divide e continua se desenvolvendo até formar um câncer. Mais raramente, quando a neoplasia maligna ocorre como parte de uma síndrome de câncer hereditário, as alterações iniciais são herdadas por meio de linhagem germinativa e, portanto estão presentes em todas as células do organismo.61
A ocorrência de polimorfismos genéticos pode ser detectada pela técnica da reação em cadeia catalisada pela polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) combinada com a técnica de restrição enzimática RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição).
Essa técnica consiste na amplificação da sequência específica do DNA, pela técnica da PCR, seguida pela restrição enzimática na presença de um tampão e análise por eletroforese. 62
Recentemente tem se utilizado a reação em cadeia da polimerase em tempo real para se identificar polimorfismos genéticos. Esta técnica mostra-se mais
19
eficiente quando comparada com o ensaio de PCR convencional. Tal método utiliza o sistema TaqMan, na qual os oligonucleotídeos flanqueiam a região de interesse e sondas marcadas com fluoróforos diferentes se associam ao polimorfismo em questão, sendo uma sonda específica para cada alelo. A observação de dois fluoróforos caracteriza o genótipo heterozigoto para o polimorfismo, enquanto a observação de um único fluoróforo o genótipo é caracterizado como homozigoto para um dos dois alelos.63,64
O polimorfismo no exon 4 do Códon 72 é o polimorfismo de p53 mais comumente estudado, é aquele que codifica arginina (Arg) ou prolina (Pro).
Especula-se que essas variações alteram a estrutura e a função da proteína p53.
Por exemplo, o alelo Pro induz apoptose com cinética mais lenta, ou seja, apresenta um potencial apoptótico menor em relação ao alelo Arg.58,61,65
Tentativas de definir as associações do polimorfismo do códon 72 do p53 com a susceptibilidade ou progressão do câncer têm levado a resultados inconsistentes em diferentes etnias e diferentes tipos de câncer. 65
Estes polimorfismos resultantes de mudanças de códons podem causar alterações sutis ou até mesmo dramáticas na atividade da proteína. Neste contexto, o polimorfismo de p53 mais estudado é o do códon 72, podendo codificar uma proteína com arginina (Arg) ou prolina (Pro) nesta posição. A frequência alélica de Arg nesse códon, na população caucasiana, é de aproximadamente 70%, enquanto a frequência de Pro é de 30%, e é produzida por uma única troca nucleotídica de guanina para citosina. 65
20
3. PROPOSIÇÕES O presente trabalho teve como proposições:
3.1 Genotipar e determinar a frequência alélica do polimorfismo no códon 72 do gene TP53 (rs1042522, Arg/C:Pro/G), na mucosa gástrica de pacientes pediátricos infectados por Helicobacter pylori, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR- Tempo Real).
3.2 Comparar e correlacionar as variações polimórficas do gene TP53 com a idade e resultados histopatológicos de pacientes pediátricos infectados e não infectados pelo Helicobacter pylori.
21
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Título HELICOBACTER PYLORI DETECTION IN CHILDHOOD ASSOCIATED WITH CODON 72, POLYMORPHISM TO TP53 GENE
Tipo Original paper Nome
completo Roberto Venerando Email
principal venerando.roberto@gmail.com Endereço Rodovia BR153 Km 338+420mv Cidade Ourinhos
Estado São Paulo CEP 19900-970 País Brasil
Co-autor País Instituição E-mail
Rasmussen
LT Brasil Universidade do Sagrado
Coracao/Universidade Federal de Sao Paulo lucas_rasmussen@hotmail.com
de Labio
RW Brasil Disciplina de Genetica, Hemocentro,
Faculdade de Medicina de Marilia roger@famema.br Gatti LL Brasil Faculdades Integradas de Ourinhos genetica@famema.br Francisco O Brasil Faculdades Integradas de Ourinhos genetica@famema.br
Viani GA Brasil Disciplina de Radioterapia e Oncologia,
Faculdade de Medicina de Marilia genetica@famema.br Rivera, LML Brasil Universidade do Sagrado Coracao genetica@famema.br
Payao SLM Brasil
Universidade do Sagrado Coracao/Disciplina de Genetica, Hemocentro, Faculdade de Medicina de Marilia
slmpayao@famema.br
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HELICOBACTER PYLORI DETECTION IN CHILDHOOD ASSOCIATED WITH CODON 72, POLYMORPHISM TO TP53 GENE.
Venerando R (1,2), Rasmussen LT (1,3), de Labio RW (4), Gatti LL (2), Francisco O (2), Viani GA(5), Rivera, LML (1), Payão SLM (1,4)
(1) Universidade do Sagrado Coração, USC, Bauru, Brasil; (2) Faculdades Integradas de Ourinhos, FIO, Brasil; (3) Disciplina de Genética/Morfologia, Universidade Federal de São Paulo, Brasil; (4) Disciplina de Genética, Hemocentro, Faculdade de Medicina de Marília, Marília, Brasil; (5) Disciplina de Radioterapia e Oncologia, Faculdade de Medicina de Marília, Marília, Brasil.
ABSTRACT: The risk in developing gastric cancer is believed to be related to differences among H. pylori strains and the inflammatory responses mediated by host genetic factors. H. pylori infection is acquired early in life, and in the absence of antibiotic therapy, it generally persists for life. Additionally, Tp53 regulates the transcription of several cytokines and chemokines involved in innate immunity and this can be influenced with presence of different strains of H. pylori. We developed the present study with the intention to detect the H. pylori in pediatric patients, genotype the Tp53 polymorphism at codon 72 and correlate with age and histo- pathological results. Three hundred forty-two patients participated in the study, DNA from the gastric biopsies was extracted and the detection of H. pylori was realized by PCR assays; allelic discrimination of SNP rs1042522 (Tp53) was performed by Real Time Polymerase Chain Reaction. Our results showed a significant association between ageing and positivity for H. pylori. We verified that patients aged ≤ 10 years were 1.3 times more likely to have infection by H. pylori when compared with patients aged > 10 years. In additionally we found no association of Tp53 polymorphisms with the presence of H. pylori.
KEYWORDS: Helicobacter pylori - Childhood - TP53 - PCR
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CONFLICTS OF INTEREST: There is no conflict
FINANCIAL SOURCE: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (06/60836-1)
CORRESPONDENCE TO: SPENCER LUIZ MARQUES PAYÃO, Ph-D, Laboratório de Genética, Hemocentro, FAMEMA, Rua Lourival Freire, 240, Bairro Fragata, CEP 17519-050, Marília, São Paulo, Brazil. Phone Number: +55 14 34021856; Fax Number: +55 14 34330148; e-mail: slmpayao@famema.br
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INTRODUCTION
Helicobacter pylori is involved in the pathogenesis of a number of gastrointestinal diseases, including acute and chronic gastritis, peptic ulceration, gastric carcinoma and gastric lymphoma (1, 2). The risk in developing gastric cancer is believed to be related to differences among H. pylori strains and the inflammatory responses mediated by host genetic factors (3, 4).
Tp53 tumor suppressor gene has a common polymorphism at codon 72, encoding either proline or arginine (P72 or R72, respectively) and a large number of epidemiological studies investigated the impact of this polymorphism with cancer risk.
Frank et al. (5), suggest that there may be a minor association between the P72 allele and increased cancer risk. In additionally the transcription of the Tp53 gene is controlled by type I interferon signaling and the induction of Tp53 participates in the host defense against viral infection. Additionally, Tp53 regulates the transcription of several cytokines and chemokines involved in innate immunity and this can be influenced with presence of different strains of H. pylori (5-7).
H. pylori infection is acquired early in life (almost always before the age of 10 years), and in the absence of antibiotic therapy, it generally persists for life (8). Studies have reported that the longer the time interval between H. pylori detection, the higher the risk of developing cancer (9, 10). Eradication should be performed at this time because after the gastric mucosa is irreversibly harmed, treatment does not prevent carcinogenesis (8, 11).
It’s not clear if the gastric mucosa or oral cavity, could be considered a permanent or a transient reservoirs for Helicobacter pylori. Our research group, obtained results which establish that the microhabitat of H. pylori is the gastric mucosa and oral cavity using the polymerase chain reaction (PCR) (12, 13)
Studies using DNA fingerprinting confirmed that members of the same family tend to be infected by the same strain of bacteria, a fact that confirms the interpersonal transmission, making thus a factor to be considered in addition to the socioeconomic conditions of the population (8, 14, 15).
Other studies involving pediatric patients in developing countries show that the prevalence in children with ≤ 10 years old is above 50.0%. On de other hand, developed countries and those who have had an increase in its Human Development Index (HDI) values show a reduction to around 10% in this age group (9, 16, 17).
These results highlight the importance of detection H. pylori in childhood. So, based
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on these finds, we developed the present study with the intention to detect the H.
pylori in pediatric patients, genotype the Tp53 polymorphism at codon 72 and correlate with age and histo-pathological results.
MATERIALS AND METHODS Patients and Samples
In this study, 342 dyspeptic patients (150 male and 192 female with a mean age 9.36 years) attending the Endoscopy Clinic of the Medical School of Marilia, São Paulo, Brazil during the period between 2005 of 2011 were enrolled. All patients were divided into two groups according to their age. The first group: with patients aged ≤ 10 years was composed of a 193 patients (97 male and 96 female with a mean age 6.53 years ± 2.67) and the second group was composed of a 149 patients aged > 10 years (53 male and 96 female with a mean age 12.94 years ± 1.71). All subjects had given their informed consent, and the study protocol was approved by the Local Ethics Committee (N°: 056/2005; 223/2011).
During endoscopy, three gastric biopsy sections were taken from the antrum of each patient for detection of H. pylori. One was fixed in formalin, and assessed for the presence of H. pylori by histological examination other sections were used for rapid urease test and the third for molecular analysis.
Detection of Helicobacter pylori
DNA from the gastric biopsies was extracted with the QIAamp tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s recommendations. Additional fresh biopsies were placed in Rapid urease test, using the TUPF kit (Laborclin, Brazil), according to the manufacturer’s instructions. After 6h, the TUPF test was inspected for a change in color. The biopsies from antrum, for histopathologic examination were fixed in formalin and stained with HE (Hematoxylin and Eosin) and Giemsa. The histological features of the gastric mucosa were recorded using the updated Sydney scoring system (18).
Primers Hpx1 (5’-CTGGAGARACTAAGYCCTCC-3’) and Hpx2 (5’
GAGGAATACTCATTGCGAAGGCGA-3’) targeting the 16S ribosomal RNA gene of H. pylori were used according to the published data (13). PCR amplification was performed according to the method described previous (12, 13). In each experiment,
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positive (strain 26695) and negative (water) controls were included. The assay was considered positive when the PCR product was present.
Genotyping of Tp53 Polymorphism
Allelic discrimination of SNP rs1042522 (Tp53) (assay id: c_2403545_10) was performed by Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) on a Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems™, USA) using Taqman commercial probes (Applied Biosystems™, USA). For Genotyping the polymorphisms mentioned above we followed the cycling program according to cycling conditions recommended by Applied Biosystems. The results were assessed taking into account the allelic discrimination and absolute quantitation in all samples;
additionally, we included two negative controls per plate (non-template controls). The interpretation was performed with software Taqman Genotyper v1.0 (Applied Biosystems™, USA).
Statistical Analysis
Statistical analysis was performed by א² and Fisher test. The significance level was set at a p value of < 0.05. Statistical analyses were performed using the statistical package SPSS 11.5.1 (Chicago, IL, USA).
RESULTS
Presence of H. pylori and Genotyping of Tp53 gene
H. pylori was detected in biopsies of the antrum in 85/342 (24.8%) patients by PCR assay, in additional, the histological analysis revealed the presence of H. pylori in 49/286 subjects; because, 56 patients do not have results by histological analysis and the urease test detected H. pylori infection in 68/342 (19.9%) patients.
In addition, we examined the histology of 286 biopsies and found that 154 (53.8%) patients had chronic gastritis, 4 (1.4%) patients had esophagits and 128 (44.8%) patients demonstrated normal mucosa without gastric alterations. Forty-seven of 154 patients with chronic gastritis were H. pylori positive on the other hand just two of 128 patients without gastric alterations were H. pylori positive. This data can be suggesting a possible relationship between the presence of H. pylori and chronic gastritis in children and young patients.
