Using image analysis and processing for morphological characterization of bovine
spermatozoa
Rebecca Esp´ırito Santo da Cruz Faculdade de Medicina Veterin´ aria Universidade Federal de Uberlˆ andia
Uberlˆ andia, MG, Brasil rebecca@vet.ufu.br
Marcelo Em´ılio Beletti Instituto de Ciˆencias Biom´edicas Universidade Federal de Uberlˆ andia
Uberlˆ andia, MG, Brasil mebeletti@ufu.br
Bruno Augusto Nassif Traven¸colo Faculdade de Computa¸c˜ ao Universidade Federal de Uberlˆ andia
Uberlˆ andia, MG, Brasil travencolo@gmail.com
Resumo—The semen analysis is the main method of diagnosis in male fertility used in veterinary medicine.
However, due to the subjectivity intrinsic of an visual analysis, it has being proposed to use computer image analysis for the evaluation of sperm morphology. Thus, the present study aims to characterize the morphology of bull sperm head by using image processing and analysis techniques. For morphological analysis it was performed the preparation of smears, the capture and segmentation of the images, and the automatic evalua- tion of various characteristics obtained from the head of the sperm. In order to validate the efficiency of the automatic segmentation, an index of similarity from the comparison with manual segmentation was obtained.
From this ratio it was found that 85% of the heads automatically detected had good quality segmentation.
The results show that the method can be used by researchers in male fertility studies.
I. Introdu¸ c˜ ao
Em termos mundiais, a pecu´ aria bovina brasileira destaca-se pelo seu efetivo e inesgot´ avel potencial de cres- cimento. Esse crescimento demonstra a consolida¸c˜ ao da atividade, cada vez mais fortalecida pela maior disponi- bilidade de sˆemen [1]. O aumento do n´ umero do rebanho est´a diretamente ligado `a melhoria das taxas reprodutivas dos animais, que por sua vez depende diretamente da fertilidade. Nenhum teste isolado ´e capaz de predizer a fertilidade de uma amostra de sˆemen, mas o exame de v´arias caracter´ısticas f´ısicas e morfol´ ogicas pode predizer uma maior fertilidade [2].
V´arias t´ecnicas tˆem sido empregadas para medir estes fatores, entre elas encontra-se o espermograma. O esper- mograma consiste na avalia¸c˜ ao f´ısica e morfol´ ogica do sˆemen, assumindo grande importˆ ancia como diagn´ ostico, sendo que o m´edico veterin´ario ´e frequentemente requisi- tado para a avalia¸c˜ao do animal quanto ` a sua habilidade em produzir espermatozoides vi´ aveis [3], seja em centrais de insemina¸c˜ao ou em propriedades que utilizam a monta natural para provar a aptid˜ ao do macho. ´ E o principal m´etodo de diagn´ostico de fertilidade do macho utilizado na rotina veterin´aria para a avalia¸c˜ ao de v´ arias caracter´ısticas
esperm´ aticas, dentre elas a motilidade e a morfologia dos espermatozoides [4], [5].
Frequentemente, a morfologia e a motilidade dos esper- matozoides s˜ ao estimadas de forma subjetiva, por meio da avalia¸c˜ ao visual das c´elulas esperm´ aticas sob microscopia
´
optica convencional, representando a principal an´ alise la- boratorial utilizada pelas centrais de coleta e congelamento de sˆemen [6]. Essa avalia¸c˜ ao subjetiva, amplamente utili- zada em laborat´ orios de andrologia, depende da habilidade e percep¸c˜ ao do t´ecnico [7]. Por isso, com o objetivo de reduzir a subjetividade, tendenciosidade, poss´ıveis falhas e aumentar a reprodutibilidade entre diferentes examina- dores, vem sendo proposto o uso de an´ alise de imagem por computador para a avalia¸c˜ ao da motilidade e morfologia dos espermatozoides [6], [7], [8], [9].
A an´ alise de caracter´ısticas est´ aticas do espermatozoide referentes ` a sua morfologia e a an´ alise do movimento esperm´ atico por meio da computa¸c˜ ao ´e uma an´ alise mais r´ apida e objetiva para avalia¸c˜ ao do macho da esp´ecie bovina. A an´ alise de imagens por computador oferece uma maior precis˜ ao e confiabilidade nos resultados, pois reduz a subjetividade, e consequentemente falhas que possam surgir durante a avalia¸c˜ ao, inerentes do processo feito por an´ alise visual, al´em de fornecer novas metodologias e t´ecnicas para a avalia¸c˜ ao da fertilidade contribuindo desta forma com melhoria da reprodu¸c˜ ao animal [10], [11], [2].
No entanto os sistemas computacionais j´ a dispon´ıveis apresentam algumas desvantagens que tornam seu uso limitado como o elevado custo do equipamento, a necessi- dade de valida¸c˜ ao, o controle de qualidade e a padroniza-
¸c˜ ao das avalia¸c˜ oes realizadas [11].
Com o presente trabalho objetivou-se a caracteriza-
¸c˜ ao morfol´ ogica da cabe¸ca de espermatozoides de touros
por meio de t´ecnicas computacionais de processamento
e an´ alise de imagem. Foi realizada uma verifica¸c˜ ao da
viabilidade de se usar essa metodologia, por meio da
avalia¸c˜ ao da precis˜ ao do algoritmo de segmenta¸c˜ ao. Essa
avalia¸c˜ ao foi feita comparando-se os resultados da seg-
menta¸c˜ ao autom´ atica com a segmenta¸c˜ ao manual. Ap´ os a
segmenta¸c˜ ao, diversas medidas que permitem caracterizar
morfologicamente as cabe¸cas foram realizadas.
II. Materiais e M´ etodos
A an´alise da morfologia da cabe¸ca de espermatozoides bovinos ´e composta de trˆes principais etapas: (i) Prepara-
¸c˜ ao das amostras e captura das imagens; (ii) Segmenta¸c˜ ao autom´atica das imagens; e (iii) Avalia¸c˜ ao autom´ atica das caracter´ısticas morfol´ ogicas das cabe¸cas.
A. Prepara¸c˜ ao das amostras e captura das imagens dos espermatozoides
Foram utilizadas 25 amostras de sˆemen de touro for- necidas pelo Laborat´ orio de Histologia da Universidade Federal de Uberlˆ andia. As amostras estavam armazenadas em solu¸c˜ ao de citrato formalado, sendo 2,9% de citrato e 10% de formol at´e o momento do processamento. O sˆemen foi utilizado para captura das imagens para avalia¸c˜ ao da morfologia esperm´ atica. Para an´ alise morfol´ ogica dos espermatozoides foram realizados esfrega¸cos das doses de sˆemen sendo que essas amostras j´ a estavam fixadas pelo citrato formalado. Ap´ os secagem ao ar, os esfrega¸cos foram hidrolisados por 25 min., em ´ acido clor´ıdrico 4N, lavados em ´agua destilada e secos `a temperatura ambiente. Ent˜ ao, foi colocada uma gota de azul toluidina a 0,025% em tamp˜ao Mcllvaine (citrato de s´ odio-fosfato) pH 4 e coberto com lam´ınula [9].
Ap´os confec¸c˜ao dos esfrega¸cos, fez-se a leitura por mi- croscopia ´optica utilizando a objetiva de imers˜ ao (100X).
Por meio de uma cˆamera conectada a um computador acoplado ao microsc´opio, as imagens digitais das cabe¸cas esperm´aticas foram capturadas (Fig. 1).
Figura 1. Imagens das cabe¸cas esperm´aticas de touro obtidas ap´os captura pela cˆamera acoplada ao microsc´opio ´optico em aumento de 1000X.
B. Segmenta¸c˜ ao autom´ atica das imagens
Posteriormente as imagens obtidas foram processadas realizando a segmenta¸c˜ao [12], que neste caso significa identificar a cabe¸ca dos espermatozoides na imagem. Essa identifica¸c˜ao consiste em gerar uma nova imagem (Fig. 2).
Nessa imagem, os pixels ou pontos em preto representam regi˜ oes que n˜ ao pertencem aos espermatozoides, enquanto que esses s˜ ao marcados pelos pixels em branco. O pro- cesso de segmenta¸c˜ ao ´e fundamental para que as medidas autom´ aticas, descritas na pr´ oxima se¸c˜ ao, possam ser cal- culadas. O m´etodo adotado para segmenta¸c˜ ao foi a limiari- za¸c˜ ao, com limiar escolhido automaticamente baseando-se na an´ alise dos picos da segunda derivada do histograma da imagem [13].
Figura 2. Resultado da segmenta¸c˜ao autom´atica das cabe¸cas de espermatozoides de touro contidas na Fig. 1.
Para verificar se o processo autom´ atico de segmenta¸c˜ ao foi realizado corretamente, as cabe¸cas dos espermatozoides de touro tamb´em foram segmentadas manualmente. Em seguida, foram comparados os dois m´etodos (Fig. 3). A imagem obtida pela segmenta¸c˜ ao autom´ atica (Fig. 3a) e pela segmenta¸c˜ ao manual (Fig. 3b) foram sobrepostas.
O resultado dessa sobreposi¸c˜ ao gerou uma nova imagem com duas diferentes regi˜ oes (n˜ ao considerando o fundo) (Fig. 3c): R1, que cont´em pixels que pertencem ` a cabe¸ca do espermatozoide tanto na imagem segmentada automa- ticamente quanto na manual (pixels em branco na Fig. 3c);
e R2, que cont´em os pixels da cabe¸ca do espermatozoide somente na imagem obtida pela segmenta¸c˜ ao autom´ atica ou somente pela segmenta¸c˜ ao manual (pixels em cinza na Fig. 3c). Com isso, foi poss´ıvel calcular um ´ındice de similaridade entre a imagem original e a segmentada por meio da seguinte equa¸c˜ ao:
S = P (R1)
P (R1) + P (R2) (1)
onde S ´e o ´ındice de similaridade e P (R1) e P (R2)
indicam a quantidade de pixels que pertencem ` a regi˜ ao R1
e R2, respectivamente. Dessa forma, quando o resultado
da segmenta¸c˜ ao autom´ atica for exatamente igual ao da
manual, o valor de S ser´ a 1. N˜ ao havendo nenhuma
intersec¸c˜ao, o valor de S ser´ a 0.
Figura 3. Segmenta¸c˜ao das cabe¸cas de espermatozoides de touro.
(a) Resultado da segmenta¸c˜ao autom´atica. (b) Resultado da seg- menta¸c˜ao manual. (c) Sobreposi¸c˜ao dos resultados para realiza¸c˜ao do c´alculo do ´ındice de similaridadeS(Eq. 1).
C. Avalia¸c˜ ao autom´ atica das caracter´ısticas morfol´ ogicas das cabe¸cas
Neste trabalho foram extra´ıdas medidas morfol´ ogicas importantes das cabe¸cas dos espermatoz´ oides. As medidas foram calculadas ap´ os o processo de segmenta¸c˜ ao. Foram avaliadas ´ area, per´ımetro, elonga¸c˜ ao, simetria, textura, entropia, largura e comprimento [14], [9], [5], [15], [16]. A partir desses valores ´e poss´ıvel realizar an´ alises que podem ajudar na determina¸c˜ ao da existˆencia ou n˜ ao de anomalias na cabe¸ca dos espermatozoides.
III. Resultados e Discuss˜ ao A. Avalia¸c˜ ao do ´ındice de similaridade
Analisando os resultados, verificamos empiricamente que uma boa segmenta¸c˜ao foi obtida para cabe¸cas com
´ındice de similaridade S maior que 0, 80. A Fig. 4 mostra alguns exemplos de cabe¸cas com diferentes ´ındices de similaridade. Para valores acima de 0, 8 a detec¸c˜ ao fun- cionou bem – pode-se notar que as imagens segmentadas manualmente e as autom´aticas s˜ ao bem semelhantes. No entanto, para valores menores que 0, 8 pode-se observar cabe¸cas que possuem algum tipo de patologia ou ent˜ ao estavam sobrepostas a outras cabe¸cas, ou apresentavam algum artefato de t´ecnica que de alguma forma interferiu em sua morfologia, prejudicando desta forma a segmen- ta¸c˜ao. Ou ainda algum artefato presente na lˆ amina que foi considerado como sendo uma cabe¸ca e acabou sendo segmentado.
No total, 1228 cabe¸cas foram consideradas, sendo que 953 (85%) obtiveram grau de similaridade maior que 0, 8 (Fig. 5). Com isso, podemos considerar que o algoritmo de segmenta¸c˜ao autom´atica funciona muito bem. As cabe¸cas com similaridade menor que 0, 8 – o que indica que n˜ ao foram corretamente segmentadas – poderiam ser descar- tadas por meio da an´alise de outras medidas (como, por exemplo, simetria ou ´area).
B. An´ alise da Morfologia da Cabe¸ca
Como o ´ındice de similaridade mostrou que o algortimo de segmenta¸c˜ao pode ser usado para detec¸c˜ ao autom´ atica das cabe¸cas de espermatoz´oides nas imagens, o pr´ oximo passo ´e obter medidas referentes a essas cabe¸cas, de forma a caracterizar morfologicamente o espermatozoide.
Foram calculadas, para cada cabe¸ca, as seguintes medidas:
Figura 4. Exemplos de imagens com diferentes ´ındices de simi- laridade. As images s˜ao apresentadas aos pares, onde a imagens `a esquerda mostram o resultado da segmenta¸c˜ao autom´atica (mas com os pixels com intensidades da imagens originais) e as imagens `a direita mostram a segmenta¸c˜ao manual.
Figura 5. Grau de similaridade de todas as cabe¸cas esperm´aticas analisadas.
Tabela I
M´edia e desvio padr˜ao das 25 amostras analisadas, para cabe¸cas com simetria maior que 0.9.
Amostra Area (µm)´ Per´ımetro Elonga¸c˜ao Simetria Textura Entropia Compri– Largura
(µm) (µm) mento (µm) (µm)
1 40,4 27,1 4,7 0,94 3,93 3,86 10,5 4,9
2 35,1 24,9 4,8 0,95 2,77 3,34 9,7 4,5
3 34,9 24,1 4,03 0,94 2,55 3,3 9,2 4,7
4 36 24,7 4,12 0,95 1,74 2,78 9,4 4,7
5 39,2 25,9 3,62 0,94 4,6 4,1 9,6 5,1
6 35,5 24,3 4,13 0,95 2,47 3,24 9,4 4,7
7 34,4 24,4 4,69 0,95 2,36 3,14 9,6 4,5
8 36,2 25 4,99 0,95 3,69 3,72 9,8 4,5
9 37,8 25,3 4,29 0,96 5,42 4,21 9,6 4,9
10 40,9 26,3 4,12 0,95 3,28 3,6 10 5
11 37 25,1 4,35 0,95 3,47 3,67 9,5 4,6
12 36,1 24,7 4,58 0,95 2,46 3,24 9,5 4,6
13 34,1 23,9 4,33 0,95 3,53 3,71 9,1 4,5
14 36,3 25 4,53 0,95 2,9 3,39 9,6 4,6
15 36,7 24,6 3,55 0,95 4,71 4,06 9,1 4,9
16 40,6 25,9 3,73 0,94 5,22 4,25 9,6 5,1
17 35,2 24,4 4,42 0,95 2,91 3,37 9,3 4,6
18 40,4 25,7 3,7 0,95 6,81 4,52 9,5 5,2
19 37,6 25,4 4,24 0,94 2,22 3 9,8 4,8
20 36 24,7 4,56 0,96 3,38 3,56 9,5 4,6
21 41 26,3 3,98 0,95 4,31 3,86 9,7 5,1
22 42,9 26,8 3,95 0,96 3,76 3,8 10 5,2
23 41,7 26,2 4,06 0,96 5,38 4,17 10 5,1
24 36 24,2 3,69 0,96 6,41 4,58 9,1 4,8
25 40 25,8 4,2 0,96 2,84 3,37 9,9 5
M´edia 37,68 25,21 4,21 0,95 3,72 3,67 9,6 4,8
Desvio 2,54 0,86 0,38 0,01 1,31 0,46 0,32 0,23
Figura 6. Exemplo de cabe¸cas com patologias ou artefatos de t´ecnica. Em muitos casos essas imagens podem ser eliminadas da an´alise morfol´ogica por meio de uma consulta ao valor de simetria.
Para imagens mostradas nesta figura, todas cabe¸cas apresentam simetria abaixo de 90%.
´area (µ
2m), per´ımetro (µm), elonga¸c˜ ao, simetria, textura, entropia, comprimento (µm) e largura (µm). O c´ alculo dessas medidas serve tamb´em n˜ ao s´ o para caracterizar o espermatozoide, mas tamb´em como uma etapa de p´ os- processamento, pois ´e poss´ıvel remover das an´ alises cabe-
¸cas com medidas discrepantes da m´edia. No caso, a medida escolhida foi a simetria. A Tab. I apresenta o resultado das medidas para as 25 amostras. Foram selecionadas somente as cabe¸cas com simetria acima de 90%, porque s˜ ao as com maior chance de apresentarem morfologia normal.
Como pode ser visto na Fig. 6, cabe¸cas com simetria abaixo de 90% possuem algum tipo de patologia, sobre- posi¸c˜ao com outras cabe¸cas, ou presen¸ca de artefato de t´ecnica que de alguma forma interferem na morfologia esperm´atica, prejudicando dessa forma a segmenta¸c˜ ao.
Os valores obtidos para as medidas apresentadas na Tab. I foram semelhantes aos valores encontrados na
literatura, demonstrando que a an´ alise autom´ atica pode ser utilizada para an´ alise da morfologia da cabe¸ca. Vale notar que pode haver uma varia¸c˜ ao nas medidas devido ` a ra¸ca [15], espermatozoide normal ou defeituoso [17] e fato- res extr´ınsecos como, por exemplo, m´ a nutri¸c˜ ao, traumas e varia¸c˜ ao da temperatura ambiental, que afetam direta ou indiretamente a espermatogˆenese. E essas varia¸c˜ oes s˜ ao esperadas entre indiv´ıduos mesmos que estes apresentem fertilidade comprovada [18].
Al´em disso, os m´etodos de fixa¸c˜ ao celular, calibra¸c˜ ao das imagens digitais, equipamentos e m´etodos de mensura¸c˜ ao podem alterar a conforma¸c˜ ao ou os valores absolutos das medidas [18]. Alguns estudos relatam a possibilidade de existir uma rela¸c˜ ao entre a forma da cabe¸ca do espermato- zoide e a fertilidade de touros. Animais de maior fertilidade produziriam espermatozoides com cabe¸cas alongadas e afiladas em compara¸c˜ ao a touros de menor fertilidade [19].
IV. Conclus˜ ao
Neste trabalho foi feita a caracteriza¸c˜ ao morfol´ ogica das cabe¸cas esperm´ aticas de touros por meio da utiliza¸c˜ ao de t´ecnicas computacionais de processamento e an´ alise de imagem. Com a utiliza¸c˜ ao da an´ alise de imagem compu- tacional foi poss´ıvel identificar diversas caracter´ısticas da cabe¸ca dos espermatozoides, como ´ area, per´ımetro, elon- ga¸c˜ ao, comprimento, largura, simetria, textura e entropia.
A an´ alise da segmenta¸c˜ ao autom´ atica foi comparada com
a segmenta¸c˜ ao manual, na qual foi poss´ıvel avaliar a
qualidade do m´etodo autom´ atico. Verificou-se que 85% das
cabe¸cas detectadas automaticamente apresentam uma boa qualidade de segmenta¸c˜ao.
As rotinas atuais j´a est˜ao sendo utilizadas em v´ arios projetos de pesquisa relacionados ao estudo da fertilidade bovina. Como trabalhos futuros pretende-se avaliar em de- talhe a importˆancia de cada medida usada (ou combina¸c˜ ao de medidas) para definir novos parˆ ametros de fertilidade esperm´ atica.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq, CAPES, FAPEMIG e PROPP-UFU pelo suporte financeiro.
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