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Julio Sergio dos Santos
A ULTRAESTRUTURA DOS ESPERMATOZOIDES
DE ALGUMAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA
LEPTODACTYLIDAE (AMPHIBIA: ANURA)
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RESUMO
Os anuros da família Leptodactylidae estão alocados em três subfamílias: Leiuperinae, Leptodactylinae e Paratelmatobiinae. Com o auxílio da microscopia eletrônica, foram observados os espermatozoides de 23 espécies de leptodactilídeos buscando-se contribuir com elementos para o entendimento de incertezas filogenéticas. Em Pseudopaludicola, gênero alocado em Leiuperinae, foram comparados os espermatozoides de representantes do grupo P. pusillae de espécies dos quatro clados recuperados na filogenia molecular, os quais correspondem aos grupos cromossômicos 2n=22, 20, 18 e 16. A análise das espécies de Pseudopaludicola mostrou que as cabeças dos espermatozoides são semelhantes e contém a vesícula acrossomal cobrindo o cone subacrossomal. Já as caudas dos espermatozoides de Pseudopaludicola apresentam diferenças marcantes. Nas espécies com número cromossômico 2n=22, Pseudopaludicola sp. 1 (grupo P. pusilla), P. saltica, P. falcipes e P. mineira, as caudas exibem fibras acessórias (justa-axonemal, membrana ondulante e a fibra axial). Essas fibras também são observadas em P. ternetzi e P. ameghini, ambas do clado com 2n=20, mas a sua fibra axial é mais desenvolvida. Nos indivíduos do clado com número cromossômico 2n=18, P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula e Pseudopaludicolasp. 2 e com 2n=16, P. mystacalis, a cauda apresenta a membrana ondulante espessa, caracterizando um bastão para-axonemal, o qual é mais curto do que a membrana ondulante da cauda dos Pseudopaludicola com número cromossômico 2n=22 e 20. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas dos espermatozoides indicam que esses caracteres podem ser filogeneticamente informativos, quando mapeados na filogenia molecular, pois os perfis ultraestruturais da cauda coincidem parcialmente com a formação dos quatro clados filogenéticos e possibilitam levantar a hipótese de uma progressiva simplificação do espermatozoide durante a evolução do gênero Pseudopaludicola. A análise comparativa de espécies entre os gêneros de leiuperíneos mostra que as caudas dos espermatozoides de Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicadae P. cuvieri), também exibem fibras acessórias, como a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, contudo, a membrana ondulante nesse gênero é mais longa que aquela encontrada em Pseudopaludicola. Além disso, as caudas dos espermatozoides de Physalaemus não mostram fibra axial. Do gênero Engystomops, grupo irmão de
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Physalaemus, foram analisadas E. petersi, E. freibergi e E. puyango, cujas caudas apresentam fibra justa-axonemal, membrana ondulante e fibra axial. Esses gêneros diferem ainda pela membrana ondulante mais curta em Engystomops, corroborando a revalidação do gênero Engystomops.A cauda de Engystomops puyango difere de E. petersi e E. freibergi, clado Duovox, e é igual a E. pustulosus, do clado Edentulus, indicando a necessidade de ampliar os estudos desse gênero. A espécie Pleurodema diplolister, do gênero próximo a Physalaemus e Engystomops, apresenta na cauda do espermatozoide a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, as quais são semelhantes àquelas observadas nas espécies de Physalaemus, entretanto, a membrana ondulante de P. diplolister é menor que a observada em Physalaemus. A comparação dos espermatozoides de representantes das outras subfamílias de Leptodactylidae mostrou que Paratelmatobiinae, representada por P.poecilogaster, apresenta estruturas iguais àquelas observadas nos Pseudopaludicola do clado com número cromossômico 2n=22. Por outro lado, a espécie analisada, Leptodactylus natalensis, Leptodactylinae, apresenta fibra axial bem desenvolvida, diferente daquela exibida nos espermatozoides de Engystomops, Pseudopaludicola e P. poecilogaster. A outra espécie de Leptoctylinae, Adenomeramarmorata, a qual era alocada em Leptodactylus, apresenta apenas o axonema na cauda do espermatozoide. Essa diferença ultraestrutural das caudas de A. marmorata e L. natalensis, corrobora a re-alocação de A. marmorata como espécie válida e diferente de Leptodactylus. As descrições ultraestruturais dos gametas masculinos dos leptodactilídeos mostram caracteres filogenéticos informativos, principalmente aqueles das caudas, contribuindo para o entendimento dos relacionamentos intra e intergenérico.
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ABSTRACT
The anurans of the family Leptodactylidae are distributed in three subfamilies – Leiuperinae, Leptodactylinae and Paratelmatobiinae. The spermatozoa of 23 leptodactylid species were analyzed under an electron microscope in order to provide evidence for the better understanding of a number of phylogenetic uncertainties. In the case of the leiuperine genus Pseudopaludicola, the sperm of the representative of the P. pusilla group and those of four clades identified in the molecular phylogeny, which correspond to well-defined chromosomal groups with 2n=22, 20, 18, and 16, were compared. The analysis of the different Pseudopaludicola species found spermatozoa with heads of similar shape, which contain an acrosomal vesicle covering the subacrosomal cone. However, the tails present marked differences. In the species with 2n=22, that is, Pseudopaludicola sp. 1 (P. pusilla group), P. saltica, P. falcipes and P. mineira the tails present accessory fibers (juxtaxonemal fiber, undulating membrane and axial fiber). Fibers of this type are also observed in P. ternetz and P. ameghini (representatives of the 2n=20 clade), although the axial fiber is more developed. In the specimens of the 2n = 18 clade (P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula and Pseudopaludicola sp. 2) and the 2n=16 clade (P. mystacalis), the tail has a thick undulating membrane, characterized by a paraxonemal rod, which is shorter than the undulating membrane of the tail of Pseudopaludicola (2n=22 and 20). The ultrastructural morphological differences observed in the tails of the spermatozoa indicates that these traits are phylogenetically informative, given their partial correspondence to the four clades identified in the molecular studies, and provide evidence of a progressive simplification of the spermatozoa during the evolution of the genus Pseudopaludicola. The comparative analysis of the leiuperine genera indicates that in Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada and P. cuvieri), the tail of the spermatozoon also shows accessory fibers, such as the juxtaxonemal and the undulating membrane, although in this genus, the membrane is longer than that observed in Pseudopaludicola. In addition, there is no axial fiber on the tail of the spermatozoon in Physalaemus. In the case of Engystomops, sister group of Physalaemus, the species E. petersi, E. freibergi, and E. puyango the sperm tail presents all three types of fiber (juxtaxonemal, undulating membrane and axial fiber).The tail of these two genera also differ each other for the shorter undulating membrane in Engystomops,
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corroborating the revalidation of the genus Engystomops. Additionaly, the tail of E.puyango differs from E. petersi and E. freibergi, Duovox clade, and it is similar to E. pustulosus, Edentulus clade, indicating the need of more studies in this genus.In Pleurodema diplolister, representing the genus closest to Physalaemus and Engystomops, the sperm tail has a juxtaxonemalfiber and undulating membrane, which are similar to those found in Physalaemus, although the membrane observed in Pleurodema diplolister is shorter than that observed in Physalaemus. Comparisons with other leptodactylid subfamilies indicated that the Paratelmatobiinae, represented by P. poecilogaster, has the same structures as those observed in the 2n = 22 clade of Pseudopaludicola. On the other hand, the leptodactyline species analyzed, Leptodactylusnatalensis, has a well-developed axial fiber, distinct from that found in the sperm of Engystomops, Pseudopaludicola and P. poecilogaster. However, in the other leptodactyline species analyzed, Adenomera marmorata, previously allocated to Leptodactylus, the sperm tail has only an axoneme. This ultrastructural difference in the tails of A. marmorata and L. natalensis supports the status of A. marmorata as a valid taxon distinct from Leptodactylus.Overall, then, the ultrastructural description of the male gametes of a selection of leptodactylid species provided informative phylogenetic characters, especially with regard to the morphology of the sperm tails, contributing for the understanding of intra and intergeneric relationships.
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Sumário
I INTRODUÇÃO ... 01
1. Os anuros ... 01
2. A família Leptodactylidae ... 02
3. Espermatozoides nos anuros ... 05
4. Justificativa do trabalho ... 11
5. Objetivos... 14
5.1. Objetivo geral ... 14
5.2. Objetivos específicos ... 14
6. Referências ... 15
II ARTIGO I Diferências ultraestruturais nos espermatozoides de espécies de Pseudopaludicola (Amphibia, Anura, Leptodactylidae) com comentários filogenéticos…...23
1. Introdução.. ... 25 2. Material e Métodos ... 27 3. Resultados ... 28 4. Discussão ... 29 5. Referências ... 33 Tabela 1 ... 41 Legendas da Figuras ... 42 Figuras. ... 44
III. ARTIGO II Características ultraestruturais dos espermatozoides de dez espécies de leptodactilídeos (Amphibia, Anura)...49
1. Introdução.. ... 51 2. Material e Métodos ... 53 3. Resultados ... 53 4. Discussão ... 56 5. Referências ... 59 Tabela 1 ... 67 Legendas da Figuras ... 68 Figuras ... 70
IV. CONDISERAÇÕES FINAIS...75
Referências. ... 77
Legendas das figuras ... 80
Figuras ... 81
V. APÊNDICE...84
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Agradecimentos
À minha orientadora, Profa Dra. Shirlei M. Recco-Pimentel, por abrir as portas do seu laboratório e compartilhar suas experiências de ensino e teoria científica.
À minha co-orientadora, professora Dra. Gisele Orlandi Introíni, pela confiança, dedicação, carinho e ensino da teoria e prática, as quais contribuíram para minha formação.
Aos professores Dr. Daniel Pacheco Bruschi, Dra. Mary Anne Heidi Dolder e Dra.Lenita de Freitas Tallarico, pela leitura prévia desse trabalho.
À professora Dra. Ana Cristina Prado Veiga-Menoncello, pelas críticas e sugestões ao trabalho e por auxiliar em diversos momentos, na parte experimental e teórica.
Aos Professores Doutores Maurício Papa de Arruda, Stênio Vittorazzi e Andrea Aparecida Aro, pela agradável convivência e carinho. Também à professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço pelos ensinamentos de teoria científica.
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
Aos docentes do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, pela contribuição a minha formação profissional. Em especial, a Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder, por disponibilizar o seu laboratório para o trabalho experimental.
Ao programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, em especial à secretária Liliam Alves Senne.
Às servidoras do Laboratório de Microscopia Eletrônica: Adriana, Ana e Stella. Aos professores e alunos do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, especialmente a Bruna.
À colega de laboratório Maria Rodrigues, pela amizade, compaixão e parceria nos momentos inesquecíveis que tornaram esse trabalho prazeroso, audacioso, criativo e extremamente importante para a minha formação.
Aos colegas de laboratório, em especial Ariane, Amanda, Karin, Kaleb, William, Débora, Dra. Cíntia, Livia e aos demais que passaram pelo laboratório nesse período. Tenho certeza que todos ajudaram no meu crescimento pessoal e profissional.
Aos amigos da UNICAMP, em especial GDU, Yaoska e Natalia. Aos familiares, em especial Mãe Josefa, irmãos Regina, Ana, Paulo, Luiz e Maria, sobrinhos (os cinco), Zenaide e Graciele. Ao meu amor Bruno pela compreensão, incentivo e carinho que foram fundamentais no crescimento espiritual, pessoal e de luta contra qualquer preconceito.
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I. INTRODUÇÃO
1. Os anuros
A classe Amphibia inclui as ordens: Gymnophiona, Caudata e Anura. A maioria dos anfíbios se concentra nas áreas tropicais, onde apresentaram relevante radiação adaptativa (Duellman e Trueb, 1986). Os anfíbios foram os primeiros representantes vertebrados a ocuparem o ambiente terrestre (Purves et al., 2005) e sua denominação amphi: dual + bios: vida mostra que a maioria dessas espécies vivem parcialmente na água e na terra. Atualmente essa classe é compreendida por 7347 espécies (Frost, 2015).
A ordem Anura (anura: sem cauda) contém a maioria dos anfíbios, 6455 espécies (Frost, 2015). As relações filogenéticas existentes nessa ordem ainda apresentam controvérias e vêm sendo discutidas com auxílio de ferramentas moleculares, citogenéticas, morfológicas e ultraestruturais dos espermatozoides.
Nos anuros existe grande diversidade dos modos reprodutivos (Duellman e Trueb, 1986), nos quais a deposição dos ovos pode ocorrer em ambientes aquáticos, terrestres e arborícolas (Haddad e Prado, 2005). As estratégias reprodutivas nos anuros combinam uma série de atributos morfológicos, fisiológicos e comportamentais, adaptados a certas condições ambientais (Pombal-Júnior e Haddad, 2005).
A chuva é um fator externo importante na reprodução de anuros e a desova reprodutiva aquática é considerada primitiva em relação ao modo de reprodução terrestre (Duellman e Trueb, 1986; Scheltinga e Jamieson, 2003). O modo de reprodução terrestre, juntamente com a fertilização interna, ocorre, por exemplo, em E.coqui, Eleutherodactylidae (Kasinsky et al., 2005).
A fertilização interna foi adquirida independentemente nas ordens Anura, Caudata e Gymnophiona (Lee e Jamieson, 1993). Essa fertilização, retida originalmente em Caeciliidae, na maioria das espécies da ordem Caudata e, também presente nos anuros Ascaphus truei é considerada plesiomórfica em relação à fertilização externa em meio aquático (Lee e Jamieson, 1993). Esses autores sugerem que houve uma divergência evolutiva que fez com que a maioria dos anuros tivesse a fertilização externa e, em grupos mais basais, existisse a fertilização interna.
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2. A família Leptodactylidae
A família Leptodactylidae, nominalmente, foi proposta em 1896 por Werner. Atualmente é formada por 199 espécies encontradas em diferentes regiões das Américas Norte, Central e Sul (Frost, 2015). É um grupo diversificado e que vem sofrendo constante revisão taxonômica (Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Fouquet et al., 2013),exibindo variação cariotípica de 2n=16 a 2n=26 (De Lucca et al., 1974).
Lynch (1971) propôs a criação de quatro subfamílias para agrupar os leptodactilídeos, correspondendo a Ceratophryinae, Hylodinae, Leptodactylinae e Telmatobiinae. Ford (1989) afirmou que os leptodactilídeos apresentam ausência de sinapomorofia. Em 1996, Ruvinsky e Maxson sugeriram que essa família era polifilética, o que foi constatado também por Darst e Cannatella (2004) e posteriormente, por dados moleculares, uma vez que seus representantes formaram dois agrupamentos distintos, Leptodactylinae I: Pleurodema, Edalorhyna, Physalaemus e Pseudopaludicola, e Leptodactylinae II: Adenomera, Lithodytes, Leptodactylus e Vanzolinius, mostraram ser parafiléticos com relação à Cycloramphinae I: Paratelmatobius e Scythrophrys (Frost et al., 2006). De acordo com esses autores, estes agrupamentos somados ao gênero Somuncuria passaram então a ser reconhecidos como leptodactilídeos.
Para um melhor entendimento das relações de parentesco entre os leptodactilídeos, Grant et al. (2006) ampliaram os estudos moleculares e propuseram uma nova estruturação para a família Leptodactylidae que passou a ser composta somente por quatro gêneros: Hidrolaetere, Leptodactylus, Paratelmatobius e Scythrophrys. Pseudopaludicola, Physalaemus (incluindo Engystomops e Eupemphix sensu Nascimento et al., 2005), Edalorhyna, Pleurodema e Somuncuria foram alocados na família Leiuperidae.
Pyron e Wiens (2011), por meio de dados de filogenia molecular, verificaram que a família Leptodactylidae é parafilética em relação à Leiuperidae. Esses autores propuseram então a expansão da família Leptodactylidae, incluindo os gêneros Edalorhyna, Engystomops, Eupemphix, Physalaemus, Pleurodema, Pseudopaludicola e Somuncuria na subfamília Leiuperinae. Os autores também incluíram na subfamília Paratelmatobiinaeos gêneros Paratelmatobius e Scythrophrys. Na subfamília Leptodactylinae, ficaram alocados os gêneros Leptodactylus, Adenomera, Lithodytes e Hydrolaetare (Figura 1)
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Figura 1: Parte do cladograma de Pyron e Wiens (2011)
Ohler e Dubois (2012) validaram a subfamília Paratelmatobiinae. Fouquet et al. (2013), com base em dados moleculares, afirmaram que Rupirana é táxon irmão de Scythrophrys+ Crossodactylodes+ Paratelmatobius. Assim, Paratelmatobiinae foi confirmada com os gêneros Paratelmatobius, Scythrophrys, Rupirana e Crossodactylodes.
Fouquet et al. (2013) consideraram que o ninho de espuma pode ter evoluído de forma independente nas subfamílias Leptodactylinae e Leiuperinae. A presença do ninho de
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espuma nos leiuperíneos pode ter contribuído para a diversificação de espécies, principalmente em relação ao gênero Physalaemus (Fouquet et al., 2013).
Historicamente, os estudos sobre as relações intra e intergenéricas entre os leptodactilídeos são antigos. No relacionamento intergenérico dos leiuperíneos foram levantados diversos questionamentos referentes às relações envolvendo o gênero Pseudopaludicola e outros leiuperíneos. Heyer (1974), em concordância com o estudo de Lynch (1971), sugeriu que Pseudopaludicola estaria relacionado ao gênero Physalaemus e que Pleurodema, por sua vez, seria o grupoirmão de Physalaemus e Pseudopaludicola.
Heyer (1975), utilizando caracteres morfológicos, cromossômicos e reprodutivos, indicou Pseudopaludicola como mais relacionado à Physalaemus e Pleurodema. Cannatella e Duellman (1984), em estudos também baseados em caracteres morfológicos sugeriram a origem de Pseudopaludicola a partir de um grupo de Physalaemus (P. cuvieri, P. fernandezae e P. henselii). Porém, essa hipótese relacionada ao surgimento do gênero Pseudopaludicola foi questionada por Lynch (1989), pois dois dos caracteres (dados larvais e osteológicos) apresentam variações em ambos os gêneros.
As relações entre Engystomops e Physalaemus também sempre foram motivo de controvérsia. Engystomops foi descrito por Jimenéz-de-la-Spada (1872), porém, foi sinonimizado a Physalaemus por Lynch (1970).
Nascimento et al. (2005) com base na morfologia externa e osteologia dos Physalaemus, obtiveram sete grupos fenéticos: P. cuvieri, P. signifer, P. albifrons, P. deimaticus, P. gracilis, P. henselii e P. olfersii. Ademais, esses autores revalidaram os gêneros Engystomops e Eupemphix.
A revalidação para o gênero Engystomops também foi confirmada por Ron et al. (2006, 2010). Sobre a espécie Eupemphix nattereri, Faivovich et al. (2012), com base em dados moleculares e reprodutivos de Pleurodema, consideraram E. nattereri sinônimo junior de Physalaemus.
Lourenço et al. (2008) analisaram dados moleculares e cariotípicos dos gêneros Scythrophrys e Paratelmatobius. Nessa análise incluíram Pseudopaludicola falcipes, a qual foi recuperada como grupo irmão do gênero Leptodactylus. Entretanto, Lourenço et al.
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(2008) consideraram que a relação exata entre os ramos não está resolvida, devido ao baixo suporte de valores de bootstrap.
Fouquet et al. (2013) afirmaram que o gênero Pseudopaludicola é grupo irmão de todos os outros representantes da subfamília Leiuperinae, contrariando dados de autores, como Grant et al. (2006) e Faivovich et al. (2012).
Entre os representantes de Leptodactylinae, diversos questionamentos foram levantados. Por exemplo, Heyer (1969) subdividiu o gênero Leptodactylus em cinco grupos fenéticos: L. fuscus, L. melanonotus, L. ocellatus, L. pentadactylus e L. marmoratus. Heyer (1974) alocou as espécies do grupo L. marmoratus no gênero Adenomera. De La Riva (1996), com base em dados morfológicos de girinos, questionou esse arranjo entre Leptodactylus e Adenomera. Em 1998, Heyer, usando dados de bioacústica e morfologia, apontaram o parafiletismo de Leptodactylus em relação à Adenomera, Vanzolinius e Lithodytes.
Frost et al. (2006), com base em dados moleculares, concluíram que Adenomera é sinônimo de Lithodytes e subgênero de Leptodactylus. Contudo, em diversas análises, Ponssa e Heyer (2007), Zaracho e Hernando (2011), Pyron e Wiens (2011) e Fouquet et al. (2013) afirmaram que Adenomera é distinto do gênero Leptodactylus.
3. Espermatozoides nos anuros
As células germinativas migram para as gônadas onde se estabelecem e se proliferam por mitose, produzindo as oogônias nas fêmeas e as espermatogônias nos machos. Nos anuros, essas células germinativas estão arranjadas em cistos (Prado et al., 2004). Na diferenciação dessas células reprodutivas, a oogônia dará origem ao ovócito e a espermatogônia dará origem ao espermatozoide. Uma vez formados os espermatozoides, esses se concentram livres no lúmen dos túbulos seminíferos, juntamente com outras espermátides em diferenciação (Prado et al., 2004).
Nos anfíbios existe a condição primitiva dos sistemas de ductos, a qual retém o espermatozoide nos testículos até a liberação deles para o ambiente de fertilização. Os ductos testiculares agem apenas na condução do espermatozoide. Além disso, Duellman e Trueb (1986) descreveram uma característica importante em todos os anfíbios, a existência
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de corpos adiposos de coloração amarelada, os quais servem de reserva nutricional para as gônadas (Fitzpatrick, 1976).
Em torno das células de Sertoli, agrupam-se as células germinativas, formando os cistos de espermatócitos, os quais contêm células no mesmo estágio de diferenciação (Báo et al.,1991; Oliveira et al.,2002). Os espermatozoides se encontram próximos à luz e as espermatogônias são localizadas na base do epitélio no tecido germinativo.
Os estágios para formação do espermatozoide são: espermatogônia primária, espermatogônia secundária, espermatócito primário, espermatócito secundário e espermátide, conforme estudos realizados em Bufo arenarum (Burgos e Fawcett, 1956) e em Hyla ranki (Taboga e Dolder, 1991), entre outros.
O tamanho do gameta masculino dos anuros pode ser variável. O comprimento do espermatozoide varia normalmente entre 25 e 180 μm, mas pode chegar a 2330 μm, como é o caso de Discoglossus pictus, Alytidae (Furieri, 1975). Já Leiopelma hochstetteri, Leiopelmatidae, alcança 250 μm (Scheltingaet al., 2001).
Nos anuros, o espermatozoide pode conter diversas estruturas, como a vesícula acrossomal que recobre um espaço epinuclear, um cone subacrossomal, um perforatório endonuclear e o núcleo (Garda, 2002). Na cabeça, estruturas associadas (perforatório e/ou cone subacrossomal, estruturas homólogas em Garda et al., 2002), assumem formas variadas: cilíndrica, fusiforme e “saca-rolhas” (Scheltinga e Jamieson, 2003).
A vesícula acrossomal, nos anuros, pode apresentar duas formas: (1) intimamente associada com a parte apical do núcleo ou (2) pode estar separada da parte apical do núcleo pelo cone subacrossomal (Scheltinga e Jamieson, 2003). Na família Ranidae, a vesícula acrossomal está localizada na parte apical do núcleo na forma de disco ou “saca-rolha”.
Nos espermatozoides de P. falcipes, Leptodactylidae, o complexo acrossomal é composto por uma vesícula acrossomal e abaixo dessa pode ser encontrado o perforatório cônico, também chamado de cone subacrossomal, o qual cobre a porção anterior do núcleo (Amaral et al., 2000). Diferentemente, o espermatozoide dos leptodactilídeos P. thaul (Pugin-Rios, 1980) e L. wagneri (Scheltinga, 2002) não exibiram o cone subacrossomal. Os espermatozoides de diversos representantes da família Ranidae não apresentaram o cone (Qin et al., 2007).
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As inferências filogenéticas associadas à presença e ausência do cone nos espermatozoides de diversos anuros, permanecem incertas. Scheltinga (2002) sugeriu que a ausência dessa estrutura seria uma modificação derivada em Leiopelmaltidae, Pipidae, Ascaphidae e Myobatrachidae.
O cone subacrossomal possuía aspecto de um anel contínuo e homogêneo de feixes na espécie Ameerega flavopicta, Dendrobatidae (referida como E. flavopictus em Garda et al., 2002) e em A. femoralis, Aromobatidae (referida como E. femoralis, Aguiar-Junior et al., 2003). Já nos espermatozoides de P. gracilis, P. biligonigerus (Amaral et al., 1999), P. marmoratus (referida como P. fuscomaculatus em Amaral et al., 1999) e P. falcipes (Amaral et al., 2000), Leptodactylidae, o cone (referido aqui como estrutura de denominação igual a perforatório) era formado por numerosos corpos densos de aspecto não contínuo e não homogêneo no plano transversal.
A peça intermediária do espermatozoide dos anuros, geralmente, apresenta a fossa nuclear, o centríolo proximal, o distal, o início do flagelo e o colar de mitocôndrias (Scheltinga e Jamieson, 2003).
O espermatozoide de Pleurodema thaul foi o primeiro descrito na literatura para um leptodactilídeo (Pugin-Rios, 1980). Uma característica peculiar do espermatozoide desse leptodactilídeo é a ausência de um colar de mitocôndrias e em alguns representantes da família Myobatrachidae as mitocôndrias foram observadas aderidas ao redor da fibra axial da cauda (Lee e Jamieson, 1992).
Apesar do gameta masculino de Leptodactylus wagneri também não apresentar um colar de mitocôndrias, as mesmas foram vistas na região posterior do núcleo e início da cauda (Scheltinga, 2002).
Em Ameerega hahneli e A. trivittata, Dendrobatidae (referidas como E. hahneli e E. trivittata em Aguiar-Junior et al., 2004) o espermatozoide apresenta um colar de mitocôndrias bem desenvolvido, o qual se situa na porção posterior do núcleo até a porção anterior da cauda.
Em Anomaloglossus stepheni, Aromobatidae (anteriormente Colostethus stepheni, Dendrobatidae) foi verificado um colar de mitocôndrias em torno da porção anterior do
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flagelo e, além disso, algumas mitocôndrias foram encontradas na membrana ondulante da cauda (Veiga-Menoncello et al., 2006).
Physalaemus nattereri (anteriormente Eupemphix nattereri sensu Nascimento et al., 2005) apresenta bainha citoplasmática envolvendo o colar mitocondrial e lamelas aneladas, as quais são visualizadas em espermátides tardias. No corte transversal, conforme ocorre mais próximo da região da cauda e distante da peça intermediária, essa bainha diminui em espessura (Zieri et al., 2008).
As caudas dos espermatozoides dos anuros podem exibir diferentes estruturas, como a membrana ondulante e a fibra axial. Essas estruturas podem fornecer informações filogenéticas relevantes (Scheltinga, 2002).
O número de axonemapode variar como é o caso incomum descrito para Telmatobufo australis, Calyptocephalellidae (anteriormente Leptodactylidae, em Scheltinga, 2002), que possui dois axonemas (Pugin-Rios, 1980). Incomum também é apresença de duas caudas verificada no espermatozoide de Allobates femoralis (referida como E. femoralis), por Aguiar-Junior et al. (2003) e em Allobates sp. aff. trilineatus, A. brunneus e A. nidicola (referidas como Colostethus em Veiga-Menoncello et al., 2006). Diferentemente, em Anomaloglossus stepheni (referida como C. stepheni em Veiga-Menoncello et al., 2006), foi encontrada uma única cauda. Esses dados foram importantes para refutar a proposta de Morales (2000), de que a espécie A. stepheni pertencia ao mesmo grupo de A. brunneus (Veiga-Menoncello et al., 2006).
Outro estudorealizado com Hylodes phyllodes, Megaelosia massarti e Crossodactylus sp. (Hylodidae) mostrou espermatozoides com uma única cauda, entretanto, exibiram caudas com dimensões variadas das fibras acessórias, constituídas de fibra justa-axonemal, membrana ondulante e fibra axial (Aguiar-Junior et al., 2006).
Em diversos grupos de anuros, as fibras acessórias das caudas dos espermatozoides variaram na constituição, por exemplo, as caudas dos espermatozoides de Rhinella arenarum (Bufonidae) (referida como Bufo arenarum em Burgos e Fawcett, 1956), de alguns bufonídeos (Lee e Jamieson, 1993), de A. truei (Ascaphidae) (Jamieson et al., 1993), de P. falcipes (Leptodactylidae) (Amaral et al., 2000), de O. cultripes (Odontophrynidae) (Báo et al., 2001), de L. hochstetteri (Leiopelmatidae) (Scheltinga et al., 2001) e de L.
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lineatus (Leptodactylidae) (Salles, 2014), a região da membrana ondulante alojou uma lâmina axial, chamada de fibra axial, constituída de material com forte elétron densidade.
Por sua vez, nas caudas dos espermatozoides de algumas espécies do gênero Physalaemus, P. gracilis, P. biligonigerus (Amaral et al., 1999), P. marmoratus (referida como P. fuscomaculatus em Amaral et al., 1999) e P. nattereri (Leptodactylidae) (referida como E. nattereri em Zieri et al., 2008) não foi observada a fibra axial. Fibra axial bastante dilatada e com aspecto fortemente elétron-denso foi observada em Leptodactylus wagneri (Scheltinga, 2002) e L. podicipinus (Salles et al., 2013).
Ausência de fibras acessórias foi detectada em P. paradoxa, P. tocantins, P. bolbodactyla (Hylidae) (Garda et al., 2004) e em alguns ranídeos do gênero Rana (Kwon e Lee, 1995).
Apesar da diversidade já observada nos espermatozoides de anuros, ainda são necessárias mais descrições dessas células que retratem fielmente a diversidade morfológica gamética entre as espécies presentes nessa ordem (Frost, 2015).
Um resumo das principais estruturas presentes nos espermatozoides de alguns representantes da família Leptodactylidae é apresentado no quadro 1.
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Quadro 1: Estruturas dos espermatozoides testiculares de alguns representantes da família Leptodactylidae.
Dados: 1Pugin-Rios (1980), 2Amaral et al. (1999), 3Amaral et al. (2000), 4Scheltinga (2002), 5Zieri et al.(2008), 6Salles et al. (2013), 7Salles (2014). X: indica presença. Espécies Estruturas Leiuperinae Leptodactylinae Pleurodema thaul1 Physalaemus biligonigerus2 Physalaemus gracilis2 Physalaemus marmoratus2 Pseudopaludicola falcipes3 Engystomops pustulosus4 Physalaemus nattereri5 Leptodactylus wagneri4 Leptodactylus podicipinus6 Lithodytes lineatus7 Vesícula acrossomal X X X X X X X X X X Cone subacrossomal/ Perforatório X X X X X X Forma cônica vesícula X X X X X X X X X X Espaço subacrossomal X X X X X X X X Núcleo X X X X X X X X X X Fossa nuclear posterior X X X X X X X X X X Colar de mitocôndrias X X X X X X X X Canal citoplasmático X X X X X X Anel citoplásmico X X X X X Lamelas aneladas X Material pericentriolar X X X X Estriações transversais X X X X X X Fibra justa-axonemal X X X X X X X X Fibra axial X X X X X X Membrana ondulante X X X X X X X X X X Axonema único X X X X X X X X X X
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4. Justificativa do Trabalho
Entre os anuros, os do gênero Pseudopaludicola, alocados na família Leptodactylidae sensu Pyron e Wiens (2011) são interessantes para estudos científicos que usam a morfologia, a análise molecular - sequências de DNA, citogenética e a ultraestrutura de espermatozoide, por conta das controvérsias sobre suas relações intra- e intergenéricas.
O gênero Pseudopaludicola (Miranda-Ribeiro, 1926) é composto por sapos de pequeno porte (Cardozo e Lobo, 2009). Um dos estudos mais importantes para o grupo Pseudopaludicola foi produzido por Lynch (1989) que fez uma revisão do gênero, confirmando o seu monofiletismo e separando as espécies em dois grupos, um deles, o de P.pusilla, caracterizado pela presença de uma falange terminal em forma de “T”, composto por P. pusilla, P. ceratophyes, P. boliviana e P. llanera, e o outro grupo, que não apresenta esse tipo de falange constituído por P. falcipes, P. mystacalis e P. ternetzi. Mais recentemente, algumas espécies novas como P. giarettai, P. parnaiba e P.hyleaustralis, foram descritas e ainda não foram alocadas em nenhum grupo (Veiga-Menoncello et al., 2014)
Veiga-Menoncello et al. (2014), com base em dados moleculares, mostraram que o grupo de espécies de Pseudopaludicola que não apresenta a falange terminal em forma de T é parafilético ao grupo P. pusilla. Além disso, esses autores mostraram as espécies de Pseudopaludicolaalocadas em quatro clados, correspondentes aos grupos cromossômicos 2n=22, 2n=20, 2n=18 e 2n=16, e que o cariótipo 2n=22 representa uma condição plesiomórfica (Fig. 2).
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Figura 2: Parte do Cladograma de Veiga-Menoncello et al. (2014) para Pseudopaludicola.
Lobo (1996), com base em caracteres morfológicos, propôs P. ameghini como sinônimo de P. mystacalis. Entretanto, essa sinonimização foi contestada por Favero et al. (2011), com base em diferenças marcantes observadas nos cariótipos, sendo P. mystacalis 2n=16 e P. ameghini 2n=20, claramente distintas citogeneticamente. Posteriormente, Pansonato et al (2013) propuseram P. ameghini como espécie válida e essa proposta foi
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corroborada também pelos estudos de filogenia molecular de Veiga-Menoncello et al. (2014).
Duarte et al. (2010) e Fávero et al. (2011) investigaram citogeneticamente diversas espécies e populações do gênero Pseudopaludicola. Esses estudos confirmaram a ocorrência de uma ampla variação cromossômica numérica intragenérica (2n=16 a 22), a qual havia sido anteriormente relatada para P. falcipes e P. ameghini (Cope, 1887) e atribuída, equivocadamente, a um polimorfismo intraespecífico presente em P. falcipes (Beçak, 1968; Batistic, 1970).
Conforme detalhado anteriormente, ampliar o conhecimento sobre os quatro grupos de Pseudopaludicola pode favorecer o entendimento das relações nesse gênero. Além disso, essa melhor compreensão do relacionamento intragenérico pode ajudar no entendimento da relação intergenérica de Pseudopaludicola com os demais gêneros de leptodactilídeos que sempre foi motivo de discordâncias (Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Pyron e Wiens 2011; Faivovich et al., 2012; Fouquet et al., 2013).
Somado a isso, outros gêneros leptodactilídeos também sofreram revisões taxonômicas. Entre essas revisões, destacamos aqui os leiuperíneos Physalaemus e Engystomops, os quais foram sinonimizados por Lynch (1970) e revalidados como distintos por Nascimento et al. (2005). Autores como Funk et al. (2007, 2008, 2009) não concordaram com essa revalidação. Atualmente, esses gêneros são considerados grupos irmãos nas filogenias de Pyron e Wiens (2011) e Fouquet etal. (2013).
As relações filogenéticas dos anuros da subfamília Leptodactylinae (sensu Pyron e Wiens, 2011) também têm sido discutidas na literatura, como aquelas debatidas para o grupo L. marmoratus (=Adenomera marmoratus) em relação às demais espécies de Leptodactylus e de Lithodytes. Frost et al. (2006) afirmaram que Adenomera é sinônimo de Leptodactylus. Entretanto, outros autores, Ponssa et al. (2010), Pyron e Wiens (2011), Fouquet et al. (2013), De Sá et al.(2014) afirmaram que Adenomera é válido e distinto de Leptodactylus.
Lithodytes lineatus foi alocada dentro de Leptodactylus e sinônimo de Adenomera por Frost et al. (2006), entretanto, Pyron e Wiens (2011), Fouquet et al. (2013) e De Sá et al. (2014) propuseram como diferente de Leptodactylus e grupo irmão de Adenomera.
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Nos útimos anos, foi crescente a obtenção de novos dados ultraestuturais de espermatozoides em diversos anuros (Scheltinga e Jamieson, 2003; Aguiar-Junior et al., 2003, 2006; Veiga-Menoncello et al. 2006; Muto e Kubota, 2011; Salles 2014). Esses dados, aliados às ferramentas (molecular, morfologia e canto) revelaram novas possibilidades de inferências de relacionamento e conhecimento sobre a evolução das diferentes famílias de anuros.
Assim, a descrição de espermatozoides de representantes das três subfamílias de Leptodactylidae pode contribuir para o entendimento das relações intragenéricas, principalmente entre os Pseudopaludicola, e intergenéricas, de Pseudopaludicola, Physalaemus, Pleurodema, Engystomops, Adenomera, Leptodactylus e Paratelmatobius.
5. Objetivos
5.1. Objetivo geral
Analisar a ultraestrutura dos espermatozoides de representantes da família Leptodactylidae e comparar as caraterísticas ultraestruturais entre as espécies.
5.2. Objetivos específicos
Comparar os caracteres ultraestruturais dos espermatozoides de espécies de Pseudopaludicola, alocadas no grupo P. pusilla (falange em forma “T”) e nos quatro clados, os quais correspondem aos quatro grupos cromossômicos, 2n=16 a 22.
Confrontar as características ultraestruturais dos gametas masculinos de espécies da subfamília Leiuperinae, principalmente aquelas removidas de Physalaemus e realocadas em Engystomops.
Comparar os caracteres ultraestruturais dos espermatozoides de representantes das subfamílias Leptodactylinae, Leiuperinae e Paratelmatobiinae, especialmente os gêneros Leptodactylus e Adenomera.
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II. Diferenças ultraestruturais nos espermatozóides
de espécies de Pseudopaludicola
(Amphibia, Anura, Leptodactylidae), com comentários
filogenéticos
Ultrastructural sperm differences in Pseudopaludicola species (Amphibia, Anura, Leptodactylidae), with phylogenetic comments
1
Julio Sergio dos Santos, 2Gisele Orlandi Introini, 1Ana Cristina Prado Veiga-Menoncello e 1Shirlei Maria Recco-Pimentel
1
Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Charles Darwin, CEP 13083-863,
Campinas, São Paulo,Brasil. E-mail do autor correspondente: shirlei@unicamp.br
2
Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Fundação Universidade Federal deCiências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), Rua Sarmento Leite, 245, CEP: 90050-170, PortoAlegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
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Resumo
O gênero Pseudopaludicola é composto por pequenos anuros sul-americanos, cujas relações taxonômicas tem sido historicamente alvo de questionamentos. Inferências filogenéticas utilizando dados moleculares recuperaram quatro clados dentro de Pseudopaludicula, os quais demonstram correlação com as variações do número de cromossomos previamente detectado, 2n=22, 20, 18 e 16. No presente trabalho foi analisada a ultraestrutura dos espermatozoides de 12 espécies, com o objetivo de descrever sua morfologia e levantar caracteres ultraestruturais que possam contribuir para o melhor entendimento das relações em Pseudopaludicola. Os espermatozoides mostramdistinções nas estruturas que compõem a cauda. As caudas dos espermatozoides das espécies com número cromossômico 2n=22, Pseudopaludicola sp.1 (grupo P. pusilla), P. falcipes, P. mineirae P. saltica, assim como P. ameghini e P. ternetzi com 2n=20, exibem fibras justa-axonemal, membrana ondulante e fibra axial. Já as caudas das espécies com cariótipo 2n=18, P. facureae, P. giarettai, P. canga, P. atragula e Pseudopaludicola sp. 2, e também P. mystacalis com 2n=16, não apresentam fibras justa-axonemal e axial distinguível, caracterizando um bastão para-axonemal, com uma membrana ondulante espessa que é mais curta em relação à exibida nos outros Pseudopaludicola. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas desses espermatozoides podem ser filogeneticamente informativas, pois essas caudas coincidem com alocação das espécies nos ramos da árvore filogenética e possibilitam levantar a hipótese de uma progressiva simplificação do espermatozoide durante a evolução desse gênero.
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1. Introdução
O gênero Pseudopaludicola Miranda-Ribeiro (1926) pertencente à família Leptodactylidae, subfamília Leiuperinae (Pyron e Wiens, 2011) é atualmente composto por 18 espécies (Frost, 2015) de pequeno porte, não ultrapassando 2,5 cm de comprimento. Essas espécies são amplamente distribuídas pela América do Sul, desde a Colômbia à Argentina, incluindo as Guianas e Suriname.
Uma relevante revisão do gênero Pseudopaludicola foi realizada por Lynch (1989) na qual as espécies até então descritas foram alocadas em dois grupos fenéticos: Grupo “pusilla”, caracterizado pela presença de uma falange terminal em forma de “T” e composto pelas espécies P. boliviana Parker 1927, P. ceratophyes Rivero e Serna 1985, P. llanera Lynch 1989 e P. pusilla Ruthven 1916, e o grupo “falcipes”, composto pelas espécies P. falcipes Hensel 1867, P. ameghini Cope 1887, P. mystacalis Cope 1887, P. saltica Cope 1887 e P. ternetzi Miranda-Ribeiro, 1937 e que possuem falange terminal simples. Esse grupo foi considerado por Lynch, em sua revisão, parafilético em relação ao grupo “pusilla”. Espécies descritas posteriormente e que também apresentam falanges simples não foram alocadas em nenhum grupo, sendo elas, P. mineira Lobo 1994, P. murundu Toledo et al. 2010, P. giarettai Carvalho 2012, P. hyleaustralis Pansonato et al. 2012, P. facureae Andrade e Carvalho 2013, P. parnaiba Roberto et al. 2013 e P. atragula Pansonato et al. 2014. Pseudopaludicola canga Giaretta e Kokubum 2003, inicialmentefoialocada no grupo “pusilla”, mas posteriormente removida, devido a não comprovação da existência de falange terminal em T (Cardozo e Suárez 2012).
A grande semelhança morfológica entre as espécies do gênero Pseudopaludicola contribui para as diversas mudanças taxonômicas, envolvendo sinonimizações e revalidações de espécies, por exemplo, Haddad e Cardoso (1987) usaram dados morfológicos e sinonimizaram P. ameghinicom P. mystacalis, entretanto, Strüssmann (2003), com base em dados bioacústicos e morfométricos, sugeriu a revalidação de P. ameghini. Fávero et al. (2011) encontraram uma diferença cariotípica marcante entre P. ameghini(2n=20) e P. mystacalis(2n=16) e corroboraram a hipótese de retirada de P. ameghini da sinonímia de P. mystacalis, realizada recentemente por Pansonato et al. (2013).Em outro exemplo conflitante de taxonomia, P. riopiedadenses foi diagnosticada
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como distinta de outros Pseudopaludicola (Mercadal de Barrio e Barrio, 1994), mas, recentemente essa espécie foi sinonimizada com P. ternetzipor Cardozo e Toledo (2013). Pseudopaludicola serrana, descrita por Toledo (2010), foi considerada próxima de P. saltica e sinonimizada a P. murudu por Pansonato et al. (2014).
Diversas espécies e populações de Pseudopaludicola foram citogeneticamente analisadas por Duarte et al. (2010) e Fávero et al. (2011). Esses autores confirmaram a ocorrência de variação no número diploide de cromossomos, observado anteriormente por Beçak (1968) e Batistic (1970), com a existência de quatro grupos distintos: 2n=16, 2n=18, 2n=20 e 2n=22. Veiga-Menoncello et al. (2014), com base em análise filogenética molecular, recuperaram quatro clados, concordantes com os quatro grupos cromossômicos. Esse estudo confirmou também o monofiletismo do gênero Pseudopaludicola e o parafiletismo das espécies que não possuem a falange em forma de “T” em relação ao grupo “pusilla”.
A relação intergenérica de Pseudopaludicola com os demais representantes da subfamília Leiuperinae tem sido motivo de controvérsias (Lynch, 1971; Heyer, 1974; Heyer, 1975; Lobo, 1995; Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Pyron e Wiens, 2011; Faivovich et al., 2012; Fouquet et al., 2013).
Com relação às características ultraestruturais dos espermatozoides de anuros, (ver Scheltinga e Jamieson, 2003) podemos destacar a importante contribuição na elucidação de alguns questionamentos relacionados à sistemáticaenvolvendo, por exemplo, em algumas espécies do gênero Litoria, família Hylidae (Meyer et al., 1997), do gênero Ameerega, família Dendrobatidae (anteriormente referido como Epipedobates, ver Aguiar-Junior et al., 2004) e dos gêneros Anomologlosuse Allobates, família Aromobatidae (referidos anteriormente como Colosthetus,ver Veiga-Menoncello et al., 2006).
A ultraestrutura do espermatozoide também tem auxiliado no conhecimento das áreas de taxonomia e sistemática de outros grupos de vertebrados, por exemplo, em lagartos da família Teiidae (Callopistes flavipunctatus, Crocodilurus amazonicus, Dicrodon
guttulatum, Dracaena guianensis e Teius oculatus) e Cercosaura ocellata,
Gymnophthalmidae (Colli et al., 2007), em peixes Ostariophysi (Quagio-Grassioto e Oliveira, 2008), e em invertebrados, como nos insetos da família Eulophidae (Brito et al.,
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2009) e nos moluscos Isognomon bicolor e I. alatus (Introíni et al., 2009).Considerando o gênero Pseudopaludicola, a ultraestrutura do espermatozóide foi descrita apenas para uma espécie P. falcipes (Amaral et al., 2000).
Diante da carência de informações ultraestruturais de espermatozoides em Pseudopaludicola, no presente trabalho foi realizada uma análise comparativa entre as espécies de Pseudopaludicolaque possuem falange simples e em forma de “T”, buscando correlacionar as características ultraestruturais dos espermatozoides com os quatro clados/grupos cromossômicos 2n=16, 2n =18, 2n=20 e 2n=22 recuperados na filogenia molecular (Veiga-Menconcello et al., 2014).
2. Material e Métodos
2.1. Espécies analisadas e locais de coleta
Foram analisados os espermatozoides de 12 espécies de Pseudopaludicola coletadas em 15 localidades diferentes do Brasil (Tabela 1, Figura 1), com permissão do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA - processos 02001.002003/2005-16 e 02001.002/2005/16).
2.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Suspensões de célulasforam obtidas a partir de testículos retirados de animais previamente anestesiados por lidocaína e fixadas em glutaraldeído 2% + paraformaldeído 2% e gotejadas em lamínulas e pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio 1%. Posteriormente, essas lamínulas foram desidratadas em uma série crescente de álcool (30-100%), levadas ao ponto crítico (CPD-030) e cobertas com partículas de ouro no Sputter Coater (SCD-050). As preparações foram observadas no Microscópio Eletrônico de Varredura Jeol - JSM 5800 LV.
2.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
Os testículos foram fixados em glutaraldeído a 2% e paraformaldeído 2%, 24 horas, à 4ºC. Após lavagem em tampão cacodilato (0,1M), foram pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio 1%, desidratados em uma série crescente de acetona (30-100%) e incluídos em resina Epoxi Epon 812.Cortes ultrafinos, obtidos em Ultramicrótomo Ultracult (UCT), foram transferidos para telas de cobre 200 mesh, submetidos ao acetato de
