ELISA DE TOLEDO BALDI
NÍVEIS ELEVADOS DE TNF-α NO SANGUE DE
CORDÃO UMBILICAL EM FILHOS DE MÃES
OBESAS
CAMPINAS 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENFERMAGEM
ELISA DE TOLEDO BALDI
NÍVEIS ELEVADOS DE TNF-α NO SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL EM FILHOS
DE MÃES OBESAS
Orientadora: Profª Dra. Eliana Pereira de Araujo
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Enfermagem da Faculdade de Enfermagem da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de “Mestra em Ciências da Saúde”, Área de Concentração: Enfermagem e Trabalho.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ELISA DE TOLEDO BALDI E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ELIANA PEREIRA DE ARAUJO.
Assinatura da Orientadora
CAMPINAS 2015
EPÍGRAFE
"O sucesso é como o ar que respiramos, está ao nosso redor, em toda parte, todos nós em uma condição normal temos acesso a ele de forma ili mitada, as oportunidades são iguais para todos, a grande diferença é que alguns respiram
fundo e seguem adiante, outros perdem o fôlego e desistem ". (Luis Alves)
AGRADECIMENTOS
“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei, pois se não fosse por elas, eu não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mas as críticas nos auxiliam muito”. Chico Xavier
Primeiramente agradeço a Deus pelo dom da vida, pelos meus olhos, pela minha capacidade de sorrir diante às dificuldades e desafios impostos, o qual me faz amadurecer diariamente e contribuir para meu crescimento pessoal e profissional.
Agradeço à minha família, por sempre me fazer acreditar que sou capaz, pelo amor incondicional, e pelo amparo ao ultrapassar os obstáculos diários.
À Professora e orientadora Eliana, por quem tenho grande apreço e orgulho pelo seu conhecimento, exemplo de profissionalismo e dedicação na área de Enfermagem. Agradeço pelos ensinamentos que adquiri através de sua experiência tanto no projeto desenvolvido quanto na vida profissional.
Aos colegas do laboratório pela paciência com os procedimentos, sempre dispostos a ensinar-me as melhores técnicas para facilitar o meu trabalho.
À todas as funcionárias do CAISM pelo carinho e pela grande colaboração neste trabalho com as coletas de sangue, contribuindo para essa etapa longa da pesquisa.
Aos colegas da pós-graduação que dividiram experiências, momentos de aflição e angústia pelos prazos estabelecidos.
A todos os professores da Faculdade de Enfermagem que contribuíram para meu aprendizado profissional nas disciplinas do curso, especialmente ao professor Henrique pela grande paciência para esclarecimento das minhas dúvidas em estatística.
“Quando eu deixei de olhar tão ansiosamente para o que me faltava e passei a olhar com gentileza para o que eu tinha, descobri que, de verdade, há muito mais a agradecer do que a pedir”. Ana Jácomo
RESUMO
Obesidade é uma grande preocupação na saúde pública mundial nos dias de hoje. Sua freqüente associação com algumas doenças, como: DM tipo 2, HAS, aterosclerose e alguns tipos de câncer, contribui para o comprometimento da qualidade de vida e longevidade. Estudos epidemiológicos indicam que em várias regiões do planeta crianças e jovens estão sendo acometidos precocemente por essa doença, fazendo com que suas projeções futuras sejam ainda piores. A obesidade materna tem sido implicada com distúrbios metabólicos da prole, porém, pouco se sabe a respeito de como o ambiente gestacional de uma mãe obesa pode determinar o desenvolvimento de doenças na vida adulta de sua prole.
Objetivo: avaliar a expressão de citocinas inflamatórias (TNF-α, INF-γ,TGF-1β ) e quimiocinas (MCP-1 e MCP-2) no sangue de cordão umbilical de bebês de mães com sobrepeso e obesidade, e correlacionar estes marcadores com o peso do bebê por volta dos 9 meses de idade.
Métodos: estudo transversal de abordagem quantitativa. Os dados antropométricos das mães e dos bebês foram coletados do cartão de pré-natal da gestante e do prontuário do binômio, sendo registrados em impresso próprio. Foram coletadas 104 amostras de sangue de cordão umbilical, sendo: 54 do grupo 1 (mães com sobrepeso e obesidade) e 50 do grupo 2 (mães com peso adequado e baixo peso). As citocinas TNF-α, INF-γ,TGF-1β e quimiocinas MCP-1 e MCP-2 foram avaliadas por meio de ELISA, segundo a orientação do fabricante de cada kit. Os lactentes foram localizados posteriormente através de contato telefônico com a mãe para informar os dados antropométricos e idade atual das crianças, conforme registro em cartão de acompanhamento pediátrico. As correlações entre as proteínas e o IMC materno foram estimadas por meio do coeficiente de correlação de Spearman. Já as comparações envolvendo os grupos de mães com sobrepeso e obesidade (grupo 1) e peso adequado e baixo peso (grupo 2) com relação às proteínas foram realizadas por meio do teste não-paramétrico de Mann-Whitney, considerado um nível de significância igual a 5%.
Resultados: Somente a concentração da citocina TNF-α no sangue do cordão teve relação com o IMC materno, sendo aproximadamente duas vezes mais elevada em mães obesas e com sobrepeso do que em mães com peso adequado ou com baixo
peso. Houve uma correlação inversa entre a concentração de TGF-1β no sangue de cordão e o peso do bebê ao nascimento.
Conclusão: Apesar de não termos encontrado um marcador biológico que permita prever um maior ganho de peso de bebês durante os primeiros anos de vida, este estudo fornece informação adicional a respeito do risco proporcionado pela obesidade materna, uma vez que expõe o bebê a níveis mais elevados de uma citocina inflamatória desde etapas muito precoces da vida.
Palavras-chave: obesidade, prole, inflamação
ABSTRACT
Nowadays, obesity is a major concern in worldwide public health. Its frequent association with certain diseases, such as type 2 diabetes, hypertension, atherosclerosis and some cancer, contributes to reduced quality of life and longevity. Epidemiological studies indicate that in many parts of the world, children and young people are being affected early by this disease, making their future projections are even worse. Maternal obesity has been implicated in offspring’s metabolic disorders, however, few studies have been done about how the gestational environment of obese mother can determine the development of diseases in offspring’s adult life.
Objective: To evaluate the expression of inflammatory cytokines (TNF-α, IFN-γ, TGF-1β) and chemokines (MCP-1 and MCP-2) in the babies’ umbilical cord blood of mothers with overweight and obesity, and correlate these markers with the baby's weight at around 9 months of age.
Methods: Cross-sectional study with a quantitative approach. Anthropometric data of mothers and babies were collected from antenatal card’s pregnant and the medical records of the binomial, being recorded in own form. It was collected 104 umbilical cord blood samples, as follows: 54 in group 1 (mothers with overweight and obesity) and 50 in group 2 (mothers with normal weight and underweight). The cytokines TNF-α, INF-γ, TGF-1β and chemokines MCP-1 and MCP-2 were evaluated by ELISA according to manufacturer's instruction of each kit. The infants were later located by telephone with their mother to inform the anthropometric data and the current age of the children, as recorded in pediatric card. The correlations between proteins and maternal BMI were estimated using the Spearman correlation coefficient. The comparisons involving groups of mothers with overweight and obesity (group 1), normal weight and underweight (group 2) in relation to proteins, were performed using the non-parametric Mann-Whitney test, with a significance level equal 5%.
Results: Only the concentration of TNF-α cytokine in cord blood was related to maternal BMI, being about twice as high in obese and overweight mothers than mothers with normal weight or underweight. There was an inverse correlation between the concentration of TGF-1β in cord blood and the baby’s birth weight.
Conclusion: Although we have not found a biological marker to forecast a baby’s weight gain during the first year of life, this study provides additional information regarding risk
provided by maternal obesity, since it exposes the baby to high levels of inflammatory cytokines from early stages of life.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Sinalização inflamatória no desenvolvimento da resistência à insulina ... 18
.
Tabela 1. Diagnóstico nutricional da gestante conforme o IMC e a idade gestacional ..22
Tabela 2. Variáveis qualitativas do estudo (n=104). Campinas, 2015... 25
Gráfico 1. Distribuição das gestantes do estudo, segundo faixa etária (n=104). Campinas, 2015 ... 25
Tabela 3. Comparação das concentrações das proteínas no sangue de cordão umbilical do bebê entre os grupos de mães com obesidade/sobrepeso (grupo 1) vs. peso adequado/baixo peso (grupo 2). TNF-α, MCP-1, MCP-2, TGF-1β, IFN-γ (em pg/ml). Campinas, 2015... 26
Tabela 4. Comparação das concentrações das proteínas no sangue de cordão umbilical entre os grupos de mães com obesidade, sobrepeso, peso adequado e baixo peso. TNF-α, MCP-1, MCP-2, TGF-1β, IFN-γ (em pg/ml). Campinas, 2015... 27
Tabela 5. Correlação entre as proteínas TNF-α, MCP-1, MCP-2 e TGF-1β no sangue de cordão e parâmetros antropométricos quantitativos de mães e bebês. Campinas, 2015... 28
ABREVIATURAS E SIGLAS
Akt Proteína Quinase B
AgRP Peptídeo Relacionado ao Agouti AMPK Adenosina Monofosfato Quinase
CART Transcrito Regulado por Cocaína e Anfetamina (CART) CEP Comitê de Ética em Pesquisa
Cm Centímetro
DM2 Diabetes Mellitus tipo 2
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay HAS Hipertensão arterial sistêmica
IKK I-Capa-B-Quinase
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e estatística IL Interleucina
IMC Índice de Massa Corpórea
IRS1 Substrato do Receptor de Insulina 1 IRS2 Substrato do Receptor de Insulina 2 JNK C-Jun N-Terminal Quinase
Kg Quilograma
Kg/m2 Quilogramas por Metro Quadrado
MCP Proteína Quimiotáxica de Monócitos mg/dl Miligramas por Decilitro
NF-Κb Fator Nuclear Capa B NPY Neuropeptídeo Y
OMS Organização Mundial de Saúde PCR Proteína C-Reativa
POMC Propiomelanocortina pg/ml Picograma por Mililitro
PKR Proteína Quinase Ativada por RNA
PPAR Receptor Ativado por Proliferador de Peroxisoma TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TG Triglicérides
SUMÁRIO 1. Introdução...14 2. Justificativa...21 3. Objetivos...21 Objetivos Gerais...21 Objetivos Específicos...21 4. Material e Método ...21 5. Resultados...24 6. Discussão...28 7. Conclusão ...30 8. Referências ...32
9. APÊNDICE 1: Dados de Identificação do binômio mãe/bebê ...38
10. ANEXOS ... 39
10.1. ANEXO 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ... 39
10.2. ANEXO 2: PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP/CAISM ... 42
10.3. ANEXO 3: APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE PESQUISA DTG/CAISM ... 44
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1. Introdução
A obesidade é uma doença crônica, multifatorial e de etiologia complexa resultante da interação entre fatores genéticos, ambientais, culturais, econômicos, emocionais, comportamentais e estilo de vida (1). É definida pela Organização
Mundial da Saúde (OMS) como um “acúmulo excessivo ou anormal de gordura, o qual implica em agravos à saúde” (www.who.int).
Atualmente a obesidade é considerada um desafio para a saúde pública mundial devido a sua alta prevalência. Dados da OMS revelaram que em 2008 mais de 1,4 bilhões de pessoas adultas estavam acima do peso, sendo que dessas, aproximadamente 200 milhões de homens e 300 milhões de mulheres encontravam-se obesos. Não apenas os adultos sofrem com este fenômeno, mas também as crianças. Esse mesmo estudo mostrou que 42 milhões de crianças menores de cinco anos apresentavam sobrepeso ou obesidade em 2013 (www.who.int).
No Brasil, uma pesquisa realizada pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) identificou metade da população adulta com sobrepeso, prevalecendo a obesidade em 12,5% dos homens e 16,9% das mulheres (2). Outro
estudo realizado com gestantes de idade superior a 20 anos que faziam o acompanhamento pré-natal em clínicas do Sistema Único de Saúde (SUS) demonstrou entre elas uma prevalência de 25% de sobrepeso e 5,5% de obesidade, deixando evidente o índice alarmante dessa doença (3).
Os principais problemas de saúde causados pela obesidade são os relacionados com a Síndrome Metabólica, que é caracterizada por vários fenômenos como a intolerância à glicose, resistência à insulina, aumento da circunferência abdominal, Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) e dislipidemias, o que acaba culminando com o desenvolvimento de doenças coronarianas (4,5). Além disso, a
obesidade também leva ao aumento da prevalência de alguns tipos de câncer como os de mama e cólon (5).
A obesidade não é um fenômeno atual. Estudos revelam seu surgimento na época paleolítica, há mais de 25 mil anos, quando nos primórdios da evolução humana a luta para obtenção de alimentos devido às condições ambientais desfavoráveis exigia a capacidade de estocar energia e armazenar gordura. Esses genes evolutivamente selecionados para priorizar o armazenamento de gordura
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foram disseminados durantes gerações, chegando aos dias atuais quando a disponibilidade de alimentos é grande na maior parte das regiões do planeta, levando assim ao aumento da prevalência dessa doença (6).
Nas últimas décadas, importantes estudos foram realizados na identificação dos mecanismos que levam ao desenvolvimento da obesidade, na tentativa de encontrar alvos que pudessem ser modulados para controlar o seu crescimento (7,8).
Sabe-se que fatores exógenos (principalmente os comportamentais, dietéticos e ambientais) representam 95% dos casos de obesidade, e que os fatores endógenos (como os componentes genéticos, endócrinos, neuropsicológicos e metabólicos) representam apenas 5% dos casos (9,10). No entanto, os fatores exógenos são os
mais difíceis de serem controlados pela baixa aderência às terapias de mudanças comportamentais (11).
O controle da massa corporal ocorre por meio do equilíbrio entre a ingestão alimentar e o gasto energético orquestrado por mecanismos fisiológicos que ocorrem no Sistema Nervoso Central (SNC). O hipotálamo é a região responsável por esse comando (7,8). Na região do núcleo arqueado do hipotálamo existem duas
subpopulações de neurônios que expressam neuropeptídeos orexigênicos: o Neuropeptídeo Y (NPY) e o Peptídeo Relacionado ao Agouti (AgRP); e os neuropeptídios anorexigêncos: Propiomelanocortina (POMC) e Transcrito Regulado por Cocaína e Anfetamina (CART), responsáveis pelo controle da fome. Todos estes neurônios expressam receptores para leptina (ObRb), e para insulina (IR), hormônios fundamentais na regulação do metabolismo energético (7,8). A insulina é
um hormônio secretado exclusivamente pelas células - pancreáticas, principalmente em resposta a concentração plasmática de nutrientes. Já a leptina é um hormônio com características estruturais de citocina produzido pelo tecido adiposo branco (TAB) numa relação diretamente proporcional à massa deste tecido. Tais hormônios agem de forma complementar, ou seja, ambos têm a capacidade de estimular as células produtoras de neuropeptídeos anorexigênicos e inibir as células produtoras de neuropeptídeos orexigênicos (7,8). Desta forma, em situações
pós-prandiais quando esses hormônios estão elevados no plasma, eles ativam os neurônios POMC/CARTérgicos e inibem os neurônios NPY/AGRPpérgicos o que resulta na redução da ingestão alimentar (7,8). Por outro lado, durante períodos de
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NPY/AGRPérgicos que se encontram ativados, resultando, portanto, no aumento da fome e diminuição do gasto energético. O controle inadequado deste sistema resulta em alterações da adiposidade, sendo que a obesidade é o resultado mais comum deste distúrbio (7,8).
Uma das consequências sistêmicas mais importantes da obesidade é a resistência à insulina, fenômeno biológico caracterizado pela redução da resposta molecular a este hormônio. Apesar de se tratar de um fenômeno molecular, a resistência à insulina tem uma série de consequências clínicas, como: redução da captação de glicose, aumento da produção hepática de glicose e distúrbio do metabolismo de lípides, entre outros (12).
Os mecanismos moleculares envolvidos com o desenvolvimento da resistência à insulina são estudados há mais de trinta anos. A redução da fosforilação em resíduos de aminoácidos tirosina que se detecta nos receptores de insulina (IR) e em seus principais substratos como IRS-1, IRS-2 são os marcadores moleculares mais evidentes do fenômeno de resistência insulínica (13). Além destes,
outros fatores podem estar envolvidos como o aumento da ação de fosfatases, a nitrosação de substratos da via, redução da expressão das proteínas fosforiláveis e ativação de proteínas com atividade serina-quinases (8, 13-16). As primeiras evidências
destes fenômenos surgiram em estudos com humanos e animais experimentais com Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), que ao desenvolverem quadros infecciosos ou inflamatórios graves, apresentavam significativo comprometimento da ação da insulina, mensurável pela redução do clearance de glicose induzida por este hormônio (17). Entretanto, somente em 1993 que Hotamisligil e colaboradores
demostraram que a conexão entre infecções e resistência a insulina decorria do fato de que citocinas inflamatórias como TNF-α, eram capazes de ativar proteínas citosólicas com atividades serina/treonina quinase, JNK e IKK, as quais levavam à fosforilação inibitória do receptor de insulina e seus substratos (18). Além disso, este
estudo demonstrou também que na obesidade, o tecido adiposo se torna inflamado e produz algumas das mesmas citocinas inflamatórias que são produzidas na infecção. Assim, em modelos animais de obesidade e em humanos obesos, as citocinas produzidas no tecido adiposo são capazes de induzir a resistência à insulina (18).
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O TNF- α é uma citocina pró-inflamatória que age através do seu receptor especifico trimérico TNFAR, e ativa importantes cascatas de sinalização, entre elas a proteína quinase c-Jun Terminal (JNK). A JNK é uma serina/treonina quinase pertencente à superfamília de proteínas ativadas por mitógenos (MAP quinases). Estas são componentes importantes na cascata de eventos que controlam a embriogênese, diferenciação, proliferação e morte celular. Porém, a JNK, Fator Nuclear Kappa B (NF-kB) e Proteína quinase C (PKC) podem ser ativadas em reposta às citocinas inflamatórias, e quando ativadas inibem a via de sinalização da insulina por agir sobre os substratos do receptor de insulina (19,20). Quando a insulina
se liga ao seu receptor (IR), o substrato do receptor de insulina 1 e 2 (IRS-1/2) é fosforilado em resíduos tirosina e assim é propagada a cascata de sinalização desse hormônio. No entanto, estas proteínas inflamatórias são capazes de fosforilar o IRS-1 e 2 em resíduos serina o que contribui para resistência à transdução do sinal deste hormônio (8,13).
Outra via pró-inflamatória que pode levar à fosforilação em serina de substratos do receptor de insulina, assim como aumento da transcrição de proteínas inflamatórias como a própria JNK, é a via IKK/IκB/NF-kB. Esta via pode ser ativada tanto pelo TNF-α quanto pela IL-1β. A inibição farmacológica da ativação da via IKK/IκB/NF-kB com uso de antiinflamatório como o Ácido Acetilsalicílico (AAS) reverte a resistência à insulina induzida por sinais pró-inflamatórios ou por sepse (21).
Estudos mais recentes mostraram ainda que há uma estreita relação entre o sistema imune e o metabólico por meio dos receptores Toll-like (TLR). Os TLRs são membros de uma superfamília de receptores de interleucina-1 (IL-1R), que responde a sinais microbianos, levando à ativação da resposta imune inata (30,31). Até o
momento, onze membros da família TLR foram identificados (22,23). TLR1, 2, 4 e 6
são capazes de reconhecer porções lipídicas de microorganismos. Dímeros de TLR1/2 reconhecem lipopeptídeosdiacil, dímeros de TLR2/6 reconhecem lipopeptídeostriacil e TLR4 reconhece lipopolissacáride (LPS) presentes também em gorduras saturadas. Estudos revelaram que além de reconhecer estruturas lipídicas derivadas de microorganismos, o TLR4 pode também ser ativado em resposta a gorduras saturadas provenientes da dieta (22).Alguns estudos mostram que uma vez
ativado, o TLR4 é capaz de induzir o aumento da expressão de genes relacionados com a produção de citocinas (22,23).
18
Figura 1: Sinalização inflamatória no desenvolvimento da resistência à insulina. As vias inflamatórias podem ser ativadas por citocinas como o TNF- α e por gorduras saturadas provenientes da dieta, por meio do TLR2/4, os quais provocam a ativação de outras proteínas intermediárias à via de sinalização, como as quinases IKK e JNK. Estas proteínas causam a transcrição aumentada dos genes inflamatórios, que levam ao efeito negativo da via de sinalização da insulina (Fig. adaptada de Olivia Osborn & Jerrold M Olefsky, 2012)(24).
Um aspecto importante da inflamação subclínica da obesidade diz respeito aos tipos de células envolvidas nesta resposta. Estudos mostraram que no tecido adiposo de modelos animais e humanos magros, existem macrófagos residentes que se encontram num estado funcional com baixo potencial inflamatório (25). Tais
macrófagos quando ativados produzem IL-6, IL-8 e pequenas quantidades de IL1-β, recebendo a denominação de macrófagos M2 (25,26). Por outro lado, na obesidade,
os macrófagos podem ser estimulados por IFN-γ e assim diferenciarem-se em macrófagos com elevado potencial inflamatório, produzindo predominantemente
19
TNF-α e IL-12, sendo denominados M1 (25,26). Com o progressivo aumento da
adiposidade, novos monócitos podem ser recrutados para o tecido adiposo aumentando a atividade inflamatória local. A quimiocinas MCP-1 e MCP-2 desempenham papel importante no recrutamento de células monocíticas e, principalmente a MCP-1 parece ser fundamental para o completo desenvolvimento da inflamação do tecido adiposo associada a obesidade (27).
Outro aspecto interessante da inflamação associada à obesidade e DM2 é que não apenas mediadores pró-inflamatórios são ativados. Estudos recentes têm demonstrado que substâncias com atividade anti-inflamatória, como por exemplo, IL-10 e TGF-1β podem também ter sua expressão aumentada, sugerindo que existam mecanismos endógenos que tentam limitar a magnitude da inflamação sistêmica (28).
Do ponto de vista epidemiológico, o crescimento progressivo da prevalência de obesidade na infância e adolescência representa fator de grande risco para a saúde publica no futuro (1). Estudos revelam que o desenvolvimento precoce de
obesidade aumenta o risco de dislipidemia e doença cardiovascular (29). Além disso,
pessoas que crescem obesas têm dificuldade ainda maior de perder peso que aqueles que se tornam obesos na idade adulta.
A obesidade gestacional pode contribuir para o surgimento de complicações maternas e neonatais, levando a uma maior predisposição do binômio à morbi-mortalidade. Dentre essas complicações neonatais, estão: macrossomia, aumento de admissões em Unidades de Terapia Intensiva Neonatal, prematuridade, natimortos, defeitos congênitos e morte perinatal (30).
Alguns estudos têm demonstrado que a obesidade materna também é capaz de levar a agravos irreparáveis no metabolismo da prole (31). Trabalhos realizados na
década de 90 mostraram que situações como desnutrição, obesidade, diabetes e alguns fármacos como os corticóides, agindo sobre a prole durante a gestação, podem levar ao desenvolvimento de obesidade na fase adulta (32,33).
Se houver complicações no início da gestação o feto poderá desenvolver doenças coronarianas, na fase intermediária há maiores riscos de desenvolver problemas renais, e ao final da gestação, o bebê está predisposto a apresentar baixo peso ao nascer e alterações no metabolismo glicídico (34). Tais eventos
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cruciais durante períodos sensíveis como a gestação estariam relacionados a um conceito de “programação metabólica” (35).
Considera-se atualmente que essa “programação metabólica” acontece, pelo menos em parte, por meio de mecanismos epigenéticos, que decorrem de alterações bioquímicas do DNA, seja por metilação e acetilação, por modificações covalentes nas bases de DNA ou ainda modulando na tradução de RNA, resultando desta forma em modificação do padrão de expressão gênica (36).
Os primeiros trabalhos que demostraram que alterações nutricionais maternas durante a gestação poderiam predispor o feto a desenvolver obesidade e doenças cardiovasculares na vida adulta, foram os que estudaram indivíduos que sobreviveram ao chamado “inverno da fome holandês”, ocorrido no final da Segunda Guerra Mundial. Esses trabalhos mostraram que a exposição do feto à fome materna poderia aumentar a prevalência de doenças metabólicas e cardiovasculares na fase adulta (37-39).
Outro estudo de Bertin et al também demonstrou que a desnutrição durante a gestação é capaz de prejudicar o desenvolvimento das células β-pancreáticas na prole com consequente diminuição da secreção de insulina (40).
Assim como a desnutrição, a ingestão calórica em excesso também é capaz de desencadear alterações epigenéticas na prole. Em um estudo recente foi demonstrado que a submissão de ratas prenhes a uma dieta rica em gordura levou a um aumento de massa corpórea e uma redução da sensibilidade à glicose induzida por insulina, que se manteve por duas gerações (41). Outro estudo demonstrou que a
adiposidade materna induz à hiperleptinemia e resistência insulínica na prole, além do aumento do peso corporal que persiste até a idade adulta (42).
Um estudo realizado em mães com DM tipo 1 identificou no cordão umbilical dos bebês, marcadores inflamatórios aumentados, mostrando que já dentro do útero ocorre uma inflamação subclínica que pode ser considerada como um potencial mecanismo de programação dessa doença para o futuro desses indivíduos (43).
Entretanto, não existem estudos que tenham avaliado se há alteração de marcadores inflamatórios no sangue de cordão umbilical em filhos de mães obesas, e se tais marcadores, caso alterados, se relacionam com o ganho de peso da prole no primeiro ano de vida.
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2. Justificativa
O número crescente de gestantes obesas pode significar um risco adicional para a saúde metabólica e cardiovascular das gerações futuras. É possível que marcadores inflamatórios detectados no sangue de cordão umbilical possam indicar risco para ganho precoce de peso.
Portanto, o período de desenvolvimento perinatal pode ser um importante foco de pesquisa adicional para a prevenção da doença, para que desta forma possamos encontrar novos alvos terapêuticos e profiláticos para a obesidade, assim como estratégias para conter essa epidemia.
3. Objetivos Objetivo Geral:
Avaliar a expressão de proteínas inflamatórias no cordão umbilical de bebês cujas mães apresentam sobrepeso e obesidade, e correlacionar com suas medidas antropométricas por volta dos 9 meses de idade.
Objetivos específicos
Avaliar a expressão protéica das citocinas TNF-α, INF-γ,TGF-1β e das quimiocinas MCP-1 e MCP-2 em bebês de mães com sobrepeso/obesidade.
Correlacionar a expressão destes marcadores com o peso do bebê por volta dos 9 meses de idade.
4. Material e Método
Trata-se de um estudo transversal, com abordagem quantitativa.
4.1- Seleção dos sujeitos
As gestantes incluídas no estudo foram selecionadas no centro-obstétrico de um hospital público universitário de alta complexidade, através de amostras de conveniência, de acordo com os dados de peso e altura de seu cartão de pré-natal para o cálculo do IMC gestacional. Os dados foram coletados no período de Janeiro a Junho/2014, após aprovação da Comissão de Pesquisa local, sob o parecer 050/2013, do Comitê de Ética em Pesquisa da FCM/Unicamp, sob o parecer
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494.775, e após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) pelos responsáveis dos recém-nascidos.
4.2- Critérios de inclusão:
Foram incluídos no estudo os bebês nascidos de mães com sobrepeso/obesidade (grupo 1) e os bebês nascidos de mães com peso adequado/baixo peso (grupo 2), segundo a classificação do IMC materno pela idade gestacional, de acordo com a tabela 1.
Tabela 1: Diagnóstico nutricional da gestante segundo o IMC e a idade gestacional(44)
4.3 - Critérios de exclusão:
Foram excluídos do estudo os bebês das mães que faziam uso contínuo de corticosteróides ou antiinflamatórios não esteróides sistêmicos, e os bebês gemelares.
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4.4 - Cálculo do tamanho amostral:
O tamanho amostral foi estimado com o objetivo de comparar os dois grupos com relação aos marcadores inflamatórios, sendo considerada a metodologia estatística para um teste t não pareado (45,46). Para o cálculo foi assumido um nível
de significância igual a 5%, um poder de 80% e uma diferença de 30% entre os grupos. O cálculo amostral resultou em: 52 recém-nascidos de mães com sobrepeso e obesidade (grupo 1), e 52 recém-nascidos de mães com o peso adequado e baixo peso (grupo 2).
4.5 - Instrumento de coleta de dados
Para a coleta de dados foi utilizado um instrumento (Apêndice 1) para registrar as seguintes informações coletadas do prontuário do binômio:
Parturiente: nome, idade, número do prontuário, procedência, telefone de contato, doenças de base, medicamentos utilizados. Os dados de peso, estatura e idade gestacional no momento do cálculo do IMC foram coletados diretamente do cartão de pré-natal da gestante.
Recém-nascido: sexo, tipo de parto, idade gestacional de nascimento segundo o método de Capurro (47), peso e estatura.
4.6 - Procedimentos técnicos:
Foi coletada uma amostra de 2 ml de sangue do cordão umbilical em sala de parto, pelos auxiliares e técnicos de enfermagem, conforme rotina pré-estabelecida do serviço para coleta de tipagem sanguínea do bebê. O sangue foi armazenado em geladeira local, e logo após, centrifugado e o soro foi armazenado à -20ºC no Laboratório de Sinalização Celular da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. Foram avaliadas as seguintes proteínas: TNF-α, INF-γ,TGF-1β, MCP-1, MCP-2, por meio de ELISA. Para a dosagem de MCP-1, MCP-2, INF-γ, TGF-1 utilizou-se o kit Biolegend Legend Max, San Diego CA, EUA e para o TNF-α utilizou-se o kit Quantikine – R e D systems, Minneapolis, MN, EUA. Os procedimentos foram realizados segundo a orientação do fabricante de cada kit.
4.7- Busca ativa dos lactentes do estudo
Os lactentes do estudo foram localizados posteriormente através de contato telefônico com a mãe para informar os dados de peso, estatura e idade atual das
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crianças, conforme registro em cartão de acompanhamento pediátrico. Porém, houve uma certa dificuldade para essa localização, pois os contatos deixados no instrumento não eram os contatos atuais das mães.
4.8- Análise estatística
A descrição das variáveis quantitativas foi realizada por cálculos de médias, desvio-padrão, medianas e valores mínimos e máximos, sendo utilizadas tabelas e gráficos para ilustração das mesmas. As correlações entre as proteínas e o IMC materno foram estimadas por meio do coeficiente de correlação de Spearman. As comparações envolvendo os grupos com relação às proteínas foram realizadas por meio do teste não-paramétrico de Mann-Whitney (46). Para todas as análises foi
utilizado o Statistical Analyses Software (SAS) 9.2, considerado um nível de significância igual a 5%.
5. Resultados
Um total de 239 gestantes consentiu a participação na pesquisa assinando o TCLE, porém destas, somente 104 amostras de sangue de cordão umbilical do bebê foram aproveitadas. O restante das amostras não foi aproveitado por motivo de hemólise ou porque a quantidade de sangue do cordão era insuficiente.
Quando a análise das proteínas foi realizada através de cada kit, as 104 amostras não puderam ser mensuradas completamente para todas as proteínas, sendo que destas, pudemos mensurar somente 102 amostras para a citocina TNF-α, 98 amostras para o TGF-1β e apenas 27 amostras para INF-γ. As quimiocinas MCP-1 e MCP-2 foram mensuradas em todas as MCP-104 amostras. Devido a essa dificuldade de mensuração de INF-γ, a análise estatística poderia ser comprometida, impedindo uma conclusão a respeito da variação deste marcador no sangue de cordão e sua relação com os parâmetros antropométricos das mães e dos bebês. Portanto, essa proteína não será considerada neste estudo.
Com relação à busca posterior dos lactentes, houve dificuldade para obtenção dos dados, pois algumas mães não foram localizadas, sendo, portanto somente 78 lactentes encontrados.
25
A Tabela 2 apresenta as variáveis qualitativas avaliadas no estudo, sendo 61 recém-nascidos do sexo masculino e 43 do sexo feminino. Com relação ao IMC materno, haviam 29 obesas, 25 com sobrepeso, 40 com peso adequado e 10 com baixo peso. Quando agrupadas em dois grupos, obtivemos 54 gestantes do grupo 1 (obesidade/sobrepeso) e 50 gestantes do grupo 2 (peso adequado/baixo peso).
Tabela 2: Variáveis qualitativas do estudo (n=104). Campinas, 2015.
Variável n % Sexo do bebê Masculino 61 58,65 Feminino 43 41,35 Diagnóstico nutricional Obesidade 29 27,88 Sobrepeso 25 24,04 Peso adequado 40 38,46 Baixo peso 10 9,62 Diagnóstico nutricional Grupo1: Obesidade/Sobrepeso 54 51,92
Grupo 2: Peso adequado/Baixo peso 50 48,08
Gráfico 1: Distribuição das gestantes do estudo, segundo faixa etária (n=104). Campinas, 2015.
26
A idade das mães variou de 15 a 43 anos, com idade média de 27 anos. Houve uma maior concentração na faixa etária dos 18 aos 30 anos de idade (n=62). Como a idade da mãe representa risco para a gestação e pode acelerar o amadurecimento e degeneração da placenta, realizamos uma análise do impacto da idade da mãe sobre as proteínas, sem que se detectasse qualquer relação.
As Tabelas 3 e 4 apresentam as comparações entre os valores das citocinas/quimiocinas/fatores de crescimento no sangue do cordão umbilical do bebê e o IMC materno.
Na Tabela 3 utilizou-se as variáveis qualitativas obesidade/sobrepeso versus peso adequado/baixo peso; enquanto que na Tabela 4 a análise foi feita utilizando-se cada um dos quatro grupos referentes ao IMC materno, de forma independente.
Tabela 3: Comparação das concentrações das proteínas no sangue de cordão umbilical do bebê entre os grupos de mães com obesidade/sobrepeso (grupo
1) vs. peso adequado/baixo peso (grupo 2). TNF-α, MCP-1, MCP-2, TGF-1β (em pg/ml). Campinas, 2015.
Variável Grupos N Média Desvio-padrão Mínimo Mediana Máximo p-valor* TNF-α Obesidade/Sobrepeso 54 4,26 6,07 0,83 2,52 43,37 0,0096
Peso adequado/Baixo peso 48 2,11 1,10 0,25 2,18 4,45
MCP-1 Obesidade/Sobrepeso 54 94,86 71,93 21,13 79,28 431,04 0,4051 Peso adequado/Baixo peso 50 111,62 102,63 22,12 84,12 642,65 MCP-2 Obesidade/Sobrepeso 54 25,57 11,07 6,54 24,90 71,65 0,3079
Peso adequado/Baixo peso 50 28,00 11,07 7,76 25,35 62,71
TGF-1β Obesidade/Sobrepeso 50 179,32 132,20 13,26 150,23 743,69 0,2939 Peso adequado/Baixo peso 48 200,09 120,22 22,22 178,65 429,84
*Teste de Mann-Whitney
Somente as concentrações de TNF-α foram estatisticamente diferentes quando comparadas às amostras de sangue do cordão de mães com obesidade/sobrepeso versus peso adequado/baixo peso (p-valor <0,05). As outras proteínas não apresentaram diferenças significativas entre os grupos.
27
Tabela 4: Comparação das concentrações das proteínas no sangue de cordão umbilical do bebê entre os grupos de mães com obesidade, sobrepeso, peso
adequado e baixo peso. TNF-α, MCP-1, MCP-2, TGF-1β (em pg/ml). Campinas, 2015.
*Teste de Kruskal-Wallis
Nas comparações realizadas separando-se os grupos de acordo com as quatro classificações de IMC materno, houve apenas tendência de diferença nos níveis de TNF-α. Nenhuma das outras proteínas apresentou diferença significativa entre os grupos.
A Tabela 5 apresenta as correlações das proteínas avaliadas no sangue do cordão umbilical do bebê com os parâmetros antropométricos das mães (IMC e peso) e dos bebês (peso de nascimento, peso atual aos nove meses de idade e IMC atual aos nove meses de idade).
A análise confirmou a existência de uma correlação direta entre as concentrações de TNF-α no sangue do cordão umbilical do bebê e o IMC materno, assim como uma correlação direta de TNF-α e o peso da mãe.
Variável Grupo n Média Desvio-padrão Mínimo Mediana Máximo p-valor*
TNF-α Obesidade 29 3,82 3,16 1,00 2,58 12,71 0,0643 Sobrepeso 25 4,77 8,32 0,83 2,43 43,37 Peso adequado 39 2,13 1,16 0,25 2,31 4,45 Baixo peso 9 2,05 0,85 1,04 2,04 3,46 MCP-1 Obesidade 29 86,27 48,29 23,11 74,24 261,97 0,7506 Sobrepeso 25 104,82 92,27 21,13 100,93 431,04 Peso adequado 40 102,56 73,69 31,27 80,01 380,94 Baixo peso 10 147,87 178,86 22,12 91,75 642,65 MCP-2 Obesidade 29 24,10 10,02 6,54 24,19 50,86 0,6339 Sobrepeso 25 27,27 12,15 11,68 25,05 71,65 Peso adequado 40 28,09 11,99 7,76 25,53 62,71 Baixo peso 10 27,63 6,65 20,02 25,35 39,75 TGF-1β Obesidade 25 216,46 168,96 13,26 177,81 743,69 0,2292 Sobrepeso 25 142,17 65,26 54,90 139,92 285,63 Peso adequado 39 191,09 114,89 22,22 178,40 425,10 Baixo peso 9 239,07 141,80 88,97 239,28 429,84
28
As variáveis: peso do bebê atual, IMC do bebê atual e a diferença de peso do bebê (entre a idade atual e o nascimento), não se correlacionaram com os níveis de citocinas/quimiocinas e fator de crescimento.
Observamos também uma correlação inversa entre a concentração de TGF-1β no sangue de cordão e o peso do bebê ao nascimento, e uma tendência à correlação positiva entre o TGF-1β e o peso atual do bebê.
Tabela 5: Correlações entre as proteínas TNF-α, MCP-1, MCP-2 e TGF-1β no sangue de cordão e parâmetros antropométricos de mães e bebês. Campinas, 2015.
TNF-alfa MCP-1 MCP-2 TGF-1β IMC mãe 0,2440 -0,0584 -0,0714 -0,0002 0,0135 0,5560 0,4713 0,9982 102 104 104 98 Peso mãe 0,2038 -0,0892 -0,0948 -0,0473 0,0399 0,3679 0,3385 0,6441 102 104 104 98 Peso nascimento 0,1133 -0,1299 0,1300 -0,3077 do bebê 0,3232 0,2507 0,2503 0,0072 78 80 80 75 Peso atual 0,1800 -0,0543 0,0421 0,1343 do bebê 0,1148 0,6325 0,7106 0,2506 78 80 80 75 IMC atual 0,1190 -0,0377 -0,0392 0,0957 do bebê 0,3126 0,7465 0,7366 0,4273 74 76 76 71 Diferença de peso 0,1620 -0,0319 -0,0028 0,2086 (atual – nascimento) 0,1565 0,7789 0,9805 0,0725 78 80 80 75
Coeficiente de correlação de Spearman, p-valor e n
6. Discussão
Dentre os parâmetros avaliados, o TNF-α foi o que apresentou maior relação com o IMC da mãe. Nas análises comparativas, detectou-se níveis mais elevados de TNF-α no sangue de cordão de bebês de mães obesas ou com sobrepeso. Quando
29
a análise foi realizada dividindo-se o IMC materno em quatro grupos: obesidade, sobrepeso, peso adequado e baixo peso houve perda da significância estatística, porém a tendência foi mantida. O valor deste dado foi reforçado pela análise de correlação que se revelou significativa com correlação direta entre peso ou IMC da mãe e TNF-α no sangue do cordão.
O TNF-α é uma das citocinas de maior potência pró-inflamatória. Ele sinaliza através de um receptor de membrana que ativa vias inflamatórias citosólicas como JNK e IKK, levando a um aumento da transcrição de genes de reposta inflamatória e assim atuando como um potencializador da resposta imune em vários tecidos (18).
A identificação do TNF-α como um dos mais importantes indutores da resistência à insulina serve como marco na caracterização da inflamação como um mecanismo central na associação entre obesidade e doença metabólica (48).
Alguns estudos anteriores avaliaram a presença de TNF-α na placenta ou no sangue de cordão. Em um estudo com apenas 15 sujeitos, Varastehpour et al. (49)
encontraram uma relação positiva entre TNF-α placentário e a adiposidade dos neonatos. Neste estudo, não se avaliou a relação entre a concentração da citocina e a massa corporal da mãe. Em outro estudo com 20 mães obesas e 15 magras, Challier et al. (50) detectaram concentrações elevadas de TNF-α na placenta das
mães obesas, porém não foi avaliada a relação entre a inflamação placentária e o peso dos bebês. Por fim, Aye et al. (51) estudaram 60 mães com diferentes massas
corporais. Houve uma relação positiva entre a adiposidade materna e os níveis de TNF-α na placenta. Neste estudo, os níveis de TNF-α na placenta foram comparados ao peso de nascimento do bebê, porém, de forma similar ao nosso estudo, não foi encontrada qualquer relação entre estes parâmetros (51).
Outros dois parâmetros avaliados no estudo foram as quimiocinas MCP-1 e MCP-2. Em nenhuma das análises observamos relação entre as quimiocinas com o IMC materno, o peso do bebê ao nascimento ou peso atual, ou ainda com o ganho de peso do bebê no período. Em pacientes obesos, a concentração sérica de MCP-1 está elevada e tem relação proporcional com a magnitude da resistência à insulina
(52). Animais transgênicos expressam quantidades elevadas de MCP-1 no tecido
adiposo e tornam-se rapidamente resistentes à insulina, enquanto animais knockout para o gene da MCP-1 não se tornam resistentes à insulina quando alimentados
30
com uma dieta rica em gordura (53). Ainda não existem estudos que demonstrem a
associação entre MCP-2 e obesidade, e este estudo também não apresentou alguma relação entre esta quimiocina e os parâmetros antropométricos das mães e dos bebês.
O último parâmetro avaliado foi TGF-1β, um fator de crescimento que participa de uma série de ações importantes no controle fisiológico e em diversas condições patológicas (54. Estudos mostram a sua participação no desenvolvimento
embrionário, crescimento e reparo celular, processo de cicatrização de feridas e desenvolvimento de neoplasias. Entretanto, o que mais nos interessava no presente estudo era a sua participação no controle da resposta imune e na patogênese da obesidade (55). No que diz respeito a regulação da resposta imune, o TGF-1β age
como regulador da resposta contra antígenos não patogênicos e na tolerância contra antígenos próprios, reduzindo assim o risco do desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas e doenças autoimunes (56). Atuando em paralelo a IL-10, o
TGF-1β garante que mesmo frente a uma resposta inflamatória contra eventuais patógenos, o dano tecidual do hospedeiro é minimizado (56).
Nenhum estudo anterior havia avaliado a concentração de TGF-1β no sangue de cordão umbilical em filhos de mães obesas. Neste estudo encontramos uma correlação inversa entre o peso do bebê ao nascimento e o TGF-1β, bem como uma tendência à correlação positiva entre o TGF-1β e o peso atual do bebê. Como bebês que nascem com menor peso tendem a ganhar mais peso nos primeiros meses de vida, devido ao armazenamento de energia pelo organismo, como uma resposta adaptativa (57) é possível que esta correlação positiva seja decorrente deste
fenômeno.
7. Conclusão
A literatura atual confirma um aumento da expressão da citocina inflamatória TNF-α em animais experimentais obesos, porém em indivíduos humanos obesos, ainda há poucos estudos em andamento. Em nosso estudo encontramos um aumento significativo dos níveis de TNF-α no sangue de cordão umbilical em bebês de mães obesas e com sobrepeso. Também houve uma relação inversa entre os níveis de TGF-1β e o peso do bebê ao nascimento. Apesar de não termos
31
encontrado um marcador biológico que permita prever um maior ganho de peso de bebês durante os primeiros anos de vida, nosso trabalho fornece informação adicional a respeito do risco proporcionado pela obesidade materna, uma vez que expõe o bebê a níveis mais elevados de uma citocina inflamatória desde etapas muito precoces da vida. Mais estudos são necessários para se determinar o real impacto da exposição precoce a TNF-α em etapas posteriores da vida.
32
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38
9. APÊNDICE 1: Dados de Identificação do binômio mãe/bebê
Nome: RN de ____________________________________ nº prontuário: ________
Idade da mãe: ____ anos Procedência: ________________ Telefone: ________
Sexo ( ) Feminino ( ) Masculino
DN RN: ______________ Peso: ___________ Estatura: _______________
Tipo de Parto: ___________________
IG nascimento: __________________
Possíveis doenças de base da mãe
___________________________________________________________________
Possíveis medicamentos utilizados pela
mãe:_______________________________________________________________
Peso materno: __________ kg Estatura materna: __________
IG no momento do cálculo do IMC: _______________
39
10. ANEXOS
10.1 ANEXO 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Nome do Projeto: Avaliação dos marcadores inflamatórios em recém-nascidos de mães com sobrepeso e obesidade.
Pesquisadora Responsável: Elisa de Toledo Baldi
Responsável pelo bebê: ______________________________________________ Objetivo da pesquisa: Você está sendo convidada a participar na pesquisa que tem a finalidade de saber se os bebês nascidos de mães com sobrepeso e obesidade têm alguma alteração no sangue quando comparados aos bebês nascidos de mães magras.
Justificativa: A importância dessa pesquisa é saber se realmente existe alteração ao nascimento e desta forma prevenir a obesidade das mães e encontrar meios de tratar uma possível obesidade nos filhos, o mais cedo possível.
Procedimento que será realizado: Serão coletadas do prontuário algumas informações da mãe e do bebê, como: nome, idade da mãe, idade gestacional de nascimento, procedência, telefone da mãe, possíveis doenças de base da mãe, possíveis medicamentos utilizados pela mãe. Será coletado do cartão de pré-natal o valor de peso e altura da mesma para o cálculo do IMC gestacional. Estas informações serão utilizadas somente para a pesquisa, sendo que nenhum dado de identificação será utilizado para os resultados e publicações futuras. Será coletada também uma amostra de 2 ml de sangue diretamente do cordão umbilical no momento do nascimento do bebê, e este sangue será descartado após 5 anos do término da pesquisa.
Riscos: Não há riscos para o bebê ou para a mãe ao participar da pesquisa.
Participação voluntária: A sua participação na pesquisa é voluntária. A sua recusa não levará a qualquer prejuízo no seu tratamento ou do seu bebê, como também em realizações de consultas, exames e internações futuras. Caso aceite, você poderá solicitar informações a respeito do trabalho durante o andamento da pesquisa, assim como poderá desistir de participar a qualquer momento.
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Benefícios e custos: Você não receberá nenhum benefício, como por exemplo, uma remuneração, ao participar da pesquisa, assim como também não terá nenhum gasto.
Confidencialidade da pesquisa: A sua identidade e do seu bebê será mantida em segredo em todas as fases da pesquisa.
A pesquisadora irá seguir os preceitos éticos da Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde.
Este termo de Consentimento Livre e Esclarecido será realizado em duas vias, sendo uma via da responsável pelo bebê, e uma via da pesquisadora.
Declaração de Consentimento
Eu, ________________________________________ RG: _______________ declaro participar voluntariamente deste estudo.
Campinas, ___ de ___________ de 2014.
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Assinatura da responsável pelo bebê Assinatura da pesquisadora
Declaração de Assentimento (em caso de mãe menor)
Eu, ________________________________________ RG: _______________ declaro participar voluntariamente deste estudo.
Campinas, ___ de ___________ de 2014.
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Assinatura da responsável pelo bebê Assinatura da pesquisadora
Em caso de dúvidas relacionadas à pesquisa, entrar em contato com a pesquisadora: Enfermeira Elisa de Toledo Baldi, pelo telefone: (19) 98103-2945 ou através do e-mail: li_baldi@yahoo.com.br
Em caso de denúncias e/ou reclamações referentes aos aspectos éticos da pesquisa, entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
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Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP pelos telefones: (19) 3521-8936 ou (19) 3521-7187, ou no endereço: Rua: Tessália Vieira de Camargo, 126 – CEP 13083-887, Campinas – SP, ou através do e-mail: cep@fcm.unicamp.br
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