Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Raquel Viana Rodrigues
ABORDAGENS ALTERNATIVAS PARA REDUZIR A DEGRADAÇÃO DO COLÁGENO TIPO I
ALTERNATIVE APPROACHES TO REDUCE TYPE I COLLAGEN DEGRADATION
Piracicaba 2017
Raquel Viana Rodrigues
ABORDAGENS ALTERNATIVAS PARA REDUZIR A DEGRADAÇÃO DO COLÁGENO TIPO I
ALTERNATIVE APPROACHES TO REDUCE TYPE I COLLAGEN DEGRADATION
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do Título de Doutora em Materiais Dentários.
Thesis presented to the Piracicaba Dental School of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Dental Materials.
Orientador: Profa. Dra. Fernanda Miori Pascon Coorientador: Prof. Dr. Marcelo Giannini
Este exemplar corresponde à versão final da Tese defendida pela aluna Raquel Viana Rodrigues, e orientada pela Profa. Dra. Fernanda Miori Pascon.
Piracicaba 2017
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Antônio Tadeu Rodrigues e Cecilia Brandão Viana Rodrigues, por serem responsáveis pelo caráter em mim imputado por todo o apoio e suporte dado para que fosse possível a realização desse sonho, além de todos os outros já realizados e também os que ainda virão, muitas vezes deixando de realizar os seus próprios. Pela educação e esforço sem medida. Agradeço ao amor incondicional, em todos os momentos. Por me mostrarem um modelo maior que vocês, JESUS.
À minha irmã Esther Rodrigues Prado, por sempre acreditar em mim. Pela presença em todos os momentos de minha vida, pelos abraços e sorrisos, por todo amor. Também pela proteção na tenra infância. E por cuidar sempre de mim.
Ao meu marido Rafael Fávaro, pela colaboração extrema, sendo corresponsável pelo sucesso deste trabalho. Pela paciência quando eu estava tomada de afazeres nos finais de semana, férias e feriados, estando sempre ao meu lado. Agradeço o incentivo e por ser minha motivação para iniciar e prosseguir em minha caminhada. Agradeço pelo companheirismo, amizade e amor eternos.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A minha orientadora, Profa. Dra. Fernanda Miori Pascon, inicialmente por acreditar em meu potencial e oportunidade desde a iniciação cientifica completando assim 9 anos de trabalho em equipe. Sou grata por todo conhecimento adquirido, atenção, confiança e ensino passado. Agradeço pelo convívio agradável, e pelos laços criados, sendo uma pessoa que admiro de maneira pessoal. Muito obrigada!
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Marcelo Giannini, que confiou em meu trabalho e proporcionou a oportunidade de fazer parte do seu grupo de trabalho, indicando-me também para meu doutorado-sanduíche. Sou grata por todo conhecimento adquirido, atenção, confiança e ensino passado.
Ao Prof. Dr. Ricardo Marins de Carvalho, por todo conhecimento compartilhado, convívio agradável e oportunidades ofertadas. Sua humildade e busca de conhecimento contínuo é fonte de estímulo na caminhada diária. Obrigado por acreditar em minha capacidade, comprometimento e por contribuir para o meu crescimento pessoal e profissional.
Meu reconhecimento e gratidão pela orientação Obrigada!
AGRADECIMENTOS
A Deus por todo amparo e proteção em todos os momentos de minha vida. Ensinando-me a ser paciente e persistente com as dificuldades do caminho. Por ser minha esperança e dirigir minha de vida de maneira cuidadosa e afetiva.
A Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, na pessoa do seu Diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques pela oportunidade da realização do Curso de Doutorado nesta instituição.
A Coordenadoria da Pós-Graduação em nome da Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury e ao Programa de Pós-Graduação em Materiais Dentários em nome da coordenadora Profa. Dra. Regina Maria Puppin Rontani.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES pela concessão da bolsa de doutorado e oportunidade de realizar parte do meu doutorado em uma universidade estrangeira, com a concessão da bolsa de Doutorado Sanduíche na University of British Columbia.
Aos meus amigos e colegas de sanduíche, Bernardo Ubanetto Peres, Luana Dutra de Carvalho, Prof. Dr. Sérgio Lima Santiago, Xianjya Huang, Hazuki Maesono, Dayse Dai, pelos momentos compartilhados e colaborações e melhores desejos de sucesso profissional. Em especial a Eveline Turatti e Elaine Carbonero, pelo e auxílio com os testes laboratoriais durante a realização deste trabalho.
A Profa. Dra. Adriana Manso, pela receptividade e preocupação. Pelo conhecimento partilhado e oportunidade de trabalharmos juntas durante minha estadia na Universidade British Columbia, e pelos almoços veganos personalizados.
Aos docentes do Curso de Pós-Graduação em Materiais Dentários, pelos ensinamentos e experiências cotidianas fundamentais para minha formação. Em especial a professora Profa. Dra. Regina Maria Puppin Rontani, que acompanha minha trajetória desde a iniciação científica acreditando em meu potencial.
Aos técnicos do departamento de Materiais Dentários, engenheiro Marcos Blanco Cangiani e Selma Segalla pela disponibilidade e auxílio quando solicitado. Ao funcionário do laboratório da Área de Odontopediatria, Marcelo Correa Maistro, pela disponibilidade e colaboração. Aos técnicos do laboratório de
Microscopia eletrônica de Varredura Eliene Narvaes Romani e Adriano Luis Martins, pela prontidão e boa vontade em ensinar.
Aos Profs. Drs. Vanessa Cavalli Gobbo, Américo Bortolazzo Correr e Rafael Pino Vitti pela significante contribuição para o aprimoramento dessa tese quando do exame de qualificação.
A todos os professores da FOP-UNICAMP que contribuíram para minha formação, em especial aos professores da área de Materiais Dentários pelos ensinamentos e conhecimentos transmitidos, por toda a atenção e incentivo durante o curso. Agradeço a oportunidade proporcionada e pela grande contribuição para o meu desenvolvimento profissional e pessoal.
À secretária da pós-graduação nas pessoas da Érica A. Pinho Sinhoreti, Raquel Q. Marcondes Cesar Sacchi, Ana Paula Carone, Claudinéia Prata Pradella e Leandro Viganó pelo comprometimento com que realizam seus trabalhos, pela prontidão em ajudar e atenção dispensada a todos os alunos de pós-graduação.
Aos funcionários da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/Unicamp) por estarem sempre prontos a ajudar.
Aos amigos de doutorado: Renata Fernandes, Eveline Soares, Camila Sobral, Tales Candido Garcia, Rafael Pacheco, Caio Vinícius, Valéria Bisinoto, Pedro Freitas, Tóride Cellegati, Ana Paula Ayres e Dayane Oliveira.
Em especial aos amigos:
Tales Candido Garcia pelo apoio e ajuda, por ter tido a oportunidade de caminhar pelos mesmos caminhos, e nunca estar sozinha por estar acompanhada por vocês meus amigos.
Camila Sobral pela parceria em trabalhos, companheirismos, ajuda, conversas e risadas, e por poder compartilhar essa etapa de nossas vidas.
Eveline Soares e Camila Bortoleto Schoba amigas que escolhi como irmãs. Agradeço pelo companheirismo, compaixão, pelas caronas, por poder dividir conversar, choros, angustias, e ainda sorrir da vida! Agradeço por fazer parte da vida de vocês, e lhes desejo todo sucesso do universo.
A todos os amigos da área de Materiais Dentários e também amigos de outras áreas: enfrentarmos momentos de dificuldades e conquistas. A nossa amizade e troca de experiências foi essencial para o crescimento pessoal e profissional de cada um.
A todos meus amigos, estivessem eles perto ou longe, presentes ou apenas em pensamento, se fizeram sempre presentes me auxiliando a ser mais forte quando necessário, principalmente nos momentos de distância e solidão. Vocês alegram meus dias e me ajudaram a tornar possível a conclusão de mais esta etapa.
Agradeço aos meus preciosos avós, Leonilda Brunheroto Garcia, Sávio Viana e Emiliana Brandão Viana por todo cuidado, incentivo e amor a minha vida. Sempre preocupados com minha felicidade e com o sucesso das minhas atividades. Amo muito vocês meus queridos!
Aos meus queridos tios, Maria de Lourdes, Edemir, Neris, Laudemir, Ceris e Ademir, João Batista, José Maria, Helena, Sávio, Gláucia, Márcia, João e Marina, que sempre contribuíram me apoiando, incentivando e com muitas ideias construtivas.
Agradeço em especial também aos meus tios, Sávio, Gláucia e Márcia que apoiaram durante minha estadia no Canadá, ajudando constantemente, incentivando meu desenvolvimento e proporcionando ótimos momentos.
A meus tios sou grata por todo amor dedicado em toda minha vida. Também responsáveis pela minha criação e meu senso crítico. Amo-os de todo meu coração.
Aos meus queridos primos Barbara, André, Felipe, Renata, Ana Paula, João Pedro, Rebeca, Helen, Karen, Raquel, Alexandre, Andrea, Márcio, Nélio, Maria Rita, Maria Carolina, por todo companheirismo e apoio durante essa jornada de estudos, sendo eles pessoas de grande importância na minha vida e que desejo muito sucesso e bênçãos de Deus, AMO VOCÊS!
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
EPÍGRAFE
“Porque sou eu que conheço os planos que tenho para vocês", diz o Senhor, "planos de fazê-los prosperar e não de lhes causar dano, planos de dar-lhes esperança e um futuro.
Então vocês clamarão a mim, virão orar a mim, e eu os ouvirei. Vocês me procurarão e me acharão quando me procurarem de todo o coração...”
RESUMO
Os objetivos nesta tese foram: (1) investigar a capacidade do FeCl3 prevenir
degradação do colágeno solúvel (CS) e insolúvel (CI); (2) comparar os efeitos do ácido fosfórico a 35% (AF) e soluções condicionantes contendo ácido cítrico (AC) e FeCl3 na resistência da união a dentina, degradação do colágeno e o efeito de FeCl3
na atividade da Catepsina K (CT-K). A tese foi apresentada em dois artigos: (1) Para avaliar a degradação do CS e CI (fibras de tendões de cauda de camundongo - FTCCs), os substratos foram incubados com CT-K e concentrações de 0,02% a 2% de FeCl3. O sobrenadante foi submetido à eletroforese de proteínas. Os
experimentos foram feitos em triplicata. As FTCCs foram caracterizadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a quantidade de Fe absorvida foi determinada pela espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX). Os dados foram submetidos à análise de variância (Brown-Forsythe), normalidade (Shapiro-Wilk ou Anderson-Darling), ANOVA um fator + Holm-Sidak ou Tukey (α=5%). (2) Para avaliar a resistência da união a microtração (μTBS), 78 dentes foram distribuídos em 13 grupos de soluções contendo AC e/ou FeCl3 nas concentrações:
10%-1,8%, 10%-0,6%, 10% AC, 5%-1,8%, 5%-0,6%, 5% AC, 1%-1,8%, 1%-0,6%, 1% AC, 1,8% FeCl3, 0,6% FeCl3 (aplicadas por 15 segundos) e com AF (aplicado por
5 ou 15 segundos). Utilizou-se o sistema adesivo Adper Scotchbond Multi-Purpose, fotoativado por 20 segundos com o aparelho Bluephase G2 (1200Mw/cm2). A μTBS
foi avaliada em 24 horas e 9 meses de armazenamento. Para a degradação do colágeno dentinário, fatias de dentina (n=3) foram tratadas com e sem FeCl3 e
incubadas com CT-K. A dentina foi caracterizada após a incubação utilizando MEV. Outras fatias foram submetidas às soluções condicionantes por 15 segundos e analisadas utilizando EDX. Para avaliar a atividade enzimática da CT-K e efeito de FeCl3 utilizou-se a espectrofluorimetria. Os dados foram submetidos aos testes:
normalidade, ANOVA dois fatores + Holm-Sidak, ANOVA um fator + Tukey ou Fisher (α=5%). FeCl3 foi capaz de prevenir a degradação do CS e CI contra CT-K para as
FTCCs e para a dentina desmineralizada. As micrografias revelaram desenovelamento das FTCCs na ausência de FeCl3 e integridade quando expostas
a concentrações de 0,02%-0,8% de FeCl3. Observou-se interação Fe/colágeno. Os
grupos 5-0,6 e 5-1,8 de AC/FeCl3 apresentaram maiores valores de μTBS
comparados ao AF, independentemente do tempo de armazenamento. Observou-se redução da μTBS aos 9 meses para todos os grupos. A solução contendo 1,8% de
FeCl3 preservou a estrutura da dentina. Observou-se pela análise de EDX que a
imersão nas soluções condicionantes com FeCl3 por 15 segundos foi suficiente para
que as fibrilas de colágeno adsorvessem Fe. A análise por espectrofluorimetria revelou que o FeCl3 inibiu a atividade de CT-K nas concentrações 0,005%-0,08%e
suprimiu a atividade na concentração 0,08%. Concluiu-se que o FeCl3 agiu como um
indutor de reticulação do colágeno e como inibidor da atividade CT-K e estas duas habilidades atuaram em conjunto para a preservação do colágeno tipo I nas FTCCs e na dentina desmineralizada.
ABSTRACT
The aim of this thesis was (1) to investigate the FeCl3 ability to prevent degradation of
soluble (SC) and insoluble collagen (IC), and (2) to compare the effects of phosphoric acid 35% and conditioning solutions containing citric acid (CA) and/or FeCl3 in dentine bond strength, collagen degradation and the effect of FeCl3 on
Cathepsin K (CT-K) activity. The thesis was presented in two articles: (1) To evaluate SC and IC (mouse tail tendon fibers-MTTF) degradation, the substrates were incubating with CT-K with different concentrations of FeCl3 (0.02% to 2%). The supernatant was submitted to protein electrophoresis. The experiments were done in triplicate. The fibers were characterized after incubation by scanning electron microscopy (SEM). The amount of Fe absorbed was determined by X-ray dispersive energy spectroscopy (EDX). Data were submitted to analysis of variance (Brown-Forsythe), normality test (Shapiro-Wilk or Anderson-Darling), and one-way ANOVA (Holm-Sidak or Tukey post-test) (α=5%). (2) For the microtensile bond strength (μTBS), 78 teeth were distributed into 13 groups of solutions containing citric acid (AC) and/or FeCl3 in different concentrations: 10%-1,8%, 10%-0,6%, 10% AC,
5%-1,8%, 5%-0,6%, 5% AC, 1%-5%-1,8%, 1%-0,6%, 1% AC, 1,8% FeCl3, 0,6% FeCl3
(applied for 15 seconds) e com AF (applied for 5 and 15 seconds). The Adper Scotchbond Multi-Purpose adhesive system was used and light/cured for 20 seconds with Bluephase G2 (1200Mw/cm2). The μTBS was evaluated at 24 hours and 9
months of storage. For the dentine collagen degradation, dentine slices (n=3) were treated with and without FeCl3 were incubated with CT-K. Dentine was characterized
after enzymatic treatment by SEM, and other slices were submitted to conditioning solutions and analyzed by EDX. Spectrofluorimetry was used to evaluate the FeCl3
effect against CT-K enzymatic activity. The data were submitted to the tests: normality, two–way ANOVA and post-test Holm-Sidak, one–way ANOVA and Tukey or Fisher tests (α=5%). FeCl3 was able to prevent the degradation of soluble collagen
and collagen fibers against CT-K for the MTTF and the demineralized dentine. The micrographs revealed unraveling of collagen fibers in the absence of FeCl3 and
showed fiber integrity exposed to 0.02%-2% FeCl3 concentrations. The Fe/collagen
interaction was observed. AC/FeCl3 5-0.6 and 5-1.8 solutions had higher μTBS
values compared to the AF, regardless of storage time. A reduction of μTBS was observed at 9 months for all groups. The treatment solution 1.8% FeCl3 preserved
the FeCl3 conditioning solutions was sufficient for the collagen fibrils to adsorb Fe.
Spectrofluorimetry analysis revealed that FeCl3 inhibited CT-K activity at
concentrations 0.005%-0.08% and suppressed activity when using 0.08%. It was concluded that FeCl3 acted both as an inducer of collagen cross-linking and as
inhibitor of CT-K activity, both abilities acted together for the preservation of collagen type I on the MTTF and on the demineralized dentine.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16
2 ARTIGOS 2.1 Artigo 1: Does Ferric Chloride prevent enzymatic collagenase activity? ... 21
2.2 Artigo 2: Effect of conditioning solutions containing ferric chloride on dentine bond strength and collagen degradation* ... 43
3 DISCUSSÃO ... 70
4 CONCLUSÃO ... 75
REFERÊNCIAS ... 76
APÊNDICE - Figuras ilustrativas com a descrição da metodologia empregada nos estudos ... 84
ANEXOS ANEXO 1 - Certificado de submissão para a Dental Materials ... 94
ANEXO 2 - Certificado do Comite de Ética e Pesquisa da Universiade de British Columbia ... 95
1 INTRODUÇÃO
O colágeno é o principal componente do tecido conjuntivo, sendo também a proteína mais abundante em mamíferos, representando 25% aproximadamente em massa corporal (Dang e Leong, 2006; Bertassoni et al., 2012; Bertassoni et al., 2016). Ainda, é composto por mais de 30 cadeias polipeptídicas distintas e pelo menos 25 tipos distintos de colágeno foram identificados em tecidos humanos (Dang e Leong, 2006). Do ponto de vista molecular, o colágeno é formado por três cadeias polipeptídicas em forma de tripla hélice. O colágeno tipo I, por exemplo, é formado por duas cadeias α 1 e uma cadeia α 2. Cada uma destas 3 cadeias de proteínas são formadas por glicina (que representa 1/3 da sequência), prolina e lisina, e por mais dois aminoácidos que são modificados pelos ribossomos: a hidroxiprolina e a hidroxilisina Cada cinco moléculas tri-helicoidais adjacentes, por sua vez, formam uma estrutura que se assemelha a uma hélice, chamada microfibrila (Dang e Leong, 2006; Bertassoni et al., 2012).
Na dentina, o colágeno tipo I apresenta-se em feixes concêntricos, medindo cerca de 100 nm de diâmetro (Bertassoni et al., 2012), os quais se auto-organizam hierarquicamente para formar as fibrilas de colágeno (Bertassoni et al., 2016). O colágeno tipo I representa 90% das proteínas encontradas neste substrato (Tjäderhane et al., 2015). Outros componentes, como proteoglicanos, fosfolipídeos e proteases endógenas, as quais estão ligadas a processos de degradação da matriz orgânica extracelular são observados na dentina (Tjäderhane et al., 2015; Mazzoni et al., 2015). Entre as proteinases endógenas, as metaloproteinases de matriz (MMPs) (Shimada et al., 2009; Mazzoni et al., 2012 [a]; Tjäderhane et al., 2015) desempenham funções fisiológicas e patológicas (Mazzoni et al., 2015). Quanto às funções fisiológicas, acredita-se que as MMPs participam do processo de formação da dentina peritubular e dentina terciária, e também na liberação de fatores de crescimento durante o processo da formação da cárie, regulando as respostas de proteção da polpa (Mazzoni et al., 2012; Tjäderhane et al., 2013 [a]; Tjäderhane, 2015). Quanto às patológicas, participam do processo de formação da cárie dentária, erosão e degradação da camada híbrida (Tjäderhane et al., 2015).
Outra importante família de proteases, as cisteíno catepsinas (CTs) foram observadas em dentina (Nascimento et al., 2011) e a expressão das mesmas (A, B, C, F, H, L, O, Z, D, E, K, L2 e S) foi identificada em odontoblastos de tecido pulpar (Tersariol et al., 2010). AS CTs, assim como as MMPs, também participam dos
processos fisiológicos da dentina, e patológicos estando associadas à progressão de lesão de cárie e degradação da interface adesiva ao longo do tempo (Mazzoni et al., 2012; Vidal et al., 2014; Tjäderhane et al., 2015; Tjäderhane, 2015).
A CT-K, recentemente encontrada em dentina sadia e cariada (Vidal et al., 2014) é caracterizada como uma das mais efetivas colagenases, capaz de hidrolisar o colágeno do tipo I, II e IV. A atividade colagenolítica da CT-K é direcionada tanto para fora da região de hélice da molécula como também em vários locais dentro da região helicoidal, do colágeno tipo I em pH ácido (5,5), sendo que esta propriedade única entre as proteinases dos mamíferos (Garnero et al., 1998), comparadas as MMPs agem em pH neutro (7-8).
Sendo assim diante de situações de desequilíbrio metabólico, a matriz orgânica dentinária é exposta à degradação por essas duas classes de enzimas proteolíticas (MMPs e CTs). Essas enzimas se tornam ativas no momento em que estão livres do componente mineral e, portanto, aptas a degradar o colágeno e outros componentes da matriz dentinária que compõe a camada híbrida. Assim ocorre desestruturação do colágeno exposto e parcialmente infiltrado pelo sistema adesivo, explicando parcialmente à prematura degradação das restaurações adesivas (Tjäderhane et al., 2013 [a]; Tjäderhane et al., 2013 [b]; Tjäderhane et al., 2015). Isto levou os pesquisadores a buscarem estratégias para preservar a matriz do colágeno, prevenir a atividade enzimática na dentina e manter a resistência da união em longo prazo (Tjäderhane et al., 2013 [b]; Tjäderhane et al., 2015).
Essas estratégias envolvem o uso de inibidores enzimáticos, que podem ser incorporados em adesivos ou usados como um passo extra de aplicação. Ainda, podem ser utilizados agentes de ligação cruzada, artificiais e naturais, com o objetivo de aumentar a resistência do colágeno a degradação enzimática, e diminuir a presença da água na interface, com o objetivo de diminuir a velocidade da degradação hidrolítica dos componentes da camada híbrida (Tjäderhane, 2015).
A abordagem mais comum, baseada na inibição de proteases endógenas é o uso a clorexidina. Esta substância tem se mostrado capaz de inibir colagenases e gelatinases presentes na dentina (Pashley et al., 2004, Garcia et al., 2009; Zhou et al., 2011; Scaffa et al., 2012; Sabatini et al., 2013). Entretanto, uma desvantagem clínica do uso da clorexidina é a necessidade de um passo extra de aplicação antes da aplicação do sistema adesivo (Tjäderhane; 2015). Além disso, dificuldades foram encontradas na adição da clorexidina a um adesivo, pois a concentração afetou a
sorção e solubilidade do adesivo, o grau de conversão e as propriedades mecânicas deste (Hiraishi et al., 2008; Pallan et al.,2012; Nishitani et al., 2013). Estudos acerca de um condicionador ácido contendo clorexidina também apresentaram resultados positivos na redução da nanoinfiltraçao e também na perda de resistência de união (Stanislawczuk et al., 2009 e 2011). Porém, por ser uma molécula grande e insolúvel em água ela pode se lixiviada da camada híbrida e perder seu efeito inibitório em longo prazo (Ricci et al., 2010). Assim outros produtos foram testados quanto à habilidade de inibir MMPs: tetraciclinas; bisfosfonatos; íons catiônicos (Zn, Fe); EDTA; Dimetil Sulfóxido (DMSO) e compostos de amônia quaternária como cloreto de benzalcônio e brometo de metacriloíloxidodecilpiridínio (MDPB) (Chaussain et al., 2013; Tjäderhane et al., 2013[b]; Buzalaf et al., 2015; Tjäderhane, 2015).
A estratégia da utilização de substâncias químicas sintéticas como reticuladores não enzimáticos também tem sido estudada e mostrado resultados positivos (Tjadehane, 2015; Buzalaf et al., 2015). O uso do glutaraldeído, cloridrato de carbodiimida (EDC) induziram ligações cruzadas mesmo em tecidos altamente reticulados como a dentina. Contudo, o uso clínico permanece incerto devido à citotoxidade dos compostos (Sung et al., 2003; Han et al., 2003; Bedran-Russo 2010). Também foi demonstrado que agentes derivados de plantas, as proantocianidinas (PACs), interagem fortemente com tecidos biológicos, aumentando as propriedades mecânicas e diminuindo a degradação da dentina através da interação com colágeno tipo I (Han et al., 2003; Vidal et al., 2016). Glutaraldeído, EDC e PACs e riboflavina associada à luz ultravioleta são compostos capazes de inibir proteases endógenas e induzir a reticulação do colágeno (Han et al., 2003; Scheffel et al., 2014; Dirihan et al., 2015 [a]; Seseogullari-Dirihan et al., 2015 [b]; Seseogullari-Seseogullari-Dirihan et al., 2016; Vidal et al. 2016; Seseogullari-Dirihan et al., 2017).
Essas abordagens foram descritas na literatura mais recentemente, entretanto, no inicio do desenvolvimento da “Odontologia Adesiva”, em sua proposta original, Nakabayashi et al. (1982) utilizaram uma solução ácida composta de ácido cítrico (AC) a 10% e cloreto férrico hidratado (FeCl3.6H2O) a 3%, solução essa
conhecida como 10-3. Segundo os autores, o emprego do FeCl3 seria importante
para preservar a estrutura do colágeno exposto, evitando desnaturação, o que era uma preocupação diante do uso de ácidos sobre o colágeno (Nakabayashi et al., 1992 [a]; Nakabayashi et al., 1992 [b]; Nakabayashi & Hiranuma, 2000).
A definição precisa dos benefícios da adição do FeCl3 à solução de
condicionamento da dentina nunca foi esclarecida. Os estudos apresentam discrepâncias sobre os mecanismos envolvidos na melhoria da adesão quando esse componente foi adicionado ao agente de condicionamento, ora como agente de prevenção da desnaturação do colágeno, ora como agente de melhoria da polimerização do adesivo (Imai et al., 1991; Nakabayashi et al., 1992 [a]; Nakabayashi & Hiranuma, 2000).
Independente dos mecanismos de ação, a solução 10-3 foi adotada como agente de condicionamento ácido de dentina por vários produtos japoneses na década de 90 e segue até hoje sendo empregada no cimento resinoso Super Bond C&B (Sun Medical, Japan). Entretanto, esta solução não recebeu atenção por parte dos pesquisadores e fabricantes. Após muita relutância para a aceitação da técnica de condicionamento ácido total devido aos potenciais efeitos deletérios sobre a polpa, pesquisadores e clínicos do ocidente se renderam ao emprego do ácido fosfórico como agente de condicionamento da dentina, seguido do emprego da técnica úmida de adesão para se preservar os espaços interfibrilares e favorecer a infiltração da resina adesiva (Kanca, 1991; Gwinnett, 1994; Carvalho et al., 1996; Hitmi et al., 2012). A aceitação geral do uso do ácido fosfórico se deu ao fato da ausência de evidências demonstrando seu efeito lesivo ao colágeno (quando aplicado dentro dos parâmetros clínicos aceitos atualmente) (Tezvergil-Mutluay et al., 2013). Além da facilidade de fabricação e estabilidade de armazenagem e favorável relação custo-eficácia. Com isso, os estudos acerca da solução 10-3 ou mais especificamente do FeCl3, como agente de condicionamento da dentina, são
escassos e há lacunas no conhecimento sobre os potenciais benefícios sobre a estabilidade da camada híbrida quando do emprego dessa solução.
O ferro ganhou destaque em estudos arqueológicos, os quais investigaram como ocorreu a manutenção do colágeno tipo I e proteínas em fósseis (Schweitzer et al., 2009; San Antonio et al., 2011; Schweitzer et al., 2013; Boatman et al., 2014). Estes estudos sugerem que a preservação de tecidos moles encontrados em fósseis foi resultado da ação do ferro. Além disso, foi observado que o colágeno tipo I hiper-reticulado estava presente em fósseis de Tyrannosaurus rex com associação aos nanocristais à base de Fe com o colágeno dos vasos sanguíneos. Indicando dessa forma que o componente férrico [FeO(OH)] derivados da hemoglobina através da formação de ferritina contribuiu para a preservação do tecido (Schweitzer et al.,
2013; Boatman et al., 2014). Além disso, o uso de FeSO4 mostrou resultados
promissores em relação à inibição da atividade das MMP-2 e -9 (Kato et al., 2010, Kato et al., 2012).
Assim como vários produtos químicos naturais e sintéticos possuem capacidade de aumentar a reticulação do colágeno inter e intramolecular (Seseogullari-Dirihan et al., 2015 [a]; Vidal et al., 2016), o que reflete no aumento das propriedades mecânicas e efeito potencial na conservação da estrutura colágena contra a degradação (Seseogullari-Dirihan et al., 2015 [a]), o emprego do Fe pode atuar como forma de estabilizar o colágeno (Fathima et al., 2006). Contudo, a maioria dos produtos descritos anteriormente é utilizada adicionalmente ao condicionamento ácido e aplicação do sistema adesivo. Assim, a vantagem da utilização de soluções alternativas contendo AC e FeCl3 seria a utilização de um
único composto para condicionamento ácido da dentina.
Entretanto, até o momento não foi realizada qualquer investigação sobre possíveis interações do FeCl3 com CT-K e a capacidade deste composto férrico de
prevenir a degradação do colágeno solúvel e insolúvel, bem como os efeitos na dentina e por consequência na camada híbrida e resistência de união. Sendo assim, os objetivos da presente tese, a qual foi apresentada em dois artigos, foram investigar a interação do FeCl3 com o colágeno solúvel e insolúvel frente a
degradação pela CT-K (Artigo 1) e comparar os efeitos do ácido fosfórico a 35% e soluções condicionantes alternativas contendo AC e FeCl3 na resistência da união a
dentina, degradação do colágeno dentinário e o efeito do FeCl3 sobre a atividade da
2 ARTIGOS 2.1 Artigo 1
Does Ferric Chloride prevent enzymatic collagenase activity?
Raquel Viana Rodrigues a1, Marcelo Giannini b, Fernanda Miori Pascon c, Preety
Panwar ade, Dieter Brömme adf, Ricardo Marins de Carvalho a
Raquel Viana Rodrigues
a Department of Oral Biological and Medical Sciences, Faculty of Dentistry,
University of Columbia, 368-2199 Wesbrook Mall Vancouver, BC V6T 1Z3 Canada. e-mail: rquelrodrigues@hotmail.com
1 Present address - Department of Restorative Dentistry, Dental Materials Division,
Piracicaba Dental School, UNICAMP. Av. Limeira, 901, CEP 13414903 Piracicaba, SP, Brazil. Tel.: +55 19 21065200; Fax: +55 19 34210144
Marcelo Giannini
b Department of Restorative Dentistry, Piracicaba Dental School, UNICAMP, Av.
Limeira, 901, CEP 13414903 Piracicaba, SP, Brazil. Tel.: +55 19 21065200; Fax: +55 19 34210144/ e-mail: giannini@fop.unicamp.br
Fernanda Miori Pascon
c Department of Pediatric Dentistry, Piracicaba Dental School, UNICAMP, Av.
Limeira, 901, CEP 13414903 Piracicaba, SP, Brazil. Tel.: +55 19 21065200; Fax: +55 19 34210144/ e-mail: fmpascon@yahoo.com
Preety Panwar
a Department of Oral Biological and Medical Sciences, Faculty of Dentistry
d Center for Blood Research, University of British Columbia, 4540, Life Sciences
Centre 2350 Health Sciences Mall Vancouver, BC, V6T 1Z3 Canada.
e ClinicalCell Biology, Vejle Hospital/Lillebaelt Hospital, Institute of Regional Health
Research, University of Southern Denmark, Vejle, Denmark. e-mail: preity.pan@gmail.com
Dieter Brömme
a Department of Oral Biological and Medical Sciences, Faculty of Dentistry, d Center
for Blood Research, f Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of
Medicine, University of British Columbia, 2350 Health Sciences Mall, Vancouver, BC, V6T 1Z3 Canada. e-mail: dbromme@dentistry.ubc.ca
Corresponding Author: Ricardo Marins de Carvalho
a Department of Oral Biological and Medical Sciences, Faculty of Dentistry,
University of British Columbia, 368-2199 Wesbrook Mall Vancouver, BC V6T 1Z3 Canada.
ABSTRACT
Collagen is the most abundant protein in mammals and a biomaterial with application in regeneration field. Cathepsin-K (CT-K) it is the most potent collagenase, and it has an important role on degradation of collagen. This study investigated the effect of FeCl3 ability to prevent degradation of soluble and insoluble collagen. Soluble and
insoluble collagen (mouse tail tendon fibers-MTTF) degradation at the presence of FeCl3 against CT-K was measured through electrophoresis. Substrates were
incubated with CT-K and different concentrations of FeCl3 (0.02%; 0.04%; 0.06%;
0.08%; 0.1%; 0.2%; 0.4%; 0.8%; 1%; 2%). The supernatant was subjected to SDS/PAGE. The collagenase activity was evaluated by the lost or generation of bands. The MTTF were characterized after enzymatic treatment using scanning electronic microscopy (SEM) and energy-dispersive X-ray (EDX) evaluation. Data were submitted to the normality test and one-way ANOVA + Holm/Sidak were applied (α=5%). FeCl3 was able to prevent soluble and insoluble collagen degradation, and
inhibited the enzyme starting at 0.06% of FeCl3. SEM observation revealed
unraveling of collagen fibers in FeCl3 absence. It was observed integrity of the fiber
exposed to low concentrations of FeCl3 (0.06%-0.4%), and interaction between
Fe/Collagen. It can be concluded that FeCl3 showed to be a CT-K inhibitor and
cross-linking inducer reducing the collagen enzymatic degradation.
1. INTRODUCTION
Enzymatic activity play crucial role in several biological systems in the human body. The excessive activity of collagenolytic and elastolytic cathepsins (CTs) has been associated with bone and cartilage erosion in osteoporosis and arthritis [1], as well as plaque and blood vessel destabilization in atherosclerosis and aneurysms [2,3]. In dentistry, dental tissue collagenolytic CTs and matrix metalloproteinases (MMPs) have been associated with caries, dental erosion and degradation of resin-dentin bonds [4,5]. Together, these findings make collagenolytic CTs an important drug target [4,6].
Cathepsin K (CT-K) represents the most potent mammalian collagenase [6,7]. It can degrade collagen at various sites of the helical region [8]. CT-K is also a pH-dependent and has its best activity at a relatively low pH (5.5) [9]. The progression of dental erosion and caries and at the onset of clinical adhesive procedures, the surrounding environment usually faces a pH drop. During the bond procedure, acidic conditioners or acidic monomers are used to etch the surface. The acidic condition is required to remove minerals and expose the interfibrillar collagen network to allow for resin infiltration and secure bonding. However, the acidic environment also exposes and activates endogenous proteolytic enzymes (MMPs and CTs) that are considered to be a long-term threat to the stability of the newly formed bond to dentin [4,10,11]. They may be responsible for endogenous proteolytic activity of dentin, contributing not only to collagen degradation at resin-dentin interfaces but in caries progression, since both are present in human dentin [10,12–14].
Because of that, most of the recent research in resin-dentin adhesion has focused on ways to inhibit or reduce enzymatic activity at the interface in order to preserve the exposed collagen and extend the durability of the bonds [4,15].
The interaction of collagen with metal ions such as Fe2+ Fe3+ is one of the
known methods to stabilize collagen. Metal ions find predominant application in cross-linking of collagen for various end uses [16]. Cross-link process could promote tissue stability, strength and restore function in connective tissues such as skin, bone and dentin which are mainly composed of type I collagen [16,17].
Some metal salts can inhibit enzymes that collectively target collagen (such as MMPs), and FeSO4 showed promising result against MMP-2 and -9 activity [18,19].
Since ferric chloride (FeCl3) has been used as part of dental conditioner, in the past
becomes interesting to investigate the ability of FeCl3 to potentially protect collagen
against collagenases. Therefore, the aim of the study was to evaluate the effect of FeCl3 on CT-K activity and the interaction with the soluble and insoluble collagen.
The hypothesis tested was that FeCl3 would be able to prevent soluble and insoluble
collagen degradation.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1 Materials
All chemicals and solvents used in the study: chondroitin 4-sulfate (CSA), dithiothreitol (DTT), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glutaraldehyde, dimethylmethylene blue, N, N-dimethylformamide (DMF), - ferric chloride (FeCl3),
carboxy-trans-2,3-epoxypropionyl-leucylamido-(4-guanidino)butane (E-64) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 37.5:1 (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada) was purchased from the supplier Bachem (Weil Amrhein, Germany). Mouse tail tendons from unrelated study that would be otherwise disposed, and CT-K was kindly provided by the Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia, CA.
2.2 Interaction enzyme/ substrate/ inhibitors 2.2.1Soluble Collagen degradation assay
Bovine type 1 soluble collagen (0.6 mg/ml) (MSJ BioLynx Inc.) was incubated for 4 h at 28◦C in assay buffer (100 mM acetate buffer, pH 5.5, containing 2.5 mM DTT and EDTA 2 5 mM) containing 400 nM CT-K wild type in the presence of 200 nM CAS with addition of the inhibitors in solution form (FeCl3 in concentrations of
0.02% to 2% (Table 1). The reactions were stopped by the addition of 10μM E-64 and subsequently the reaction mixtures were subjected to 10% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS/PAGE). Bands were visualized by Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB) and the staining quantified using densitometrically analysis program Image J (National Institutes of Health). The collagenase activity was quantified based on the loss of α1- and α2 bands after SDS/PAGE. Three individual experiments were performed.
Table 1. Groups inserted at the lanes and respective FeCl3 concentrations on soluble
collagen assays.
Lanes Groups CT-K % FeCl3 in weight
1 control collagen soluble NO 0
2 soluble collagen + CT-K YES 0
3 Å_ control soluble collagen + CT-K+ CSA YES 0
4 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.02% FeCl3 YES 0.02% 5 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.04% FeCl3 YES 0.04% 6 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.06% FeCl3 YES 0.06% 7 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.08% FeCl3 YES 0.08% 8 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.1% FeCl3 YES 0.1% 9 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.2% FeCl3 YES 0.2% 10 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.4% FeCl3 YES 0.4% 11 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 0.8% FeCl3 YES 0.8% 12 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 1% FeCl3 YES 1% 13 soluble collagen + CT-K+ CSA+ 2% FeCl3 YES 2% Positive Å_ Negative
CT-K: Catephin K CSA: chondroitin 4-sulfate
2.2.2 Insoluble Collagen assay 2.2.2.1Isolation of Collagen Fibers
Freshly isolated collagen fibers were used for the present experiments. Type I collagen fibers were isolated from mouse tail tendons. The fibers were pulled out from the distal end of mouse tail using surgical clamps and collected in PBS. These fibers were disinfected with 70% ethanol for five seconds, air-dried, and transferred to a sterile container for further use.
2.2.2.2 In Vitro Collagen Fiber Degradation
Insoluble type I collagen fibers (1 mg) were incubated with wild type CT-K 1M concentration in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.5, containing 2.5 mM DTT and EDTA and the inhibitors in solution form (FeCl3 in concentrations of 0.02% to 2%
(Table 2) for 20 hours at 28 °C. The reaction was stopped by the addition of 10 M E-64. Subsequently, the reaction mixture was centrifuged for 20 minutes, and the supernatant was taken and subjected to SDS/PAGE analysis using 10% Tris/glycine gels. Bands were visualized by Coomassie Brilliant Blue R-250 staining and quantified using densitometrically analysis program Image J. The collagenase activity was evaluated on the basis of the generation and loss of 1 and 2 bands after SDS-PAGE [23]. Three individual experiments were performed.
Table 2. Groups inserted at the lanes and respective FeCl3 concentrations on
insoluble collagen assays.
Lanes Groups CT-K % FeCl3 in
weight
1 control insoluble collagen NO 0
2 Å_ control insoluble collagen + CT-K YES 0
3 insoluble collagen + CT-K + 0.02% FeCl3 YES 0.02%
4 insoluble collagen CT-K+ 0.04% FeCl3 YES 0.04%
5 insoluble collagen + CT-K+ 0.06% FeCl3 YES 0.06%
6 insoluble collagen + CT-K + 0.08% FeCl3 YES 0.08%
7 insoluble collagen + CT-K+ 0.1% FeCl3 YES 0.1%
8 insoluble collagen + CT-K+ 0.2% FeCl3 YES 0.2%
9 insoluble collagen + CT-K+ 0.4% FeCl3 YES 0.4%
10 insoluble collagen + CT-K+ 0.8% FeCl3 YES 0.8%
11 insoluble collagen + CT-K+ 1% FeCl3 YES 1%
12 insoluble collagen + CT-K+ 2% FeCl3 YES 2%
Positive Å_ Negative CT-K: Catephin K
2.2.2.3 Electron Microscopy Imaging and Energy-Dispersive X-ray Measurement Scanning electron microscopy (SEM) was used to characterize collagen fibers after enzymatic treatment. Collagen fibers were incubated under the conditions as described above. The treated fibers were processed for imaging as described previously [9]. After drying procedure, fibers were positioned on acrylic stub with double-sided carbon adhesive tape and sputter-coated with carbon (MED 010 Baltec, Balzers, Liechtenstein). Images were examined under SEM (JEOL, JSM-5600LV, Tokyo, Japan) and energy-dispersive X-ray (EDX) spectrometry analysis (Vantage, NORAN Instruments, Middleton, WI, USA) used to identify the percentage of elements and quantify Fe% in weight. Each spectrum was acquired for 100 seconds (voltage 15 kV, working distance 20 mm). Images showing the identified chemical elements were obtained from ten distinct areas of each treatment group. Micrographs were taken from different regions of the fibers to evaluate morphological changes.
2.3 Statistical Analysis
The data for soluble and insoluble collagen degradation assay were evaluated to check the equality of variance (Brown-Forsythe) and to confirm a normal distribution (Shapiro-Wilk). So, data were submitted to one-way ANOVA and all
pairwise multiple comparison procedures (Holm-Sidak method) (SigmaPlot 11, Systat Software Inc.).
EDX data were tested to confirm a normal distribution (Anderson-Darling Test). Data were submitted to one-way ANOVA all pairwise multiple comparison procedures (Tukey) (Minitab express, version 1.5.0, Minitab Inc.). The significance level was pre-set to all analysis α = 5%.
3. RESULTS
3.1 Degradation of soluble Type I Collagen by CT-K
Soluble collagen assay showed that significant reduction of CT-K activity and consequent reduction of collagen degradation was observed beyond 0.04% and up to 0.1% FeCl3 (Fig. 1). As concentration of FeCl3 increased from 0.04% to 0.1%, the
inhibition of CT-K activity gradually diminished, but were still significantly different from control and from solutions containing 0.02% and 0.04% FeCl3. When soluble
collagen was mixed with different concentrations of FeCl3 without adding the enzyme
and run through the gel, it was noted that at higher concentrations of FeCl3 there was
collagen precipitation caused by iron cross-link with soluble collagen. This cross-link generates high weight molecules that are not able to go through the gel during the electrophoresis (Fig. 2).
Because of this technical limitation, we subtracted the precipitation rate from the CT-K activity results to obtain the actual, relative percentage of CT-K activity as a function of FeCl3 concentration (Fig. 3). From that, the results indicated that there
was a significant reduction of approximately 50-55% of CT-K activity when as little as 0.02-0.04% FeCl3 was added to the solution and further reductions of CT-K activity to
approximately 80-90% was observed beyond the threshold of 0.06% FeCl3
concentration (Fig. 3).
3.2 Degradation of Insoluble Type I Collagen Fibers by CT-K
Fig. 4A showed the results collagenase activity when the substrate is insoluble collagen. At 0.02% FeCl3 is was observed a significant reduction of CT-k activity
dropping around 11.05% (5.33), at 0.04% FeCl3 CT-k activity was 7.75%(2.2) and
starting at 0.06% FeCl3 it is consider that no degradation occurs (p <0.05). The
visibility of 1 and 2 bands represents the collagenase activity, considering lane 2 (no inhibitors) as 100% of CT-K activity Fig. 4B.
3.2.1 EDX Measurement
It was noted by EDX analysis that, after the 20 hours incubation, the fibers adsorbed Fe on the structure. It was found in all groups higher concentration of Fe (%wt.) attached to the fibers than the initial solution concentration, as showed in Fig. 4C. Also Fe % wt found in the fibers it is not directed proportional to the FeCl3
reaction solutions. Groups 11(1% FeCl3) and 12 (2% FeCl3) presented a lower
amount of Fe compared to 7 (0.1% FeCl3).
3.2.2 SEM micrographs analysis
CT-K incubation with collagen revealed a dramatic degradation resulting in the disruption of the arrangement of fibrils with significant structural changes were observed as showed in Fig 4. D1. The iron exercised a degradation preventive effect on the fibers (Fig 4. D2-9). It was observed too the effect of the long ionic exposition on the groups 10,11,12 micrographs, where the fibers were denatured assuming a flat shape.
Fig. 1. Effects of FeCl3 on inhibition of CT-K activity and degradation of soluble
collagen. (A) CT-K activity (%) as function of FeCl3 concentration. The apparent lack
of inhibition of enzymatic activity at and beyond 0.2% FeCl3 was due to precipitation
of collagen (see Results and Fig. 2). Different letters indicate statistically significant differences (p<0.05). (B) Representative SDS/PAGE analysis of soluble collagen degradation products. Soluble bovine collagen was incubated with 400 nM enzyme at pH 5.5 and 28◦C for 4 h in the presence of CSA. Bands α1 and α 2 (130-100 kDa) as showed in the rectangular area, were investigate by densitometric analysis, considering control collagen (lane 1) as no degradation. Molecular weight Marker (M) (PiNK Plus Prestained Protein Ladder - Genedirex ladder).
Fig. 2. Collagen precipitation caused by iron cross-link. (A) Collagen precipitation increased with increased FeCl3 concentration reaching above 95% when FeCl3
concentration was 0.2% and beyond. (B) Precipitation quantification was based on the loss of the bands α1 and α2 by densitometric analysis as showed in the rectangular area, considering control collagen (lane 1) as no precipitation. Different letters indicate statistically significant differences (p<0.0001). Molecular weight Marker (M) (PiNK Plus Prestained Protein Ladder - Genedirex ladder).
Fig. 3. Relative CT-K activity after removing the precipitation rate caused by collagen cross-linking. Significant reductions of CT-K activity could be observed with as little as 0.02% FeCl3 in the solution, with further reductions as the concentration of FeCl3
increased.
Fig. 4. FeCl3 action on the degradation of type I collagen fibers by CT-K. (A)
Quantitative analysis of collagenase activity by SDS/PAGE based on released products (α-Chains) of degradation from fibers upon digestion. The results of three independent experiments are expressed in mean standard deviation (SD) (p <0.05). The statistic difference is showed by lowercase letters. (B) Representative collagenase activity by SDS/PAGE gel. Quantification of collagenase activity is based on the presence of bands α1 and α2 (130-100 kDa) by densitometric analysis as showed in the rectangular area. Considering lane 1 as a control (no degradation), and lane 2 as the maximum of collagen fiber degradation and products formation. (M) Molecular weight Marker (PiNK Plus Prestained Protein Ladder - Genedirex ladder). (C) EDX results showed in boxplot graphic about the percentage in weight (wt%) of iron in the collagen fibers after incubation. The statistic difference was showed by uppercase letters (p<0.05). (D) Representative images corresponding to 1-13
incubated fibers treatments (FeCl3 concentration) and gel lanes. The micrographs
(500X) were taken from different fibers spots. The morphology of fibers after 20 hours CT-K incubation was observed (bars represent 50m), on 2 CT-K unrevealing effect it is observed. CT-K partially degrade the collagen fiber at its surface on 3, 4. Note the collagen fibers incubated with activity buffer in the absence of CT-K reveal no structural changes after 20 hours (D.1) as well as 5, 6, 7, 8, 9 (0.06%- 0.4% FeCl3). The long ionic exposition on the groups 10,11,12 micrographs, cause
denaturation, changing the cylindrical morphology of the fibers flattening them.
4 DISCUSSION
The tested hypothesis that FeCl3 would be able to prevent soluble and
insoluble collagen degradation was confirmed. It was demonstrated a direct relationship between FeCl3 concentration and inhibition of CT-K activity. Our study
showed the effect of FeCl3 on CT-K activity and the interaction with soluble and
insoluble collagen, preventing their degradation (Fig. 3, Fig 4 A).
CT-K is a thiol-dependent cathepsins, so it has a cysteine residue in its active site [24]. As Fe3+ Fe2+ ions generate reactive oxygen species, they could cause
oxidation of the thiol groups of cysteine residues and result in enzyme inhibition [25– 27]. Also, the thiol group (–C–SH or R–SH) has a high affinity for heavy metals. So, the formation of irreversible covalent bond between iron-sulfur, could block the active site of the enzyme [28,29]. As well the Fe3+ could change the collagen enzyme site
inhibiting the degradation, as collagen became unrecognizable to collagenase. [16]. All the three alternatives that probably occur simultaneously will consequently inactivate enzymes catalytic functions [16,25,27,26,30,28,29,31], and result in reduced activity of the CT-K at concentrations of 0.06% of FeCl3 (Fig. 3).
Complexation of metal ions with EDTA leads to stabilization of proteins. Similarly, destructive oxidative reactions of thiol groups of cysteine can also be prevent by adding reducing agents such as β-mercaptoethanol or DTT [26]. The activity buffer used on assays contains 2.5 mM DTT and EDTA. So, if we consider that EDTA is a chelator, the activity buffer was prepared in the absence of EDTA certainly the FeCl3 inhibition concentration would be lower. However, DTT in the
presence transition metals and O2, can induce oxidative damage in biomolecules ,
and the combination of EDTA ,DTT and Fe3+ ions showed to be involved in several
phases with radicals (O2-), O
biomolecules degradation [32]. As well as EDTA stimulates the iron-catalyzed oxidation of DTT probably by accelerating Fe3+ reduction [32].
Soluble collagen is a pre-fragmented molecule (α1 and α2) that is easily broken into smaller parts. Fig. 1B showed the presence of the band α1 and α2 (100– 130 kDa, Lane 1) indicated no degradation, and the loss of the bands α1 and α2 indicated the increase of collagenase activity, demonstrating by the presence of sub sequential bands of low molecular weight fragments [23]. In our study, it was observed a high rate of collagen precipitation (Fig. 2) caused by iron cross-linking with soluble collagen. Ferric ions could do the deeds of lysyl oxidase inducing the collagen cross-linkage. Ionsmight act on lysine and hydroxylysine aminoacids at the telopeptides regions producing aldehyde groups, resulting in the formation of inter-, and intra-molecular and inter-microfibrillar [33,34]. Iron form covalent complex with collagen [16]. So the cross-link bond takes place between the iron complex and collagen [34], drawing the collagen molecules closer together and increase stability [34–36], improve the mechanical properties and decrease degradation rates [33]. Because of the collagen cross-link we showed the results as “Relative CT-K activity removing the precipitation rate” with the goal to reveal the real enzymatic action (Fig. 3). So the apparent lack of CT-K inhibition at 0.2% FeCl3 and beyond was due to
collagen precipitation caused by cross-linking with iron (see Fig. 2) [9].
A differential in soluble collagen degradation assay was the addition of chondroitin sulfate (CSA) on the reaction. CT-K activity depends on the formation of a complex glycosaminoglycans(GAGs) such as CSA [37]. CSA it is present on nature tissues as bone, cartilage, tendon [9,37] and dentin [38]. Because of the importance of the GAG complex, as was used processed collagen, it is necessary to add CSA into reactions in order to active the enzyme as we observed on Fig. 1, lane 2 without CSA, and lane 3 with CSA exhibited a significant increase on CT-K activity.
Morphology of collagen fibers is considered a sequential arrangement of fibrils that through GAG mediated proteoglycan interactions were put together [39,40]. When the degradation occurs by the action of CT-K, the product formation was characterized by the release of collagen α -chains from the fiber [9,23], as showed in Fig. 4A, B (lane 2) and D micrograph 2, where was possible to see the fiber degradation, and unraveling process [41]. CT-K is the only CT able to release significant amounts of tropocollagen fragments from insoluble collagen fibers [9], as CT-K it is the unique enzyme holding the ability to cleave at multiple sites the triple
helical region of tropocollagen [7].
CT-K is regulated by sulphated glycosaminoglycans (GAG) when connected with exosites [40]. It is possible that cross-linking agents such as Fe3+ion alter the
GAG-CK-T exosite interaction, changing its conformation and consequently inactivate the catalytic function. Cross-linking also decreases enzymatic degradation by altering the enzyme binding site on the collagen molecule [17,42–45]. Since EDX analysis demonstrated higher concentration of Fe (%wt.) attached to the fibers (Fig. 4C) the alteration on enzyme binding site on the collagen molecule and GAG-CK-T exosite interaction probably were the two protect mechanism on insoluble collagen assay. However, Fe % wt. found in the fibers did not increase as FeCl3
concentrations at reaction solutions. Insoluble collagen groups 11 (1% FeCl3) and 12
(2% FeCl3) presented a lower amount of Fe compared to 7 (0.1% FeCl3). It is
probably related to ionic degradation as visualized in Fig. 4 D micrographs 11 and 12. So the formed Fe/collagen complex is well documented pointing an increase of enzymatic stability [16,18,19].
Micrographs reveal iron exercised a preventive effect of degradation on the fibers (Fig. 4 D2-9). But also the effect of the high long ionic exposition (20h) on the groups 10,11,12 micrographs, causing denaturation of the fibers. Denaturation by ionic forces act on secondary and / or tertiary structure, that is, the three-dimensional arrangement of the polypeptide chain is broken, almost always losing its characteristic biological activity. But the primary structure it is kept intact. There is no disruption of covalent bonds of the polypeptide chain, preserving the amino acid sequence. So the ionic degradation did not affect the soluble collagen since it is formed by simplified chains [46]
The use of protease inhibitor or cross-link inducer can increase collagen properties and reduce its enzymatic degradation [33]. As we showed, FeCl3 act in
both outcomes. This is an important field where a more detailed picture of the actions will further improve our understanding of the collagen degradation processes and the participants involved.
5 CONCLUSION
Based on the in vitro conditions of the present study, it could be concluded that FeCl3 inhibited CT-K activity starting at 0.06% concentrations. In addition, FeCl3
it was observed unraveling of collagen fibers in FeCl3 absence. The use of FeCl3
formed a cross-linked complex with collagen that increases stability against collagenolytic enzymes.
Statement of Significance
Collagen is the main component of connective tissue and the most abundant protein in mammals, making up about 25% of the total body mass. Improvements on collagen stability against collagenases could be useful in multiples areas of science and health. CT-K it is the most potent mammalian collagenase and its hyperactivity is related to several implications related to skeletal and vascular diseases, caries, dental erosion and hybrid layer degradation. This is the first report to show the inhibition effect of FeCl3 against CT-K, and its preventive effect on collagen type I, as
well its ability to induce collagen cross-link.
Acknowledgements
This study was partially supported by: Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (Capes #1777-2014 and 999990107), National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq #30217-2014-0), UBC Start-Up research funding to RMC and AMP, and by Canadian Institutes of Health Research Grants MOP-8994 (DB) and a Canada Research Chair award (DB).
6 REFERENCES
[1] Y. Yasuda, J. Kaleta, D. Br??mme, The role of cathepsins in osteoporosis and arthritis: Rationale for the design of new therapeutics, Adv. Drug Deliv. Rev. 57 (2005) 973–993. doi:10.1016/j.addr.2004.12.013.
[2] I. Podgorski, Future of anticathepsin K drugs: dual therapy for skeletal disease and atherosclerosis?, Future Med. Chem. 1 (2009) 21–34. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20126511 (accessed January 8, 2017). [3] S.P.M. Lutgens, K.B.J.M. Cleutjens, M.J.A.P. Daemen, S. Heeneman,
Cathepsin cysteine proteases in cardiovascular disease, FASEB J. 21 (2007) 3029–3041. doi:10.1096/fj.06-7924com.
[4] L. Tjäderhane, M.A.R. Buzalaf, M. Carrilho, C. Chaussain, Matrix metalloproteinases and other matrix proteinases in relation to cariology: The era of “dentin degradomics,” Caries Res. 49 (2015) 193–208. doi:10.1159/000363582.
[5] M.A.R. Buzalaf, S. Charone, L. Tjäderhane, Role of host-derived proteinases in dentine caries and erosion., Caries Res. 49 Suppl 1 (2015) 30–7. doi:10.1159/000380885.
[6] A.G. Costa, N.E. Cusano, B.C. Silva, S. Cremers, J.P. Bilezikian, Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis., Nat. Rev. Rheumatol. 7 (2011) 447–56. doi:10.1038/nrrheum.2011.77.
[7] P. Garnero, O. Borel, I. Byrjalsen, M. Ferreras, F.H. Drake, M.S. McQueney, N.T. Foged, P.D. Delmas, J.M. Delaissé, The collagenolytic activity of cathepsin K is unique among mammalian proteinases, J. Biol. Chem. 273 (1998) 32347–32352. doi:10.1074/jbc.273.48.32347.
[8] A. Mazzoni, L. Breschi, M. Carrilho, F.D. Nascimento, G. Orsini, A. Ruggeri Jr, P. Gobbi, L. Manzoli, F.R. Tay, D.H. Pashley, L. Tjäderhane, A review of the nature, role, and function of dentin non-collagenous proteins. Part II: enzymes, serum proteins, and growth factors, Endod. Top. (2012) 19–40. doi:10.1111/j.1601-1546.2012.00268.x.
Effects of cysteine proteases on the structural and mechanical properties of collagen fibers, J. Biol. Chem. 288 (2013) 5940–5950. doi:10.1074/jbc.M112.419689.
[10] L. Tjäderhane, F.D. Nascimento, L. Breschi, A. Mazzoni, I.L.S. Tersariol, S. Geraldeli, A. Tezvergil-Mutluay, M. Carrilho, R.M. Carvalho, F.R. Tay, D.H. Pashley, Strategies to prevent hydrolytic degradation of the hybrid layer - A review, Dent. Mater. 29 (2013) 999–1011. doi:10.1016/j.dental.2013.07.016.
[11] L. Tjäderhane, F.D. Nascimento, L. Breschi, A. Mazzoni, I.L.S. Tersariol, S. Geraldeli, A. Tezvergil-Mutluay, M.R. Carrilho, R.M. Carvalho, F.R. Tay, D.H. Pashley, Optimizing dentin bond durability: Control of collagen degradation by matrix metalloproteinases and cysteine cathepsins, Dent. Mater. 29 (2013) 116–135. doi:10.1016/j.dental.2012.08.004.
[12] C. Vidal, L. Tjäderhane, P. Scaffa, I. Tersariol, D. Pashley, H. Nader, F. Nascimento, M. Carrilho, Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentin., J. Dent. Res. (2014) 269–274. doi:10.1177/0022034513516979.
[13] I.L. Tersariol, S. Geraldeli, C.L. Minciotti, F.D. Nascimento, V. Pääkkönen, M.T. Martins, M.R. Carrilho, D.H. Pashley, F.R. Tay, T. Salo, L. Tjäderhane, Cysteine Cathepsins in Human Dentin-Pulp Complex, J. Endod. 36 (2010) 475–481. doi:10.1016/j.joen.2009.12.034.
[14] a. Mazzoni, F.D. Nascimento, M. Carrilho, I. Tersariol, V. Papa, L. Tjaderhane, R. Di Lenarda, F.R. Tay, D.H. Pashley, L. Breschi, MMP Activity in the Hybrid Layer Detected with in situ Zymography, J. Dent. Res. 91 (2012) 467–472. doi:10.1177/0022034512439210.
[15] L. Tjäderhane, Dentin Bonding: Can We Make it Last?, Oper. Dent. 40 (2015) 4–18. doi:10.2341/14-095-BL.
[16] N.N. Fathima, M.C. Bose, J.R. Rao, B.U. Nair, Stabilization of type I collagen against collagenases (type I) and thermal degradation using iron complex, J. Inorg. Biochem. 100 (2006) 1774–1780. doi:10.1016/j.jinorgbio.2006.06.014.
Tay, Limitations in bonding to dentin and experimental strategies to prevent bond degradation., J. Dent. Res. 90 (2011) 953–968. doi:10.1177/0022034510391799.
[18] M.T. Kato, A.L. Leite, A.R. Hannas, R.C. Oliveira, J.C. Pereira, L. Tjäderhane, M.A.R. Buzalaf, Effect of iron on matrix metalloproteinase inhibition and on the prevention of dentine erosion, Caries Res. 44 (2010) 309–316. doi:10.1159/000315932.
[19] M.T. Kato, M.A.R. Buzalaf, Iron supplementation reduces the erosive potential of a cola drink on enamel and dentin in situ, J. Appl. Oral Sci. 20 (2012) 318– 322. doi:10.1590/S1678-77572012000300004.
[20] Y. Imai, Y. Kadoma, K. Kojima, T. Akimoto, K. Ikakura, T. Ohta, Importance of polymerization initiator systems and interfacial initiation of polymerization in adhesive bonding of resin to dentin., J. Dent. Res. 70 (1991) 1088–91. doi:10.1177/00220345910700071401.
[21] N. Nakabayashi, K. Kojima, E. Masuhara, The promotion of adhesion by the infiltration of monomers into tooth substrates, J. Biomed. Mater. Res. 16 (1982) 265–273. doi:10.1002/jbm.820160307.
[22] N. Nakabayashi, K. Hiranuma, Effect of etchant variation on wet and dry dentin bonding primed with 4-META/acetone., Dent. Mater. 16 (2000) 274–279. doi:10.1016/S0109-5641(00)00017-8.
[23] V. Sharma, P. Panwar, A.J. O’Donoghue, H. Cui, R.V.C. Guido, C.S. Craik, D. Brömme, Structural requirements for the collagenase and elastase activity of cathepsin K and its selective inhibition by an exosite inhibitor., J., Biochem. 465 (2015) 163–173. doi:10.1042/BJ20140809.
[24] E. Godat, V. Hervé-Grvépinet, F. Veillard, F. Lecaille, M. Belghazi, D. Brömme, G. Lalmanach, Regulation of cathepsin K activity by hydrogen peroxide., Biol. Chem. 389 (2008) 1123–6. doi:10.1515/BC.2008.109.
[25] K. Kim, S.G. Rhee, E.R. Stadtman, Nonenzymatic cleavage of proteins by reactive oxygen species generated by dithiothreitol and iron, J. Biol. Chem. 260 (1985) 15394–15397.
[26] R. Wünschiers, M. Jahn, D. Jahn, I. Schomburg, S. Peifer, E. Heinzle, H. Burtscher, J. Garbe, A. Steen, M. Schobert, D. Oesterhelt, J. Wachtveitl, A. Chang, Metabolism, in: Biochem. Pathways, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA, 2013: pp. 37–209. doi:10.1002/9781118657072.ch3.
[27] E.R. Stadtman, Mechanism and Biological Consequences, 9 (1990) 315–325.
[28] R. Lill, U. Mühlenhoff, Iron-sulfur protein biogenesis in eukaryotes: components and mechanisms., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22 (2006) 457–86. doi:10.1146/annurev.cellbio.22.010305.104538.
[29] D.H. Baker, G.L. Czarnecki-Maulden, Pharmacologic role of cysteine in ameliorating or exacerbating mineral toxicities., J. Nutr. 117 (1987) 1003–10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3298579 (accessed January 8, 2017). [30] A. Domsalla, M.F. Melzig, Occurrence and properties of proteases in plant
latices, Planta Med. 74 (2008) 699–711. doi:10.1055/s-2008-1074530.
[31] M.L. Mei, L. Ito, Y. Cao, Q.L. Li, C.H. Chu, E.C.M. Lo, The inhibitory effects of silver diamine fluorides on cysteine cathepsins, J. Dent. 42 (2014) 329–335. doi:10.1016/j.jdent.2013.11.018.
[32] L.E.S. Netto, E.R. Stadtman, The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions, Arch. Biochem. Biophys. 333 (1996) 233–242. doi:10.1006/abbi.1996.0386.
[33] C.M.P. Vidal, W. Zhu, S. Manohar, B. Aydin, T.A. Keiderling, P.B. Messersmith, A.K. Bedran-Russo, Collagen-collagen interactions mediated by plant-derived proanthocyanidins: A spectroscopic and atomic force microscopy study, Acta Biomater. 41 (2016) 110–118. doi:10.1016/j.actbio.2016.05.026.
[34] N.N. Fathima, J.R. Rao, B.U. Nair, Effect of UV irradiation on the physico-chemical properties of iron crosslinked collagen, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 105 (2011) 203–206. doi:10.1016/j.jphotobiol.2011.09.003.
[35] N.N. Fathima, M. Baias, B. Blumich, T. Ramasami, Structure and dynamics of water in native and tanned collagen fibers: Effect of crosslinking, Int. J. Biol.
Macromol. 47 (2010) 590–596. doi:10.1016/j.ijbiomac.2010.08.003.
[36] C.A. Miles, N.C. Avery, V. V Rodin, A.J. Bailey, The increase in denaturation temperature following cross-linking of collagen is caused by dehydration of the fibres., J. Mol. Biol. 346 (2005) 551–6. doi:10.1016/j.jmb.2004.12.001.
[37] Z. Li, Y. Yasuda, W. Li, M. Bogyo, N. Katz, R.E. Gordon, G.B. Fields, D. Brömme, Regulation of Collagenase Activities of Human Cathepsins by Glycosaminoglycans, J. Biol. Chem. 279 (2004) 5470–5479. doi:10.1074/jbc.M310349200.
[38] G. Orsini, A.R. Jr, A. Mazzoni, F. Nato, L. Manzoli, A. Putignano, R. To, D.I. Lenarda, L.E.O. Tjäderhane, L. Breschi, A review of the nature , role , and function of dentin non-collagenous proteins . Part 1 : proteoglycans and glycoproteins, Endod. Top. (2012) 1–18. doi:10.1111/j.1601-1546.2012.00268.x.
[39] L.E. Bertassoni, J.P.R. Orgel, O. Antipova, M. V. Swain, The dentin organic matrix - Limitations of restorative dentistry hidden on the nanometer scale, Acta Biomater. 8 (2012) 2419–2433. doi:10.1016/j.actbio.2012.02.022.
[40] J.P.R.O. Orgel, T.C. Irving, A. Miller, T.J. Wess, Microfibrillar structure of type I collagen in situ., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (2006) 9001. doi:10.1073/pnas.0502718103.
[41] L.E. Bertassoni, M. V. Swain, 5323 Removal of Dentin Non-collagenous Structures Results in the Unraveling of Microfibril Bundles in Collagen Type I, Connect. Tissue Res. 8207 (2016) 03008207.2016.1235566. doi:10.1080/03008207.2016.1235566.
[42] P. Panwar, G. Lamour, N.C.W. Mackenzie, H. Yang, F. Ko, H. Li, D. Brömme, Changes in structural-mechanical properties and degradability of collagen during aging-associated modifications, J. Biol. Chem. 290 (2015) 23291– 23306. doi:10.1074/jbc.M115.644310.
[43] M. Novinec, L. Kovacic, B. Lenarcic, A. Baici, Conformational flexibility and allosteric regulation of cathepsin K., Biochem. J. 429 (2010) 379–89. doi:10.1042/BJ20100337.
