1 10 DE ENERO
TRABAJO INDIVIDUAL: PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA VIRTUALIZADO – ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA (16 S) Y ANALISIS DE SECUENCIAS DE ADN
UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental
PRESENTADO POR: MAMANI RAMOS TANIA
DOCENTE: Blog. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN
MATERIA: BIOTECNOLOGIA MOQUEGUA – PERÚ
2 INDICE 1. INTRODUCCION... 3 2. OBJETIVOS ... 4 2.1. Objetivo General ... 4 2.2. Objetivos Específicos ... 4 3. REVISION BIBLIOGRAFICA ... 4 3.1.Electroforesis ... 4 3.2.Agarosa ... 5 3.3.Tampón de electroforesis ... 5 3.4.Concentración de agarosa ... 6 3.5.ADN marcador ... 5
3.6.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR ... 7
4. METODOLOGIA ... 8 4.1. Materiales y Equipos ... 8 4.2. Procedimiento ... 8 5. RESULTADOS ... 8 6. CONCLUSIONES ... 10 7. RECOMENDACIONES ... 11 8. CUESTIONARIO ... 11 9. BIBLIOGRAFIA ... 16 10.ANEXOS ... 17
3 1. INTRODUCCION
La técnica de electroforesis en gel es un método para separar, identificar y purificar ADN, ARN o proteínas, entre las matrices más utilizadas se encuentra la de agarosa y la de poliacrilamida. La localización de la biomolécula en el gel puede ser determinada mediante la utilización de distintos colorantes que tienen afinidad específica por la biomolécula a resolver.
Las separaciones electroforéticas generalmente se realizan sobre matrices que sirven de tamices moleculares que potencian la separación. Las moléculas más pequeñas que los poros se desplazan fácilmente a través de él, mientras que las de mayor tamaño quedan retenidas y las intermedias se desplazan con distinto grado de dificultad dependiendo de su tamaño.
La forma, tamaño, porosidad y tipo de matriz del gel puede variar dependiendo del tamaño y la biomolécula a ser analizada. Independientemente del tipo de matriz elegida, la misma debe ser eléctricamente neutra, tal que no se produzca un flujo de solvente hacia uno u otro electrodo debido a la presencia de grupos cargados inmovilizados en la matriz (electro endósmosis) que disminuye la resolución de la muestra.
Entre las matrices más utilizadas se encuentra la agarosa y la poliacrilamida. La agarosa es un polisacárido altamente purificado derivado del agar, el tamaño del poro puede ser predeterminado ajustando su concentración en el gel; entonces a mayor concentración menor tamaño de poro. El rango de trabajo es aproximadamente de 0,4 a 2 % (p/v). Se utiliza para separar macromoléculas tales como ácidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor poder de resolución, pero un gran rango de separación, tal que ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb pueden ser separadas utilizando varias concentraciones de agarosa.
En tal sentido este trabajo busca realizar una Simulación de electroforesis en gel de agarosa en SnapGene con el objetivo de hacer de la practica interactiva que cuente con una etapa de investigación y aplicación con utilización de un software virtual. Para ello se realizará una revisión bibliográfica que detalle a mayor punto este trabajo.
4 2. OBJETIVOS
2.1.Objetivo General
▪ Realizar una Simulación de electroforesis en gel de agarosa y análisis de secuencias de ADN en SnapGene.
2.2.Objetivos Específicos
▪ Seleccionar secuencias de 15 tipos de nucleótidos y evaluar sus características y acción en el SnapGene.
▪ Comprender el mecanismo por el cual los fragmentos de ADN se separan dentro de una matriz de gel
▪ Conocer las variables que condicionan la separación de las macromoléculas.
3. REVISION BIBLIOGRAFICA
3.1.Electroforesis
La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa como tamiz molecular, separando las moléculas en función de su tamaño. Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros, dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:
▪ Fuerza del campo
▪ Tamaño y forma de las moléculas ▪ Hidrofobicidad relativa de las muestras
▪ Fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas. Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en la electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a esta técnica.
5 3.2.Agarosa
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar las moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kDa.
Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse. Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración.
3.3.Tampón de electroforesis
La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante
6 cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8). Los tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona un poder más que suficiente y en la actualidad prácticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se practican utilizando esta concentración.
3.4.Concentración de agarosa
Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a través de los geles según la concentración de agarosa. En función de la concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 %.
3.5.ADN marcador
Para una tensión, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampón determinadas, la distancia de migración depende del peso molecular del material inicial. Así pues, debe cargarse un ADN marcador de tamaño conocido en las ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un marcador contiene un número
Cuadro 1. Concentración recomendada de gel de agarosa para separar moléculas de ADN lineales
7 determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el tamaño de los ADN desconocidos en caso de que se produjese alguna distorsión sistemática del gel durante la electroforesis.
3.6.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador.
Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos. La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.
▪ La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo).
▪ La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de ADN de interés.
▪ En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanco. ▪ La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza
de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis forense de ADN.
8 4. METODOLOGIA
Este actual trabajo no es experimental es practico virtual por lo que se recurre casi en su totalidad a la utilización de software SnapGene y demás paginas como el Ncbi con el objetivo de diferencias las secuencias de los 15 nucleótidos elegidos.
4.1.Materiales y Equipos ▪ Cuaderno de apuntes ▪ Laptop
4.2.Procedimiento
5. RESULTADOS
1. En un primer punto se procedieron a buscar 15 tipos de nucleótidos en el programa del NCBI donde posterior a ello se copiaron las secuencias.
2. Se exportaron cada una de las secuencias guardadas en el equipo hacia el software SnapGene.
3. Como ultimo paso se analizo las graficas resultante de todas las secuencias de nucleótidos.
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FIG 3: Guardado de los 15 tipos de nucleótidos en la laptop.
10 6. CONCLUSIONES
▪ El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.
▪ Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e hibridación, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína, entre otros.
11 ▪ Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño que en este caso son simulados por el software SnapGene.
7. RECOMENDACIONES
▪ Es conveniente que para un conocimiento practico se es necesario una práctica en laboratorio.
▪ Para un mayor grado de análisis estas secuencias también podrían emplearse otros tipos de software y comparar diferencias en caso hubiera.
8. CUESTIONARIO
a) ¿Qué es un gel de agarosa y cómo influye la concentración en la migración de los fragmentos de ADN?
Como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel: un bloque de material similar a la gelatina. Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un polisacárido llamado agarosa, que se consigue como hojuelas secas pulverizadas. Cuando la agarosa se calienta en una solución amortiguadora (agua mezclada con algunas sales) y deja enfriar, se forma un gel sólido ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas de agarosa que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman pequeños poros.
Una vez que el gel está en la cámara, cada una de las muestras de ADN que queremos analizar (por ejemplo, cada reacción de PCR o cada plásmido digerido con enzimas de restricción) se transfiere cuidadosamente a uno de los pozos. Un pozo se reserva para el marcador de peso molecular, un estándar de referencia que contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas. Los marcadores de ADN comerciales cubren diferentes intervalos de tamaños, por lo que trataremos de usar uno con buena "cobertura" en el intervalo de tamaños en el que esperamos encontrar nuestros fragmentos.
12 A continuación, se aplica energía eléctrica a la cámara y empieza a fluir corriente a través del gel. Los grupos fosfato de su esqueleto de azúcares-fosfato le otorgan una carga negativa a las moléculas de ADN, por lo que comienzan a moverse a través de la matriz de gel hacia el polo positivo. Cuando el sistema está encendido y pasa corriente por el gel, se dice que el gel está corriendo.
Conforme corre el gel, los fragmentos más cortos de ADN viajarán más rápido a través de los poros de la matriz del gel que los fragmentos más grandes. Después de un rato que ha corrido el gel, los fragmentos más cortos de ADN estarán más cerca del extremo positivo del gel y los más largos se mantendrán cerca de los pozos. Los fragmentos de ADN muy pequeños podrían correr hasta salirse del gel si lo dejáramos corriendo por demasiado tiempo.
13 c) Proceso de la electroforesis
d) En el primer video mostrado por el profesor ¿Porque las muestras de ADN son mezclados con un colorante azul? ¿Cómo se llama?
Marcador de peso molecular, el glicerol presente en el tampón de carga aporta densidad a las muestras, de esta manera se consigue que las muestras se depositen con facilidad en el fondo del pocillo, trazas de bromofenol azul (como un colorante de rastreo para monitorear la formación de límites en sistemas discontinuos y para verificar la terminación de la corrida).
Considerando que las electroforesis horizontales son submarinas, para evitar o al menos disminuir la difusión de la muestra, se homogeniza con una solución hiperdensa de sacarosa (de hasta 4 M), a la que se le agrega azul de bromo fenol, que además tiñe a la muestra, permite verificar el avance de la electroforesis, debido a que avanza a una velocidad similar a la de moléculas de unos 500 pares de bases. e) ¿Qué es el bromuro de etílico (BrEt), como lo podemos remplazar, existe otros
colorantes?
“EtBr es el reactivo más común usado para teñir ADN en geles de agarosa” (Sharp, Sugden, Sambrook, 1973). Cuando se expone a la luz UV, los electrones en el anillo aromático de la molécula de etidio se activan, lo que conduce a la liberación de energía (luz) como el retorno electrones a estado fundamental. EtBr funciona por sí mismo intercalando en la molécula de ADN de una manera dependiente de la concentración. Esto permite una estimación de la cantidad de ADN en cualquier banda de ADN particular, sobre la base de su intensidad. Debido a su carga positiva, el uso de EtBr reduce la tasa de migración del ADN en un 15%.
Manchas alternativas para ADN en geles de agarosa son SYBR Gold, SYBR Green, cristal violeta y azul de metilo. De éstos, El azul de metilo y violeta cristal no
14 requieren la exposición del gel a la luz UV para la visualización de las bandas de ADN, reduciendo así la probabilidad de mutación si la recuperación del fragmento de ADN desde el gel se desea.
Cabe recalcar que los tintes de carga utilizados en electroforesis en gel sirven para tres propósitos principales. Primero se añade a la densidad de la muestra, Permitiendo que se hunda en el gel. En segundo lugar, los tintes proporcionar color y simplificar el proceso de carga. Finalmente, los colorantes se mueven a velocidades estándar a través del gel, lo que permite la estimación de la distancia que los fragmentos de ADN han migrado.
f) ¿Por qué se utilizaron dos marcadores de peso molecular?
En electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) puesto que se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema.
Los marcadores moleculares son una herramienta muy robusta que nos permite estudiar y entender a la naturaleza desde diferentes perspectivas con enfoques novedosos y complementarios a los que se abordan con herramientas tradicionales. Estos marcadores se basan en el análisis de las diferencias en moléculas como proteínas, ARN y ADN. Durante varias décadas, los marcadores más utilizados en ecología fueron las isoenzimas. Sin embargo, en la actualidad, se han desarrollado diversas técnicas basadas en ADN que permiten obtener una gran cantidad de información para analizar patrones y procesos ecológico-evolutivos a diferentes escalas espaciales y temporales, como la diversidad genética, paternidad, conducta animal, adaptación, especiación e interacciones.
g) ¿Tipos de electroforesis y cómo funciona en gel de agarosa para segmentos de ADN?
La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa en geles de agarosa.
▪ La electroforesis de proteínas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), isoelectro enfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional. ▪ Electroforesis capilar.
15 ▪ Electroforesis de ADN.
▪ Zimografía o zimogramas. ▪ Extracción en gel.
▪ Electroforesis en gel de campo pulsado.
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño. Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
h) ¿Es posible recuperar un fragmento de ADN del gel de agarosa para clonar en un plásmido y mantener en un organismo? Fundamente.
Si. La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento particular de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de interés se inserta primero en un fragmento circular de ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que cortan y pegan ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.
i) ¿Qué son las enzimas de restricción, mencione 10?
Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco específica y corta el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar, muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla cortos que sobresalen. Los sitios de restricción cuentan con entre cuatro y seis pares de bases, con las que son reconocidos. Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizómeros
Enzima Origen
EcoRI Escherichia coli
BamHI Bacillus amyloliquefaciens BglII Baccilus globiggi
FokI Flavobacterium okeanokoites DpnI* Diplococcus pneumoniae HindII Haemophilus influenzae TaqI Thermus aquaticus
16 9. BIBLIOGRAFIA
▪ EDVOTEK. (2016). Principios y práctica de la electroforesis en gel de agarosa. EDVOTEK.
▪ khan Academy. (2018). Obtenido de khan Academy:
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis
▪ Lee, P. Y., JCostumbrado, o., Chih, -Y. H., & Yong, H. K. (2012). Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN. California: University of California Los Angeles. Obtenido de Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN: https://www.jove.com/t/3923?language=Spanish
▪ MINSA. (2005). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS Y ADN. Lima: MINISTERIO DE SALUD.
▪ Montalvo, N. C., & Lugo, F. M. (2016). ELECTROFORÉSIS: FUNDAMENTOS, AVANCES Y APLICACIONES. California: EPISTEMUS.
SmaI* Serratia marcescens HaeIII* Haemophilus egytius AluI* Arthrobacter luteus
17 10. ANEXOS
Fig.6: Movimiento de los fragmentos de ADN a través del gel.
Fuente:
https://es.khanacademy.org/science/a
p-biology/gene-expression-and- regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis
