UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ – UFC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA DOUTORADO EM BIOTECNOLOGIA
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA – RENORBIO
ANDERSON WEINY BARBALHO SILVA
Localização de proteínas, quantificação de RNAm e papel das citocinas TNF-α e IL-1β no desenvolvimento folicular in vivo e in vitro em bovinos
FORTALEZA 2016
LOCALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS, QUANTIFICAÇÃO DE RNAm E PAPEL DAS CITOCINAS TNF-α E IL-1β NO DESENVOLVIMENTO FOLICULAR IN VIVO E IN
VITRO EM BOVINOS
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO, Universidade Federal do Ceará – UFC, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia em Agropecuária.
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Viana Silva
FORTALEZA 2016
Ao Criador; Aos meus pais, Sr. Silva e Sr.ª Antônia; A minha irmã Sheilliany,
A minha equipe, Aos meus alunos e futuros alunos, Com amor,
Agradeço a Deus, acima de tudo, por sua suprema bondade e infinita misericórdia de me guiar por caminhos retos, sempre em sua presença. Obrigado Senhor, por ser teu escolhido, e por desfrutar sempre da Tua Santa bondade! Sou grato por sempre iluminar meus caminhos, dando-me determinação, fé e força de vontade para nunca desistir! A luz que me guia é mais forte que os olhos que me cercam.
Aos meus amados pais, Antônia Lopes Barbalho Silva e Francisco Ferreira Silva, que por muito me amarem, renunciaram aos seus próprios sonhos para que os meus fossem prioridade. Obrigado por cada palavra de incentivo, por cada olhar que muitas vezes falaram mais que mil palavras. Vocês são os maiores exemplos de verdadeiros PAIS que nessa terra pode existir. Obrigado por terem projetado em mim o Anderson Weiny que hoje sou. Amo muito vocês! Razão do meu existir.
À minha irmã Sheilliany Barbalho, pelo nosso amor, que é o elo que nos une, fazendo com que palavras sejam inúteis para sabermos que sempre nos apoiaremos em todas as decisões de nossas vidas.
Agradeço à toda minha família, especialmente a minha iluminada Avó D. Antônia (Vovó Toinha), meus amados Tios Luiz Barbalho e Sílvia Helena, meu primo João Victor Barbalho pela admiração incondicional, pelo apoio nesta jornada, pelas doces recordações da infância e pelos grandes ensinamentos eternizados.
A todos os meus amigos, em especial os amigos Clayrtiano Alves, Jordânia Freire, Amélia Araújo, Jackson Costa, Juliane Passos, Cleuston Monteiro, Regislane Ribeiro, Eronalda Rodrigues, Luana Rodrigues Moêmia Portela, Rony Barroso, Anderson Douglas, Alana Godinho e todos aqueles que de alguma forma contribuíram para que eu pudesse viver cada etapa desta jornada, construindo sonhos e acreditando que eles seriam concretizados um a um. Agradeço por terem me proporcionado inesquecíveis momentos de abstração e aventura.
Aos irmãos que a vida me permitiu escolher: Raphaella Carneiro, Juliana Almeida e sua filha Maria (minha pequena estrela guia, minha afilhada), Lilyan Baima, Paola Aragão, Valeska Frota, Gabriel de Brio, Jaylson Victor, Enéas Mamede, Eleones Filho, Gerson Pinho, Dávson Freitas, Ákila Vasconcelos, Dhone Frota, Rafael Olivindo, Rodrigo Olivindo, Elton Andrade e Bruno Sousa. Agradeço pela palavra amiga, pela companhia, pelo sorriso sincero e pelo abraço caloroso. Serei eternamente grato pelo incentivo dado, que me fez viver e trabalhar de uma forma diferente, onde o novo não era temido e sim enfrentado, mesmo com
sem finalidade, sem valor. Cada pensamento, cada palavra, cada ato, representou algo para o meu destino final. A concretização de um sonho, ser Doutor (antes dos 30)! Amo Vocês!
À família Techgym Academia, em especial ao meu amigo e Personal Trainer Prof. Anderson Marques, agradeço pelo apoio e incentivo nos momentos de treino que me serviram como válvula de escape para que eu pudesse suportar as pressões e cobranças do dia-a-dia pré-defesa de tese. Não há sentido em viver mais, se não se puder viver melhor. Assim, a qualidade de vida deve ser o objetivo número um de sua lista de prioridades. Obrigado Mestre, por tudo!
À família Negreiros: Roberto Negreiros, Valéria Negreiros, Sra. Quitéria Rodrigues, Sr. José Rodrigues e Sra. Luíza Magalhães que apareceram em minha vida como anjos que caem do céu, uma história de vida que tenho como exemplo. O exímio caráter, conduta, personalidade forte e vontade de vencer sempre é o que faz a diferença na vida desta família, por quem tenho enorme carinho, admiração e apreço. Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o desejo de vencer. Com isso, vocês se tornam essenciais. Sou grato por toda atenção e carinho que a mim é dedicado.
Ao meu orientador Prof. Dr. José Roberto Viana Silva, palavras me faltam para preencher essas linhas em forma de agradecimento. Agradeço pelas oportunidades, pelos grandes ensinamentos, por me provar que ter coragem e ousadia, acima de tudo, não temer o desconhecido é um fator imprescindível para alcançarmos o sucesso profissional e pessoal. Sou grato por todo o tempo dedicado a mim ao longo desses anos de produção de conhecimento e formação profissional. Obrigado por me “projetar” e ter acreditado em mim, por várias vezes, e ter possibilitado que hoje eu sentisse uma das maiores alegrias de minha vida, tornar-me Doutor.
Agradeço aos meus companheiros de aventura, minha equipe, meus amigos: Ellen Vasconcelos, Amélia Araújo, Glaucinete Borges, Adriel Castro, Bianca Silva, Bruno Galvão, Edilcarlos Lima, Joyla Bernardo, Kelry Lopes, Laryssa Barroso, Miguel Fernandes e Pedro Alves pela parceria de trabalho e, principalmente, por me proporcionarem a virtude do trabalho em equipe. De forma especial, curvo-me aos amigos e colaboradores Taiã Gomes, Regislane Ribeiro, Jackson Costa, Renato Passos, Lais Melo e Éverton Pimentel, obrigado por se fazerem presentes e extremamente responsáveis! Grande parte do sucesso deste trabalho pertence, por direito, a vocês.
Aos amigos que compuseram a primeira geração do nosso grupo de pesquisa e que hoje trilham caminhos diferentes: Cíntia Camurça, Gisvani Lopes, Juliane Passos, Larisse
especial minha madrinha de formatura Isana Mara, agradeço pelos “choques de realidade”, pelas longas conversas, pela amizade e pelo prazeroso convívio ao lado de vocês. Enfim, pelos momentos especiais desde a época de iniciação científica, que jamais serão esquecidos. Agradeço de coração a vocês por tudo!
Aos Professores Paulo Bayard Dias Gonçalves (UFSM), Vilceu Bordignon (McGill University) e João Francisco Coelho de Oliveira (in memorian) pela oportunidade e confiança na execução e parceria deste projeto, mas principalmente pelos ensinamentos que ajudaram a me tornar uma pessoa melhor. Sou grato a equipe do Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal – BIOREP da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) em especial aos amigos Werner Glanzner e Andressa Minussi. Obrigado por terem posto tanta sabedoria, cuidado e dedicação em minhas atividades, por compartilhar tantas coisas boas e por marcar tantas lembranças positivas em minha vida. Obrigado por sempre serem honestos comigo, por serem gentis e sempre presente quando necessito. Agradeço ainda aos anjos que Deus colocou em minha vida na temporada em que estive morando no Rio Grande do Sul - Betty Martam, Karine Brondani, Bernardo Silva, Luane Pereira, Patrícia Mortari, Kellen Mendes e Roziane Bortoluzzi. De tantas diferentes e significativas formas, muito obrigado por tudo.
Aos colaboradores Ricássio Barberino e Vanúzia Menezes do Laboratório de Biotecnologia Aplicada ao Desenvolvimento de Folículos Ovarianos Pré-antrais – BIOFOV, da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), em especial à Prof. Dra. Maria Helena Tavares de Matos, pelo compromisso e empenho nas análises de cultivo in situ.
Agradeço ao corpo técnico, aos pesquisadores e estudantes do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – FIOCRUZ – PE, em especial a Profa. Dra. Christina Peixoto e a Dra. Mariana Aragão Matos Donato, pela parceria e oportunidade que me foi dada em executar parte de meus experimentos nesta instituição. Uma experiência inenarrável que levarei comigo para sempre.
Ao Prof. Dr. Robert Van den Hurk pela contribuição na redação dos trabalhos. À minha turma de Doutorado, em especial aos amigos André Leandro, Milena Esmeraldo, Rosane Cavalcante, Neto Gomes, Diva Almeida, Karine Pires, Gerlane Modesto, e Edivania de Lima agradeço pela amizade, todos, sem exceção, a partir de então são peças chave em minha trajetória pessoal e profissional. Que o nosso elo de companheirismo e amizade nunca seja deixado quebrar pelo tempo e pela distancia que possivelmente existirá entre nós.
Biotecnologia – Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), pela oportunidade de realização de um Curso de Doutorado de nível reconhecido e de qualidade e seriedade inquestionáveis.
Ao Núcleo de Biotecnologia de Sobral (NUBIS), pela disponibilidade de equipamentos e todo o apoio técnico necessário.
Agradeço também a todos os funcionários da UFC Campus de Sobral, em especial a Srta. Aline Araújo, Sr. Carlos Mendes, Profa. Dra. Mirna Marques, Prof. Dr. Gerardo Cristino, Prof. Dr. Juvenal Linhares e Prof. Dr. Vicente Pinto, pelos muitos auxílios prestados a mim.
Aos animais, parte fundamental deste trabalho, obrigado por suas contribuições à ciência.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro para as pesquisas – Projeto Casadinho/Procad – MCTI/CNPq/MEC/Capes – Ação Transversal nº06/2011.
Aos integrantes da Banca Examinadora, Prof. Dr. José Roberto Viana Silva, Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Profa. Dra. Maria Helena Tavares de Matos, Profa. Dra. Mirna Marques Bezerra Brayner, Profa. Dra. Valdevane Rocha Araújo, Profa. Dra. Márcia Viviane Alves Saraiva e Prof. Dr. Rafael Rossetto de Sousa por terem gentilmente aceito o convite para participar da banca de defesa desta Tese e pela solicitude em contribuir no engrandecimento deste trabalho.
Agradeço, enfim, a todas as pessoas que contribuíram, direta ou indiretamente, para a efetivação deste sonho.
“No fim, quando você estiver lá, te dirão que você teve sorte, que é sortudo. Mas você não se sente assim. Eles não viram quantas vezes você caiu, pensou em desistir, quantas foram as noites de sono perdidas e o estresse causado pela pressão de conseguir. Não foi sorte. O caminho é longo, cheio de buracos e desvios mas se você estiver acompanhado da coragem e da persistência, nada poderá te impedir.”
RESUMO
Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar a expressão e a distribuição de RNAs mensageiros e proteínas dos sistemas TNF-α e interleucina 1 em ovários de vacas cíclicas, 2) avaliar os efeitos do TNF-α, Dexametasona e da IL-1β, na sobrevivência e ativação de folículos primordiais bovinos cultivados in situ; 3) caracterizar o perfil de expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1β em células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos, durante a ovulação induzida por GnRH/LH in vivo; 4) avaliar a influência das gonadotrofinas (FSH/LH) na expressão de RNAm para o sistema TNF-α e sistema IL-1β em células do cumulus cultivadas in vitro; e 5) analisar o efeito do TNF-α e da IL-1β na expansão de células do cumulus, na manutenção da integridade ultraestrutural de CCOs; na expressão de RNAm para HAS-2, CASP3, CASP6 e iNOS em células do cumulus após cultivo in vitro. Ovários bovinos foram processados para análises de imunohistoquímica e Western Blot para a localização das proteínas para o sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 em folículos pré-antrais e pré-antrais. Para avaliação da sobrevivência e ativação folicular in vitro, fragmentos ovarianos foram cultivados por 6 dias na presença de IL-1β, TNF-α ou Dexametasona em diferentes concentrações. Células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos foram coletadas em diferentes momentos após a administração intramuscular de GnRH para avaliação do perfil de expressão dos sistemas TNF-α e IL-β in vivo. CCOs foram cultivados in
vitro por 12 e 24 h na presença de gonadotrofinas, TNF-α e IL-1β. Os resultados da
imunohistoquímica mostraram que as proteínas para os membros do sistema TNF-α (TNF-α, TNFR1 e TNFR2) e do sistema interleucina I (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) foram detectados em folículos pré-antrais e antrais. Foram observados níveis variáveis de RNAm para o sistema interleucina 1 nas diferentes categorias foliculares analisadas. Em relação ao cultivo in vitro de fragmentos ovarianos, a presença de TNF-α (10 ng/mL) reduziu a sobrevivência folicular e aumentou o número de células apoptóticas, enquanto que a adição de Dexametasona (10 ng/mL) ao meio de cultivo manteve a ultraestrutura folicular. Por outro lado, a presença de IL-1β (10 ou 50 ng/mL) foi capaz de manter a percentagem de folículos normais e de promover a ativação dos folículos primordiais. In vivo, um aumento na expressão de RNAm para TNF-α e TNFR1 foi observado 12 h após tratamento com GnRH. Níveis mais elevados de RNAm para TNFR2 foram observados em 3, 6 e 12 h após administração de GnRH. No entanto, foi observado um aumento nos níveis de RNAm para IL-1RA após 24h da indução por GnRH. In vitro, o TNF-α e a IL-1β não apresentaram efeito aditivo à expansão das células do cumulus. Os níveis de RNAm para TNF-α, TNFR1 e
TNFR2 foram aumentados em CCOs cultivados por 12 h na presença de gonadotrofinas. A presença de gonadotrofinas aumentou os níveis de RNAm para IL-1R1 e IL-1RA em células do cumulus após cultivo por 24h. O TNF-α reduziu os níveis de RNAm para HAS-2, CASP3 e CASP6, enquanto que a IL-1β elevou os níveis de expressão de IL-β, IL-1RA e HAS-2 em células do cumulus cultivadas. Além disso, a IL-1β aumentou a expressão de iNOS após 24h de cultivo. A análise ultraestrutural confirmou a integridade dos CCOs cultivados na presença de TNF-α ou IL-1β. Em conclusão, os componentes do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 são expressos diferencialmente em células ovarianas. O TNF-α reduz a sobrevivência folicular in vitro, enquanto a Dexametasona mantém a ultraestrutura de folículos cultivados. Por outro lado, a IL-1β promove o desenvolvimento de folículos primordiais in vitro. A expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1 é regulada por gonadotrofinas in vivo e in vitro. A presença de TNF-α e IL-1β mantém a ultraestrutura normal de CCOs cultivados. Estes resultados sugerem um importante papel do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 na regulação da foliculogênese e ovulação em bovinos.
ABSTRACT
The aims of this study were: 1) to investigate the expression and distribution of messengers RNAs and proteins of TNF-α and interleukin 1 systems members in the ovaries of cyclic cows; 2) to evaluate the effects of TNF-α, Dexamethasone and IL-1β, on the survival and activation of bovine primordial follicles in vitro; 3) to characterize the expression profile of TNF-α and IL-1β systems in bovine granulosa cells of preovulatory follicles during ovulation induced by GnRH/LH in vivo; 4) to evaluate the influence of gonadotropins (FSH/LH) in the expression of mRNA for TNF-α system and IL-1β system in cumulus cells cultured in vitro; and 5) to analyze the effect of TNF-α and IL-1β on cumulus cells expansion, ultrastructure integrity of cultured COCs; mRNA expression of HAS-2, CASP3, CASP6 and iNOS of cumulus cells after in vitro culture. Bovine ovaries were processed for immunohistochemistry and Western Blot analyzes for the location of proteins for TNF-α system and interleukin system 1 in preantral and antral follicles. To evaluate the in vitro follicular survival and activation, ovarian tissues were cultured for 6 days in the presence of IL-1β, TNF-α or Dexamethasone at different concentrations. To evaluate the profile of expression of TNF-α and IL-β systems after GnRH treatments in vivo, granulosa cells from bovine preovulatory follicles were collected at different time points. COCs were cultured for 12 and 24h in the presence of gonadotropins, TNF-α and IL-1β. TNF-α system (TNF-α, TNFR1 and TNFR2) and interleukin I system (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI and IL-1RII) were detected in preantral and antral follicles by immunohistochemistry. Variable levels of mRNA for the interleukin 1 system members were observed at different stages of development. Concerning to in vitro culture of bovine ovarian tissue, the presence of TNF-α (10 ng/mL) reduced the follicular survival and increased the number of apoptotic cells, whereas the addition of dexamethasone (10 ng/mL) maintained the follicular ultrastructure. On the other hand, the presence of IL-1β (10 or 50 ng/mL) was able to maintain the percentage of normal follicles and promote the primordial follicles activation. In vivo, an increased expression of mRNA for TNF-α and TNFR1 was observed 12 h after GnRH treatment. Higher levels of mRNA for TNFR2 were observed at 3, 6 and 12 h after GnRH administration. However, it was seen an increase in mRNA levels for IL-1RA 24h after GnRH induction. In vitro, TNF-α and IL-1β did not shown additive effect of cumulus cells expansion. The levels of mRNA for TNF-α, TNFR1 and
TNFR2 were increased in COCs cultured for 12 h in the presence of gonadotropins. The
presence of gonadotropins increased the mRNA levels for IL-1R1 and IL-1RA in cumulus cells after 24h of culture. The presence of TNF-α reduced levels of HAS-2, CASP3 and
CASP6, whereas IL-1β increased levels of mRNA for IL-β, IL-1RA and HAS-2 in cultured
cumulus cells. Furthermore, IL-1β increased iNOS expression after 24h of culture. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of COCs cultured in presence of TNF-α or IL-1β. In conclusion, TNF-α system members and interleukin-1 system members are differentially expressed in ovarian cells. TNF-α reduces the follicular survival in vitro, while dexamethasone enhances the ultrastructure of cultured follicles. On the other hand, IL-1β promotes the development of primordial follicles in vitro. The expression of TNF-α system and the IL-1 system is regulated by gonadotropins in vivo and in vitro. The presence of TNF-α and IL-1β maintain the normal ultrastructure of cultured COCs. These results indicate an important role of TNF-α and interleukin 1 systems in the regulation of bovine folliculogenesis and ovulation.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1
Oogênese e foliculogênese. Representação esquemática da oogênese e foliculogênese em fêmeas mamíferas. Fonte: adaptado de Milewski (2013) ... 32
Figura 2 Migração das células germinativas primordiais (CGPs) a partir do saco vitelínico para as cristas gonadais. Fonte: adaptado de Senger (2003) ... 33
Figura 3
Esquema ilustrando o ovário mamífero com suas principais estruturas. Adaptado de: (<http://britannica.com/EBchecked/media/99761/The-steps-of-ovulation-beginning-with-a-dormant-primordial-follicle>)... 35
Figura 4 Fatores que controlam a ativação, a sobrevivência e o crescimento de folículos primordiais. Adaptado de Silva et al., (2016) ... 38
Figura 5
A cascata de sinalização da via Hippo inicia com a ativação de quinases, STK4 (MST1) e STK3 (MST2). Estas quinases irão fosforilar a proteína SAV1, formando um complexo que por sua vez irão fosforilar e ativar as quinases LATS1/2 da família DBF. Após ativação das proteínas LATS, ocorrerá à associação com proteínas adaptadoras MOB1A/B que irão fosforilar os co-ativadores transcricionais YAP1 e WWTR1 (TAZ). Em seguida, YAP1/WWTR1 fosforilados, se associarão com proteínas 14-3-3 que serão retidos no citoplasma e, portanto inativados. A inativação da via de sinalização Hippo leva à desfosforilação de YAP1 e TAZ seguido da translocação destes fatores para o núcleo, onde, em conjunto com outros ligantes, como o TEAD1-4, induzem a proliferação e/ou sobrevivência. ... 40
Figura 6 Representação esquemática do desenvolvimento oocitário no ovário de mamíferos. Oócitos imaturos permanecem quiescentes no estágio de
VG (diplóteno –Prófase I). A retomada da meiose in vivo é marcada pelo pico pré-ovulatório de LH que desencadeia a progressão da meiose até o estágio de metáfase II, onde ocorre a extrusão do primeiro corpúsculo polar. A meiose é então bloqueada novamente, e somente será retomada após a fertilização, seguindo da expulsão do segundo corpúsculo polar e formação do oócito haploide fecundado (adaptado de LONERGAN & FAIR, 2015) ... 48
CAPÍTULO 1
Figure 1
Tumor necrosis factor-alfa (TNF-α) staining in preantral and antral follicles from bovine ovaries. (A) primordial follicle, (B) primary follicle, (C) secondary follicle, (D) small antral follicle, (E) COC of a large antral follicle, (F) mural granulosa and theca cells from a large antral follicle, (G) negative control reaction. O: oocyte; GC: granulosa cells; MGC: mural granulosa cells; CC: cumulus cells; TC: theca cells. Scale bars – original magnification: A-C and G, ×400; D-F, ×100 ……... 70
Figure 2
Tumor necrosis factor receptor type 1 (TNFR1) staining in preantral and antral follicles from bovine ovaries. (A) Primordial follicle, (B) primary follicle, (C) secondary follicle, (D) small antral follicle, (E) COC of a large antral follicle, (F) mural granulosa and theca cells from a large antral follicle, (G) negative control reaction. O: oocyte; GC: granulosa cells; MGC: mural granulosa cells; CC: cumulus cells; TC: theca cells. Scale bars – original magnification: A-C and G, ×400; D-F, ×100 ……... 70
Figure 3
Tumor necrosis factor receptor type 2 (TNFR2) staining in preantral and antral follicles from bovine ovaries. (A) Primordial follicle, (B) primary follicle, (C) secondary follicle, (D) small antral follicle, (E) COC of a large antral follicle, (F) mural granulosa and theca cells from a large antral follicle, (G) negative control reaction. O: oocyte; GC: granulosa cells; MGC: mural granulosa cells; CC: cumulus cells; TC: theca cells. Scale bars – original magnification: A-C and G, ×400; D-F, ×100 .…….. 71
Figure 4
Western blot analysis of TNF-α system in follicular compartments from bovine large antral follicles (<10 mm). (A) TNF-α; (B) TNFR1; (C) TNFR2; (D) β-actin. TC: theca cells; GC: granulosa cells ... 72
Figure 5
Normal primary follicle in fresh control (A); normal primary follicle cultured for 6 days in the presence of dexamethasone (10 ng/mL) (B); atretic primary follicle cultured in the presence of TNF-α (200 ng/mL) (C). GC, granulosa cell; Nu, oocyte nucleus; O, oocyte. Scale bars – original magnification: ×400 ... 73
Figure 6
Percentage of morphologically normal follicles in uncultured control tissue and after 6 days of culture in α-MEM+ supplemented with different concentrations of TNF-α (1, 10, 100, or 200 ng/mL) and dexamethasone (1, 10, 100, or 200 ng/mL). ∗Differs from fresh control; Distinct uppercase letters (A/B) represent significant differences
between treatments .……… 74
Figure 7
Percentage of primordial (A) and development (B) follicles in ovarian tissue at day 0 (fresh control) and after culture for 6 days in α-MEM+
supplemented with different concentrations of TNF-α (1, 10, 100, or 200 ng/mL) and dexamethasone (1, 10, 100, or 200 ng/mL). ∗Differs from cultured tissues; Distinct uppercase letters (A/B) represent significant differences between treatments …………...……… 75
Figure 8
Mechanically isolated follicles visible after staining with calcein – AM (A, B – green staining) and ethidium homodimer-1 (C, D – red staining).
Scale bars represent 10 µm ……… 76
Figure 9
TUNEL positive cells in bovine ovarian follicles and stromal cells .(A) Normal primary follicles in fresh control; (B) apoptotic primary follicles after 6 days of culture in the presence of dexamethasone (10 ng/mL); (C) negative control. (*) apoptotic oocyte; (arrow) apoptotic granulosa cell.
GC: granulosa cell; Nu, oocyte nucleus; O, oocyte; x400 magnification .. 77
Figure 10 Ultrastructural characteristics of normal (A) and (B) atretic follicles. OO: oocyte; GC: granulosa cells; V: vacuoles. ………. 79
Figure 11
Ultrastructural characteristics of follicles cultured in α-MEM+
alone (A), or supplemented with 10 ng/mL of TNF-α (B), or 10 ng/mL of dexamethasone (C). Bars are presented in the micrographs. GC: granulosa cells; OO: oocyte; V: vacuole …...……….……… 79
Figure 12
Levels of mRNA for tumor protein p53 (P53) (A); B-Cell CLL/lymphoma 2 (BCL-2) (B); BCL2-associated X Protein (BAX) (C); tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) (D); caspase-3 (CASP3) (E) and
caspase-6 (CASP6) (F) in fresh control and in bovine ovarian tissue
cultured for 6 days in medium containing TNF-α (10 ng/mL) or dexamethasone (10 ng/mL). A/B/C: significant difference between treatments. #p<0.05 compared with fresh control; *p<0.01 compared with fresh control; +p<0.05 compared with α-MEM+…………...…….………. 81
CAPÍTULO 2
Figure 1
Levels of mRNA for TNF-α (A); TNFR1 (B) and TNFR2 (C) in granulosa cells (mean ± SD) from preovulatory follicles after 0h, 3h, 6h and 12h of GnRH injection. Distinct uppercase letters (A, B) represent significant differences between different times (P<0.05) …… 111
Figure 2
Immunohistochemical analyse for TNF-α (A), TNFR1 (B) and TNFR2 (C) in bovine preovulatory follicles. A negative control reaction is shown in D. OO: oocyte; CC: cumulus cells; COC: cumulus-oocyte complex; TC: theca cells; GC: granulosa cells. Scale bars – 50 µm………... 112
Figure 3 Levels of mRNA for CASP3 (A), CASP6 (B), and HAS-2 (C) in bovine cumulus cells after 12 and 24 h of culture (means ± S.E.M.) in
the presence or absence of TNF-α. Distinct lowercase letters (a/b) represent significant differences after 24h of culture; *significant differences between treatments in the same time of culture, P<0.05 ….. 114
Figure 4
Levels of mRNA for CASP3 and CASP6 in bovine mural granulosa cells after 24 h of culture (means ± S.E.M.) in the presence or absence of TNF-α. Distinct uppercase letters (A/B) represent significant differences after 24h of culture; P <0.05……….. 115
Figure 5
Representative micrographs of COCs from bovine ovarian follicles after 0, 12 and 24h of culture (means ± S.E.M.) in the presence or absence of TNF-α. (A) oocyte from uncultured COCs, (B) CC from uncultured COCs, (C) oocyte from cultured COCs in TCM-199* for 12h, (D) CC from cultured COCs in TCM-199* for 12h, (E) oocyte from cultured COCs in TNF-α for 12h, (F) CC from cultured COCs in TNF-α for 12h, (G) oocyte from cultured COCs in TCM-199* for 24h, (H) CC from cultured COCs in TCM-199* for 24h, (I) oocyte from cultured COCs in α for 24h, (J) CC from cultured COCs in TNF-α for 24h. Bars are presented in the micrographs. ZP: zona pellucida; C; cortical granules N: nucleus; V: vacuole ………. 116
Figure 6
Levels of mRNA for TNF-α, TNFR1 and TNFR2 in cumulus cells after 12 h (A) and 24 h (B) of culture (means ± S.E.M.) in the presence or
absence of gonadotropins ………. 118
CAPÍTULO 3
Figure 1
(A–D) Relative expression of messenger RNA (mRNA) for interleukin (IL) 1 system in bovine preantral (secondary) and small antral follicles (<3 mm). Significantly different. Different superscript letters (a, b) indicate significant differences. CC, cumulus cells; FW, follicular wall; OO, oocyte; SEC, secondary follicle……... 130
Figure 2
(A–D) Relative expression of messenger RNA (mRNA) for interleukin (IL) 1 system in bovine small antral follicles. Significantly different (P < 0.05). f. wall, follicular wall. Different superscript letters (a, b) indicate significant differences. ………...
130
Figure 3
A–D) Relative expression of messenger RNA (mRNA) for interleukin (IL) 1 system in bovine large antral follicle. Significantly different (P < 0.05). f. wall, follicular wall. Different superscript letters (a, b) indicate significant differences.………... 131
Figure 4
(A–D) Relative expression of messenger RNA (mRNA) for interleukin (IL) 1 system in small (<3 mm) and large antral follicle (>3 mm). Significantly different (P < 0.05). f. wall, follicular wall. Different superscript letters (a, b) indicate significant differences. .………... 131
Figure 5
IL-1β and IL-1RA immunoreactivity in different follicular categories. (A) Primordial follicle, (B) primary follicle, (C) secondary follicle, (D) small antral follicle, (E) COC of a large antral follicle, (F) mural granulosa and theca cells from a large antral follicle, (G) negative control reaction. O: oocyte; G: granulosa cells; MGC: mural granulosa cells; CC: cumulus cells; T: theca cells. Scale bars – Original magnification: A–C and G, x400; D-F, x100 ………... 133
Figure 6
Interleukin 1-RI and IL-1RII immunoreactivity in different follicular categories. (A) Primordial follicle, (B) primary follicle, (C) secondary follicle, (D) small antral follicle, (E) COC of a large antral follicle, (F) mural granulosa and theca cells from a large antral follicle, (G) negative control reaction. O: oocyte; G: granulosa cells; MGC: mural granulosa cells; CC: cumulus cells; T: theca cells. Scale bars – Original magnification: A–C and G, x400; D-F, x100 ………... 134
Figure 7 Percentage (mean ± standard error of the mean) of morphologically normal follicles in uncultured control tissue (day 0) and in tissue
cultured for 6 d in medium containing IL-1β. *Differs significantly from fresh control follicles. AB indicates significant differences among cultured treatments (P < 0.05). IL, interleukin. ……… 135
Figure 8
Percentage (mean ± standard error of the mean) of primordial follicles in uncultured tissues and in tissues cultured for 6 d in medium containing IL-1β. *Differs significantly from control; ABCD indicates significant differences among cultured treatments (P < 0.05). IL,
interleukin. ….………. 135
Figure 9
Percentage (mean ± standard error of the mean) of developing follicles in uncultured tissues and in tissues cultured for 6 d in medium containing IL-1β. *Differs significantly from control (uncultured follicles). ABCD indicates significant differences among cultivated treatments (P < 0.05). IL, interleukin. ………. 135
CAPÍTULO 4
Figure 1
Levels of mRNA for IL-1β (A); IL-1RI (B) and IL-1RA (C) in granulosa cells (mean ± SD) from preovulatory follicles after 0h, 3h, 6h and 12h of GnRH injection. Distinct uppercase letters (A, B) represent significant differences between different times (P<0.05) …… 150
Figure 2
Levels of mRNA for IL-1β (A), IL-1RI (B) and IL-1RA (C) in cumulus cells after 24 h of culture (means ± S.E.M.) in the presence or absence of gonadotropins …...………. 151
Figure 3
Levels of mRNA for IL-1β (A); IL-1RI (B) and IL-1RA (C) in bovine cumulus cells after 12 and 24 h of culture (means ± S.E.M.) in the presence or absence of IL-1β. Distinct uppercase letters (A/B) represent significant differences after 24h of culture; * significant differences between treatments in the same time of culture, P<0.05 ….. 153
Figure 4
Levels of mRNA for Has-2 (A), iNOS (B) in bovine cumulus cells after 12 and 24h of culture (means ± S.E.M.) in the presence or absence of IL-1β. Distinct uppercase letters (A/B) represent significant differences after 24h of culture; *significant differences between treatments in the same time of culture, P<0.05 ……… 154
Figure 5
Representative micrographs of COCs from bovine ovarian follicles after 0, 12 and 24h of culture (Means ± S.E.M.) in the presence or absence of IL-1β. (A) oocyte from uncultured COCs (fresh control), (B) CC from uncultured COCs, (C) oocyte from cultured COCs in TCM-199* for 12h, (D) CC from cultured COCs in TCM-199* for 12h, (E) oocyte from cultured COCs in IL-1β for 12h, (F) CC from cultured COCs in IL-1β for 12h, (G) oocyte from cultured COCs in TCM-199* for 24h, (H) CC from cultured COCs in TCM-199* for 24h, (I) oocyte from cultured COCs in IL-1β for 24h, (J) CC from cultured COCs in IL-1β for 24h. Bars are presented in the micrographs. ZP: zona pellucida; O: oocyte; n: nucleus; rer: rough endoplasmic reticulum; m: mitochondria; v: vacuole ...……… 155
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1 Expressão de hormônios, receptores hormonais; fatores de crescimento e receptores que controlam a foliculogênese pré-antral em bovinos ... 43
CAPÍTULO 1
Table 1 Relative intensity of the immunohistochemical staining for TNF-α; TNFR-1and TNFR-2 protein in bovine ovarian follicles………… 69
Table 2
Percentage of apoptotic oocytes and granulosa cells before (fresh control) and after 6 days of in vitro culture in medium (α-MEM+) alone or in medium with TNF-α (10 ng/mL) or dexamethasone (10
ng/mL).……… 78
Table 3 Primer pairs used in real-time PCR for quantification of TNF-α and genes expressed in apoptotic cell death. ………... 90
CAPÍTULO 2
Table 1 Primer pairs used in real-time PCR for quantification of messenger RNA in COCs from bovine ovarian follicles... 103
Table 2
Diameters of COCs from bovine follicles (3 to 8 mm in diameter) (mean ± S.E.M.) after 12 and 24h of in vitro culture in TCM-199* or supplemented with TNF-α (100 ng/mL) ……... 113
CAPÍTULO 3
Table 1 Oligonucleotide primers used for the analysis of bovine follicles by the polymerase chain reaction……… 128
Table 2
Relative intensity of immunohistochemical staining for IL-1β, IL-1RA, 1RI and 1RII, and localization of mRNA for 1β, 1RA,
IL-1RI and IL-IL-1RII in the ovaries of cows... 132
CAPÍTULO 4
Table 1 Primer pairs used in real-time PCR for quantification of messenger
RNA in granulosa cells and COCs from bovine ovarian follicles …... 145
Table 2
Effect of IL-1β on cumulus expansion of COCs from bovine follicles (3 to 8 mm in diameter) (mean ± S.E.M.) after 0, 12 and 24 hours of in
vitro maturation in TCM-199* alone or supplemented with IL-1β (10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Português Inglês
ANOVA : Análise de variância Analysis of variance
As : Anti-senso Antisense
BSA : Albumina sérica bovina Bovine serum albumin
cAMP : Monofosfato cíclico de adenosina Cyclic adenosine monophosphate
cDNA : DNA complementar Complementary DNA
BAX : Proteína X associada ao BCL2 BCL2-associated X Protein BCL-2 : Células B CLL/linfoma 2 B-Cell CLL/lymphoma 2
CASP3 : Caspase 3 Caspase 3
CASP6 : Caspase 6 Caspase 6
CGPs : Células germinativas primordiais Primordial germ cells
CO2 : Dióxido de carbono Carbon dioxide
COC : Complexo cumulus-oócito Cumulus-oocyte complex
CT : Limiar do ciclo Cycle threshold
CYP11A1 : Colesterol desmolase Cholesterol desmolase
CYP17A1 : Citocromo P450 17α hidroxilase Cytochrome P450 17α-hydroxylase
D0 : Dia 0 do tratamento Day 0 of treatment
D6 : Dia 6 do tratamento Day 6 of treatment
dATP : Deoxiadenosina trifosfato Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxicitidina trifosfato Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxiguanosina trifosfato Deoxyguanosine triphosphate DNA : Ácido desoxirribonucleico Deoxyribonucleic acid
DNAse : Deoxiribonuclease Deoxyribonuclease
dNTP : Deoxiribonuclease trifosfato Deoxyribonucleotide triphosphates dTTP : 2' deoxitimidina 5' trifosfato 2'-deoxythymidine 5'-triphosphate
E2 : Estradiol Estradiol
EGF : Fator de crescimento epidermal Epidermal growth factor FGF-2 : Fator de crescimento fibroblástico Fibroblast growth factor FIV : Fertilização in vitro In vitro fertilization
FOPA : Folículo ovariano pré-antral Preantral ovarian follicle FSH : Hormônio folículo estimulante Follicle-stimulating hormone
GAPDH :Gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GDF-9 : Fator de crescimento e diferenciação tipo 9 Growth differentiation factor type 9
GnRH : Hormônio liberador de gonadotrofinas Gonadotropin-releasing hormone
GC : Células da granulosa Granulosa cells
H : Hora Hour
HAS2 : Ácido hialuronico sintetase-2 Hyaluronan synthase 2 H2O2 : Peróxido de Hidrogênio Hydrogen peroxide
IA : Inseminação artificial Artificial insemination
ITS : Insulina-transferrina-selênio Insulin-transferrin-selenium
kDa : Quilodalton Kilodalton
KL : Kit ligand Kit ligante
LH : Hormônio luteinizante Luteinizing hormone
LHR : receptor para LH LH receptor
M : Molar Molar
MAPK : Proteína kinase ativada por mitógenos Mitogen-activated protein kinase MET : Microscopia eletrônica de transmissão Transmission electronic microscopy
Mg : Miligrama Milligram
MgCl2 : Cloreto de magnésio Magnesium chloride
min : Minuto Minute
MIV : Maturação in vitro In vitro maturation
mL : Mililitro Millilitre
mm : Milímetro Millimeter
mM : Milimolar Millimolar
mRNA : RNA mensageiro Messenger RNA
N : Núcleo Nucleus
NaCl Cloreto de Sódio Sodium chloride
Ng : Nanograma Nanogram
nL : Nanolitro Nanoliter
nm : Nanômetro Nanometer
O : Oócito Oocyte
P4 : Progesterona Progesterone
P53 : Proteína tumoral 53 Tumor protein p53
PDF : Fator derivado da próstata Prostate-derived fator
PF : Folículo primordial Primordial follicle
PGC : Célula germinativa primordial Primordial germ cell
PI3K : Fostado de inositol 3-kinase phosphatidylinositol-3-kinases
PKC : Proteína quinase C Protein kinase C
RNA : Ácido ribonucleico Ribonucleic acid
RNAm : RNA Mensageiro Messenger RNA
RNAse : Ribonuclease Ribonuclease
S : Senso Sense
SD : Desvio-padrão Standard deviation
SF : Folículo secundário Secondary follicle
StAR : Proteína reguladora aguda esteroidogênica Steroidogenic acute regulatory protein
TE : Transferência de embriões Embryo transfer
TEM : Microscopia eletrônica de transmissão Transmission electron microscopy TGF-β : Superfamília de fatores de crescimento
transformante beta Transforming growth fator beta superfamily
U : Unidade internacional International unit
V : Vacúolo Vacuole
VEGF : Fator de crescimento do endotélio vascular Vascular endothelial growth fator VIP : Peptídeo intestinal vasoativo Vasoactive intestinal peptide
Zp : Zona pelúcida Pellucid zona
α-MEM : Meio essencial mínimo modificado de Eagle alfa
Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification
α-MEM+ : α-MEM suplementado
28 LISTA DE SÍMBOLOS
Português Inglês
% : Percentagem Percentage
~ : Aproximadamente Nearly
< : Menor que Less than
> : Maior que Higher than
± S.E.M : Erro padrão da média Satndard eror mean
≥ : Maior igual a Greater-than ore qual to
°C : Graus Celsius Celsius degrees
µg : Micrograma Microgram
µL : Microlitro Microliter
µm : Micrômetro Micrometer
µM : Micromolar Micromolar
p<0,05 : Probabilidade menor do que 5% Probability less than 5% p>0,05 : Probabilidade maior do que 5% Probability higher than 5%
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 30 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 31 2.1 Oogênese ... 31 2.2 Foliculogênese ovariana e caracterização folicular ... 34 2.3 População e atresia folicular ... 36 2.4 Ativação de folículos primordiais ... 37 2.5 Crescimento de folículos pré-antrais pós-ativação ... 42 2.6 Crescimento folicular na fase antral ... 44 2.7 Maturação de oócitos bovinos ... 47 2.8 Ovulação ... 50 2.9 Importância do Sistema TNF-α no ovário e seus efeitos na foliculogênese e ovulação ... 52 2.10 Caracterização do Sistema Interleucina-1 (IL-1) na foliculogênese ovariana e ovulação ... 54 3. PROBLEMA ... 57 4. HIPÓTESE CIENTÍFICA ... 58 5. JUSTIFICATIVA ... 59 6. OBJETIVOS ... 61 6.1 Objetivos gerais ... 61 6.2 Objetivos específicos ... 61 7. CAPÍTULO 1
Expression of TNF-α system members in bovine ovarian follicles and the effects of TNF-α and dexamethasone on in vitro preantral follicle survival, development and ultrastructure ... 63
8. CAPÍTULO 2
Expression profile of mRNA for TNF-α system in LH-induced bovine preovulatory follicles and effects of TNF-α on gene expression, ultrastructure and expansion of cumulus-oocyte complexes cultured in vitro ………... 96 9. CAPÍTULO 3
Protein and mensseger RNA expression of interleukin 1 system members in bovine ovarian follicles and effects os interleukin 1β on primordial follicle activation and survival in vitro ... 125 10. CAPÍTULO 4
In vivo effect of GnRH treatment on expression of Interleukin 1 (IL-1) system
members in bovine preovulatory follicles and effects of IL-1β on gene expression, ultrastructure and expansion of cumulus-oocyte complexes cultured in vitro ……... 138 11. CONCLUSÕES ... 165 12. PERSPECTIVAS ... 166 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 167
1. INTRODUÇÃO
As biotecnologias reprodutivas vêm se destacando no cenário nacional e internacional, criando oportunidades extraordinárias para a reprodução animal, especialmente no que se refere ao aumento da eficiência reprodutiva dos rebanhos de elevado potencial econômico. A bovinocultura é um dos principais destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial. O Brasil lidera o ranking de maior exportador de carne bovina do mundo desde 2008 e hoje é o segundo maior produtor, com mais de 212,34 milhões de cabeças, superado apenas pelos Estados Unidos, responsável por 17% da produção total (IBGE, 2015). A criação de rebanho bovino apresenta um impacto significativo no cenário socioeconômico mundial, atuando como fonte de renda para criadores, além de produzir alimento de alto valor nutricional e contribuir com valioso material genético voltado às pesquisas para reprodução animal.
Dentre as biotecnologias utilizadas com maior frequência na produção animal, destacam-se a Inseminação Artificial (IA), Fecundação in vitro (FIV) e a Transferência de Embriões (TE). Atualmente, o Brasil destaca-se como primeiro país do mundo em número de embriões produzidos in vitro (IETS, 2014). Além das biotécnicas supramencionadas, existe técnicas que apresentam boas perspectivas para aplicação em larga escala no futuro como a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais (MOIFOPA), a qual vem sendo bastante explorada por sua potencialidade em aproveitar a abundância oocitária presente no ovário. Avanços no desenvolvimento da biotécnica de MOIFOPA envolvem essencialmente duas estratégias. A primeira baseia-se no estudo in vivo da presença, distribuição e níveis de expressão de diversas substâncias nas diferentes categorias foliculares; já a segunda, concerne à avaliação de diversos fatores – substâncias intra e extra-ovarianas, meios de cultivo de base, concentração de gases, matrizes extracelulares, sistemas de cultivo, dentre outros – sobre a sobrevivência e o desenvolvimento de folículos pré-antrais crescidos
in vitro. Desta forma, a utilização da biotécnica de MOIFOPA poderia incrementar a
produção in vitro de embriões através do fornecimento de um elevado número de oócitos maturos que poderiam ainda ser utilizados para o incremento na eficiência das biotécnicas de clonagem e transgenia, as quais têm aplicação direta na produção de biofármacos. Assim, tanto no contexto molecular quanto nos aspectos aplicados, o desenvolvimento e aprimoramento de biotécnicas da reprodução, são necessários para aumentar a eficiência produtiva e reprodutiva dos rebanhos. Para isto, torna-se necessário a compreensão da
fisiologia ovariana em bovinos e o desenvolvimento de métodos eficientes que possibilitem avaliar os efeitos de substâncias que estão envolvidas no controle da foliculogênese.
Os estudos in vivo e in vitro são de grande importância, pois apesar da enorme quantidade de informações produzidas durante as duas últimas décadas, o entendimento completo dos mecanismos que controlam o desenvolvimento folicular, ovulação e maturação oocitária ainda não foram alcançados. Desta forma, o modelo bovino vem sendo utilizado na identificação de fatores envolvidos na ativação e desenvolvimento e seleção folicular, maturação oocitária, ovulação e luteólise (FERREIRA et al., 2007; FERREIRA et al., 2011;; GASPERIN et al., 2012; TONELLOTTO DOS SANTOS et al., 2012; BARRETA et al., 2013; GASPERIN et al., 2014; PASSOS et al., 2016; BEZERRA et al., 2016). Dentre estes fatores, pode-se destacar as citocinas inflamatórias, tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina 1β (IL-1β) que desempenham importante papel tanto na ovulação como na função folicular (MORRISON et al., 2002; VAN DER HOEK, 1998). Um conceito emergente é que as citocinas são importantes reguladores intraovarianos, agindo modulando ações relativas à foliculogênese, ovulação, e função do corpo lúteo, revelando a importância dos sistemas TNF-α e IL-1 nas alterações funcionais e estruturais no ovário em todas as fases do ciclo ovariano.
Visando uma melhor compreensão do assunto, a revisão de literatura a seguir abordará inicialmente os aspectos gerais relacionados à oogênese e foliculogênese. Além disso, será discutida a importância das gonadotrofinas para a foliculogênese, bem como aspectos relacionados à ovulação; cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais e maturação in vitro. Ademais, será feita uma abordagem da importância das citocinas para a foliculogênese e ovulação.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Oogênese
A formação dos folículos ovarianos, em mamíferos, ocorre ainda na vida fetal e engloba os processos de oogênese e foliculogênese (FIGUEIREDO et al., 2008) (Figura 1). A oogênese compreende o desenvolvimento e diferenciação das células germinativas primordiais (CGPs) até a formação do oócito haploide fecundado (RÜSSE, 1983). Em ruminantes, a oogênese inicia-se antes do nascimento, mas somente alguns oócitos conseguem
completar este processo meses ou anos mais tarde no animal adulto, após a fecundação (WASSARMAN, 1988). Em animais de laboratório, as proteínas morfogenéticas ósseas BMP-4 e BMP-8b induzem a formação de CGPs na região do epiblasto do disco embrionário (YING & ZHAO, 2001).
Figura 1. Oogênese e foliculogênese. Representação esquemática da oogênese e foliculogênese em fêmeas mamíferas. Fonte: adaptado de Milewski (2013).
Em bovinos, as CGPs são oriundas da porção caudal do saco vitelínico do embrião (WASSARMAN & ALBERTINI, 1994). As CGPs expressam várias proteínas, como por exemplo, OCT4, SOX2, Stella, Fragilis, E-Caderina e Blimp1 e iniciam o processo de migração para o alantoide e mesoderma extra-embrionário (HAYASHI et al., 2007). Após perderem suas características de motilidade e sofrerem extensiva proliferação celular e redistribuição das organelas citoplasmáticas, as CGPs passam a se chamar oogônias (SADEU
et al., 2006), as quais possuem alta atividade mitótica e transcricional (EPPIG et al., 2004).
Essas divisões mitóticas que ocorrem no período pré-natal asseguram que a fêmea nascerá com um completo suprimento de células germinativas, as quais irão compor o futuro reservatório folicular.
Acredita-se que a migração das CGPs (Figura 2) é orientada pelo contato entre o receptor c-kit, expresso na superfície destas células, e o seu ligante, o Kit ligante expresso nas células somáticas que formam o substrato para a migração das CGPs para a crista gonadal (BUEHR et al., 1993). Ao entrarem na primeira divisão meiótica, as oogônias dão origem aos oócitos primários ou gametas femininos (PICTON et al., 1998). Esses oócitos ficam bloqueados na prófase I da meiose (em estágio de vesícula germinativa) até a puberdade (SUH et al., 2002).
Figura 2. Migração das células germinativas primordiais (CGPs) a partir do saco vitelínico para as cristas gonadais. Fonte: adaptado de Senger (2003).
Com o desenvolvimento das gônadas, uma camada de células somáticas achatadas, conhecidas como células da pré-granulosa, circundam os oócitos formando assim os folículos primordiais (PICTON, 2001), dando início à foliculogênese. As células da pré-granulosa são originárias do mesonéfron ou de células mesoteliais oriundas do epitélio da superfície ovariana. Um estudo recente concluiu que as células da granulosa e as células epiteliais da superfície do ovário surgem a partir de um precursor comum, que seriam células do ápice gonadal semelhantes a células epiteliais (Gonadal Ridge Epithelial-Like – GREL) (HUMMITZSCH et al., 2013).
2.2 Foliculogênese ovariana e caracterização folicular
A foliculogênese bovina é um processo contínuo de crescimento e atresia dos folículos ovarianos (MATTON et al., 1981; WOOLUMS; PETER, 1994) que se inicia na vida fetal, passa pela puberdade (EVANS; ADAMS; RAWLINGS, 1994) e continua na vida reprodutiva até a senilidade (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Este processo está presente inclusive durante a prenhez (TAYLOR; RAJAMAHENDRAM, 1991) e no período pós-parto que precede a ciclicidade (ROCHE; CROWE; BOLAND, 1992; MCDOUGAL et al., 1995), e caracteriza-se por alterações morfológicas acompanhadas pelo desenvolvimento funcional do folículo (HUSSEIN, 2005).
Na região medular do ovário estão presentes vasos sanguíneos, linfáticos e nervos, e na região cortical são encontrados oócitos circundados por células somáticas (células da granulosa e células da teca), constituindo o folículo ovariano (FIGUEIREDO et al., 2008) (Figura 3). Com base no nível de desenvolvimento, o folículo pode ser classificado em diferentes estágios agrupados em duas grandes categorias: Folículos ovarianos pré-antrais (FOPA) – (folículos primordiais, transição, primários e secundários) e folículos antrais (folículos terciários e pré-ovulatórios) (FIGUEIREDO et al., 2008).
Figura 3. Esquema ilustrando o ovário mamífero com suas principais estruturas. (Adaptado de <http://www.britannica.com/EBchecked/media/99761/The-steps-of-ovulation-beginning-with-a-dormant-primordial-follicle>.)
Os FOPAs possuem um oócito circundado por uma ou mais camadas de células somáticas, sem a formação do antro. O desenvolvimento folicular pré-antral inicia-se em torno de 90 a 140 dias de vida com a colonização do ovário fetal por células mesonéfricas, precursoras das células foliculares, estas células somáticas achatadas circundam o oócito e formam uma camada de células da pré-granulosa originando os folículos primordiais. A ativação de folículos primordiais é um processo irreversível e contínuo que culminará no crescimento folicular ininterrupto até a ovulação ou atresia (PICTON, 2001). Os folículos pré-antrais representam cerca de 90 a 95% de toda a população folicular (WOOLUMS; PETER, 1994; FIGUEIREDO et al., 2008).
Já os folículos antrais ou cavitários são caracterizados pela presença de uma área preenchida por fluido folicular, denominada antro folicular. O desenvolvimento dos folículos antrais na espécie bovina envolve o recrutamento de um grupo de folículos secundários avançados ou antrais iniciais para retomar o crescimento (fase de recrutamento). Dentre estes, um folículo é selecionado, não sofre atresia e potencialmente pode ovular (fase de seleção). O
folículo selecionado passa a exercer dominância sobre os demais folículos, suprimindo o crescimento dos mesmos e inibindo o recrutamento de um novo grupo de folículos (fase de dominância) (HODGEN, 1982; GINTHER; KNOPF; KASTELIC, 1989; SIROIS; FORTUNE, 1990; GINTHER et al., 1996).
2.3. População e atresia folicular
A população folicular é bastante variável entre as espécies, sendo população estimada em 235.000 folículos em vacas, 160.000 em ovelhas, 37.000 em cabras e 2.000.000 em mulheres (BETTERIDGE et al., 1989; AMORIM et al., 2000; LUCCI et al., 1999; ERICKSON et al., 1986).
O “pool” de folículos pré-antrais existente nos ovários de mamíferos representa uma significativa reserva de material para estudos de manipulação genética em espécies domésticas, bem como para a preservação de espécies em extinção e preservação da fertilidade (PICTON, 2001). Entretanto, o número e a distribuição dos diferentes tipos foliculares nos ovários de animais são marcados por uma grande variação individual, além de ser afetado pela raça, idade, níveis hormonais, genética, bem como o status reprodutivo e nutricional do animal (IRELAND et al., 2007).
A fertilidade das fêmeas é determinada em grande parte pela capacidade de desenvolvimento dos oócitos, refletindo assim, na sua capacidade de sofrer meiose, ser fertilizado e originar um embrião saudável (KIDDER, 2010). Entretanto, ao longo da vida das fêmeas há uma significativa redução na população de folículos pré-antrais (SHAW et al., 2000), devido ao processo fisiológico degenerativo irreversível denominado atresia, que acomete cerca de 99,9% dos folículos ovarianos (FIGUEIREDO et al., 2008). Este processo pode ocorrer pelas vias degenerativa (SAUMANDE, 1981) e/ou apoptótica (FIGUEIREDO et
al., 1995), quando o ambiente parácrino ou endócrino não é apropriado para suportar o
crescimento e/ou diferenciação das células foliculares (SILVA et al., 2002).
Segundo Barnett et al., (2006), a apoptose folicular ocorre de forma ordenada sendo geneticamente regulada pela expressão de genes específicos tais como BAX e caspases. Estudo relatou que o desbalanço entre fatores pró e anti-apoptóticos são fatores determinantes na sobrivência e desenvolvimento folicular (HSU; HSUEH, 2000). Portanto, apesar do expressivo contingente da população folicular ovariana, poucos são os oócitos ovulados e que potencialmente serão fecundados, caracterizando a gônada feminina como um órgão de baixo desempenho.
Dessa forma, para se obter o sucesso no crescimento e desenvolvimento folicular, se faz necessário uma complexa interação entre oócito e células somáticas do estroma ovariano, envolvendo diversos mensageiros, fatores de crescimento, citocinas e hormônios (ARAÚJO et
al., 2014; PASSOS et al., 2016; SILVA et al., 2016). A interação harmônica entre estas
substâncias é responsável pela saída dos folículos primordiais do estágio de quiescência e posterior crescimento dos folículos até o estágio pré-ovulatório.
2.4 Ativação de folículos primordiais
O desenvolvimento de folículos pré-antrais pode ser dividido em três estágios: ativação de folículos primordiais, transição de folículo primário para secundário e desenvolvimento de folículos secundários até o estágio antral (FORTUNE, 2003). A maioria dos folículos em desenvolvimento sofrerão atresia, porém alguns irão amadurecer até o estágio de folículos pré-ovulatórios.
A ativação dos folículos primordiais caracteriza-se pela saída destes folículos do estágio de quiescência e entrada destes para o “pool” de folículos em crescimento. A ativação folicular resulta em alterações bioquímicas e funcionais nas células foliculares que levam ao aumento da atividade metabólica e transcricional destas células levando à mudanças na morfologia das células da granulosa o que pode acontecer dias, meses ou anos após a sua formação. Uma vez ativados, os folículos entram em um curso pré-programado de desenvolvimento e maturação, processos que são necessários para o sucesso da ovulação e fertilização, ou, alternativamente, são perdidos por atresia (MCGEE et al., 2000). Em adição, um grande número de fatores de crescimento e hormônios estão envolvidos na ativação de folículos primordiais (Figura 4).
O processo de ativação folicular é regulado por uma via de sinalização denominada de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) – proteína quinase B (Akt) (REDDY et al., 2008; LIU
et al., 2007a,b). Por intermédio desta via, muitos fatores de transcrição que agem na
sobrevivência dos folículos e no crescimento oocitário são ativados (REDDY et al., 2008). Além disso, a ativação desta via dependerá do balanço entre as moléculas inibitórias e estimulatórias.
Figura 4. Fatores que controlam a ativação, sobrevivência e o crescimento de folículos primordiais testados no cultivo folicular in vitro. Adaptado de Silva et al. (2016).
No que diz respeito às substâncias inibitórias, podem ser citadas a fosfatase e tensina homóloga com deleção no cromossomo 10 (PTEN), a proteína p27 (p27), ou o Fator de Transcrição Forkhead 3 (Foxo3) podem ser destacadas (JOHN et al., 2008).Como substâncias estimulatórias, pode-se destacar o kit ligante (KL) (JOHN et al., 2009), a insulina (ENGELMAN; LUO; CANTLEY, 2006), o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) (NAGAO et al., 2006), o fator de crescimento de queratinócito (KGF) (CHANG et
al., 2005; BAO et al., 2005), o fator de crescimento neural (NGF) (RAHBEK et al., 2005), o
fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF) (SRINIVASAN et al., 2005), o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) (ABID et al., 2004) e o fator de crescimento do hepatócito (HGF) (TAHER et al., 2002).
De fato, a ativação da PI3K nos oócitos leva à fosforilação da AKT serina/treonina-quinase e do fator de transcrição FOXO3 em oócitos de camundongas e ratas, resultando na ativação da AKT e na supressão do FOXO3 (Reddy et al., 2005). A AKT é uma molécula sinalizadora conhecida por aumentar a proliferação e a sobrevivência celular, bem como a síntese de glicogênio e proteína (Blume-Jensen e Hunter, 2001). O FOXO3, por sua vez, corresponde a um membro da subfamília FOXO de fatores de transcrição, a qual consiste do
FOXO3, FOXO1 e FOXO4, todos efetores negativos do padrão PI3K/AKT/PTEN (Tran et al., 2003). Além disso, o FOXO3, substrato da AKT, é um fator transcricional que leva à apoptose e à parada do ciclo celular. Portanto, tem sido sugerido que a AKT estimula o desenvolvimento do oócito, enquanto o FOXO3 o inibe. Vale ressaltar que, além do FOXO3, o FOXO1 e o FOXO4 também podem ser fosforilados pela via PI3K, resultando na inibição da apoptose e na ativação do ciclo celular (ACCILI E ARDEN, 2004).
Com o objetivo de compreender melhor os mecanismos de ativação em bovinos, o cultivo in vitro de tecido cortical ovariano vem sendo utilizado e no qual foi observado que a maioria dos folículos iniciam o seu crescimento espontaneamente após o cultivo (WANDJI et
al., 1996; BRAW-TAL et al., 1997). Inicialmente, foi sugerido que um inibidor de origem
medular regulava a ativação in vivo e que a separação do córtex da medula provocaria a ativação dos folículos primordiais bovinos in vitro. Atualmente, foi identificado que uma nova rota de sinalização pode está envolvida no controle da ativação e crescimento folicular. A via de sinalização Hippo é essencial para o controle do tamanho de órgãos e componentes desta via são conservados em todos os animais metazoários (PAN, 2007). Esta via consiste em vários fatores que atuam como inibidores do crescimento, a partir de uma cascata de quinases que fosforilam e inativam as principais vias efetoras da sinalização: Yes-associated
protein (YAP) e transcricional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). Quando a via de
sinalização Hippo é interrompida, ocorre a desfosforilação de YAP e um aumento dos níveis nucleares de YAP é observado. A proteína YAP atua em conjunto com fatores de transcrição TEAD que aumentam os níveis de expressão de fatores de crescimento da família CCN, bem como de fatores inibidores de apoptose – BIRC (baculoviral inhibitors of apoptosis repeat
containing), estimulando o crescimento celular, sobrevivência e proliferação (PAN, 2007;
HOLBOURN et al., 2008) (Figura 5).
É possível que a via de sinalização Hippo seja regulada com base na localização individual dos folículos no microambiente ovariano. Além disso, não é descartada a hipótese de que exista uma comunicação inter-folicular com base nesta via de sinalização (BAKER & SPEARS, 1999), uma vez que folículos dominantes podem reforçar a via de sinalização Hippo na adjacência folicular suprimindo o crescimento de outros folículos. Estudos genômicos e genéticos fornecem um maior suporte para a compreensão do papel essencial da via Hippo e da polimerização da actina na regulação do desenvolvimento folicular. Uma vez que os folículos primordiais são ativados, a via de sinalização Hippo em folículos próximo a área cortical poderia ser interrompida, levando a um aumento da atividade do co-ativador transcricional YAP (Yes-associated protein) e secreção do fator de crescimento CCN seguido
pela proliferação celular e o crescimento folicular. A sigla CCN é derivado a partir de grandes membros da família, CCN1 (cysteine-rich angiogenic protein), CNN2 (connective tissue
growth factor), e CCN3 (nephroblastoma overexpressed) (HOLBOURN et al., 2008).
Figura 5. Via de sinalização Hippo no ovário. A fragmentação do córtex ovariano induz a desorganização do citoesqueleto e a polimeração da actina que desencadeia a ativação de quinases, MST1/2. Feito isso, acontece a fosforilação da proteína SAV1 e formação do complexo SAV1_MST1/2, que por sua vez fosforila e ativa as quinases LARS1/2. Em seguida, co-ativadores transcricionais YAP1/TAZ são fosforilados e associados com proteínas 14-3-3, sendo retidos no citoplasma e, portanto inativados. A inativação de YAP1/TAZ é seguido da translocação destes fatores para o núcleo, onde, em conjunto com outros ligantes, como o TEAD1-4, induzem a expressão de fatores de crescimento (Ex: CCN), bem como de fatores que inibem a apoptose, controlando assim a proliferação e/ou sobrevivência.
Estudos in vitro com folículos primordiais caprinos têm demonstrado que o controle do início do crescimento folicular é regulado por diversos fatores, como o KL (CELESTINO
et al., 2010), o estradiol (LIMA-VERDE et al., 2010), a proteína morfogenética óssea 7
(BMP-7) (ARAÚJO et al., 2010), o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) (BRUNO et al., 2010), o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) (MARTINS et al., 2010), o VEGF (BRUNO et al., 2009), o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF-9) (MARTINS
et al., 2008), a Ativina-A (SILVA et al., 2006a), o fator de crescimento fibroblástico básico
(FGF-2) (MATOS et al., 2007), o fator de crescimento epidermal (EGF) (SILVA et al., 2004b), que atuam na promoção da ativação de folículos primordiais e no crescimento oocitário. A esfingosina 1-fosfato (S1P), após 7 dias de cultivo na concentração de 1ng/mL, promoveu a ativação e o desenvolvimento de folículos primordiais caprinos (NÓBREGA Jr.
et al., 2014). Além disso, o FGF-10 (FSH/FGF-10 e FSH/FSH) mantêm a viabilidade e a
ultraestrutura folicular, promovendo a ativação e o crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro por 16 dias (ALMEIDA et al., 2015). Em ovinos, o EGF associado ao ácido indolacético (IAA) ou ao FSH foi capaz de promover a ativação de folículos primordiais e manter a viabilidade folicular por até seis dias de cultivo (ANDRADE
et al., 2005). Ademais, o KL promoveu a ativação de folículos primordiais inclusos em tecido
ovariano de ovelhas após 7 dias de cultivo in vitro (CAVALCANTE et al., 2014).
Desta forma, acumulam-se evidências de que a ativação e o crescimento dos folículos primordiais requerem a expressão de vários fatores e receptores. Em particular, a família dos fatores de crescimento transformante beta (TGF-β) tem-se mostrado potente regulador da proliferação e diferenciação celular, nas diferentes espécies (ELVIN et al., 2000). Além desses fatores, existem também comprovações sobre a importância das gonadotrofinas, hormônio do crescimento (GH), esteroides e andrógenos no desenvolvimento de folículos pré-antrais (HARTSHORNE et al., 1994; VENDOLA et al.; 1998; BACHELOT
et al., 2002; ZACZEK et al., 2002).
Há ainda estudos que utilizam proteínas de origem vegetal, como as lectinas, durante a ativação de folículos primordiais in vitro. A lectina jacalina (50 µg/mL) associada ao FSH (50 µg/mL) foi capaz de promover a ativação e a sobrevivência de folículos primordiais caprinos em 6 dias de cultivo (RIBEIRO et al., 2014). A lectina concanavalina A (Con A) (10 ou 40 µg/mL) e o FSH promoveram a ativação de folículos primordiais na espécie caprina, após 6 dias de cultivo (PORTELA et al., 2014).
