UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DEPARTAMENTO DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC CNPq e PIBIC UFPA
RELATÓRIO TÉCNICO – CIENTÍFICO
Período: 08/2012 a 08/2013 ( ) PARCIAL
( x ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Estudo de fungos endofíticos de espécies de plantas da amazônia como produtores de aleloquímicos
Nome do Orientador: Lourivaldo da Silva Santos Titulação do Orientador: Doutor
Departamento: Faculdade de Química Unidade: ICEN
Laboratório: Química – Pesquisa Título do Plano de Trabalho:
Atividade anti-leshmaniose de Virola surinamensis (Myristicaceae).
Nome do Bolsista: Steven Souza Paes
Tipo de Bolsa: (X) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/UFPa
INTRODUÇÃO.
O gênero Virola passou a ter maior atenção cientifica após a divulgação que algumas de suas espécies são usadas por tribos da Amazônia no preparo de um chá alucinógeno e como veneno utilizado para caças (RODRIGUES 1972).
A Virola surinamensis (Rol.) Warb. é muito utilizada contra reumatismo e artrite (HOEHNE,1939). Na medicina popular também é utilizada como cicatrizante e no tratamento de cólicas e dispepsias (SCHULTES e HOLMSTED, 1971). A resina obtida das cascas é utilizada para o tratamento de erisipelas e inflamação (SCHULTES e HOLMSTED, 1971; BERGER, 1992).
Dentre as mais conhecidas espécies de Virola está a V. surinamensis (Rol) Warb. pertencente à família Myristicaceae, e conhecida popularmente como ucuuba, ucuuba-branca, cheirosa, de-igapó, da-várzea, ucuúba-verdadeira, bicuíba, bicuíba-branca, árvore-de-sebo, virola, entre outros.
JUSTIFICATIVA
As plantas medicinais são de grande utilidade para pessoas que não tem condições financeiras para se medicar através da quimioterapia. Mas a utilização de plantas apesar de seu efeitos benéficos pode trazer consequências danosas à saúde daqueles que utilizam esse modo de automedicação. A utilização de plantas medicinais é feita de maneira indiscriminada pela população, e pode, assim como a quimioterapia, causar efeitos adversos àqueles esperados, necessitando, portanto, um conhecimento prévio de seus componentes químicos, pois a presença de substâncias nelas contidas pode produzir efeitos que desconhecemos principalmente se ingerida em longo tempo, podendo assumir natureza tóxica a exemplo do “pau d’arco” (Tabebuia avellanedeae), “barbatimão” (Stryphnodendron obovatum), “confrei” (Symphytum officinale), dentre outros (ALMEIDA, 1993).
É necessário, portanto, um engajamento dos pesquisadores brasileiros no sentido de investigar nossas plantas medicinais, não somente com o objetivo de isolar seus componentes químicos como também, interagir com farmacólogos, verificar suas propriedades tóxicas e comprovar seus efeitos medicinais na medicina. Um grave problema de saúde pública, acometendo aproximadamente 350 milhões de homens, mulheres e crianças em 98 países ao redor do mundo está relacionado às leishmanioses que são causadas por protozoários do gênero Leishmania (WHO, 2010; PAHO, 2012). Trata-se de uma doença infecciosa
zoonótica afetando homem e animais, causada pela infecção por Leishmania spp. podeendo abranger as formas tegumentar, mucocutânea e a leishmaniose visceral. A leishmaniose tegumentar é a forma mais comum da doença, podendo evoluir em humanos desde lesões cutâneas auto limitadas (com possível cura espontânea) a lesões graves, de difícil resolução. A forma visceral da leishmaniose, também conhecida por calazar, é a mais severa da doença e sua apresentação clínica pode variar desde quadros assintomáticos a polissintomáticos, e graves, com desfecho invariavelmente fatal sem o tratamento adequado. (MULLER et. al., 2008; WHO, 2010). A transmissão da doença ao homem ocorre quando os mosquitos flebótomos, dos gêneros Lutzomyia e Psychopopygus, infectam-se ao picar o animal portador da doença, aspirando macrófagos parasitados ou amastigotas livres no sangue ou tecidos e podendo assim, transmitir a doença ao homem.
Atualmente mais de 450 lignanas e neolignanas, com mais de quarenta tipos diferentes de esqueletos carbônicos, são descritos na literatura. Estudos com este grupo de substâncias mostraram que alguns lignoides são capazes de inibir a transcriptase reversa e conseqüentemente a atividade do vírus HIV (EICH et al., 1996). Desta forma, com base nos dados apresentados na literatura do potencial farmacológico e variedades dos constituintes químicos da V. surinamensis verifica-se a necessidade da realização de mais estudos químicos e farmacológicos da espécie.
A surinamensina uma das substâncias muito comum das folhas de V. surinanensis apresentou atividade in vitro contra espécies de Leishmania donovani promastigota com concentração inibitória de 50 μM, enquanto que para amastigota em macrófagos a substância foi ativa em 100 μM, entretanto, revelou-se tóxica para o macrófago (BARATA, et al., 2000). Análogos de neoliganas 8.O.4’ apresentaram 100% de inibição para Leishmania amazonensis à 80 μg/mL (AVENIENTE et. al, 2007), enquanto que compostos β-cetoeteres e β-cetoaminanas revelaram-se ativas nas concentrações de 30 a 100 μM frente ao Leishmania donovani (BARATA, et al., 2000). A atividade leishmanicida das espécies V. oleifera, V. surinamensis, V.donovani e V. pavonis foi atribuída à presença de neolignanas (FERNANDES et al., 1993). Levando em consideração os ensaios farmacológicos que têm confirmado a eficácia de determinadas plantas da Amazônia contra diferentes cepas de Leishmania (WABWOBA et al., 2010; MOREIRA et al., 2007), e a necessidade da busca de novos fármacos para o tratamento das leishmanioses, quer por problemas
de alta toxicidade, resistência parasitária ou muitas reações adversas, tem-se também como objetivo da pesquisa fornecimento de frações e substâncias para a avaliação da atividade contra espécies de Leishmania.
OBJETIVO GERAL.
Isolar e identificar substâncias da Virola surinamensis, e realizar ensaios de atividade biológica frente a Leshmania .
ATIVIDADES PROGRAMADAS PARA O PERÍODO DA BOLSA: 1. Atualização bibliográfica: Objetivo alcançado
Foram feitos levantamentos biográficos referentes à espécie V.surinamensis nas principais bases de dados, como Web of Science e Scifinder.
2. Coleta e identificação botânica da planta: Objetivo alcançado Vide em materiais e métodos, coleta e identificação.
3. Preparação dos extratos brutos: Objetivo alcançado Vide em materiais e métodos, extração do material botânico. 4. Fracionamento cromatográfico: Objetivo alcançado
Vide em materiais e métodos, fracionamento do extrato acetato de etila. 5. Identificação estrutural dos constituintes isolados: Objetivo alcançado
A identificação dos constituintes foi realizada através das técnicas de RMN uni e bi dimensional.
6. Isolar e identificar substâncias das folhas de Virola surinamensis, e realizar ensaios de atividade anti- Leshmania de frações e substâncias: Objetivo parcialmente alcançado
7. Relatório Parcial: Objetivo alcançado.
Foi apresentado e Aprovado o Relatório Parcial com atividades dos seis meses iniciais de bolsa.
8. Relatório Final: Objetivo alcançado.
MATERIAIS E MÉTODOS:
Materiais.
1. Vidrarias diversas (becker, erlenmeyer, pipetas graduadas, volumétricas e pasteur, buretas, provetas, balões, funis, bastões de vidro).Alem de espátulas de alumínio garras de fixação, aros e vidrinhos de penicilina. 2. O espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear utilizado na obtenção
dos espectros foi modelo Mercury 300 (VARIAN).
3. Evaporadores rotativos a vácuo: BÜCHI, modelo 461 e QUIMIS, modelo Q-344-2, utilizados na concentração dos extratos.
4. Câmara de análise de fluorescência por luz ultravioleta: Cabine e luz SPECTROLINE, modelos CM-10/ ENF-260C, para visualização de CCDC (cromatografia em camada delgada comparativa).
5. Balanças Analíticas: SARTORIUS, modelo BP210S.
6. Os solventes utilizados para extração e nos diversos procedimentos cromatográficos foram solventes graus P.A. hexano, acetato de etila, metanol, diclorometano (SYNTH, NUCLEAR, VETEC). Alem da utilização de solventes retificados no LPN (Laboratório de Produtos Naturais) da UFPA
7. Os espectros de RMN foram obtidos em solventes deuterados (clorofórmio-d e metanol-d4 ).
8. Nos fracionamentos cromatográficos em coluna foi utilizada sílica gel60 70-230 mesh.
9. Nos procedimentos cromatográficos em camada delgada comparativa foi empregada sílica gel 60 para CCD do tipo HF254, (MERCK).
10. Reagentes utilizados na revelação das placas de CCDC: Solução de Ce(SO4)2 1%
Métodos.
Coleta e Identificação:
Um espécime de V. surinamensis foi coletado nas matas da Embrapa em Belém por um parataxônomo com larga experiência onde uma exsicata está depositada no museu paraense EMILIO GOELDI-MPEG.
Secagem, Moagem:
As folhas foram secas em estufa a uma temperatura de 40ºC por um período de dois dias. Depois de secas, as folhas foram trituradas e moídas em moinho de facas resultando em 6,2 kg de material.
Extração do material botânico:
Folhas secas e moídas de V. surinamensis (4,0 kg) foram extraídas seqüencialmente com hexano (8 L), acetato de etila (6 L) e metanol (5 L) durante sete dias para cada solvente. Após filtração e evaporação dos solventes foram obtidos 61,7 g de extrato bruto hexânico (EBH), 120,8 g de extrato bruto Acetato de etila (EBAcOET) e 244,3 g de extrato bruto metanólico (EBMeOH). A figura 1 mostra o fluxograma relativo à extração a frio do material botânico.
Figura 1: Obtenção dos extratos brutos de Hex, AcOEt e MeOH. Material Botânico 4,0 kg
Resíduo 1 Extrato Hexânico 61,7g
Resíduo 2 Extrato AcOEt 120g
Resíduo 3
Extrato MeOH 244g
Fracionamento do extrato acetato de etila (AcOEt)
O extrato AcOEt (15,0 g) foi fracionado em coluna filtrante utilizando como eluentes misturas de hexano (hex), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH) em gradientes de polaridades crescentes, onde foram coletadas 26 alíquotas (1 a 26) de 400 mL cada, conforme dados apresentados na tabela 1.
Tabela 1: Fracionamento Cromatográfico do extrato acetato de etila e reuniões das alíquotas.
Sistema de
Solventes
N º de aliquotas Nº das frações
resultante das reuniões HEX- 100% 1-3 1 HEX/AcOEt–5% 4-8 2-6 HEX/AcOEt–50% 9-11 7 HEX/AcOEt–75% 12-14 8-10 AcOEt– 100% 15-17 11-13 AcOEt/MeOH– 5% 18-20 14 AcOEt/MeOH–15% 21-22 15-16 AcOEt/MeOH–50% 23-24 17 MeOH–100% 25-26 18-19
As 26 alíquotas foram concentradas em evaporador rotativo e submetidas a análises por meio de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC). As alíquotas que apresentaram perfil cromatográfico semelhantes foram reunidas, dando origem a 19 frações (tabela 1). A Fração 7 foi submetida a cromatografia em coluna dando origem a substância S1 como um óleo de coloração amarelada.
Partição do extrato AcOEt.
O extrato bruto AcOEt (10 g) foi solubilizado em 1L de solução hidroalcoólica MeOH/H2O (7:3) e extraído com 700 mL de hexano (4x). As frações hexânicas foram
reunidas, secadas com sulfato de sódio anidro, e após filtração e concentração sob vácuo obteve-se 500 mg da Fase Hexânica. A Fase Hidroalcoólica resultante da extração com hexano foi extraída com acetato de etila (4x 700mL) e após o mesmo
procedimento usado anteriormente obteve-se 2,0 g da Fase Acetato de Etila. A figura 2 ilustra o fluxograma da partição.
Figura 2: fluxograma da partição do extrato bruto AcOEt
MeOH/H2O 7:3 1L
Partição com 700mL de Hex
A Fase AcOEt (2,0 g) foi fracionada por cromatografia de coluna (CC) sendo utilizados sistemas de solventes empregando hexano (hex), acetato de etila (AcOET) e metanol (MeOH) em gradientes de polaridades crescentes. Foram coletadas 191 alíquotas as quais foram analisadas por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) e as alíquotas que apresentaram perfis cromatográficos semelhantes foram reunidas dando origem a 30 subfrações. Análise das subfrações levou às Frações ST2, ST3, ST4 e ST5 que foram utilizadas nos testes biológicos. O fluxograma da figura 3 apresenta de maneira simplificada o procedimento utilizado.
Extrato Bruto AcOEt 10g
Solução Hidroalcoólica
Resíduo 1 Fase Hexânica
(500 mg)
Resíduo 2 Fase AcOEt (2,0 g)
Figura 3: Fluxograma da obtenção de ST2, ST3, ST4 E ST5.
ST2 ST3 ST4 ST5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A substância S1 (10 mg) foi isolada por cromatografia em coluna como um óleo de coloração amarelada, a partir da fração 7 do fracionamento do extrato acetato de etila. Na análise do espectro de RMN 1H de S1 (Figura 4, anexo) foi observado grande número de sinais em regiões diferentes do espectro, onde foi possível notar que a referida substância se apresenta em mistura. No espectro se destaca dois sinais: um mutipleto em δH 4,41 (1H) e um dupleto centrado em δH 4,73 (d, J = 7,8 Hz, 1H), característicos respectivamente dos prótons metínicos de C-8 e C-7 de uma substância da classe das neolignanas alcoólicas 8.O.4’ com configuração treo (BARATA, 1976), além de um dupleto em δH 1,22 (J = 6,3 Hz) atribuído aos hidrogênios metilícos de C-9. Na região de hidrogênios aromáticos, observam-se seis sinais, sendo dois duplos dupletos, um em δH 7,44 (dd, J = 1,8 e 8,1 Hz) e o
FASE AcOEt. 2,0 g 30 SUBFRAÇÕES Subfração 5 Hex/AcOEt 5%,300 mg Subfração 16 Hex/AcOEt 33%,475mg Subfração 14 Hex/AcOEt 25%, 87 mg Subfração 9 Hex/AcOEt 15%, 40 mg
outro em δH 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz), dois dupletos orto relacionados em δH 7,06 (d, J = 8,1 Hz) e δH 6,84 (d, J = 8,1 Hz), e dois dupletos meta relacionados em δH 7,45 (d, J = 1,8 Hz) e δH 6,95 (d, J = 2,1 Hz).
A partir da análise mapa de correlações COSY H1 x H1 (Figura 5, anexo), verifica-se a corelação do duplo dupleto em δH 7,44 com o dupleto em δH 7,06, e o duplo dupleto em δH 6,93 com o dupleto em δH 6,84, sugerindo a presença de dois anéis aromáticos 1,3,4 substituídos, na estrutura, como ilustrado a seguir:
Observou-se também no espectro de RMN 1H (Figura 4, anexo) três intensos singletos na região dos sinais de hidrogênios de metoxilas aromáticas em δH 3,88, 3,89 e 3,96, além de um intenso singleto em δH 9,87 que pode ser atribuído a hidrogênio de aldeído ou de uma hidroxila fenólica. No espectro de RMN 13C (Figura 6, anexo) e DEPT (Figura 7, anexo) observam-se sinais em δC 109,78, 109,83, 110,87, 115,04, 119,90, 126,40, 130,90, 131,90, 149,10, 150,74, 153,10 e 153,31 de dois anéis aromáticos, além dos sinais em δC 55,90, 55,96 e 56,12 de metoxilas ligadas a anel aromático, além de um sinal em δC 190,90 que caracteriza a presença de uma carbonila conjugada de aldeído. Ainda no espectro de RMN 13C (Figura 7, p. 19) observam-se dois sinais em δC 81,96 e 77,86 com deslocamentos característicos dos carbonos metinícos C- 8 e C-7. Enquanto que, no mapa de correlações HETCOR (Figura 8, anexo), verifica-se as seguintes correlações: do carbono δC 81,96 com mutipleto em δH 4,45- 4,36, do carbono δC 78,86 com o dupleto centrado em δH 4,73 e do carbono δC 16,40 com o dupleto em δH 1,22. No mapa de correlação HMBC (Figura 9, anexo) verifica-se a correlação 2JC,H do
Ar O Ar OH 7 8
carbono em δC 81,96 com o dupleto em δH 4,73 e a correlação 2JC,H com o dupleto em δH 1,22, assim como a correlação 2JC,H do carbono em δC 77,86 com o multipleto em δH 4,45-4,36 e a 3JC,H com o dupleto em δH 1,22. Levando em considerações as referidas correlações, podem-se realizar as seguintes atribuições:
Ar CH CH H3C O Ar OH C-8 81,96 H-8 m 4,40 C-7 77,86 H-7 d 4,73 C-9 16,40 H-9 d 1,22
A partir do mapa de correlação HETCOR (Figura 8, anexo) verifica-se as seguintes correlações: sinais de carbono em δC 119,90, 109,80 e 110,90 com os sinais de hidrogênios em δH 6,95 (d, J = 2,1 Hz), 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz) e 6,84 (d, J = 8,1 Hz), respectivamente; e sinais de carbono em δC 126,40, 109,80 e 115,05 com os sinais de hidrogênios em δH 7,45 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,44 (dd, J = 8,7 e 2,1 Hz, 1H) e 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H) respectivamente.
De acordo com a expansão do mapa de correlações HMBC (Figura 9, anexo), verifica-se uma correlação 2JC,H do sinal de carbono em δC 131,90 com o dupleto em δH 4,73, as outras correlações existentes com esse dupleto é somente com carbonos protonados, sendo assim a única correlação com um carbono totalmente substituído é com o sinal em δC 131,90, sendo este atribuído ao carbono C-1 de neolignanas 8.O.4’, e ainda conforme o mapa de correlações HMBC (Figura 11, p. 21 ) apresenta uma correlação 3JC,H com o dupleto em δH 6,84 (J = 8,1 Hz), o que leva a conclusão que o conjunto de sinais aromáticos em δH 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz), 6,84 (d, J = 8,1 Hz), 6,95 (d, J = 2,1 Hz) pertence ao anel A.
Estudos sobre a síntese de formil neolignanas foram realizados por Criss et. al., (1998), Xia e Wang, (2010) e Tsai et. al., (1996). Esses autores realizaram estudos sobre neolignanas com esqueleto básico representado a seguir:
Tomando como base as neolignanas alcoólicas 8.O.4’ e levando em consideração os estudos de Barata (1976), Criss, et. al. (1998), Xia e Wang (2010) e Tsai et. al. (1996), pode-se realizar as seguintes atribuições para a estrutura de S1: os sinais de hidrogênios que caracterizam um anel aromático 1,3,4-trissubstituído, em δH 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,44 (dd, J = 8,7 e 2,1 Hz, 1H) e 7,45 (d, J = 2,1 Hz, 1H) e de carbono em δC 115,05, 109,8, 126,40 podem ser assinalados, respectivamente, aos hidrogênios e carbonos H-5’/C-5’, H-6’/C-6’ e H-2’/C-2’, de um dos anéis aromáticos, que a partir da correlação observada dos dois últimos sinais de carbono citados com o singleto em δH 9,90 típico de aldeído, é possível assinalar este anel como anel B; o conjunto de sinais de hidrogênios e carbonos aromáticos em δH 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz), 6,84 (d, J = 8,1 Hz), 6,95 (d, J = 2,1 Hz) e δC 109,8, 110,90 e 119,90 pertencem ao anel A, também 1,3,4-trissubstituído, assinalados respectivamente como H-6/C-6, H-5/C-5 e H-2/C-2. No mapa de correlação HMBC (Figura 12 p. 22) observam-se as correlações: a 3JC,H do sinal de carbono em δC 153,10 com o sinal de hidrogênio em δH 7,44 (dd) e a 2JC,H com o sinal em δH 7,05 (d); a 3JC,H do sinal de carbono em δC 150,74 com o sinal de hidrogênio em δH 7,05 (d) e a 2JC,H com o sinal em δH 7,45 (d), além da correlação a 3JC,H do sinal de carbono em δC 130,90 com o sinal de hidrogênio em δH 7,05 (d) e a 2JC,H com o sinal em δH 9,90 (s). Assim, diante dessas correlações atribui-se ao carbono C-4’ o sinal em δC 153,10, ao carbono C-2’ o sinal em δC 150,74 e ao carbono C-1’ o sinal em em δC 130,90 que são carbonos aromáticos oxidados, e consequentemente ao ao carbono C-7’ o sinal em 190,90 e ao H-7’ o sinal em δH 9,90 (s), confirmando a presença do grupo aldeído na estrutura.
Ainda conforme o mapa de correlação HMBC (Figura 12, p. 22) observam-se também as correlações: a 3JC,H do sinal de carbono em δC 149,10 com o sinal de
hidrogênio em δH 6,93 (dd) e a 2JC,H com o sinal em δH 6,48 (d) e a correlação a 3JC,H do sinal de carbono em δC 131,90 com o sinal de hidrogênio em δH 6,84 (d), logo, atribui-se respectivamente C-4 e C-1. Neste anel aromático (A) ainda resta a posição C-3 a ser atribuída, no entanto, observa-se a presença de sinal de carbono em δC 153,31(Figura 7, p. 19) que não revela nenhuma correlação no mapa de correlação, entretanto, este sinal de carbono é tipicamente aromático oxidado restando a ele a posição C-3.
Os sinais no espectro de RMN 13C (Figura 7, p. 19) em δC 55,89, 55,96 e 56,12 são referentes aos carbonos das três metoxilas aromáticas. No espectro de RMN de 1H os sinais em δH 3,86, 3,88 e 3,96 são devidos aos hidrogênios das três metoxilas aromáticas. O espectro de massas de S1 (Figura 13, p. 22 ) apresentou o íon molecular [M+.] 346 u.m.a., compatível com a fórmula molecular C19H22O6. A reunião dos dados apresentados permitiu concluir que a substância S1 é a treo-1-(3,4-dimetoxifenil)-2-(2-metoxi-4-formilfenoxi)-propan-1-ol, produto natural. A Tabela 3 (p. 14) reúne os dados de RMN 1H, 13C, HETCOR e HMBC de S1 em comparação com os dados da substância obtida por síntese (CRISS et. al., 1998). A figura 76 demonstra as correlações citadas conforme o mapa de correlação HMBC. Para confirmar a proposta estrutural é necessária a obtenção do espectro de massas de alta resolução da substância.
Figura 5: Correlações observadas no mapa de correlação HMBC de S1.
MeO MeO OH O OMe O 2J 3J
S6 δC(HETCOR) δH HMBC δH* 1 131,90 ---- ---- ---- 2 119,90 6,95 (d, J = 2,1 Hz, 1H) 77,86 (3J) 6,86-7,50 (m) 3 153,31 ---- ---- ---- 4 149,10 ---- ---- ---- 5 110,90 6,84 (d, J = 8,1 Hz, 1H) 131,90 (3J) 6,86-7,50 (m) 6 109,8 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz, 1H) 77,86 (3J) 6,86-7,50 (m) 7 77,86 4,73 (d, J = 7,8 Hz, 1H) 81,96 (2J) 131,90 (2J) 4,84 (d, J = 4,4 Hz, 1H) 8 81,96 4,41 (m) 77,86 (2J) 4,74 (m) 9 16,40 1,22 (d, J = 6,3 Hz, 3H) 81,96 (2J) 77,86 (3J) 1,29 (d, J = 6,1 Hz, 3H) 1’ 130,90 ---- ---- ---- 2’ 126,40 7,45 (d, J = 2,1 Hz, 1H) 150,74 (2J) 6,86-7,50 (m) 3’ 150,74 ---- ---- ---- 4’ 153,10 ---- ---- ---- 5’ 115,50 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H) 153,10 (3J) 150,74 (3J) 130,90 (3J) 6,86-7,50 (m) 6’ 109,8 7,44 (dd, J = 2,1 e 8,7 Hz, 1H) 153,10 (3J) 6,86-7,50 (m) 7’ 190,90 9,90 (s) 130,90 (2J) 9,84 (s) 3x(OMe) 55,89; 55,96 e 56,12 3,88; 3,86; 3,96 (s) 3,77; 3,81; 3,90 (s) * RMN de 1H (300 MHz, acetona-d6) (Criss, et. al., 1998)
Atividade antipromastigota.
O ensaio de avaliação da atividade anti-leishmaníase foi realizado em parceria com a Prof. Dra. Fani Dolabela do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas do ICS-UFPA e a aluna de mestrado do programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas do ICS-UFPA Andreza Veiga. Foram testadas a substância S1 e as frações ST2, ST3, ST4 e ST5 das folhas de Virola surinamensis contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis.
A viabilidade das formas promastigotas foi avaliada com base no metabolismo do MTT, sendo a mesma proporcional ao valor da absorbância gerada em espectofotômetro, sob comprimento de onda igual a 490 nm.
Tabela 1. CIM e CI50 das obtido das folhas de Virola surinamensis testados em
formas promastigotas de Leishmania amazonensis.
Legenda:
CIM=Concentração inibitória mínima; CI50 = Concentração inibitória 50%; DP= Desvio padrão; (1)= intervalo de confiança de 95%
As amostras testadas nos ensaios anti-leishmaníase não apresentaram inibição da fase promastigota de Leishmania amazonensis testadas na concentração inibitória mínima de (CIM> 200μg/mL e CI50> 200μg/mL), sendo portanto, consideradas inativas. CONCLUSÃO Amostra L.amazonensis CIM (µg/mL) CI50 (µg/mL)±DP (1) S STT11 S STT22 S STT33 S STT44 S STT55 A AnnffootteerriicciinnaaBB > >220000 > >220000 > >220000 > >220000 > >220000 0 0,,3399006 6 > >220000 > >220000 > >220000 > >220000 > >220000 0 0,,1166999±0,0049
Neste trabalho foi realizado o estudo fitoquímico e a avaliação da atividade anti-leshmaniose (Leishmania chagasi e L. amazonensis) de folhas da espécie amazônica Virola surinamensis (Myristicaceae). Foram obtidos os extratos hexânico, acetato de etila e metanólico das folhas de V. surinamensis e a partir do extrato acetato de etila foi isolada e identificada a substância S1 e obtidas as frações ST2, ST3, ST4, ST5.
A partir do extrato acetato de etila foi identificada a formil neolignana treo-1-(3,4-dimetoxifenil)-2-(2-metoxi-4-formilfenoxi)-propan-1-ol (S1). Outras substâncias foram isoladas mas não foram identificadas devido a problemas técnicos com o aparelho de ressonância magnética.
Nos ensaios anti-leshmaniose as amostras testadas não apresentaram atividade de inibição da fase promastigota frente à Leishmania amazonensis na concentração (CIM> 200μg/mL e CI50> 200μg/mL).
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Figura 4 : Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) de S1.
Figura 5: Mapa de correlação COSY 1H x 1H de S1 (CDCl3, 300 MHz).
Figura 8: Mapa de correlação HETCOR de S1 (CDCl3).
Figura 10 : Mapa de correlação HMBC de S1, expansão (CDCl3).
DIFICULDADES
Dificuldade na obtenção dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear de
1
H e de 13C, devido a defeito no aparelho.
PARECER DO ORIENTADOR
O bolsista desenvolveu seu trabalho de maneira satisfatória alcançando os objetivos inicialmente propostos. A avaria no espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear dificultou o trabalho. Os resultados do trabalho são significativos e serão submetidos a apresentação em Congresso Científico da área. Assim, sou de parecer FAVORÁVEL a aprovação deste Relatório Final.
DATA: 09/08/2013
________________________________________ Lourivaldo da Silva Santos
ORIENTADOR
___________________________________ Steven Souza Paes
