Monolisa Anti-HCV PLUS Version 2

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(1)Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2 1 placa - 96 tests 5 placas - 480 tests. 72317 72318. DISPOSITIVO DE DESPISTAGEM DE ANTICORPOS ANTI-HCV (VÍRUS DA HEPATITE C) NO SORO OU NO PLASMA HUMANO POR TECNICA IMUNOENZIMATICA. IVD Controlo da qualidade de fabrico Todos os produtos fabricados e comercializados pela empresa Bio-Rad são submetidos a um sistema de garantia de qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização do produto final. Cada lote do produto final é objecto de um controlo de qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de aceitação. A documentação relativa à produção e controlo de cada lote é arquivada pela nossa empresa..

(2) ÍNDICE 1 - OBJECTIVO DA QUANTIFICAÇÃO 2 - PRINCÍPIO DO TESTE 3 - COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO 4 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO 5 - INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA 6 - PRECAUÇÕES 7 - AMOSTRAS 8 - RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES - VALIDADE - CONSERVAÇÃO 9 - MODO DE FUNCIONAMENTO 10 - ADAPTAÇÃO 11 - CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 12 - VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO 13 - DESEMPENHOS DO TESTE 14 - LIMITES DO TESTE 15 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 34.

(3) 1- OBJECTIVO DA QUANTIFICAÇÃO Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2 é uma técnica imunoenzimática de tipo indirecto que permite a despistagem dos anticorpos associados a uma infecção pelo vírus da hepatite C no soro ou plasma humano.. 2 - PRINCÍPIO DO TESTE Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2 assenta na utilização de uma fase sólida preparada com antigénios purificados : três proteínas recombinantes produzidas por E.coli a partir de clones seleccionados na região não estrutural (NS3 e NS4) e na região estrutural do genoma do vírus da Hepatite C, e de uma fase líquida (conjugado), constituída por anticorpos de cabra anti-IgG humanos purificados por cromatografia de afinidade e ligados à peroxidase. A preparação do teste compreende as fases de reacção seguintes : 1) As amostras a estudar, bem como os soros de controlo, são distribuídos pelos poços. Se houver anticorpos anti-HCV, estes ligam-se aos antigénios fixados na fase sólida. 2) Os anticorpos anti-IgG humanos marcados com peroxidase são adicionados após lavagem. Estes, por sua vez, fixam-se aos anticorpos específicos retidos na fase sólida. 3) Após eliminação do conjugado enzimático não ligado, o complexo antigénio/anticorpos é revelado por adição do substracto. 4) Após paragem da reacção, efectua-se a leitura por espectrofotómetro a 450/620-700 nm. A absorvência medida para uma amostra permite concluir quanto à presença ou ausência de anticorpos anti-HCV. A intensidade da coloração é proporcional à quantidade de anticorpos anti-HCV ligados à fase sólida.. 3 - COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO ETIQUETAGEM. NATUREZA DOS REAGENTES. R1. MICROPLACA : 12 tiras de 8 poços sensibilizados com 2 antigénios recombinantes purificados específicos da hepatite C.. R2. APRESENTAÇÃO 1 placa 5 placas 1. 5. SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA (20x) : Tampão Tris NaCl pH 7,4 Conservante : ProClin™ 300 (0,04%). 1 frasco 70 ml. 1 frasco 235 ml. R3. SORO DE CONTROLO NEGATIVO : Soro humano negativo em Ag HBs, em anticorpos anti-HIV1 e anti-HIV2 e em anticorpos anti-HCV Conservante : Azida de sódio (< 0,1%). 1 frasco 1 ml. 1 frasco 3 ml. R4. SORO DE CONTROLO POSITIVO : Soro humano contendo anticorpos anti-HCV e negativo para o antigénio HBs e para os anticorpos anti-HIV1 e anti-HIV2, inactivado fotoquimicamente Conservante : Azida de sódio (< 0,1%). 1 frasco 1 ml. 1 frasco 3 ml. R6. DILUENTE PARA AMOSTRA : Solução de leite desnatado: tampão PBS adicionado do corante de controlo do depósito da amostra Conservante : Azida de sódio (< 0,1%) e Thimerosal (0,01%). 1 frasco 15 ml. 2 frascos 2 x 40 ml. R7. CONJUGADO : Anticorpos de cabra anti-IgG humanos marcados com peroxidase Conservante : Thimerosal (0,01%). 1 frasco 15 ml. 2 frascos 2 x 40 ml. R8. TAMPÃO SUBSTRACTO DA PEROXIDASE : Solução de ácido cítrico e de acetato de sódio pH 4,0 contendo 0,015% de H2O2 e 4% de dimetilsulfoxido (DMSO). 1 frasco 60 ml. 2 frascos 2 x 60 ml. R9. CROMOGÉNIO : Solução contendo tetrametil benzidina (TMB). 1 frasco 5 ml. 2 frascos 2 x 5 ml. R10. SOLUÇÃO DE PARAGEM : Solução de ácido sulfúrico 1 N. 1 frasco 28 ml. 3 frascos 3 x 28 ml. 35.

(4) 4 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO • • • • • • •. Água destilada ou completamente desmineralizada. Lixívia e bicarbonato de sódio. Papel absorvente. Luvas descartáveis. Óculos de protecção. Tubos descartáveis. Pipetas automáticas ou semi-automáticas reguláveis ou fixas, com 20 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl e 1 ml de capacidade de distribuição. • Provetas graduadas de 10 ml, 200 ml et 1000 ml. • Agitador tipo vórtex. • Sistema de lavagem automático*, semi-automático* ou manual para microplaca. • Banho-maria ou incubadora a seco*, com possibilidade de regulação por termostato a 37°C ± 1°C ou 40°C ± 1°C. • Contentor de resíduos contaminados. • Aparelho de leitura* para microplacas (equipado com filtros 450/620-700 nm). (*) Para informações mais específicas acerca dos aparelhos aprovados é favor consultar os nossos serviços técnicos.. 5 - INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA Todos os reagentes do dispositivo são destinados a utilização para diagnóstico “in vitro”. • Usar luvas descartáveis para manipulação dos reagentes e das amostras e lavar cuidadosamente as mãos após a sua manipulação. • Não “pipetar com a boca”. • O controlo positivo foi inactivado fotoquimicamente. • O material de origem humana utilizado na preparação do controlo negativo (R3) foi testado e comprovado como não-reactivo para o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (Ag HBs), antigénios dirigidos contra o vírus da hepatite C (anti-HCV) e anticorpos dirigidos contra os vírus de imunodeficiência humana (anti-HIV1 e anti-HIV-2). • O material de origem humana utilizado na preparação do controlo positivo (R4) foi testado e comprovado como não-reactivo para o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (Ag HBs), e em anticorpos dirigidos contra os vírus de imunodeficiência humana (anti-HIV-1 e anti-HIV-2). Uma vez que nenhum método de teste conhecido pode oferecer garantia absoluta de ausência de agentes infecciosos, todos os reagentes, assim como todas as amostras de doentes, deverão ser considerados como potencialmente infecciosos e manipulados com as precauções de utilização em vigor. • Nenhum método pode garantir, de forma absoluta, a ausência dos vírus HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Considerar os reagentes de origem humana, bem como as amostras de doentes, como potencialmente infecciosas e manipulá-los com as precauções de utilização habituais. • Considerar o material directamente em contacto com as amostras e os reagentes de origem humana, assim como as soluções de lavagem, como produtos contaminados. • Evitar o derramamento de amostras ou de soluções que as contenham. • As superfícies contaminadas deverão ser limpas com lixívia diluída a 10%. Se o líquido contaminante for um ácido, as superfícies contaminadas deverão ser previamente neutralizadas com bicarbonato de sódio e, em seguida, lavadas com lixívia e limpas com papel absorvente. O material utilizado para esta limpeza deverá ser deitado fora, num contentor especialmente destinado a resíduos contaminados. • As amostras, os reagentes de origem humana, bem como o material e os produtos contaminados, deverão ser eliminados após descontaminação - por imersão em lixívia à concentração final de 5% de hipocloreto de sódio, durante 30 minutos, - ou por esterilização em autoclave à temperatura de 121°C, durante um mínimo de 2 horas. ATENÇÃO : não introduzir na autoclave soluções contendo hipocloreto de sódio. • Evitar qualquer contacto do tampão substracto, do cromogénio e da solução de paragem com a pele e mucosas. As fichas de dados de segurança estão disponíveis a pedido. • Não esquecer neutralizar e/ou esterilizar as soluções ou efluentes de lavagem ou qualquer líquido contendo amostras biológicas antes de as eliminar pelo esgoto. • Certos reagentes contêm azida de sódio. Este composto pode formar, com as canalizações de chumbo ou de cobre, azotetos altamente explosivos. • A fim de evitar a acumulação de tais azotetos nas canalizações, ao eliminar estes reagentes numa pia de esgoto, neutralizá-las e lavar a pia com bastante água. • Alguns reactivos contêm ProClin™ 300 (0.04%, 0.1% e/ou 0,5%).. 36.

(5) Xi Irritante R43 : Pode causar sensibilização em contacto com a pele S28-37 : Após contacto com a pele, lavar imediatamente com bastante água e sabão. Usar luvas adequadas.. 6 - PRECAUÇÕES A qualidade dos resultados depende do cumprimento das seguintes boas práticas de laboratório : • O nome do teste, bem como um número de identificação específico do teste, estão referidos no quadro de cada microplaca. Este número de identificação específico figura igualmente em cada tira.. Monolisa™ Anti-HCV PLUS V2 : Número específico de identificação = 42 Esta identificação deve ser verificada antes de cada utilização. Qualquer tira cujo número de teste não esteja presente ou seja diferente do acima referido não deverá ser utilizada. • Não utilizar reagentes após o termo do prazo de validade. • Não misturar reagentes de lotes diferentes no decorrer de um mesmo ensaio.. NOTA : É possível utilizar outros lotes de solução de lavagem (R2, identificação do rótulo: cor verde 20X), de tampão substracto (R8, identificado como TMB buf. a azul), de cromogénio (R9, identificado como TMB 11X. a roxo) e de solução de paragem (R10, identificado como 1N a vermelho), para além dos fornecidos no dispositivo, desde que se utilize apenas um único destes lotes no decorrer de um mesmo ensaio. Estes reagentes podem ser utilizados com outros produtos da nossa empresa. Para além disso, a solução de lavagem (R2, identificação do rótulo: cor verde 20X) pode ser misturada com as outras 2 soluções de lavagem incluídas nos kits de reagentes Bio-Rad (R2, identificações dos rótulo: cor azul 10X ou cor laranja 10X) quando adequadamente reconstituídas, desde que apenas uma mistura seja utilizada num determinado ensaio. Para obter informações detalhadas é favor consultar os nossos serviços técnicos. • Antes da utilização, aguardar 30 minutos para que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente. • Reconstituir cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação. • Não efectuar o teste em presença de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldeídos) ou de poeiras que possam alterar a actividade enzimática do conjugado. • Utilizar recipientes em vidro perfeitamente lavados e enxaguados com água destilada ou, de preferência, material descartável. • Não deixar a microplaca secar entre o final da lavagem e a distribuição dos reagentes. • A reacção enzimática é muito sensível a todos os metais ou iões metálicos. Por isso, nenhum elemento metálico deverá entrar em contacto com as diferentes soluções que contenham o conjugado ou a solução substracto. • A solução de revelação (tampão substracto + cromogénio) deve ser de cor rosa. O aparecimento de. qualquer outra coloração nos minutos que se seguem à reconstituição indica que o reagente não pode ser utilizado e deve ser substituído. Para esta preparação utilizar, de preferência, recipientes e material de distribuição em plástico descartável ou recipientes em vidro previamente lavados com ácido clorídrico 1N, enxaguados com água destilada e devidamente limpos. Conservar esta solução ao abrigo da luz. • Utilizar um cone de distribuição novo para cada soro. • A lavagem dos poços é uma etapa essencial da manipulação : respeitar o número de ciclos de lavagem prescritos e garantir que todos os poços são completamente cheios e, depois, completamente esvaziados. Uma lavagem deficiente pode dar origem a resultados incorrectos. • Nunca utilizar a mesma pipeta para distribuir o conjugado e a solução de revelação.. 7 - AMOSTRAS Proceder à colheita de uma amostra de sangue segundo as práticas habitualmente utilizadas. Os testes são realizados em amostras não diluídas de soro ou de plasma (recolhidas com anti-coagulantes como EDTA, heparina, citrato, ACD, CPD e CPDA). As amostras que apresentem agregados devem ser clarificadas por centrifugação, antes do teste. As partículas ou agregados de fibrina em suspensão podem dar resultados falsamente positivos. As amostras deverão ser conservadas a +2-8°C se a detecção for efectuada no prazo de 7 dias, ou conservadas congeladas a -20°C. Evitar processos de congelação/descongelação repetidos. Se for necessário transportar as amostras, estas deverão ser embaladas segundo a regulamentação em vigor para transporte de agentes etiológicos e preferencialmente transportadas em estado de congelação. NÃO UTILIZAR SOROS CONTAMINADOS, HIPERLIPÉMICOS OU HIPERHEMOLIZADOS. NOTA : Não foi demonstrada qualquer interferência em amostras contendo até 90 g/l de albumina e 200 mg/l de bilirrubina, bem como em amostras lipémicas contendo até 36 g/l de trioleína e em amostras hemolizadas contendo até 1,25 g/l de hemoglobina.. 37.

(6) 8 - RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES – VALIDADE - CONSERVAÇÃO Antes de utilizar os reagentes do dispositivo Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2, deixar que estabilizem à temperatura ambiente, aguardando durante 30 minutos.. 1) Reagentes prontos a utilizar Microplaca Ag HCV (R1) Cada suporte quadro que contém 12 tiras está acondicionado numa bolsa de alumínio selada. Corte a bolsa com a ajuda de tesouras ou escalpelo de 0,5 a 1 cm acima da soldadura. Abra a bolsa e retire o quadro. Coloque as tiras não-utilizadas de volta na bolsa. Feche cuidadosamente a bolsa e guarde-a de novo a +2-8 °C.. Diluente para amostras pronto a utilizar (R6) Homogeneizar por inversão, antes de utilizar.. Conjugado pronto a utilizar (R7) Homogeneizar por inversão, antes de utilizar.. 2) Reagentes a reconstituir Solução de lavagem concentrada 20X (R2) Diluir 20 vezes a solução em água destilada. Obtém-se assim a solução de lavagem pronta a utilizar.Prever 800 ml para uma placa de 12 tiras.. Solução de revelação enzimática (R8 + R9) Diluir o reagente R9 no reagente R8 a 1/11 (exemplo: 1 ml de reagente R9 em 10 ml de reagente R8), sabendo que 10 ml são necessários e suficientes para tratar 12 tiras. Homogeneizar.. 3) Validade O dispositivo deve ser conservado a +2-8°C. Cada elemento do dispositivo conservado a +2-8°C pode ser utilizado até ao termo do prazo de validade indicado naembalagem (salvo indicação específica) R1 : Uma vez aberta a bolsa selada sob vácuo, as tiras de micro-poços conservadas a +2-8 °C na bolsa cuidadosamente selada de novo podem ser utilizadas durante 1 mês. R2 : A solução de lavagem diluída pode ser armazenada à temperatura ambiente (2-30°C) durante 2 semanas. A solução de lavagem concentrada (R2) pode ser armazenada à temperatura de +2-30°C. R8 + R9 : Após a reconstituição, o reagente armazenado em local escuro pode ser utilizado durante 6 horas à temperatura ambiente (18-30°C).. 9 - MODO DE FUNCIONAMENTO • Seguir estritamente o protocolo proposto. • Utilizar os soros de controlo negativo e positivo em cada preparação do teste, para validar a qualidade do teste. • Aplicar as boas práticas de laboratório Podem utilizar-se dois métodos de detecção de anticorpos anti-HCV :. Incubação das amostras. Procedimento 1. Procedimento 2. 37 ± 1°C. 40 ± 1°C. 60 ± 5 min banho-maria/incubadora a seco Incubação do conjugado. 37 ± 1°C. 40 ± 1°C. 30 ± 5 min banho-maria/incubadora a seco Revelação enzimática. temperatura ambiente (18 - 30°C) 30 ± 5 min (no escuro). 1) Estabelecer cuidadosamente o plano de distribuição e identificação das amostras. 2) Preparar a solução de lavagem diluída. 3) Retirar o tabuleiro de suporte e as tiras (R1) da embalagem de protecção. 4) Colocar directamente, sem pré-lavagem da placa, e de modo sucessivo : 4.1) 80 µl de diluente (R6) em cada poço NOTA : Após adição do diluente violeta, é possível verificar, por leituras espectrofotométricas a 620 nm, a presença do diluente nos poços (ver capítulo 12 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO). 4.2) 20 µl de soro de controlo negativo (R3) em A1, B1 20 µl de soro de controlo positivo (R4) em C1, D1, E1 20 µl da primeira amostra em F1, se este poço não estiver a ser utilizado como poço de controlo de diluente para validação de depósito das amostras 20 µl da segunda amostras em G1, etc.. 38.

(7) Em função do sistema utilizado é possível modificar a posição ou a ordem de distribuição dos controlos. Homogeneizando bem a mistura por um mínimo de 3 aspirações com uma pipeta de 20 µl. É igualmente possível depositar 100 µl de uma amostra previamente diluída a 1/5. Se a distribuição das amostras exceder 10 mn, recomenda-se então distribuir os controlos negativos e positivos após as amostras a testar. NOTA : Após adição da amostra, o diluente passa de violeta a azul. É possível verificar, por leitura espectrofotométrica a 620 nm, a presença das amostras nos poços (ver capítulo 12: VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO). 5) Cobrir com película autocolante, premindo bem sobre toda a superfície para assegurar a estanqueidade. 6) Incubar a microplaca em banho-maria aquecido ou numa incubadora a seco de microplacas, durante: • Procedimento 1 : 60 ± 5 minutos a 37°C ± 1°C. • Procedimento 2 : 60 ± 5 minutos a 40°C ± 1°C. 7) Retirar a película adesiva. Aspirar o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados (contendo hipocloreto de sódio) e adicionar, em cada um deles, um mínimo de 0,370 ml de solução de lavagem. Aspirar de novo. Repetir a lavagem 2 vezes (um mínimo de 3 lavagens). O volum residual deve ser inferior a 10 µl (se necessário, secar a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente). Se se dispuser de uma máquina de lavagem automática, respeitar o mesmo ciclo operatório. 8) Distribuir rapidamente 100 µl da solução de conjugado por todos os poços. O conjugado deve ser agitado antes de utilizar. Cobrir com uma película autocolante nova e incubar durante: • Procedimento 1 : 30 ± 5 minutos a 37°C ± 1°C. • Procedimento 2 : 30 ± 5 minutos a 40°C ± 1°C. NOTA : O conjugado é de coloração verde. É possível verificar, por leituras espectrofotométricas a 620 nm, a presença do conjugado nos poços (ver capítulo 12 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO). 9) Retirar a película adesiva, esvaziar todos os poços por aspiração e lavar 4 vezes, como anteriormente. (Se necessário, secar as tiras por inversão sobre uma folha de papel absorvente). 10) Preparar a solução de revelação (ver capítulo 8, reagente R8 + R9). 11) Distribuir rapidamente por todos os poços 100 µl da solução de revelação da actividade enzimática. (R8 + R9), anteriormente preparada. Deixar que a reacção se desenvolva no escuro durante 30 ± 5 minutos à temperatura ambiente (18 a 30°C). Nesta incubação não utilizar película adesiva. NOTA : A distribuição da solução de revelação, de cor rosa, pode ser controlada visualmente nesta fase da manipulação : observa-se uma diferença de coloração significativa entre um poço vazio e um poço contendo a solução de revelação rosa (consultar o parágrafo 12 para a verificação automática, VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DOS REAGENTES). 12) Adicionar 100 µl da solução de paragem (R10), adoptando a mesma sequência e o mesmo ritmo de distribuição que para a solução de revelação. Homogeneizar a mistura reaccional. NOTA : A distribuição da solução de paragem, que é incolor, pode ser controlada visualmente nesta fase da manipulação. A coloração do substracto, rosa (para as amostras negativas) ou azul (para as amostras positivas) desaparece dos poços, que assim se tornam incolores (para as amostras negativas), ou amarelos (para as amostras positivas), após adição da solução de paragem. 13) Secar cuidadosamente a superfície inferior das placas. Pelo menos 4 minutos após a distribuição. da solução de paragem e nos 30 minutos que se seguem à paragem da reacção, proceder à leitura da densidade óptica a 450/620-700 nm por meio de um leitor de placas. 14) Antes de transcrever os resultados, confirmar a concordância entre a leitura e o plano de distribuição e identificação das placas e das amostras.. 10 - ADAPTAÇÃO • LAVAGEM : É indispensável respeitar os procedimentos de lavagem, a fim de obter o maior rendimento do teste. Instrumento PW40/41 e LP 35 e outro instrumento Bio-Rad : Seguir o protocolo fornecido pela Bio-Rad.. 39.

(8) 11 - CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS A presença ou ausência de anticorpos anti-HCV é determinada comparando, para cada amostra, a absorvência registada com a do valor cut-off calculado.. 1. Calcular a média das absorvências medidas para o soro positivo (DO R4) Exemplo : Controlo positivo R4 Amostra Densidade óptica C1 1,636 D1 1,704 E1 1,650 Total 4.990 Densidade Óptica Total 4,990 DO R4 = ---------------------------- = ------- = 1,663 3 3. 2. Cálculo do valor cut-off (Vs) Moyenne DO R4 Vs = --------------------5 Exemplo : Média DO R4 = 1,663 1,663 Vs = --------- = 0,332 5. Os critérios de validação são os seguintes : a) Para o controlo negativo : cada valor individual de absorvência medido deve ser inferior a 0,150. b) Para o controlo positivo • a média das absorvências medidas deve ser superior ou igual a 1,000 e inferior ou igual a 2,400. • se um dos valores individuais do controlo positivo se desviar mais de 30% da média, repetir o cálculo com os dois valores de controlo positivo restantes. • O teste deve ser repetido se os controlos negativos e/ou se mais que um controlo positivo se situarem fora do intervalo dos valores acima indicados.. Interpretação dos resultados As amostras cuja densidade óptica é inferior ao valor cut-off são consideradas negativas, segundo o teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2. No entanto, os resultados situados imediatamente abaixo do valor de cut-off (CO - 10% < DO<CO) devem serinterpretados com prudência, sendo aconselhável testar de novo as amostras em duplicado, quando os sistemasutilizados e os procedimentos de laboratório o permitirem). As amostras cuja densidade óptica é superior ou igual ao cut-off são consideradas como inicialmente positivas e devem ser novamente testadas em duplicado, antes da interpretação final. Após repetição do ensaio, a amostra é considerada positiva segundo o teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2 se a segunda e/ou terceira medição for positiva, isto é, superior ou igual ao valor cut-off. A amostra é considerada negativa se estes dois valores forem inferiores ao cut-off.. 12 - VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO : (OPCIONAL) VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS NOTA : após adição da amostra, o diluente das amostras (R6) passa de violeta a azul. Método n°1 : não utilizando reagente de controlo A presença das amostras nos poços pode ser verificada por leitura espectrofotométrica a 620 nm, comparando, para cada poço, as densidades ópticas medidas após o depósito do diluente de amostras (R6) com as medidas após a distribuição das amostras.. a) Leitura após depósito do diluente • Os valores de DO dos poços que não contenham diluente de amostra (R6) devem ser superiores a 0,200. b) Leitura após depósito da amostra e/ou controlo • um poço contendo uma amostra a testar deve apresentar uma variação de DO superior a 0,200 (uma variação de DO entre as duas medições estritamente inferior a 0,200 indica uma má distribuição da amostra a testar) Variação DO = DO (Amostra + diluente) - DO diluente. 40.

(9) Método n°2 : utilizando um reagente de controlo A presença das amostras pode ser verificada por leitura espectrofotométrica a 620 nm, realizando uma única leitura das DO obtidas para cada poço, após a distribuição das amostras e comparando-as com a DO de um poço testemunho contendo apenas diluente de amostras (R6) : • o valor da DO do poço testemunho contendo apenas diluente de amostra (R6) deve ser superior a 0,200 • um poço contendo uma amostra a testar deve apresentar uma variação de DO superior a 0,200, em comparação com o poço testemunho (uma variação de DO estritamente inferior a 0,200 indica uma má distribuição da amostra a testar) Variação DO = DO poços (Amostra + diluente) - DO poços testemunho diluente. VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DO CONJUGADO NOTA : o conjugado (R7) é de coloração verde a presença de conjugado (R7) nos poços pode ser verificada por leitura espectrofotométrica a 620 nm : o valor de DO medida para cada poço deverá ser superior a 0,300 (um valor situado abaixo desta norma indica uma má distribuição do conjugado).. VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DA SOLUÇÃO DE REVELAÇÃO É possível verificar a presença da solução de revelação rosa por leitura automática a 490 nm : um poço contendo a solução de revelação deve apresentar uma densidade óptica superior a 0.100 (uma DO mais fraca indica uma distribuição incorrecta da solução de revelação). Observa-se uma diferença de coloração significativa entre um poço vazio e um poço contendo a solução de revelação rosa.. 13 - DESEMPENHOS DO TESTE As alterações introduzidas no dispositivo Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2 em relação ao dispositivo Monolisa™ Anti-HCV PLUS dizem unicamente respeito à solução de revelação (R8 + R9) e à solução de paragem (R10). Os resultados dos estudos de especificidade e de sensibilidade da Versão 2 permitem-nos confirmar os desempenhos anunciados, tais como os abaixo obtidos com o teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS. Os desempenhos do teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS foram determinados em amostras de dadores de sangue não seleccionados, amostras de doentes atingidos com infecções pelo vírus da hepatite C, bem como amostras de doentes revelando diversas patologias não relevantes do vírus da hepatite C. A sensibilidade do teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS foi avaliada em 523 amostras documentadas, das quais 191 amostras de doentes portadores crónicos do vírus da hepatite C e para os quais a infecção pelo vírus da hepatite C foi verificada pela presença de reactividades anticorpos anti-HCV em Imuno-Blot e/ou pela positividade na técnica PCR. No âmbito deste estudo, a sensibilidade do teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS era de 100%. A sensibilidade do teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS foi igualmente avaliada em amostras de seroconversões de 55 doentes. Comparadas com o dispositivo Monolisa™ Anti-HCV New antigénios, 6 seroconversões foram igualmente detectadas mais precocemente por Monolisa™ Anti-HCV PLUS. A especificidade do teste, avaliada em 5450 amostras de dadores de sangue não seleccionados, era de 99,8%. A análise de 264 amostras de doentes que apresentavam patologias sem relação com o vírus da hepatite C não evidenciou reacções não específicas significativas. Amostras com genótipo 1 a 5 foram testadas e resultaram positivas com o dispositivo Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 2. A precisão do teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS foi determinada pela análise de 4 amostras : 1 soro negativo (amostra 1), 2 soros fracamente positivos (amostra 2 e amostra 3) e 1 soro fortemente positivo (amostra 4) em anticorpos anti-HCV. A repetibilidade (intra-teste) da técnica foi avaliada por análise destas 4 amostras, que foram testadas 30 vezes durante uma mesma manipulação, a reprodutibilidade (inter-testes) foi avaliada pela análise destas mesmas 4 amostras, que foram testadas em triplicado em 5 dias diferentes, à razão de 2 testes independentes por dia. Os resultados estão sintetizados nos dois quadros seguintes :. Quadro 1 : Repetibilidade (intra-teste) n = 30. amostra 1. amostra 2. amostra 3. amostra 4. Média das DO. 0,056. 1,188. 1,170. 1,773. Média das razões (DO/cut-off). 0,13. 2,86. 2,75. 4,27. 13,39%. 6,54%. 7,27%. 4,69%. CV (%) razões. 41.

(10) Quadro 2 : Reprodutibilidade (inter-testes) n = 30. amostra 1. amostra 2. amostra 3. amostra 4. Média das DO. 0,085. 1,164. 1,200. 1,727. Média das razões (DO/cut-off). 0,22. 2,93. 3,02. 4,34. CV (%) razões. 12%. 6,51%. 4,04%. 5,50%. 14 - LIMITES DO TESTE Dada a diversidade de respostas imunológicas dos doentes infectados pelo vírus da hepatite C (nomeadamente nas seroconversões), podem ser observadas diferenças de detecção entre testes, em função da natureza das proteínas antigénicas utilizadas. Um resultado analítico negativo num teste de despistagem não exclui, portanto, a possibilidade de exposição ou de infecção pelo vírus da hepatite C.. O método colorimétrico de verificação do depósito das amostras e/ou dos conjugados e/ou da solução de revelação não permite verificar a exactidão dos volumes distribuídos, mas apenas demonstrar a presença de amostras e/ou de conjugados e/ou da solução de revelação. A taxa de respostas erróneas obtidas com este método está associada à precisão do sistema utilizado (CV acumulados de pipetagem e de leitura superiores a 10% podem degradar significativamente a qualidade desta verificação). No caso de uma lavagem incorrecta após a etapa de incubação do conjugado, a verificação automática da distribuição da solução de revelação (por leitura a 490 nm das densidades ópticas dos poços) pode dar origem a resultados erróneos, com densidades ópticas superiores a 0.100 na ausência de solução de revelação. No entanto, este fenómeno não foi observado durante as avaliações conduzidas nas 939 amostras testadas.. 15 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS • STEVENS C.E., AACH R.D., HOLLINGER F.B. et al MOSLEY J.W., SZMUNESS W., KAHN R., WERCH J., EDWARDS V. Hepatitis B virus antibody in blood donors and the occurence of Non A Non B hepatitis in transfusion recipients: an analysis of the transfusion transmitted virus study. Ann. Int. Med. 1984 ; 101 : 733-738. • ALTER H.J., PRINCE A.M. Transfusion associated Non A Non B hepatitis : An assessment of the causative agent and its clinical impact. Transfusion Med. Rev. 1988 ; 2 : 288-293. Post transfusion Non A Non B hepatitis : physiochemical proporties of two distinct agents. J. Infect Dis. 1983; 148 : 254 - 265. • CHOO K.L., WEINER A.J., OVERBY L.R., KUO G., HOUGHTON M., BRADLEY D. Hepatitis C virus : the major causative agent of viral Non A Non B hepatitis. In : viral Hepatitis. Editor : AJ. ZUCKERMAN. CHURCHILL LIVINSTONE British Medical Bulletin. 1990, vol. 46 : 423-441. • KUO G., CHOO Q.L., ALTER H.J., et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human Non A Non B hepatitis. Science 1989 ; 244 : 362-364. • TAKEUCHI K., KUBO Y., BOOMAR S., WATANABE Y., KATAYAMA T., CHOO Q.L., KUO G., HOUGHTON M., SAITO I., MIYAMURA T. Nucleotide sequence of core and enveloppe genes of the hepatitis C virus genome derived directly from humans healtly carriers. Nucleic acid research. 1990 ; vol.18, n°15 : 4626. • VAN DER POEL C.L., REESINK H.W., LELIE P.N., LEENTVARR-KUYPERS A., CHOO Q.J., KUO G., HOUGHTON M. Anti-Hepatitis C antibodies and Non A, Non B post transfusion hepatitis in the Netherlands. Lancet, 1989, 297-299. • CHOO Q.L., RICHMAN K.H., HAN J.H., BERGER K., LEE C., DONG C., GALLEGOS C., COIT D., MEDINA-SELBY A., BARR P.J., WEINER A.J., BRADLEY D.W., KUO G. and HOUGHTON M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991 ; vol. 88 : 24512455. • KATO N., MAKOTO M., OOTSUYAMA Y., NAKAGAWA M., SUGIMARA T., SHIMOTOHNO K.. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Dec. 1990, vol. 87: 9524-9528 • NASOFF M.S., ZEBEDEE S.L. , INCHAUSPE G., PRINCE A1.M. Identification of an immudominant epitope within the capsid protein of hepatis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, June 1991, vol. 88 : 5462-5466. • CHING W.M., WYCHOWSKY C., BEACH M.J., WANG M., DAVIES C.L., CARL M., BRADLEY D.W., ALTER M.S., FEINSTONE S.M., WAI-KUO SMIM J.. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural protein region of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1992, vol. 89 : 3190-3194.. 42.

(11) (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

(12) CE ( 98/79/CE in vitro

(13)

(14)

(15) ). (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. For in vitro diagnostic use Pour diagnostic in vitro Para diagnóstico in vitro Per uso diagnostico in vitro In-vitro-Diagnostikum Para uso em diagnóstico in vitro In vitro-diagnostik In vitro diagnose in vitro . CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия). IVD. Do stosowania in vitro in vitro diagnostikai Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra In vitro diagnostiliseks kasutamiseks Na diagnostiku in vitro Pro diagnostiku in vitro (NO) - Til in vitro-diagnostikk (RO) - Pentru diagnostic in vitro (BG) - За ин витро диагностика. (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Manufacturer Fabricant Fabricante Produttore Hersteller Fabricante Tillverkad av Fremstillet af

(16). (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Batch code Code du lot Código de lote Codice del lotto Chargen-Bezeichnung Código do lote Batchnr Batchkoden

(17)

(18). Producent Gamintojas Gyártó Tootja Výrobca Výrobce (NO) - Produsent (RO) - Producător (BG) - Производител. Numer serii Serijos numeris Gyártási szám Partii kood Číslo šarže Číslo šarže (NO) - Partikode (RO) - Număr de lot (BG) - Партиден номер. (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). - Catalogue number - Référence catalogue - Número de catálogo - Numero di catalogo - Bestellnummer - Número de catálogo - Katalognummer - Katalognummer -

(19) - Numer katalogu - Katalogo numeris - Cikkszám - Katalooginumber - Katalógové číslo - Katalogové číslo. (NO) - Katalognummer (RO) - Număr de catalog (BG) - Каталожен номер. (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Authorised Representative Représentant agréé Representante autorizado Distributore autorizzato Bevollmächtigter Representante Autorizado Auktoriserad representant Autoriseret repræsentant

(20)

(21). (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Expiry date YYYY/MM/DD Date de peremption AAAA/MM/JJ Estable hasta AAAA/MM/DD Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG Verwendbar bis JJJJ/MM/TT Data de expiração AAAA/MM/DD Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

(22) YYYY/MM/DD. Upoważniony Przedstawiciel Įgaliotasis atstovas Meghatalmazott Képviselő Volitatud esindaja Autorizovaný zástupca Zplnomocněný zástupce (NO) - Autorisert representant (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Упълномощен представител. Data ważności YYYY/MM/DD Galioja iki YYYY/MM/DD Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP Použiteľné do RRRR/MM/DD Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Срок на годност година/месец/ден.

(23) (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). - Storage temperature limitation - Limites de températures de stockage - Temperatura límite - Limiti di temperatura di conservazione - Lagertemperatur - Limites de temperatura de armazenamento - Temperaturbegränsning - Temperaturbegrænsning -

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(25)

(26) - Temperatura przechowywania - Saugojimo temperatūriniai apribojimai - Tárolási hőmérsékleti határok - Piirangud säilitustemperatuurile - Skladovacia teplota od do - Teplotní rozmezí od do. (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение. (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). - Consult Instruction for use - Consulter le mode d'emploi - Consulte las instrucciones de uso - Consultare le istruzioni per uso - Siehe Gebrauchsanweisung - Consulte o folheto informativo - Se bruksanvisningen - Se instruktion før brug -

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(29) - Sprawdź instrukcję - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje - Olvassa el a használati utasítást - Kasutamisel vaata instruktsiooni - Katalógové číslo - Viz návod k použití. (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба.

(30) Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tél.: +33 1 47 95 60 00 Fax.: +33 1 47 41 91 33. 01/2009 Code: 883566.

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