LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
RENATA CRISTINA GONTIJO ORIENTADORA: CINTIA DO COUTO MASCARENHAS
2010
Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE SEPT5
EM PACIENTES PORTADORES DE
LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
Aluna: Renata Cristina Gontijo
Orientadora: MSc. Cintia do Couto Mascarenhas
Brasília - DF
2010
RENATA CRISTINA GONTIJO
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE SEPT5 EM PACIENTES PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
Projeto de Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para a obtenção do Título em Bacharel.
Orientadora: MSc. Cintia do Couto Mascarenhas
BRASÍLIA 2010
Projeto de TCC II de autoria de Renata Cristina Gontijo, intitulado “AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE SEPT5 EM PACIENTES PORTADORES DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA”, apresentado, em 04 de novembro, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, no 2º semestre de 2010, aprovado pela banca examinadora abaixo assinada:
___________________________________________________________ Profª MSc. Cintia do Couto Mascarenhas
Orientadora
Doutoranda pela Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP – Pesquisadora Colaboradora da UCB
___________________________________________________________ Prof. Dr. Anderson Ferreira da Cunha
Examinador
Professor Adjunto - UFSCar
___________________________________________________________ Prof. Esp. Fábio de França Martins
Examinador
Curso de Biomedicina - UCB
BRASÍLIA 2010
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus amados pais e irmãs, sem os quais eu não chegaria aqui.
Agradeço aos meus amados pais, Ana e Geraldo, pelo amor e carinho incondicional e por serem meu alicerce na vida, meu exemplo.
Às minhas amadas irmãs, Dri e Paty, pelo amor e apoio nas etapas boas e difíceis dessa caminhada, aturando todos os estresses, e pelas horas de descontração juntas.
À Profª MSc. Cintia do Couto, pela orientação e oportunidade, por acreditar e confiar em mim, me ensinando a enxergar mais longe.
Ao Prof. Dr. Anderson Ferreira, pela oportunidade de conhecimento e atenção com a qual nos recebeu e ensinou prontamente.
Ao Prof. Esp. Fábio de França, por aceitar participar da banca.
Às minhas queridas amigas Lú, Bárbara, Kelen, Layanne e Lai, por estarem comigo sempre que precisei, mesmo a quilômetros de distância, por compartilharem momentos tão bons, pela palavra amiga e pelo incentivo quando foi necessário. Aos meus bons e velhos amigos, por dividirem histórias tão divertidas e pela ajuda, principalmente tecnológica de Renato e Samuel. À Raquel pela adorável companhia e ajuda neste trabalho.
A toda minha família e amigos, pelo carinho e por compreenderem a minha ausência por tantas vezes.
Ao pessoal da UFSCar pela atenção, auxílio e acolhida, dividindo conhecimentos e pelos bons papos durante as PCRs.
Referência: GONTIJO, Renata Cristina. Título: Avaliação da expressão do gene SEPT5 em pacientes portadores de Leucemia Mielóide Crônica. 2010. 63 folhas. Trabalho de Conclusão de Curso (Biomedicina) – Universidade Católica de Brasília, Águas Claras, 2010.
A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa, que pode ser dividida em três fases clínicas, sendo a fase crônica a inicial, seguida da fase acelerada, culminando na crise blástica. A LMC tem como principal característica a presença do cromossomo Philadelphia (Ph) positivo, que é produto da translocação recíproca entre os cromosssomos 9 e 22. Esta translocação gera o oncogene BCR/ABL, responsável pela produção de proteínas com elevada atividade tirosina quinase, sendo a p210 a mais encontrada. Estas proteínas têm a capacidade de auto-ativação, interferindo na transdução de sinais de processos celulares básicos como a proliferação, aderência e apoptose. Com a progressão da doença, é possível encontrar alterações genéticas adicionais ao cromossomo Ph, como novas translocações. O gene SEPT5 é um membro da família das septinas, originalmente descritas em leveduras como proteínas reguladoras do ciclo de divisão celular. O rompimento da função das septinas altera a citocinese e resulta em aumento de células multinucleadas ou poliplóides. Neste trabalho foi proposta a avaliação da expressão do gene SEPT5 utilizando a técnica de Real-Time-PCR em granulócitos de sangue periférico de pacientes e indivíduos controles e o sequenciamento deste gene para a avaliação de possíveis mutações. A elucidação da relação deste gene com a LMC pode auxiliar na compreensão de sua ação e das conseqüências do aumento de sua expressão em pacientes portadores de LMC e sua correlação com a doença.
Referência: GONTIJO, Renata Cristina. Título: SEPT5 gene expression assessment in patients with chronic myeloid leukemia. 2010. 63 folhas. Trabalho de Conclusão de Curso (Biomedicina) – Universidade Católica de Brasília, Águas Claras, 2010.
Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease, divided into three clinical phases, being the chronic phase the initial, lasting years, followed by accelerated phase, and culminating in blast crisis. The CML's main characteristic is the presence of positive Philadelphia chromosome (Ph), the product of reciprocal translocation between cromossomes 9 and 22. This translocation generates the oncogene BCR/ABL, that is responsible for the production of proteins with high tyrosine kinase activity, being p210 the most prevalent one. These proteins have the ability to self-activation, interfering in the signal transduction of basic cellular processes such as proliferation, adhesion and apoptosis. With the progression of the disease, it is possible to find additional genetic alterations to the Ph chromosome, as new translocations. The gene SEPT5 is a member of the septin family, originally described in yeast as proteins that regulate the cell division cycle. The disruption of the function of septins alters cytokinesis, resulting in an increase of multinucleated or polyploid cells. In this study was proposed the evaluation of the expression from SEPT5 gene through the technique of Real-Time-PCR in peripheral blood granulocytes of patients and control subjects, and the sequencing of this gene for the evaluation of possible mutations. The elucidation of the relationship of this gene with the CML may help to understand its actions and the consequences of its increased expression in CML patients and its correlation with the disease.
Figura 1: Eventos moleculares que conduzem à expressão do fenótipo da LMC (Frazer, Irvine et al., 2007). ... 14 Figura 2: As três variantes geradas pelo BCR/ABL (A). Localização dos pontos de quebra nos genes ABL
e BCR (B) e a estrutura quimérica dos transcritos de mRNA do gene BCR/ABL derivado dos vários pontos de quebra (Inokuchi, 2006). ... 15 Figura 3: Ilustração simplificada do envolvimento BCR/ABL e Src quinases em vias de sinalização
oncogênicas. ABL = Abelson Tyrosine Kinase; BCR = Breakpoint Cluster Region; FAK = Quinase de Adesão Focal; Grb-2 = Receptor destinado ao fator de crescimento de proteína 2; HcK = quinase de células hematopoiéticas; JNK = Jun amino-terminal quinase; P = grupo fosfato; PI3K = fosfatidilinositol-3-quinase; SFK = Família Src quinase; Stat5 = sinal de transdução e ativador da transcrição 5. (Kantarijan, Talpaz et al., 2006). ... 17 Figura 4: Comparação da ação do BCR/ABL e do Imatinibe na patogênese da LMC. O Imatinibe age
mimetizando a ação do ATP, ligando-se ao domínio SH1 do BCR/ABL, evitando a fosforilação da proteína, interrompendo a cascata de sinalização que levam ao desenvolvimento da LMC (Frazer, Irvine et al., 2007). ... 24 Figura 5: Alvos da terapia da LMC: algumas terapias tem como alvo a indução ou liberação para os sinais
de apoptose ou mesmo desestabilização da proteína BCR/ABL, além de inibirem a ativação de vias relacionadas à patogenia da LMC (Frazer, Irvine et al., 2007)... 26 Figura 6: Amostra de RNA extraída pelo protocolo de Trizol. As amostras foram visualizadas em gel de
agarose a 1,2%. 01- Controle, 02- Paciente. ... 31 Figura 7: Gel de agarose a 1,5%, com amplificação do gene da beta actina. Na coluna M, marcador de
peso molecular 100 pb; nas colunas 1-7 amostras de cDNA de granulócitos de indivíduos normais e pacientes com leucemia mielóide crônica. ... 33 Figura 8: Verificação da amplificação do gene SEPT5 em linhagem celular K562, em gel de agarose a 1%.
PM – marcador de peso molecular de 100pb. ... 34 Figura 9: Análise da eficiência de amplificação do primer SEPT5, mostrando uma eficiência de 100%. .. 37 Figura 10: Parte do fragmento sequenciado do gene SEPT5 em linhagem celular K562. ... 41 Figura 11: Principais vias de sinalização oncogênicas para a ativação do SEPT5. Podemos observar uma
relação direta com vias ativadas pelo oncogene BCR/ABL derivado da t(9;22), além de vias independentes a este. Observamos também a ativação de vias correlacionadas com a ativação do SEPT5, como as iniciadas a partir da ativação de RhoA e Ras que culminam de alguma forma na ativação do SEPT5, além de atividades relacionadas à progressão da doença. ... 43 Figura 12: Ilustração das prováveis vias de ativação do gene SEPT5. A ativação de RhoA parece estar
diretamente relacionada à ativação das septinas e consequentemente do SEPT5. Pode-se observar também, que o SEPT5 pode ser ativado por vias independentes da ativação das septinas, como a via ativada por ERK 1/2. ... 46
Tabela 1: Definição de resposta hematológica, citogenética e molecular de acordo Leukemia Net segundo Baccarani et al, 2009. ... 27 Tabela 2: Monitoramento da resposta hematológica, citogenética e molecular do paciente em tratamento
Gráfico 1: Validação da expressão do gene SEPT5 nas amostras de pacientes e controles utilizados para a construção da biblioteca. Foram utilizadas duas amostras de pacientes e duas amostras de controles para a composição dos pools de pacientes e controle. ... 40 Gráfico 2: Análise da expressão do gene SEPT5 em 11 pacientes e 05 indivíduos controle, mostrando a
1 INTRODUÇÃO ... 12
1.1 CONCEITO E HISTÓRICO ... 12
1.2 EPIDEMIOLOGIA ... 13
1.3 GENÉTICA ... 13
1.4 FASES CLÍNICAS E ACHADOS LABORATORIAIS ... 18
1.4.1 Fase Crônica ... 19
1.4.2 Fase Acelerada ... 19
1.4.3 Crise Blástica ... 20
1.5 DIAGNÓSTICO ... 22
1.6 TERAPÊUTICA ... 22
1.7 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À TERAPIA ... 26
2 JUSTIFICATIVA ... 28
3 OBJETIVOS ... 28
3.1 OBJETIVO GERAL ... 28
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 28
4 PACIENTES E MÉTODOS ... 29
4.1 PACIENTES E ASPECTOS ÉTICOS ... 29
4.1.1 Pacientes ... 29
4.2 MÉTODOS ... 29
4.2.1 Separação de granulócitos ... 30
4.2.2 Extração de RNA ... 30
4.2.3 Tratamento com DNAse e Síntese de DNA complementar (cDNA) ... 31
4.2.4 Verificação da síntese de DNA complementar ... 32
4.2.5 Amplificação do cDNA ... 33
4.2.6 Clonagem ... 34
4.2.7 Sequenciamento ... 35
4.2.8 Padronizações necessárias para PCR Quantitativo em Tempo Real ... 36
4.2.8.1 Desenho de primers ... 36
4.2.8.2 Padronização de primer ... 36
5 RESULTADOS ... 40
6 DISCUSSÃO ... 42
7 CONCLUSÃO ... 48
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 49
9 ANEXOS ... 52
9.1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ... 52
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONCEITO E HISTÓRICO
A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa na qual ocorre uma expansão clonal da célula progenitora hematopoiética, desenvolvendo um quadro de hiperplasia mielóide, leucocitose, neutrofilia, basofilia e esplenomegalia. A principal característica é a presença do cromossomo Philadelphia (Ph) positivo em aproximadamente 95% dos pacientes (Brauer, Werth et al., 2007; Polampalli, Choughule et al., 2008).
Em 1845, o patologista John Hughes Bennett publicou um caso, no Edinburgh Medical Journal, em que o paciente apresentou aumento de baço e fígado, com morte associada a uma infecção. Algumas semanas depois, Rudolf Virchow mostrou um caso semelhante, mas acreditava que a causa era uma desordem neoplásica, que posteriormente ele chamou de doença dos glóbulos brancosou leucemia (Deininger, 2008; Druker, 2008).
Em 1960 foi descoberto o cromossomo Philadelphia por Peter Nowel e David Hungerford, que notaram uma anormalidade no pequeno grupo G do cromossomo (Deininger, 2008; Druker, 2008; Jamieson, 2008). Janet Rowley foi quem reconheceu, em 1973, que o cromossomo Ph era produto de uma translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22, nas regiões do braço longo (q34;q11.2), respectivamente (Polampalli, Choughule et al., 2008; Valencia, Cervera et al., 2009).
Em 1984, identificou-se que o cromossomo Ph consistia na transposição da sequência 3’ do proto-oncogene ABL (Abelson murine leukemia viral) no cromossomo 9, com a região 5’ do gene BCR (Breakpoint Cluster Region) no cromossomo 22, gerando o oncogene BCR/ABL por fusão, que produz proteínas com elevada atividade tirosina quinase, que estão intimamente relacionadas à patogenia da LMC (Frazer, Irvine et al., 2007; Koretzky, 2007; Druker, 2008).
A expansão clonal da LMC ocorre tanto na linhagem mielóide, quanto na linfóide, podendo envolver outras linhagens como a eritróide, megacariocítica, monocítica, linfóide-B e algumas vezes a linfóide-T, predominando a expansão dos granulócitos na medula óssea (Frazer, Irvine et al., 2007).
1.2 EPIDEMIOLOGIA
A LMC corresponde de 15 a 20% das leucemias que atingem os adultos (Nonino, 2008; Sessions, 2007). A incidência é de aproximadamente 1 a 2 casos a cada 100.000 habitantes por ano (Frazer, Irvine et al., 2007). No Brasil, a incidência de leucemias agudas e crônicas, mostra diferenças de acordo com as regiões. As variações entre as regiões podem ser explicadas pela sub-notificação da doença e pelo diagnóstico incorreto dado aos pacientes, ou mesmo pelo fato da LMC ser mais comum na raça caucasiana (Nonino, 2008).
A incidência da LMC em crianças até 10 anos é de 1 caso a cada 1 milhão (Hamerschlak, 2008). Apesar das evidências, não há comprovação de relação da LMC com fatores hereditários e/ou geográficos, além disso, a doença não pode ser prevenida (Quintas-Cardama e Cortes, 2006).
A idade média em que a doença se apresenta varia entre 45 a 55 anos, com uma proporção de 2:1 entre os sexos masculino e feminino, respectivamente (Frazer, Irvine et al., 2007). O único fator ambiental de risco conhecido para o desenvolvimento da LMC é a radiação ionizante, como foi demonstrado em estudos com sobreviventes da bomba atômica no Japão (Kantarjian, Melo et al., 2000; Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Hamerschlak, 2008).
Atualmente, o número de pacientes diagnosticados com LMC e que chegam a óbito pela doença, diminuiu significativamente devido aos avanços no tratamento com inibidores de tirosina quinase e com os transplantes de medula óssea.
1.3 GENÉTICA
O principal evento desencadeador da LMC é a translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22 t(9;22) (q34;q11.2) em uma célula progenitora hematopoiética, criando o oncogene BCR/ABL (Kantarjian, Melo et al., 2000; Valencia, Cervera et al., 2009). Assim, a proteína gerada tem alta atividade tirosina quinase, sendo capaz de induzir uma doença maligna, ativando múltiplos sinais citoplasmáticos e nucleares nas vias de transdução que influenciam no crescimento e sobrevivência das células hematopoiéticas (Kantarjian, Talpaz et al., 2006; Sessions, 2007).
O gene híbrido BCR/ABL é derivado da quebra do BCR na localização denominada maior (M-bcr), podendo ocorrer em duas outras localizações, m-BCR e µ-BCR, sendo que a
transcrição deste gene gera moléculas de mRNA quimérico. Assim, as fusões das sequências do BCR e ABL são representadas por junções dos exons, principalmente b3a2 e/ou b2a2, que codifica a proteína p210, capaz de regular a atividade tirosina quinase, sendo responsável pela apresentação clínica da doença (Figura 1) (Carvalho, et al., 2003; Kantarjian, Melo et al., 2000; Melo, Hughes et al., 2003; Ohsaka, Shiina et al., 2002). A proteína p210 é capaz de se auto-ativar quando há a indução maligna, interferindo na transdução de sinais de processos celulares básicos como a proliferação, aderência e apoptose (Kantarjian, Melo et al., 2000).
Figura 1: Eventos moleculares que conduzem à expressão do fenótipo da LMC (Frazer, Irvine et al., 2007).
Em alguns casos, a LMC também pode ser resultante da quebra na região menor do gene BCR (m-bcr), levando a expressão de um transcrito que codifica a proteína p190, que em alguns casos de LMC pode ser predominante ou co-expressar em baixos níveis com a p210 (Kantarjian, Melo et al., 2000; Melo, Hughes et al., 2003). Outra quebra pode ocorrer na micro região (µ-bcr), e a fusão originada leva a expressão de um largo transcrito (e19a2), codificando a proteína 230-kDa (p230) (Figura 2), sendo que nestes casos, a doença é caracterizada por uma leve desordem mieloproliferativa e geralmente relacionada a leucemia neutrofílica crônica com cromossomo Ph+ (Kantarjian, Melo et al., 2000; Ohsaka, Shiina et al., 2002; Melo, Hughes et al., 2003).
Assim, a atividade tirosina quinase desregula as funções normais da enzima Abl, alterando sua interação com proteínas efetoras. Isso resulta na proliferação celular desregulada, diminuição da aderência de células leucêmicas ao estroma da medula óssea que são liberadas na circulação, redução da resposta apoptótica ao estímulo mutagênico, produção de anormalidades no citoesqueleto e aumento do crescimento de citocinas independentes (Melo, Hughes et al., 2003; Inokuchi, 2006; Druker, 2008). Além disso, a instabilidade genética pode resultar na progressão da doença (Druker, 2008).
Figura 2: As três variantes geradas pelo BCR/ABL (A). Localização dos pontos de quebra nos genes ABL e BCR (B) e a estrutura quimérica dos transcritos de mRNA do gene BCR/ABL derivado dos vários pontos de quebra (Inokuchi, 2006).
A proteína BCR/ABL gerada ativa cascatas de sinalização que induzem à modificação de vias, sendo algumas dessas vias de sinalização: Myc, Ras, c-Raf, MAPK/ERK, SAPK/JNK, Stat, NFKB, PI-3 cinase e c-Jun. Várias proteínas sinalizadoras interagem com BCR/ABL através dos diferentes domínios funcionais e se fosforilam nas células que expressam BCR/ABL (Inokuchi, 2006).
As principais vias de sinalização ativadas pela proteína BCR/ABL, como RAS/MAPK, PI-1 cinase, vias c-CBL, vias CRKL, JAK-STAT e a via Src, têm um papel importante na transformação e proliferação celular. A inibição da apoptose parece estar relacionada a ativação da PI-3 cinase e vias RAS, com a indução através da AKT do Myc e BCL-2 (Inokuchi, 2006).
O oncogene BCR/ABL anula a dependência celular de fatores de crescimento externos pelo aumento da produção de interleucina-3 e altera as propriedades de adesão celular pela modulação da expressão e ativação de quinases de adesão e proteínas associadas (Kantarjian, Talpaz et al., 2006).
As proteínas quinases são enzimas capazes de coordenar processos celulares como o crescimento e diferenciação. A porção do gene ABL responsável pela regulação do domínio é perdida durante a translocação. A fusão da sequência do BCR ativa a tirosina quinase do domínio SH1, sendo este domínio crucial na transformação oncogênica (Frazer, Irvine et al., 2007).
Supõe-se que a proteção contra a morte programada das células é mediada em parte pelo aumento da expressão da STAT-5 e consequentemente da molécula anti-apoptótica BCLXL e a fosforilação e inativação da molécula pro-apoptótica BAD pela AKT (Druker, 2008). As células da LMC apresentam baixa adesão à fibronectina, possivelmente por efeito da fosforilação da CRKL (Figura 3) (Druker, 2008).
Figura 3: Ilustração simplificada do envolvimento BCR/ABL e Src quinases em vias de sinalização oncogênicas. ABL = Abelson Tyrosine Kinase; BCR = Breakpoint Cluster Region; FAK = Quinase de Adesão Focal; Grb-2 = Receptor destinado ao fator de crescimento de proteína 2; HcK = quinase de células hematopoiéticas; JNK = Jun amino-terminal quinase; P = grupo fosfato; PI3K = fosfatidilinositol-3-quinase; SFK = Família Src quinase; Stat5 = sinal de transdução e ativador da transcrição 5. (Kantarijan, Talpaz et al., 2006).
Pesquisas mostram o envolvimento de vias independentes do BCR/ABL relacionadas ao desenvolvimento e progressão da doença, apontando particularmente para a família de quinases Src. Ao que parece, a família Src quinases é capaz de promover alguns aspectos de progressão tumoral e metástase. As vias Lyn e outras Src quinases auxiliam na sobrevida da célula e são cruciais no desenvolvimento das leucemias BCR/ABL dependentes. A família das Src quinases pode ter um papel importante na fase final da doença, funcionando em vias independentes ao BCR-ABL, sendo assim alvo de estudos sobre a resistência ao tratamento e desenvolvimento de novas terapêuticas (Kantarjian, Talpaz et al., 2006).
No estudo realizado pela Profa. Msc Cintia do Couto Mascarenhas, enquanto aluna de mestrado da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, a partir da utilização da técnica chamada Subtractive Supression Hybridization (Diatchenko, Lau et al., 1996), fez a comparação entre os genes diferencialmente expressos em pool de granulócitos de indivíduos controle e pool de granulócitos de indivíduos com LMC. Foram evidenciados genes que estão expressos apenas em granulócitos de indivíduos com LMC e podem estar relacionados à progressão da doença nesses indivíduos e outros genes que estão
expressos apenas nos indivíduos controle. Dentre os genes que estão expressos apenas nos indivíduos com LMC está o SEPT5, da família das septinas, que foram inicialmente descritas em Saccharomyces cerevisiae com uma triagem para mutações do ciclo celular (Asada, Takahashi et al., 2010).
Os membros da família das septinas já foram identificados em vários eucariotos, e em seres humanos já foram descobertos 14 genes da família das septinas. Nos mamíferos, foi proposta a participação das septinas em atividades como a dinâmica da membrana, transporte de vesículas, apoptose, infecção e remodelamento do citoesqueleto (Asada, Takahashi et al., 2010).
O gene SEPT5 também é expresso em megacariócitos e pode estar envolvido na secreção de plaquetas. Assim, o SEPT5 parece ser um componente regulatório na exocitose, mas o seu papel ainda não está bem elucidado (Asada, Takahashi et al., 2010). Foram encontradas alterações na expressão das septinas em diversos tecidos doentes, inclusive tecidos tumorais, o que demonstra que a análise funcional das septinas pode ser importante para a compreensão de estados patológicos proliferativos, como no caso da LMC (Hall, Jung et al., 2005).
1.4 FASES CLÍNICAS E ACHADOS LABORATORIAIS
O curso clínico da LMC pode ser dividido em três fases: crônica, que pode durar anos, seguida pela fase acelerada e culminando na crise blástica, sendo as duas últimas fases mais curtas e graves (Frazer, Irvine et al., 2007; Sessions, 2007). As manifestações clínicas dependem da fase e da evolução, assim como o prognóstico.
Os scores de Sokal e Hasford são usados para a classificação do prognóstico. O score de Sokal é um dos mais utilizados, e pode estratificar os pacientes em grupos de risco baixo, risco intermediário e risco alto. Estas classificações levam em conta a idade, grau de esplenomegalia, contagem de plaquetas e blastos, ajudando assim na escolha da melhor terapêutica (Bonifazi, De Vivo et al., 2001; Hughes, 2006).
1.4.1 Fase Crônica
A fase crônica tem duração média de três a cinco anos e os sintomas e sinais comuns desta fase incluem fadiga, perda de peso, aumento do volume abdominal relacionado à esplenomegalia, febrícula, púrpura, palidez e discretas hemorragias (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Frazer, Irvine et al., 2007; Sessions, 2007).
Em 80% dos casos, a esplenomegalia está presente, e dependendo do volume, pode causar desconforto abdominal e comprimir vísceras, desencadeando distúrbios digestivos. Pode ocorrer ainda discreta a moderada hepatomegalia (Pasquini, 2001).
Em muitos casos, a LMC é descoberta durante exames de rotina, ou com o paciente em fase assintomática, já que o sistema imune ainda é competente (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Frazer, Irvine et al., 2007). Aproximadamente 85% a 90% dos pacientes são diagnosticados na fase crônica (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Frazer, Irvine et al., 2007; Radich, 2007; Sessions, 2007). Os achados laboratoriais comuns são leucocitose, anemia e trombocitose (Frazer, Irvine et al., 2007). O cromossomo Ph+ é geralmente a única anormalidade citogenética encontrada na fase crônica (Frazer, Irvine et al., 2007).
Os achados laboratoriais no sangue periférico mostram leucocitose relacionada a sinais e sintomas decorrentes da hiperviscosidade, como priapismo e acidente vascular cerebral (Quintas-Cardama e Cortes, 2006). As plaquetas podem ter níveis normais, altos ou baixos e a medula óssea exibe hiperplasia granulocítica com morfologia normal, mas que em poucos casos podem apresentar sinais displásicos. (Frazer, Irvine et al., 2007; Pasquini, 2001).
1.4.2 Fase Acelerada
Diferentes critérios são utilizados na definição da fase acelerada e muitos dos sistemas de classificação foram propostos após a introdução do mesilato de imatinibe no tratamento (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Sessions, 2007). Esta fase tem duração menor que a fase crônica, podendo apresentar uma progressiva resistência à terapêutica, aumento da esplenomegalia, da basofilia, e de células blásticas, trombocitose ou trombocitopenia, mielofibrose e evolução clonal (Kantarjian, Talpaz et al., 2006; Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Sessions, 2007).
Os pacientes podem continuar assintomáticos ou apresentar sintomas como febre, sudorese noturna, perda de peso e dores ósseas, além de aumento da esplenomegalia e anemia (Sessions, 2007).
O International Bone Marrow Transplant Registry (IBMTR) propôs alguns critérios característicos da fase acelerada como a grande leucocitose não responsiva a hidroxiuréia; trombocitopenia, não relacionada à quimioterapia; presença de trombocitose persistente em alguns casos; baço palpável, blastos e prómielócitos mais que 10% e inferior a 20% no sangue periférico ou medula óssea; basófilos mais eosinófilos excedendo 20%no sangue periférico; anormalidade citogenética clonal adicional à presença do cromossomo Ph+ (Sessions, 2007).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) define que o paciente se encontra em fase acelerada quando os blastos estão entre 10% a 19% no sangue periférico e medula óssea, com contagens de basófilos superiores a 20% no sangue periférico, evidência de evolução clonal e esplenomegalia progressiva. A evolução clonal ocorre entre 50% a 80% dos pacientes que tem progressão da doença. Pode ocorrer o surgimento de um segundo cromossomo Ph+ dentre outras alterações (Sessions, 2007).
1.4.3 Crise Blástica
É considerada crise blástica o estado no qual há um grande aumento na porcentagem de blastos, superior a 30% na medula óssea ou no sangue periférico (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Sessions, 2007; Hehlmann e Saussele, 2008). Imunofenotipicamente, a crise blástica pode ser caracterizada por um fenótipo linfóide ou mielóide (Quintas-Cardama e Cortes, 2006). O fenótipo linfóide ocorre em 20% a 30% dos casos, enquanto a presença de células imaturas, mieloblastos, em 50% dos casos, e o restante são células indiferenciadas ou em raros casos, bifenotípicas, com uma mistura de linhagens linfoblásticas e mieloblásticas (Quintas-Cardama e Cortes, 2006).
Os marcadores comuns desta fase estão relacionados com a progressão da doença, evolução clonal, com aumento da carga tumoral, incluindo a incapacidade de controlar o aumento de leucócitos, além das alterações básicas das outras fases, como mudanças na proliferação, diferenciação, apoptose e adesão, que se acentuam (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Radich, 2007). Quando submetidos ao tratamento, os pacientes com LMC podem reverter o quadro da doença para a fase crônica, porém esta nova fase pode ser de curta
duração, sendo pequena a expectativa de vida após o início da crise blástica (Quintas-Cardama e Cortes, 2006).
Para caracterizar a crise blástica, a OMS propôs uma redução de 30% para 20% ou mais de blastos no sangue periférico ou células nucleadas da medula óssea, proliferação de blastos extramedular e presença de grandes focos ou agrupamentos de blastos em biópsias da medula óssea (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Radich, 2007; Sessions, 2007; Hehlmann e Saussele, 2008).
O IBMTR define crise blástica quando há 30% de blastos ou mais no sangue periférico ou na medula óssea, e também presença de infiltrados extramedulares de células leucêmicas. Um dos aspectos importantes da crise blástica é a sua transformação em uma leucemia aguda, sendo tratada como tal. (Sessions, 2007).
A progressão para crise blástica é guiada por eventos genéticos e epigenéticos adicionais como deleções de genes supressores de tumor como o p16 e p53. A progressão da doença na crise blástica pode ser explicada pela capacidade de auto-renovação das células tronco alteradas, mas novas evidências mostraram que a progressão para a crise blástica pode estar associada com a expansão de progenitores leucêmicos em vez de células tronco leucêmicas (Michor, 2007). Na crise blástica, os progenitores leucêmicos apresentam um aumento na expressão de β-catenina, que está relacionada à capacidade de auto-renovação (Michor, 2007; Radich, 2007).
Na LMC, a proteína BCR/ABL tirosina quinase possui dois efeitos, sendo um: a capacidade de simular vias de sinalização e proliferação e o outro a modulação da resposta ao dano do DNA e mutagênese pela via de espécies reativas ao oxigênio causando instabilidade genômica por mutações, duplicação de genes, translocações e quebras cromossômicas. Isso pode estar relacionado ao efeito de progressão de doença a crise blástica, e a necessidade da utilização de alvos terapêuticos para a eliminação deste efeito desde o diagnóstico da doença (Hehlmann e Saussele, 2008).
É comum a ocorrência do isocromossomo i(17q) que causa a perda de uma cópia do gene supressor de tumor p53. Uma redução dos níveis totais de p53 pode alterar os processos de reparação e apoptose, contribuindo assim para a progressão da doença. As translocações de oncogenes são mais raras e as mais recorrentes são t(3;21) e t(7;11), que envolvem os genes AML-1/EVI-1 e NUP98/HOXA9, respectivamente, sendo que o primeiro gene impede a diferenciação e o segundo aumenta a proliferação celular (Radich, 2007).
1.5 DIAGNÓSTICO
Entre os métodos de diagnóstico e monitoramento da doença encontram-se as técnicas de cariotipagem de bandas G, FISH (Fluorescent In-situ Hibridization), RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) e qRT-PCR (Real Time Quantitative- Polymerase Chain Reaction), além de exames como mielograma, hemograma, imunofenotipagem, dentre outros (Chauffaille Mde, Oliveira et al., 2001; Sessions, 2007).
1.6 TERAPÊUTICA
A terapêutica da LMC tem como objetivo três níveis de respostas: a resposta hematológica completa, na qual há a normalização da contagem das células do sangue; resposta citogenética completa, com a erradicação das células Ph+ da medula óssea e a resposta molecular, determinada pela avaliação quantitativa dos níveis de transcritos do gene BCR/ABL por PCR em tempo real, sendo a resposta molecular completa definida como a ausência de transcritos detectável. (Kantarjian, Talpaz et al., 2006; Baccarani, Castagnetti et al., 2009; Sessions, 2007).
Dentre as terapias mais conhecidas encontram-se os agentes citostáticos como a hidroxiuréia e bussulfano, o transplante de medula óssea, o α-interferon (α-IFN) e mais recentemente, os inibidores de tirosina quinase (TK) como o do mesilato de imatinibe (MI) (Pasquini, 2001). Outros inibidores tirosina quinases foram desenvolvidos, e dois deles já são utilizados no tratamento de pacientes com resistência ou intolerância ao MI (Baccarani, Castagnetti et al., 2009).
O agente citostático hidroxiuréia interfere na síntese de DNA pela inibição da enzima ribonucleotídeo redutase, porém o benefício na sobrevida era mínimo ou inexistente. Já o bussulfano apresentava efeitos colaterais mais graves, por isso tornou-se menos recomendado (Pasquini, 2001).
O transplante de medula óssea (TMO), que continua sendo a única probabilidade de cura para a LMC, vem perdendo espaço, pois uma das principais dificuldades em se fazer o TMO é a sua limitação quanto à disponibilidade de doadores e a alta toxicidade do procedimento, na fase de indução, em pacientes mais velhos, o que limita a idade de elegibilidade em muitos centros de transplante. Na maioria dos casos, para se fazer o TMO é
levado em conta a fase da doença em que o paciente se encontra, pois tem grande influência para o TMO (Druker, O'brien et al., 2002).
A prática de TMO de doadores não aparentados é bastante limitada, devido ao fato da baixa disponibilidade de doadores compatíveis e pelo aumento da toxicidade do procedimento, principalmente relacionado à doença do enxerto contra o hospedeiro. (Druker, O'brien et al., 2002).
O tratamento com α-IFN foi um dos primeiros a demonstrar uma atividade imunomodulatória e antitumoral, conseguindo resposta citogenética. A adição de cytarabine fez com que aumentasse o número de pacientes com resposta citogenética completa, podendo aumentar a sobrevida destes pacientes em até 10 anos. Porém, em alguns pacientes ainda era possível detectar por técnicas de PCR a doença residual mínima em nível molecular, além dos efeitos colaterais que em alguns casos eram suficientemente graves para impedir seu uso (Quintas-Cardama e Cortes, 2006; Pasquini, 2001).
O Mesilato de Imatinibe, conhecido também como Gleevec, Glivec ou STI571, é um inibidor da atividade BCR/ABL tirosina quinase, inibindo seletivamente a proliferação de células que expressam esta atividade in vitro e in vivo a partir da inibição das proteínas tirosina quinases. Inicialmente, foi utilizado em pacientes que apresentaram falha no tratamento com α-IFN, ou que estivessem em fase acelerada ou crise blástica. As respostas hematológicas e citogenéticas com o uso de MI foram melhores em relação às apresentadas por pacientes tratados com α-IFN (Druker, O'brien et al., 2002).
O MI é capaz de inibir a atividade tirosina quinase do KIT, ARG (genes relacionados ao ABL), e fator de crescimento derivados de plaquetas (PDGFR), inibindo por competição a interação da adenina trifosfato (ATP) com as proteínas, e assim a capacidade dessas de fosforilar e ativar proteínas-alvo da cascata de sinalização da LMC (Figura 4) (Druker, O'brien et al., 2002; Mcfarland e Wetzstein, 2009).
Figura 4: Comparação da ação do BCR/ABL e do Imatinibe na patogênese da LMC. O Imatinibe age mimetizando a ação do ATP, ligando-se ao domínio SH1 do BCR/ABL, evitando a fosforilação da proteína, interrompendo a cascata de sinalização que levam ao desenvolvimento da LMC (Frazer, Irvine
et al., 2007).
O Dasatinibe (DA) tem como alvo a inibição do BCR/ABL e atuação em mutações sensíveis a esta droga, bem como a família Src, c-Kit, EPHA2, e do receptor do PDGFR e outras quinases em concentrações nanomolares. Ele é utilizado no tratamento de pacientes em qualquer uma das fases, que apresentarem resistência ou intolerância ao MI, pois ele é capaz de superar os mecanismos de resistência, incluindo a sinalização alternativa que envolve as vias da família Src quinases e superexpressão do MDR-1 (Multidrug-resistance gene 1 protein), intimamente relacionado ao aumento do efluxo de MI a partir da célula cancerosa mediado por transportadores de membrana (Baccarani, Castagnetti et al., 2009; Mcfarland e Wetzstein, 2009). A maioria das mutações clinicamente importantes são sensíveis ao DA, exceto a mutação T315I, que confere resistência aos inibidores MI, DA e Nilotinibe (Mascarenhas, Cunha et al., 2009; Mcfarland e Wetzstein, 2009).
O Nilotinibe (NI) é um derivado do MI capaz de inibir a atividade tirosina quinase BCR/ABL, KIT e do receptor do PDGFR, de forma mais potente e seletiva, sendo utilizado no tratamento de pacientes resistentes ao MI que se encontram nas fases crônica ou acelerada (Baccarani, Castagnetti et al., 2009; Mcfarland e Wetzstein, 2009). O NI é capaz de
interromper a ligação ATP-fosfato da tirosina quinase do ABL, inibindo a atividade catalítica da enzima, deixando a enzima inativa, bloqueando o sítio de ligação do substrato (Mcfarland e Wetzstein, 2009).
Tanto o DA quanto o NI são inibidores da segunda geração e possuem uma resposta rápida, com um tempo médio de resposta citogenética de 3 meses. Pacientes com resistência hematológica ao MI ou com anomalias cromossômicas clonais nas células Ph+ e mutações no domínio BCR/ABL quinase, em geral apresentam uma probabilidade menor de atingir resposta citogenética completa (RCC) com estes agentes. (Baccarani, Castagnetti et al., 2009).
Outros agentes ainda estão em estudo, entre os agentes estão o Bosutinibe (SKI-660) e o INNO-406. Em estudos de fase II, o Bosutinibe mostrou ser um potente inibidor do Src/Abl quinase, sendo mais potente que o MI na inibição da fosforilação do BCR/ABL, porém com pouca inibição contra PDGFR e c-Kit. Ele demonstrou atividade contra a maioria das mutações do BCR-ABL, com exceção a T315I (Bixby e Talpaz, 2009; Mcfarland e Wetzstein, 2009).
O INNO-406 está na fase II de estudo clínico, demonstrando atividade de inibição da via ABL/Lyn quinase, sendo mais potente, in vitro que o MI em linhagens de células que expressam BCR/ABL. Ele é capaz de inibir muitos domínios mutantes do BCR/ABL, com a mesma exceção dos outros, a mutação T315I (Kantarjian, Giles et al., 2007; Mcfarland e Wetzstein, 2009). Diferentemente dos outros inibidores de TK de segunda geração, o INNO-406 possui atividade específica para a via Lyn quinase, com pequena atividade em outros membros da família Src quinase (Mcfarland e Wetzstein, 2009).
A resistência aos inibidores de tirosina quinases (TKIs) na maior parte dos casos está associada a uma mutação no domínio BCR/ABL quinase e ocorrem quando a doença está em progressão, ou seja, nas fases acelerada e na crise blástica. Quando a resistência ocorre na fase crônica, esta é associada a mutações no domínio tirosina quinase em menos de 50% dos casos, sendo a causa da resistência muitas vezes desconhecida. (Baccarani, Castagnetti et al., 2009).
Outro grupo que está em estudo é o das aurora quinases, que é uma família de serina/treonina quinases com importante função nos eventos de fosforilação das proteínas, regulando a fase de mitose no ciclo celular. Essas proteínas estão super expressas em alguns cânceres humanos, o que sugere a investigação de inibidores para estas quinases (Kantarjian, Giles et al., 2007). Um inibidor da aurora quinase é o MK0457 (VX680), e estudos in vitro mostraram a capacidade de inibir a mutação T315I do BCR/ABL, impedindo a proliferação das células de LMC derivadas de pacientes com essa mutação (Kantarjian, Giles et al., 2007; Shah, 2007; Bixby e Talpaz, 2009).
Outros novos agentes estão ilustrados na Figura 5 e incluem agentes anti-angiogênicos, vacinas peptídicas, TNF (Fator de necrose tumoral) relacionado à indução da apoptose; DNA’s hipometilados, oligonucleotídeos anti sense e inibidores de RNA, efeitos P13K, evitando a ativação do AKT, resultando na liberação dos sinais apoptóticos e dos sinais promotores da sobrevivência celular, além da desestabilização da proteína BCR/ABL, porém estes agentes ainda estão em desenvolvimento pré-clínico (Frazer, Irvine et al., 2007).
Figura 5: Alvos da terapia da LMC: algumas terapias tem como alvo a indução ou liberação para os sinais de apoptose ou mesmo desestabilização da proteína BCR/ABL, além de inibirem a ativação de vias relacionadas à patogenia da LMC (Frazer, Irvine et al., 2007).
1.7 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À TERAPIA
A avaliação da resposta à terapêutica é baseada em testes hematológicos, citogenéticos e moleculares. Um grupo europeu propôs uma classificação, chamada Leukemia net, para as respostas ao tratamento como resposta ótima, sub-ótima e falha, propondo também uma definição para resposta hematológica, citogenética e molecular, como mostra a Tabela 1 (Baccarani, Castagnetti et al., 2009).
Tabela 1: Definição de resposta hematológica, citogenética e molecular de acordo Leukemia Net segundo Baccarani et al, 2009.
Resposta Hematológica Completa WBC<10x109/L, sem granulócitos imaturos, < 5% de basófilos, plaquetas < 450x109/L, baço não palpável Resposta Citogenética Completa Ausência de metáfases Ph +
Resposta Citogenética Parcial 1 a 35% de metáfases Ph+ Resposta Citogenética Menor 36 a 65% de metáfases Ph+ Resposta Citogenética Mínima 66 a 94% de metáfases Ph+ Ausência de Resposta Citogenética ≥95% de metáfases Ph+
Resposta Molecular Maior BCR/ABL: ABL ≤0,1% na Escala Internacional Resposta Molecular Completa Transcritos BCR/ABL indetectáveis por RT-Q-PCR
A primeira recomendação de tratamento na fase crônica é a utilização de MI. Caso o paciente seja resistente ou intolerante ao MI, recomenda-se o uso de DA ou NI, de acordo com a presença de mutações no domínio BCR/ABL quinase e das condições clínicas e co-morbidades do paciente. Quando o paciente não obtém resposta com os inibidores de TK, é recomendado a realização do TMO o mais rápido possível (Baccarani, Castagnetti et al., 2009).
O monitoramento da resposta ao tratamento deve ser feito, acompanhando a resposta hematológica, citogenética e molecular do paciente e pode ser definido como mostra a Tabela 2 de acordo com Leukemia Net, segundo Baccarani et al, 2009.
Para os pacientes que, dentro dos critérios da Leukemia net 2009, não atingem a resposta esperada ou perdem algum tipo de resposta atingida, a análise de mutações pode ser feita por eqüenciamento ou por cromatografia líquida desnaturante de alta performance (D-HPLC) sempre antes da troca de inibidores de TK (Baccarani, Castagnetti et al., 2009).
Tabela 2: Monitoramento da resposta hematológica, citogenética e molecular do paciente em tratamento de acordo com Leukemia Net, segundo Baccarani et al, 2009.
Resposta Hematológica Completa (RHC) Hemograma a cada 2 semanas até a confirmação da RHC, e depois disso, por mais 3 meses para o acompanhamento.
Resposta Citogenética Completa (RCC) Análise de bandas do cromossomo ou FISH de material da medula óssea no 3º e 6º mês, e depois a cada 6 meses até a RCC confirmada, e depois refazendo a análise a cada 12 meses.
Resposta Molecular Maior (RMM) Mensurar níveis de transcritos BCR/ABL nas células do sangue por RT-Q-PCR (PCR quantitativo) a cada 3 meses até uma RMM confirmada, e depois a cada 6 meses.
2 JUSTIFICATIVA
Dada a importância do conhecimento da regulação gênica em células da linhagem granulocítica de indivíduos com LMC foi proposto neste trabalho, a análise da expressão do gene SEPT5. Estudos preliminares mostraram que este gene se apresentou diferencialmente expresso entre portadores de LMC e indivíduos controle. Não existe na literatura uma relação clara entre a expressão deste gene e o desenvolvimento da LMC, tornando-o um interessante candidato a estudos funcionais no que diz respeito a sua função na diferenciação, proliferação e apoptose de células granulocíticas e progenitores mielóides.
Neste contexto, foi proposto neste projeto, inicialmente, o seqüenciamento completo do cDNA desse gene em granulócitos de linhagem celular K562 e pacientes para a averiguação da presença de mutações. Além disso, o estudo da expressão do gene SEPT5 em granulócitos de sangue periférico de pacientes com LMC e indivíduos controles usando PCR em tempo real.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliação da expressão do gene SEPT5 em pacientes com Leucemia Mielóide Crônica e indivíduos controle, além de uma possível elucidação de mecanismos relacionados com o desenvolvimento ou progressão da doença nos pacientes portadores de LMC.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Seqüenciamento do gene SEPT5 para a pesquisa de mutações em linhagem celular K562 e pacientes.
Análise do padrão de expressão do gene SEPT5 em granulócitos de sangue periférico de pacientes e indivíduos controles.
4 PACIENTES E MÉTODOS
4.1 PACIENTES E ASPECTOS ÉTICOS
A seleção dos voluntários que participaram deste estudo foi realizada pelo pesquisador com auxílio do supervisor responsável, após contato direto com os pacientes em tratamento no Hemocentro da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Foram incluídos neste estudo, indivíduos adultos de ambos os sexos, com diagnóstico de leucemia mielóide crônica, utilizando inibidores de tirosina quinase, em qualquer fase da doença.
Os pacientes selecionados foram previamente esclarecidos sobre os objetivos e procedimentos utilizados para o desenvolvimento da pesquisa de acordo com as normas do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAMP. Os indivíduos que concordaram com a participação, foram incluídos como voluntários deste estudo depois de ler e assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo I).
Esse projeto está contido dentro do projeto intitulado “Análise funcional dos genes SEPT5, TOB1 e PAN3 em cultura de linhagens celulares BaF3, BaF3T315I e linhagem granulocítica de pacientes portadores de leucemia mielóide crônica”, que foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas em 04 de dezembro de 2009, protocolo: CAAE-0690.0.146.000-09 (Anexo II).
4.1.1 Pacientes
Foram utilizadas 11 amostras de granulócitos de pacientes tratados no Hemocentro da UNICAMP, e 05 amostras de doadores de sangue sadios como indivíduos controle.
4.2 MÉTODOS
A coleta de sangue dos voluntários foi realizada pela equipe técnica, no ambulatório do Hemocentro da UNICAMP, utilizando sistema de coleta a vácuo em frascos contendo anticoagulante EDTA. A parte experimental foi realizada no laboratório do Prof. Dr. Anderson Ferreira da Cunha no Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos.
4.2.1 Separação de granulócitos
O sangue periférico coletado foi submetido a um sistema gradiente Ficoll-Hypaque de densidades 1,077 g/L e 1119 g/L, centrifugado à 700g por 30 minutos, temperatura ambiente. Os granulócitos foram separados e ressuspendidos em PBS (pH 7,4). Foi realizada a lise das células vermelhas utilizando tampão de lise, e em seguida, as células foram lavadas e ressuspendidas em tampão adequado.
4.2.2 Extração de RNA
Após a lise das hemácias com cloreto de amônio (NH4Cl) e bicarbonato de amônio (CH5NO3), as amostras de RNA de granulócitos, foram extraídas utilizando o reagente TRIzol® (Invitrogen). O TRIzol® é responsável pela conservação das células quando congeladas, porém ele é tóxico para as células quando em temperatura ambiente. É responsável também por manter a integridade do RNA, ao mesmo tempo em que rompe as células e dissolve os componentes celulares.
As amostras com TRIzol® foram armazenadas em freezer -80ºC, e quando retiradas, foram homogeneizadas e incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente (15 a 30ºC). Foi adicionado 200 µ L de clorofórmio (HCl3) gelado por mL de TRIzol® em cada amostra, que foi homogeneizada com uso do vortex vigorosamente por 15 segundos e incubada por 5 minutos a temperatura ambiente (15 a 30ºC). As amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 13.500 rpm a 4oC. Com a adição do clorofórmio seguido da centrifugação, ocorre a separação das fases em aquosa e orgânica, sendo a fase aquosa a de interesse, pois esta contém o RNA.
A fase aquosa foi então transferida para um novo microtubo seco, acrescentando 500µ L de isopropanol gelado por mL de TRIzol® e homogeneizada por inversão e incubada por 10 minutos em temperatura ambiente (15 a 30ºC). O isopropanol é responsável pela precipitação do RNA antes do DNA, evitando assim contaminações. As amostras foram novamente centrifugadas por 10 minutos a 13.500 rpm a 4ºC.
O sobrenadante foi removido invertendo o microtubo cuidadosamente para não deslocar o pellet. O pellet foi lavado com 800µ L de etanol 75% gelado, para retirar o sal e levadas ao vortex. As amostras foram centrifugadas a 11.500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O
sobrenadante foi descartado e o RNA foi seco por inversão do microtubo em contato com gaze estéril por 5 a 10 minutos.
O pellet foi dissolvido com água estéril DEPC e depois foi dado um spin e colocado em gelo. O volume de água estéril DEPC variou de acordo com o tamanho do pellet, entre 10µ L e 20µ L de água estéril DEPC.
A integridade das amostras de RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose a 1,2%. Quando íntegras, as amostras apresentam duas subunidades ribossomais: 18S e 28S (Figura 6). Após a eletroforese, as amostras foram armazenadas em freezer -80ºC.
Figura 6: Amostra de RNA extraída pelo protocolo de Trizol. As amostras foram visualizadas em gel de agarose a 1,2%. 01- Controle, 02- Paciente.
4.2.3 Tratamento com DNAse e Síntese de DNA complementar (cDNA)
A leitura do RNA foi realizada em espectrofotômetro (NanoDrop). Alíquotas de RNA foram utilizadas em reações de transcrição reversa para síntese de cDNA, utilizando o reagente SuperScriptIII® (Invitrogen).
Utilizou-se 2µg de RNA que foram tratados com DNAse I (Invitrogen) para remover DNA contaminante. O tratamento com DNAse consistiu na adição de 0,5µl de DNAseI (1u/µl), 0,5µl de 10x DNAseI Reaction Buffer (200mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl2) e água em quantidade suficiente para um volume final de 10,0µl de reação. As amostras foram incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente e a reação bloqueada com a adição de 1,0µl de 25 mM de EDTA, e logo após, incubado por 5 minutos a 65°C.
Ao fim desta etapa, foi iniciada a síntese da fita do cDNA, com a adição de 1,0µl de 50µM oligo (dT) e 1,0µl de 10mM dNTP’s. As amostras foram incubadas por 5 minutos a 65°C e em seguida por 1 minuto a 4°C.
28 S 18 S
Em cada amostra, foi adicionado 10,0µl da seguinte mistura de reação: 2 µl de 10xRT buffer, 4,0 µl de 25 mM MgCl2, 2,0 µl de 0,1 M DTT, 1,0 µl de 40U/µl Rnase OUTTM e 1,0 µl de 200 U/µl Superscript III RTTM. A reação ocorreu por 50 minutos a 50°C, seguida de 5 minutos a 85°C.
4.2.4 Verificação da síntese de DNA complementar
A síntese de cDNA foi verificada por meio da reação de polimerase em cadeia (PCR) para o gene da beta-actina (β-actina). A PCR é uma técnica que consiste na síntese de cópias de material genético in vitro por meio de três variações de temperatura que ocorrem basicamente em ciclos, obtendo assim a amplificação de sequências específicas de ácidos nucléicos a partir de uma fita molde. Na PCR, a multiplicação dos fragmentos de interesse ocorre com a alternância das temperaturas de ensaio, iniciando com a desnaturação das cadeias do DNA de interesse, permitindo o anelamento dos primers com a redução da temperatura, delimitando assim, a sequência de interesse. Após o anelamento ocorre a extensão pela enzima Taq polimerase e a extensão final, que ocorre após o término dos ciclos, geralmente acrescenta-se 4 minutos a 72ºC para uma oportunidade adicional para a polimerase agir. Por fim, programa-se uma etapa final de 0 a 4ºC, para conservar as amostras. O gene beta-actina é um dos genes endógenos mais utilizados para a padronização dos dados de PCR, porque ele é um gene constitutivo.
As reações de PCR foram realizadas com: 5,0 µl de 10xPCR buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM KCl), 1,5 µl de 50 mM MgCl2, 1,0 µl de 10 mM dNTP’s, 1,0 µl de 10 mM de primer Beta-Actina Foward (5’ – AAGAGATGGCCACGGCTGCT – 3’), 1,0µl de 10 mM de primer Beta-Actina Reverse (5’ – TCGCTCCAACCGACTGCTGT – 3’), 0,5 µl de Taq DNA polimerase (5U/ µl), 1,0 µl de cDNA e 39,0 µl de água, para um volume final de 50,0
µl. O programa foi iniciado por 2 minutos à 94°C, seguido de 35 ciclos: 94°C/30 segundos,
58°C/45 segundos e 72°C/40 segundos, sendo finalizado por 72°C/7 minutos.
Ao fim da PCR foi feita a verificação da presença dos produtos de PCR amplificados por meio da eletroforese em gel de agarose. Antes de aplicar as amostras nos poços do gel de agarose, estas foram misturadas a um tampão de amostra, cujo principal componente é o azul de bromofenol, que aumenta o peso das amostras, evitando que flutuem no tampão de corrida, e também acrescenta uma coloração, facilitando a visualização da corrida. A distância percorrida pela amostra a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância percorrida
pelo marcador de peso molecular, que foi aplicado ao lado dos produtos da PCR, e apresenta fragmentos de DNA de tamanhos variáveis, geralmente eqüidistantes entre si. Foi realizada uma eletroforese em gel de agarose a 1%, para verificar a amplificação dos produtos da PCR, no qual foi possível visualizar fragmentos de 640 pares de base (pb) (Figura 7).
Figura 7: Gel de agarose a 1,5%, com amplificação do gene da beta actina. Na coluna M, marcador de peso molecular 100 pb; nas colunas 1-7 amostras de cDNA de granulócitos de indivíduos normais e pacientes com leucemia mielóide crônica.
4.2.5 Amplificação do cDNA
Os primers para amplificação do gene SEPT5 foram desenhados usando o programa GeneRunner, tendo como base as sequências depositadas no banco de dados do NCBI: SEPT5(GI: 62087915).
Os fragmentos desenhados foram submetidos ao programa Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) para confirmar homologia com o gene de interesse. A formação de estruturas como hairpins e dimers também foram avaliadas através do programa GeneRunner.
Inicialmente, para a amplificação do gene SEPT5 utilizou-se uma reação de volume final de 50µ L: 5,0µ L de tampão 10x PCR buffer, 1,0µ L de 10mM dNTP mix, 1,5µL de 50mM de MgCl2, 1,5µ L do primer SEPT5 (100pm) Foward (5' CTGCTGCCTATACTTCATCTCCC 3’), 1,5µL do primer SEPT5 (100pm) Reverse (5' ACGATGTTGACCTTCTCATGCA 3’), 1,0µ L de cDNA, 0,5µ L de Taq DNA e 38µ L de água estéril.
M 1 2 3 4 5 6 7
O programa utilizado na PCR para a amplificação considerava o início com uma desnaturação à 94ºC por 3 minutos, seguido por 40 ciclos, iniciados com uma desnaturação à 94ºC por 30 segundos, anelamento à 57ºC por 30 segundos e extensão à 72ºC por 1:20 minutos. Após o fim do programa, as amostras foram corridas em gel de agarose 1% para verificar a amplificação do gene de interesse (Figura 8).
Figura 8: Verificação da amplificação do gene SEPT5 em linhagem celular K562, em gel de agarose a 1%. PM – marcador de peso molecular de 100pb.
4.2.6 Clonagem
As amostras de cDNA resultantes da amplificação foram clonadas em vetor para clonagem de PCR pGEM-T (Promega). 3µL do cDNA foi adicionado a 5µL de tampão ligase 2X, 1µL de vetor pGEMT e 1µL de T4 ligase e a reação incubada a 4° durante 16 a 20 horas. Cerca de 5µL da reação foram transformados em 100µL de células competentes DH5α por choque térmico (20 minutos em gelo, 2 minutos a 42 graus C e 2 minutos em gelo). As células foram transferidas para 1mL de meio LB sem ampicilina, incubadas 1 hora sob agitação de 120 rpm a 37 graus C, e plaqueadas em meio LB sólido com ampicilina e sistema de galactosidade para seleção de colônias com inserto. As colônias positivas (colônias de cor branca- positivas para inserto e colônias de cor azul-negativas) foram inoculadas em placas de 96 poços contendo 120µL de meio, LB com ampicilina, por poço. Estas placas foram incubadas over-night sob agitação de 120rpm a 37°C. Desse inóculo foram retirados 2µL e submetidos a reação de PCR , com os primers específicos, para amplificação dos insertos.
PM K562
Após a realização da PCR, corremos as amostras em um gel de agarose 1% para a verificação da amplificação.
4.2.7 Sequenciamento
Dessa reação de PCR 1µL foi seqüenciado com 5pmol de iniciador sense do PCR (SEPT5 sense), utilizando pré-mix (Amersham- Kit para Mega Bace), em reações de 14µL por poço. As condições foram desnaturação inicial de 94°C por 3 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação 94°C por 20 segundos, 58°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. O seqüenciamento foi purificado como se segue: 2µL de acetato de amônio a 7,5M e 50µL de etanol absoluto foi adicionado a cada poço e homogeneizado por vortex. As placas foram incubadas a 4°C em ambiente escuro e posteriormente aos 20 minutos foram centrifugadas por 40 minutos a 4000 rpm e 4°C. O etanol foi retirado das placas por inversão, depois foi adicionado 100µL de etanol 75% a cada poço e as placas novamente centrifugadas por 15 minutos nas mesmas condições anteriores. Após a segunda centrifugação o etanol 75% foi retirado por inversão leve e o restante por spin com a placa invertida 5 segundos 200 rpm, e então essas placas foram colocadas para secar a 65°C por aproximadamente 10 minutos. O produto da reação de seqüenciamento foi resuspendido por vortex em 10µ L de tampão de aplicação em Mega Bace (Amersham) e estocadas a 4°C até o momento da colocação da placa no seqüenciador automático Mega Bace. Foram sequenciadas 10 amostras com o primer SEPT5 sense e anti sense.
O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos em uma amostra. Foram utilizados simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (dDNTPs) marcados por fluorescência. Quando os fragmentos de DNA atingem a janela de detecção no capilar, um laser excita os corantes fluorescentes. Assim, cada corante possui um comprimento de onda diferente, que são detectados e seus resultados interpretados por um software de seqüenciamento, titulando cada base em relação à intensidade do composto fluorescente, denominando quatro cores especificas.
Em seguida, as seqüências de alta qualidade foram submetidas ao banco de dados BLAST que procurou similaridade com a sequência selvagem do gene SEPT5 já depositada neste banco de dados, foi feita a busca por similaridade com nucleotídeos (BLASTN).
4.2.8 Padronizações necessárias para PCR Quantitativo em Tempo Real
4.2.8.1 Desenho de primers
O primeiro passo antes de iniciar os experimentos de PCR em tempo real, é o desenho da sequência dos primers. Neste trabalho, os primers para REAL TIME foram desenhados com o uso do site www.invitrogen.com e com o software “Primer Express” (Applied Biosystems). Os fragmentos desenhados foram submetidos ao programa Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) para confirmar homologia com o gene de interesse. A formação de estruturas como hairpins e dimers também foram avaliadas através do programa Gene Runner.
É necessário que haja uma complementaridade, porém é importante antes de tudo observar o Ponto de Fusão Médio, o Tm (Temperature of Melting) que é a temperatura na qual metade dos primers está anelada às fitas de DNA, enquanto a outra metade está livre. Algumas características para a escolha do primer devem ser seguidas para garantir a qualidade da reação, como: evitar a complementaridade entre as extensões 3’, evitando formação de dímeros, evitar três ou mais bases G e C, Tm de primer foward e reverse próximas e não muito baixas, evitando ligações que não sejam específicas. A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição da sequência do primer e deve ser 1 a 5ºC abaixo da Tm. Caso a temperatura de anelamento seja muito baixa, pode ocorrer o anelamento não específico, enquanto temperaturas altas podem acarretar na redução da concentração do produto.
4.2.8.2 Padronização de primer
A concentração ideal de primer utilizada no qRT-PCR deve ser a mínima suficiente para permitir a duplicação de todas as cópias do material a cada ciclo de reação. Para isso, utilizando a mesma quantidade de amostra, foram feitas reações contendo cada um dos primers (Foward e Reverse) nas concentrações finais de 150 nM, 300 nM, 600 nM e 900 nM. A concentração ideal foi aquela em que o gene de interesse obteve o menor valor de Ct (ciclo threshold), neste caso, 150 nM.
4.2.8.3 Eficiência de Reação
As amplificações em qRT-PCR devem apresentar 100% de eficiência a cada ciclo da PCR, sendo que esta eficiência pode ser calculada por meio da fórmula 10(-1/slope), no qual: Slope corresponde a inclinação da reta obtida da análise da variação dos Cts dos genes alvos ou constitutivos em função do log das diferenças de concentração de cDNA. O valor de slope quando aplicado a fórmula de eficiência, tem que ser próximo de 2, que significa que a cada ciclo de amplificação o material genômico está sendo duplicado assegurando a eficiência da reação. Na figura 9 está representada a curva de eficiência do primer SEPT5 utilizado neste estudo.
Figura 9: Análise da eficiência de amplificação do primer SEPT5, mostrando uma eficiência de 100%.
4.2.9 PCR Quantitativo em Tempo Real (QRT-PCR)
A técnica de PCR em tempo real é um método de quantificação capaz de avaliar o número de moléculas de amplificação gênica produzidas a cada ciclo. O aumento no número de copias é detectado em tempo real, por meio da excitação de fluorocromos responsáveis por marcar a sequência de interesse ou primer utilizados na reação. A amplificação pode ser dividida em três fases, iniciando pela linha basal, nesta fase ainda não é possível detectar o produto, pois ainda não foi emitida a fluorescência, a fase logarítmica, na qual a quantidade de produtos de PCR duplica a cada ciclo e a fase platô, em que há uma estagnação na quantidade de produtos.
A reação utilizando a fluorescência com SYBRTM Green PCR Master Mix® (Applied Biosytems, USA) é um método de quantificação utilizado na detecção não específica, pois os
fluoróforos se ligam à fita dupla de DNA, emitindo a fluorescência. Assim, com o aumento exponencial da quantidade de DNA de fita dupla, há um aumento simultâneo da quantidade de SYBR Green ligado. Porém, caso ocorra a amplificação inespecífica ou de dímeros de primers, estes também serão detectados, podendo alterar os resultados da quantificação dos produtos de interesse da reação. Pode-se observar se ocorreu a formação de produtos inespecíficos com o auxílio da curva de fusão, pois se somente os produtos de interesse forem amplificados, formará um único pico no gráfico de fusão. Durante a reação de PCR, a polimerase realiza a síntese das novas cadeias e cliva a sonda, gerando um aumento do sinal fluorescente captado a cada ciclo até alcançar o limiar em que todas as amostras podem ser comparadas (threshold). O threshold é definido pelo pesquisador e deve estar na faixa em que a quantidade de fluorescência das amostras esteja maior que a fluorescência de base (background).
O gráfico resultante permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação, devido a diferenças de Tm (temperatura de melting) entre os produtos de PCR devido ao número e composição de bases de cada produto.
Todas as amostras foram ensaiadas em 25 µl de volume final; sendo 12,5 µl do reagente SYBR Green PCR Máster Mix®, 50 µg de amostra de cDNA para o gene gama globina ou 250 ng para os demais genes e a concentração ótima de primer determinada. Em todas as placas foram pipetados controles negativos (NTC), ou seja, para cada primer avaliado foram feitos poços contendo água estéril em substituição à amostra. As reações foram realizadas em placas de 96 poços (Sorenson, BioScience Inc) com tampas plásticas que permitem a passagem da luz. O programa foi iniciado a 95°C/10 minutos, seguido de 40 ciclos: 95°C/15 segundos e 60°C/1 minuto. Ao final de uma amplificação normal adiciona-se um passo de 20 minutos, no qual a temperatura aumenta gradualmente de 60° para 95°C. À medida que os produtos gerados por PCR desnaturam com o aumento de temperatura, cai o sinal fluorescente do SYBR Green®.
4.2.10 Análise dos dados do PCR em tempo real
A expressão do gene de interesse foi determinada de forma relativa, ou seja, os valores de expressão são normalizados em relação a genes chamados de “controles endógenos”. Neste trabalho foi utilizado o gene da Beta actina (β-actina) e GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato
