MALÁRIA HUMANA: PADRONIZAÇÃO E OPTIMIZAÇÃO DE TESTES SOROLÓGICOS PARA DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL E INQUÉRITOS SOROEPIDEMIOLÓGICOS

(1)

Rev. Insí. Med. trop. São Paulo 30 (3):137-146, maio-junho, 1988

MALÁRIA H U M A N A : PADRONIZAÇÃO E OPTIMIZAÇÃO DE TESTES

SOROLÓGICOS PARA DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL E

INQUÉRITOS SOROEPIDEMIOLÓGICOS

Antonio Walter FERREIRA (1, 2) & Maria Carmen Arroyo S A N C H E Z (1)

R E S U M O O t e s t e d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a ( I F I ) é c o n s i d e r a d o t e s t e d e r e f e r ê n c i a n a s o r o i o g i a d a m a l á r i a . N e s t e t r a b a l h o p r o c u r a m o s o p t i m i z a r o t e s t e e m p r e g a n d o P . f a l c i p a r u m o b t i d o d e s a n g u e h u m a n o e d e c u l t u r a e P . v i v a x o b t i d o d e s a n g u e d e p a c i e n t e c o m o a n t í g e n o s , p a r a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g G e I g M . D a s v a r i á v e i s t é c n i -c a s e s t u d a d a s m e l h o r e s r e s u l t a d o s f o r a m o b t i d o s q u a n d o os s o r o s f o r a m d i l u i d o s ern P B S c o n t e n d o 1 % d e T w e e n 80 e as l â m i n a s c o n t e n d o a s u s p e n s ã o a n t i g ê n i c a f o -r a m e s t a b i l i z a d a s e m d e s s e c a d o -r e s o u f i x a d a s c o m a c e t o n a . F o i t a m b é m p a d -r o n i z a d o o t e s t e i m u n o e n z i m á t i c o E L I S A c o m a n t i g e n o s de P . f a l c i p a r u m o b t i d o s e m c u l t u r a . O e s t u d o c o m p a r a t i v o c o m o t e s t e d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a p a r a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g G m o s t r o u : a) n o s p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s p o r P . f a l c i p a r u m a s e n -s i b i l i d a d e p a r a a m b o -s o -s t e -s t e -s foi d e 7 1 % ; b ) n o -s p a c i e n t e -s p r i m o i n f e c t a d o -s p e l o P . v i v a x a s e n s i b i l i d a d e foi d e 4 0 % p a r a a m b o s os t e s t e s ; c) n o s p a c i e n t e s n ã o p r i m o i n f e c t a d o s e c o m m a l á r i a a t u a l p e l o P . f a l c i p a r u m a s e n s i b i l i d a d e p a r a a m b o s o s t e s -t e s foi d e 1 0 0 % ; d ) n o s p a c i e n -t e s n ã o p r i m o i n f e c -t a d o s e c o m m a l á r i a a -t u a l p e l o P . vivax a s e n s i b i l i d a d e foi d e 8 5 % p a r a o t e s t e E L I S A e d e 9 2 % p a r a a I F I ; e) n o s p a c i e n t e s c o m m a l á r i a m i s t a a s e n s i b i l i d a d e p a r a a m b o s o s t e s t e s foi d e 1 0 0 % . A e s p e c i f i c i d a d e d a I F I foi d e 1 0 0 % e d o t e s t e E L I S A 9 5 % n o s c a s o s d e i n d i v í d u o s n ã o m a -l á r i c o s . O s r e s u l t a d o s o b t i d o s s u g e r e m ser o t e s t e E L I S A , u m a b o a a l t e r n a t i v a p a r a o t e s t e d e I F I , p a r a a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g G a n t i P . f a l c i p a r u m , n a s o r o i o g i a d a m a l á r i a . U N I T E R M O S : M a l á r i a ; I F I ; T e s t e i m u n o e n z i m á t i c o E L I S A . I N T R O D U Ç Ã O A m a l á r i a c o n t i n u a s e n d o a d o e n ç a d e n a s r e g i õ e s t r o p i c a i s o n d e p e r m a n e c e h i p e r o u m a i o r p r e v a l ê n c i a n o m u n d o , p r i n c i p a l m e n t e h o l o e n d ê m i c a . E s t i m a s e e m 3 0 0 m i l h õ e s d e c a

-(1) L a b o r a t ó r i o de Soroepidemiologia do Instituto de Medicina Tropical de São P a u l o . São P a u l o , S P , Brasil.

(2) D e p a r t a m e n t o de Moléstias Infecciosas e Parasitárias da F a c u l d a d e de Medicina da Universidade de São P a u l o . São P a u l o , S P , Brasil.

Endereço para correspondência: Dr. A n t o n i o Walter Ferreira. L a b o r a t ó r i o de I m u n o l o g i a do Instituto de Medicina Tropical de São P a u l o . Av. Dr. Enéas de C a r v a l h o Aguiar, 470. C E P 05403 São P a u l o , S P , Brasil.

(2)

sos p o r a n o , c o m c e r c a d e 3 m i l h õ e s d e ó b i t o s , p r i n c i p a l m e n t e e n t r e c r i a n ç a s . N o B r a s i l , r e p r e -s e n t a u m d o -s m a i -s -s é r i o -s p r o b l e m a -s d e -s a ú d e p ú b l i c a t e n d o s i d o n o t i f i c a d o s p e l a S U C A M a o c o r r ê n c i a d e m a i s d e 5 0 0 . 0 0 0 c a s o s e m 1 9 8 7 . A l e m d a a l t a p r e v a l ê n c i a n a s á r e a s e n d ê m i c a s , a d o e n ç a a s s u m e c a r a c t e r í s t i c a s i m p o r t a n t e s n a s á r e a s j á e r r a d i c a d a s d e v i d o a o i n t e n s o f l u x o m i -g r a t ó r i o e x i s t e n t e e, c a s o s d e m a l á r i a t ê m s i d o r e l a t a d o s p r i n c i p a l m e n t e , a m a l á r i a p ó s t r a n s f u -s i o n a l . É o b r i g a t ó r i o a i n t r o d u ç ã o d e r í g i d a -s m e d i d a s d e c o n t r o l e , q u e r n o c a m p o s o c i a l , q u e r n o c a m p o o p e r a c i o n a l . C l a s s i c a m e n t e as t é c n i c a s d e c a m p o p a r a a v a l i a ç ã o e p i d e m i o l ó g i c a n a q u a l as d e c i s õ e s o p e r a c i o n a i s s ã o b a s e a -d a s , c o n s t i t u e m n o e x a m e -d e s a n g u e e b a ç o , n a d e t e c ç ã o d e c a s o s f e b r i s e n a i d e n t i f i c a ç ã o d e p a r a s i t a s e m g o t a s d e s a n g u e . O e x a m e p a r a s i t o l ó g i c o , n o r m a l m e n t e , é feito e m i n d i v í d u o s q u e a p r e s e n t a m f e b r e . P o -r e m n e m t o d o s o s i n d i v í d u o s c o m m a l á -r i a t e m f e b r e o u r a r a m e n t e d ã o i m p o r t â n c i a a o s s i n t o -m a s q u e a p r e s e n t a -m '7. v \ U m e x a m e p a r a s i t o l ó -g i c o p o s i t i v o i n d i c a a p e n a s a p r e v a l ê n c i a d e p o n t o1 1 - 4\ P a r a se t e r u m a i d é i a d e p r e v a l ê n c i a d e p e r í o d o a s s o c i a - s e - o e x a m e p a r a s i t o l ó g i c o a o í n d i c e e s p l é n i c o , q u e é i n e s p e c í f i c o1 9. U m e x a m e p a r a s i t o l ó g i c o n e g a t i v o n e m s e m p r e é e x c l u -sivo d e m a l á r i a , p o i s f a l s o s r e s u l t a d o s n e g a t i v o s p o d e m o c o r r e r q u a n d o e x i s t e b a i x a p a r a s i t e m i a , a ç ã o d e d r o g a s a n t i m a l á r i c a s o u n o s i n d i -v í d u o s s e m i - i m u n e s4- >4-1 9- 2 6-: 7 ^ . O s t e s t e s s o -r o l ó g i c o s c o n t -r i b u e m d e m a n e i -r a d e c i s i v a n o d i a g n ó s t i c o i n d i v i d u a l o u e m e s t u d o s s o r o e p i d e m i o l ó g i c o s e m á r e a s e n d ê m i c a s o u n ã o e n d ê -m i c a s . N a s á r e a s o n d e a m a l á r i a é e n d ê m i c a o u j á foi e r r a d i c a d a o s t e s t e s s o r o l ó g i c o s s ã o ú t e i s p a -r a : m e d i -r o nível d e e n d e m i c i d a d e , v e -r i f i c a -r a p r e s e n ç a o u a u s ê n c i a d e t r a n s m i s s ã o , d e l i n e a r á r e a s m a l a r í g e n a s , d e t e c t a r m u d a n ç a s s a z o n a i s d e t r a n s m i s s ã o , i n v e s t i g a r a r e i n t r o d u ç ã o d e n o v o s c a s o s , e a v a l i a r o s p r o g r a m a s a n t i -m a l á r i c o s1- -4- n, 1^ - 20, :s. N a s á r e a s o n d e a d o e n ç a n ã o é e n d ê m i c a s ã o ú t e i s n a s e l e ç ã o d e d o a d o r e s d e s a n g u e , n o d i a g n ó s t i c o d i f e r e n c i a l e n o d i a g n ó s t i c o d e i n d i v í d u o s c o m b a i x a p a r a -s i t e m ia!- 4-s f S e g u n d o a O r g a n i z a ç ã o M u n d i a l d a S a ú -d e2 9, o s m é t o d o s s o r o l ó g i c o s , a l é m d e a p r e s e n -t a r e m b o a s e n s i b i l i d a d e , e s p e c i f i c i d a d e , d e v e m s e r v i r , t a m b é m p a r a i d e n t i f i c a r as e s p é c i e s in-f e c t a n t e s , p a r a d i in-f e r e n c i a r a s i n in-f e c ç õ e s a t u a i s d a s p r e g r e s s a s , b e m c o m o a p r i m o i n f e c ç ã o d a s r e i n f e c ç õ e s , e p a r a d e t e r m i n a r o e s t a d o d e i m u n i d a d e d o h o s p e d e i r o . A s s i m é q u e m u i t o s e s t u -d o s v ê m s e n -d o r e a l i z a -d o s a fim -d e -d e s e n v o l v e r e a p e r f e i ç o a r t e s t e s s o r o l ó g i c o s p r á t i c o s e s e g u r o s e q u e s a t i s f a ç a m a a l g u m d a q u e l e s r e q u i s i t o s . N o p r e s e n t e t r a b a l h o , p a d r o n i z a m o s e o p t i m i z a m o s o t e s t e d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i -r e t a p a -r a a p e s q u i s a d e a n t i c o -r p o s I g G e I g M , o t e s t e i m u n o e n z i m á t i c o , E L I S A p a r a a n t í g e n o s p l a s m o d i a i s e c o m p a r a m o s o s t e s t e s p a r a a p e s -q u i s a d e a n t i c o r p o s I g G a n t i P . f a l c i p a r u m e a n t i P . vivax e m s o r o s d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c -t a d o s , d e p a c i e n -t e s c o m m a i s d e u m a m a l á r i a , -de p a c i e n t e s c o m i n f e c ç ã o m i s t a e d e i n d i v í d u o s n ã o m a l á r i c o s . M A T E R I A L E M É T O D O S A n t í g e n o s — P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m foi o b t i d o a p a r t i r d o c u l t i v o " i n v i t r o "1 6-4 0>4 1 e d e s a n g u e d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s , n ã o t r a t a d o s c o m i n f e c ç ã o r e c e n t e . P l a s m o d i u m vi-vax foi o b t i d o a p a r t i r d e s a n g u e d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s n ã o t r a t a d o s c o m i n f e c ç ã o r e -c e n t e . S o r o s — P a r a p a d r ã o p o s i t i v o foi s e l e c i o n a d o u m p a i n e l d e s o r o s c o m t í t u l o s a l t o s e b a i -x o s o b t i d o s a p a r t i r d e p a c i e n t e s c o m i n f e c ç ã o a t u a l p e l o P . v i v a x o u P . f a l c i p a r u m c o n f i r m a d a p e l o e x a m e p a r a s i t o l ó g i c o . P a r a p a d r ã o n e -g a t i v o foi s e l e c i o n a d o u m p a i n e l d e s o r o s n ã o r e a g e n t e s o b t i d o s a p a r t i r d e i n d i v í d u o s n ã o inf e c t a d o s , c l í n i c a e p a r a s i t o l ó g i c a m e n t e d i a g a o s -t i c a d o s . P a r a a p l i c a ç ã o d o s t e s t e s f o r a m s e l e c i o n a d o s s o r o s d e i n d i v í d u o s d e á r e a e n d ê m i c a , p r i -m o i n f e c t a d o s p e l o P . v i v a x o u P . f a l c i p a r u -m d e p a c i e n t e s c o m m a i s d e u m a m a l á r i a , d e p a c i e n t e s c o m i n f e c ç ã o a t u a l m i s t a p o r P . f a l c i p a rum e P . v i v a x , s o r o s d e i n d i v í d u o s n ã o m a l á r i -c o s e s o r o s d e b a n -c o s d e s a n g u e . P a r a e s t u d o d a e s p e c i f i c i d a d e d o t e s t e f o r a m s e l e c i o n a d o s s o -r o s d e i n d i v í d u o s c o m o u t -r a s p a -r a s i t o s e s . C o n j u g a d o s — O s c o n j u g a d o s f l u o r e s c e n -tes f o r a m p r o d u z i d o s a p a r t i r d a f r a ç ã o I g G d e s o r o d e c a r n e i r o a n t i I g G h u m a n o , e s p e c í f i c o p a r a c a d e i a s y e d a f r a ç ã o I g G d e s o r o d e c a r -n e i r o a -n t i I g M h u m a -n o e s p e c í f i c o p a r a c a d e i a \A, p u r i f i c a d o p o r gel f i l t r a ç ã o e m S e p h a d e x G 2 0 0 o u p o r t r o c a i ó n i c a . F o i u t i l i z a d a a t é c n i -c a d e -c o n j u g a ç ã o d e C l a r k e S h e p p a r d ^

(3)

es-t a b e l e c e n d o - s e e n es-t r e 2 , 5 e 3 , 0 a r e l a ç ã o f l u o r e s c e í n a p r o t e í n a . P a r a p r o d u ç ã o d o s c o n -j u g a d o s e n z i m á t i c o s foi u t i l i z a d a a t é c n i c a d e N a k a n e , 1 9 7 82 8. C o m o e n z i m a foi u t i l i z a d a . a p e r o x i d a s e ( H o r s e r a d i s h P e r o x i d a s e T y p e VI —-S i g m a C h e m . C o . ) e e s t a b e l e c e u - s e e n t r e 0,5 e 1,0 a r e l a ç ã o e n z i m a p r o t e í n a . A m b o s c o n j u g a d o s , f l u o r e s c e n t e s e e n z i m á t i c o s , f o r a m t i t u -l a d o s p o r t i t u -l a ç ã o e m b -l o c o p a r a se e s t a b e -l e c e r a d i l u i ç ã o ó t i m a d e u s o . T e s t e de i m u n o f l u o r e s c ê n c i a indireta — A p ó s a d e t e r m i n a ç ã o d o n ú m e r o d e h e m á c i a s p a r a s i t a d a s p o r c a m p o , o s e d i m e n t o foi l a v a d o e s u s p e n s o e m s o l u ç ã o s a l i n a t a m p o n a d a c o m f o s f a t o ( P B S ) d e a c o r d o c o m a f ó r m u l a : V D = ( 2 , 5 X N ) — 1, o n d e V D é o v o l u m e d o d i l u e n t e q u e d e v e ser a d i c i o n a d o s o b r e a p a p a d e h e m á -cias e N é o n ú m e r o d e h e m á c i a s p a r a s i t a d a s p o r c a m p o m i c r o s c ó p i c o . A s l â m i n a s c o n t e n d o a s u s p e n s ã o a n t i g ê n i c a (5 ^\ p o r á r e a d e t e r m i n a -d a ) f o r a m a r m a z e n a -d a s e m freezer a — 7 0 ° C a p ó s s e r e m a c o n d i c i o n a d a s ern e m b a l a g e n s p l á s t i c a s , i s e n t a s d e u m i d a d e , C o m o v a r i á v e i s f o r a m e s t u d a d o s : lise d a s h e m á c i a s c o m á g u a d e s t i l a d a , à t e m p e r a t u r a a m b i e n t e p o r 10 m i n u -t o s ; f i x a ç ã o e m a c e -t o n a p o r 30 m i n u -t o s , a 4 ° C ; lise d a s h e m á c i a s e f i x a ç ã o e m a c e t o n a e, e s t a b i -l i z a ç ã o em d e s s e c a d o r a p ó s r e t i r a d a d o f r e e z e r , p o r 20 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e . C o m o d i l u e n t e d o s s o r o s f o r a m u t i l i z a d o s P B S e P B S c o n t e n d o T w e e n - 8 0 a 1 % ( P B S - T ) . T e s t e i m u n o e n z i m á t i c o c o m a n t í g e n o s p l a s m o d i a i s — P l a c a s p l á s t i c a s d e f u n d o p l a n o ( N U N C ) f o r a m s e n s i b i l i z a d a s c o m 100/^1 d e a n -t í g e n o p l a s r n o d i a l , o b -t i d o a p a r -t i r d e c u l -t u r a , a p ó s c o n c e n t r a ç ã o c o m p i a s m a g e l q u a n d o a p a -r a s i t e m i a e -r a m e n o -r q u e 5°/b, lise d a s h e m á c i a s e e x t r a ç ã o d o s c o m p o n e n t e s a n t i g ê n i c o s c o m u r é i a 8 M1 2, n a c o n c e n t r a ç ã o d e 5 \x\/m\ ( m é t o d o d e W a r b u n g C h r i s t i a n ) , p r e v i a m e n t e a l c a -l i n i z a d o c o m t a m p ã o c a r b o n a t o - b i c a r b o n a t o 0 , 0 6 M p H 9.6 p o r 2 h o r a s a 3 7 ° C e 18 h o r a s a 4 ° C . A p ó s l a v a g e n s c o m P B S - T p o r t r ê s vezes as p l a c a s f o r a m b l o q u e a d a s c o m s o l u ç ã o a 1 °7o s o r o a l b u m i n a b o v i n a ( B S A ) e m t a m p ã o c a r b o -n a t o p o r 1 h o r a a 3 7ÜC . A p ó s n o v o c i c l o d e lav a g e n s f o r a m a d i c i o n a d o s 100 ¿¿1 d o s s o r o s p a -d r ã o p o s i t i v o e p a -d r ã o n e g a t i v o -d i l u í -d o s e m P B S c o n t e n d o B S A a 1 % . A p ó s i n c u b a ç ã o p o r 1 h o r a a 3 7 ° C e n o v o ciclo d e l a v a g e n s foi a d i -c i o n a d o 100 ¡Á\ d e -c o n j u g a d o e n z i m á t i -c o d i l u í d o s e g u n d o o t í t u l o , e m P B S T . A p ó s n o v a i n c u b a ç ã o p o r 1 h o r a a 3 7 ° C e n o v o c i c l o d e l a v a g e n s a r e a ç ã o e n z i m á t i c a foi r e l e v a d a p e l a a d i -ç ã o d e o r t o f e n i l e n o d i a m i n a e m t a m p ã o c i t r a t o p H 5,0 c o n t e n d o á g u a o x i g e n a d a . A p ó s i n c u b a -ç ã o p o r 30 m i n u t o s à t e m p e r a t u r a a m b i e n t e e n a a u s ê n c i a d e c l a r i d a d e a r e a ç ã o e n z i m á t i c a foi i n t e r r o m p i d a p e l a a d i ç ã o d e H C 1 2 M . A l e i t u r a d a p l a c a foi feita e m a p a r e l h o M i n i r e a d e r a 4 9 2 n m . O t e s t e i m u n o e n z i m á t i c o p a d r o n i z a d o foi a p l i c a d o p a r a s o r o s d e i n d i v í d u o s p r i m o i n f e c t a d o s p o r P . f a l c i p a r u m o u P . v i v a x , p a r a i n d i -v í d u o s c o m i n f e c ç õ e s m i s t a s e p a r a i n d i -v í d u o s n ã o m a l á r i c o s . P a r a esse e s t u d o o s s o r o s f o r a m d i l u í d o s a 1 / 1 0 0 o u a 1/50 e 1 / 1 0 0 . O t í t u l o e m a n t i c o r p o s d o s o r o foi c a l c u l a d o p e l a s f ó r m u -l a s : L o g D O D — L o g D O C . O . p a r a u m a d i l u i ç ã o d o s o r o e T = L o g D l + + ( L o g DODI — L o g D O C . O . ) ( L o g D2 — Log D l ) L o g D O D I - Log D O D 2 p a r a d u a s d i l u i ç õ e s d o s o r o K _ A L° S P O D D , D l e D 2 — d i l u i ç õ e s A Log D d e s o r o D O = d e n s i d a d e ó p t i -c a o b t i d a O " c u t o f f " d o t e s t e foi d e t e r m i n a d o p e l a f ó r -m u l a : C O . = X f 2 S D a p a r t i r d e 2 0 s o r o s n e g a t i v o s , o n d e X = m é d i a a r i t m é t i c a d o s s o r o s n ã o r e a g e n t e s e S D = d e s v i o p a d r ã o o b t i d o R E S U L T A D O S A s m é d i a s g e o m é t r i c a s d o s t í t u l o s d e 10 s o -r o s -r e a g e n t e s n o t e s t e d e i m u n o f l u o -r e s c ê n c i a in-d i r e t a c o m a n t í g e n o s in-d e P . f a l c i p a r u m o b t i in-d o s a p a r t i r d e c u l t u r a e c o n j u g a d o s a n t i I g G e a n t i I g M e a p a r t i r d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s e c o n j u g a d o s a n t i I g G e s t ã o e x p r e s s a s n a t a -b e l a 1. T a m b é m s ã o a p r e s e n t a d o s o s r e s u l t a d o s o b t i d o s n a s d i f e r e n t e s v a r i á v e i s t é c n i c a s e s t u -d a -d a s .

(4)

T A B E L A 1 T A B E L A 2

Média g e o m é t r i c a dos t í t u l o s d e 1 0 soros r e a g e n t e s n o teste de i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a c o m a n t í g e n o s de P. falciparum, de c u l t u r a e d e sangue d e p a c i e n t e s p r i m o

i n f e c t a d o s , frente a diferentes variáveis técnicas.

Variável técnica A n t í g e n o de c u l t u r a C o n j u g a d o s a n t i IgG a n t i IgM 6 4 , 9 8 4 5 2 , 5 5 6 4 , 9 8 6 8 5 , 9 3 1 5 , 3 1 5 5 1 9 , 8 4 1 6 , 2 4 4 5 2 , 5 5 1 4 , 1 4 1 2 1 , 2 6 1 6 , 2 4 2 5 9 , 9 2 S N R 2 8 , 2 8 S N R 5 6 , 5 7 A n t í g e n o d e sangue h u m a n o C o n j u g a d o s a n t i I g G 2 0 , 0 0 1 3 9 , 2 9 2 1 , 4 4 1 9 6 , 9 8 S N R 6 4 , 9 8 S N R 4 5 , 9 5

Variáveis técnicas A - lise das h e m á c i a s c o m água destilad a ^ fixação destiladas lâminas c o m a c e t o n a ; C — lise destiladas h e -mácias e fixação c o m a c e t o n a e D — estabilização n o des-secador.

S N R - t o d o s os soros foram n ã o reagentes.

Médias g e o m é t r i c a s d o s t í t u l o s de 10 soros reagentes n o t e s t e de i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a c o m a n t í g e n o s de P. vivax o b t i d o s de p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s frente a

diferentes variáveis técnicas.

Variável técnica A n t í g e n o d e sangue h u m a n o liçõe s do s soro s PB S Twee n 8 0 A B C D C o n j u g a d o liçõe s do s soro s PB S Twee n 8 0 A B C D Anti-IgG Anti-IgM liçõe s do s soro s PB S Twee n 8 0 A B C D 2 6 0 1 1 1 4 121 1 8 1 0 S N R 2 7 9 12 3 2 0 5* A S N R S N R i—i _B _{6 4 0} _{3 4} SP C 13 S N R D 5 9 7 4 9

Variável técnica A - lise c o m h e m á c i a s c o m água destilada; B fixação d a l â m i n a c o m a c e t o n a ; C lise das h e -mácias e fixação c o m a c e t o n a e D - estabilização n o dessecador. S N R - t o d o s os soros foram n ã o r e a g e n t e s . C o n f o r m e i n d i c a d o n a t a b e l a 1 o s a n t í g e -n o s o b t i d o s a p a r t i r d e c u l t u r a f o r -n e c e r a m m a i o r r e a t i v i d a d e d o q u e o s a n t í g e n o s o b t i d o s d e s a n g u e h u m a n o p a r a a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g G . D a s v a r i á v e i s t é c n i c a s e s t u d a d a s m e l h o r e s r e s u l t a d o s f o r a m o b t i d o s q u a n d o a s l â -m i n a s f o r a -m f i x a d a s e -m - a c e t o n a o u q u a n d o s e n s i b i l i z a d a s e m d e s s e c a d o r c o m s o r o s d i l u í -d o s e m P B S c o n t e n -d o 1 % -d e T w e e n 8 0 . A l é m d a m a i o r r e a t i v i d a d e d o s s o r o s p o s i t i v o s , o s s o -r o s n ã o -r e a g e n t e s e d e o u t -r a s p a -r a s i t o s e s n ã o a p r e s e n t a r a m n e n h u m a c o l o r a ç ã o d e f u n d o q u e p u d e s s e a t r a p a l h a r a i n t e r p r e t a ç ã o d o s r e s u l t a -d o s , f a t o o b s e r v a -d o q u a n -d o o s a n t í g e n o s f o r a m o b t i d o s a p a r t i r d e s a n g u e d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s . A s m é d i a s g e o m é t r i c a s d o s t í t u l o s d e 10 s o r o s r e a g e n t e s n o t e s t e d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a c o m a n t í g e n o s d e P . v i v a x o b t i d o s a p a r -tir d e s a n g u e d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s e c o n j u g a d o s a n t i - I g G e a n t i - I g M b e m c o m o a s v a r i á v e i s t é c n i c a s e s t u d a d a s , e s t ã o e x p r e s s a s n a t a b e l a 2 . O s d a d o s a p r e s e n t a d o s n a T a b e l a 2 m o s -t r a m a m a i o r r e a -t i v i d a d e , d o s a n -t í g e n o s f i x a d o s e m a c e t o n a o u e s t a b i l i z a d o s a t e m p e r a t u r a a m -b i e n t e e m d e s s e c a d o r , q u a n d o d i l u í d o s e m P B S c o n t e n d o 1 % T w e e n - 8 0 . A f i g u r a 1 m o s t r a o s r e s u l t a d o s o b t i d o s n a p a d r o n i z a ç ã o d o t e s t e E L I S A . D a s c o n d i ç õ e s e n s a i a d a s m e l h o r e s r e s u l t a d o s f o r a m o b t i d o s q u a n d o a c o n c e n t r a ç ã o d e a n t í g e n o s foi f i x a d a 2 , 0 1.0 -o,i> •— • < * • « 1 < 4 0 8 0 1 6 0 3 2 0 6 4 0 1 2 8 0 2 5 6 0 5 1 2 0 D I L U I Ç Ã O D O S S O R O S

Fig. 1 — C u r v a s dose-resposta de soros p a d r ã o positivos e p a d r ã o negativos, o b t i d o s n o teste E L I S A , p a r a pesquisa de a n t i c o r p o s IgG a n t i - P . f a l c i p a r u m .

(5)

2 0 t -+

+

-E

+

-E -E + -E + + -E + < 4 5 9 0 1 8 0 3 6 0 7 2 0 1 4 4 0 2 8 8 0 5 7 6 0 11520 2 3 0 4 0 4 6 0 8 0

11

TÍTULOS DOS SOROS

Fig. 2 — Curva de distribuição de títulos em anticorpos IgG anti F. fatcipaum no teste E L I S A obtida a partir de u m a única dilui-ção dos soros.

e m 5 Mg/ml e as d i l u i ç õ e s d o c o n j u n t o e m 1 / 1 0 . 0 0 0 . N e s t a s c o n d i ç õ e s o b t i v e m o s u m a li-n e a r i d a d e e li-n t r e o log d a s d e li-n s i d a d e s ó p t i c a s e a s d i l u i ç õ e s d o s s o r o s . A f i g u r a 2 m o s t r a a c u r v a d e d i s t r i b u i ç ã o d e t í t u l o s d o s s o r o s e s t u d a d o s , e s t a b e l e c e n d o c o m o " c u t o f f " o t í t u l o i g u a l a 9 0 . C o m o p o d e -m o s o b s e r v a r d o s 20 s o r o s d e i n d i v í d u o s n ã o m a l á r i c o s , a p e n a s 1 s o r o a p r e s e n t o u t í t u l o 118 s e n d o c o n s i d e r a d o r e a g e n t e . D o s sete s o r o s d e p a c i e n t e s c o m m a l á r i a q u e a p r e s e n t a r a m t í t u l o s i n f e r i o r e s a 9 0 n o t e s t e E L I S A , t r ê s e r a m d e p a -c i e n t e s p r i m o i n f e -c t a d o s p e l o P . v i v a x , d o i s e r a m d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s p e l o P . falc i p a r u m e d o i s d e p a falc i e n t e s n ã o p r i m o i n f e falc t a -d o s c o m i n f e c ç ã o a t u a l p e l o P . v i v a x . O e s t u d o c o m p a r a t i v o d o t e s t e E L I S A , c o m c o m p o n e n t e s a n t i g ê n i c o s d e P . f a l c i p a r u m e 1EÍ c o m a n t í g e n o s d e P . f a l c i p a r u m ( I F I - P f ) e P . v i v a x ( I F Í - P v ) e s t á a p r e s e n t a d o n a s t a b e l a s 3 , 4 , 5 , 6 e 7 . P a r a o s p a c i e n t e s p r i m o in-f e c t a d o s , t a b e l a 3 , p e l o P . in-f a l c i p a r u m , 2 s o r o s f o r a m n e g a t i v o s n o t e s t e E L I S A , e m b o r a t a m -b é m f o s s e m n e g a t i v o s n a I F I - P f . N o s p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s p e l o P . v i v a x o t e s t e E L I S A foi n e g a t i v o e m 3 d o s c i n c o c a s o s e s t u d a d o s . O m e s m o r e s u l t a d o foi o b t i d o n o t e s t e EFI-Pf. N o s p a c i e n t e s c o m m a i s d e u m a m a l á r i a , t a b e l a 4 , o t e s t e E L I S A e a I F I - P f f o r a m p o s i t i v o s e m t o d o s o s c a s o s q u a n d o a i n f e c ç ã o a t u a l e r a p e l o P . f a l c i p a r u m . Q u a n d o a i n f e c ç ã o a t u a l e r a p e -l o P . v i v a x f o r a m o b s e r v a d o s 2 s o r o s n e g a t i v o s T A B E L A 3 R e s u l t a d o s d o teste i m u n o e n z i m á t i c o , E L I S A e d o teste de i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a c o m a n t í g e n o d o

P. falciparum (IFI-Pf) e P. vivax (IFI-Pv) n a t i t u l a ç ã o de a n t i c o r p o s I g G e m soros de p a c i e n t e s

p r i m o i n f e c t a d o s p e l o P . falciparum (7 casos) e P . vivax (5 casos).

P r i m o i n f e c ç ã o

P. falciparum P. vivax

E L I S A IFI-Pf IFI-Pv E L I S A IFI-Pf IFI-Pv

2 9 4 4 1 5 1 2 0 160 2 6 1 20 1 2 8 0 8 4 8 5 1 2 8 0 80 9 S N R 4 0 1 0 4 5 1 6 0 S N R 3 0 3 0 160 160 5 6 2 20 S N R 1 S N R S N R 1 8 7 80 S N R 1 S N R S N R 37 S N R S N R - — -17 S N R S N R - - -S N R — -S o r o n ã o r e a g e n t e " C u t off" = 9 0

(6)

p e l o t e s t e E L I S A e a p e n a s 1 s o r o n e g a t i v o n a I F I P f . N o s i n d i v í d u o s c o m i n f e c ç ã o m i s t a , t a -b e l a 5 , n ã o h o u v e d i f e r e n ç a n a r e a t i v i d a d e d o t e s t e E L I S A e I F I P f . O t e s t e E L I S A a p r e s e n -t o u u m f a l s o r e s u l -t a d o p o s i -t i v o n o s i n d i v í d u o s n ã o m a l á r i c o s , f a t o n ã o o b s e r v a d o n o t e s t e I F I -Pf, e m b o r a a l g u n s c a s o s t e n h a m a p r e s e n t a d o d i f i c u l d a d e n a l e i t u r a m i c r o s c ó p i c a . A s m é d i a s g e o m é t r i c a s d o s t í t u l o s d o s s o r o s a p r e s e n t a d o s TABELA 4

Resultados do teste imunoenzimático-ELISA e do teste de imunofluorescência indireta c o m antígenos de

P. f a l c i p a r u m (IFI-Pf) ou P. v i v a x (IFI-Pv) na titulação de anticorpos IgG, em soros de pacientes c o m mais de uma malária e c o m episódio

atual de malária-falciparum ( 3 4 casos) ou malária-vivax ( 1 3 casos).

Infecção Atual

P. f a l c i p a r u m P. v i v a x

ELISA IFI-Pf IFI-Pv ELISA IFI-Pf IFI-Pv

2 4 5 7 6 4 0 S N R 871 1 2 8 0 1 6 0 1 3 1 9 6 4 0 S N R 9 9 3 3 2 0 2 5 6 0 5 6 5 6 4 0 S N R 3 1 9 3 2 0 1 0 2 4 0 1 0 9 0 7 1 2 8 0 S N R 1 7 6 7 2 0 1 2 8 0 176 3 2 0 S N R 1 1 8 8 0 1 0 2 4 0 6 5 5 1 2 8 0 S N R 187 3 2 0 2 0 4 8 0 5 7 6 5 4 0 0 0 0 160 3 0 20 1 0 2 4 0 1 8 6 4 7 2 5 6 0 3 2 0 4 5 5 8 0 4 0 2 1 6 4 2 5 6 0 80 4 6 S N R 2 0 1 8 6 4 7 5 1 2 0 3 2 0 4 2 0 1 1 6 0 1 6 0 1 8 6 4 7 2 5 6 0 1 6 0 5 5 1 9 3 2 0 6 4 0 1 0 0 0 0 5 1 2 0 6 4 0 2 6 1 6 4 0 1 2 8 0 1 3 2 4 7 1 0 2 4 0 2 0 3 1 7 1 1 2 8 0 6 4 0 7 5 9 2 5 6 0 3 2 0 — - -5 9 6 7 1 2 8 0 4 0 - - -1 -1 8 8 6 4 0 4 0 _- - -3 4 6 7 5 1 2 0 4 0 - - -3 0 9 -3 2 5 1 2 0 3 2 0 - - -1 8 8 0 6 4 0 1 6 0 - - -3 0 9 -3 2 2 5 6 0 3 2 0 - - -3 -3 9 6 4 0 8 0 - - -1 5 8 4 1 0 2 4 0 3 2 0 _- - -2 5 -2 -2 3 2 0 4 0 - - -9 1 2 0 2 5 6 0 - -3 2 2 6 4 0 2 5 6 0 - _- -161 3 2 0 2 5 6 0 _- - -165 4 0 3 2 0 - - -8 3 2 3 1 2 8 0 1 2 8 0 - - -108 4 0 4 0 - - -3 8 8 5 6 4 0 6 4 0 - - -8 0 -8 -8 6 4 0 6 4 0 - - -6 2 3 6 4 0 1 2 8 0 - - -1 9 6 0 6 4 0 3 2 0 - - -1 8 6 4 7 2 5 6 0 1 2 8 0 - -

-SNR = Soro não reagente "Cut off" = 9 0

TABELA 5

Resultados d o teste i m u n o e n z i m á t i c o (ELISA) e do teste de imunofluorescência indireta c o m antígeno de

P. f a l c i p a r u m (IFI-Pf) ou P. v i v a x (IFI-Pv) na titulação de anticorpos IgG e m soros de pacientes

c o m infecção mista P. f a l c i p a r u m ou P. v i v a x

(9 casos) ou de indivíduos não maláricos ( 2 0 casos).

Infecção Mista N ã o Maláricos

ELISA IFI-Pf IFI-Pv ELISA IFI-Pf IFI-Pv

1 8 9 4 2 5 6 0 S N R 4 S N R SNR 1 0 1 2 3 1 2 8 0 80 25 S N R SNR 1 4 2 9 9 2 0 4 8 0 80 3 2 SNR SNR 1 5 9 1 0 1 0 2 4 0 80 18 S N R SNR 2 8 1 2 5 6 0 6 4 0 18 SNR SNR 1 2 7 0 2 1 0 2 4 0 1 6 0 26 S N R SNR 4 1 6 9 2 5 6 0 4 0 18 S N R SNR 1 2 3 9 6 4 0 6 4 0 11 S N R SNR 1 8 6 4 7 2 5 6 0 1 2 8 0 2 S N R SNR _ - _ 13 S N R SNR — — 13 S N R SNR — — — 11 S N R SNR - - 16 S N R SNR - - — 9 S N R SNR — — — 22 SNR SNR - - _ 1 1 8 S N R SNR - - — 83 S N R SNR _ _

_-

4 6 S N R SNR — _- _- 57 S N R SNR - - - 77 S N R SNR

S N R = Soro não reagente "Cut off" = 90 n a t a b e l a 6 , m o s t r a m ser o t e s t e E L I S A m a i s r e a t i v o q u e a I F I P f , f a t o n ã o o b s e r v a d o e m r e -l a ç ã o a I F I - P v q u a n d o a i n f e c ç ã o a t u a -l e r a p e -l o P . v i v a x . A t a b e l a 7 m o s t r a o s í n d i c e s d e s e n s i -b i l i d a d e o -b t i d o s n o s d i f e r e n t e s s o r o s t e s t a d o s .

DISCUSSÃO

O t e s t e d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a ( I F I ) é o t e s t e d e r e f e r ê n c i a n a s o r o l o g i a d a m a -l á r i a h u m a n a i i o , u , 22, 23, 25, 30, 31, 38. P o r é m e m b o r a v e n h a s e n d o e m p r e g a d o n a r o t i n a d e v á r i o s l a b o r a t ó r i o s , a s c o n d i ç õ e s t é c n i c a s n o p r e p a r o d o s r e a g e n t e s e n a e x e c u ç ã o d o t e s t e s ã o m u i t o v a r i á v e i s , s e n d o difícil e s t a b e l e c e r u m a c o m p a r a ç ã o s a t i s f a t ó r i a e n t r e d i f e r e n t e s l a b o r a t ó r i o s , o q u e i n v i a b i l i z a u m a d i s c u s s ã o c l a r a s o b r e o s r e s u l t a d o s o b t i d o s . E m r e l a ç ã o à d i l u i ç ã o d o a n t í g e n o q u e d e v e ser c o l o c a d o n a s á r e a s d e l i m i t a d a s d a s l â m i n a s , a m a i o r i a d a s

(7)

T A B E L A 6

Médias g e o m é t r i c a s d o s t í t u l o s de a n t i c o r p o s I g G , o b t i d o s pelos testes i m u n o e n s a i o E L I S A e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a c o m a n t í g e n o s de P . falciparum (IFI-Pf) e P. vivax

(IFI-Pv) e m p a c i e n t e s c o m m a l á r i a e e m i n d i v í d u o s n ã o m a l á r i c o s .

Casuística E L I S A IFI-Pf IFI-Pv

P r i m o i n f e c t a d o s P . f a l c i p a r u m P. vivax 5 6 0 2 3 1 0 8 20 20 6 1 N ã o p r i m o t a d o c o m infec-ç ã o atual p e l o P . falciparum P. vivax 2 2 4 4 5 0 2 1 0 6 5 106 147 9 8 0 Mista 4 8 5 5 3 4 8 4 137 N ã o maláricos 20 S N R S N R S N R = S o r o n ã o r e a g e n t e t é c n i c a s d e s c r i t a s n a l i t e r a t u r a p r e c o n i z a o s m é -t o d o s p o r -t e n -t a -t i v a s . C o m b a s e n o s -t r a b a l h o s d e s c r i t o s p o r L Ó P E Z - A N T U N A N O ' * e S U L Z E R e m 1969 foi feita a p a d r o n i z a ç ã o d a d i l u i ç ã o óti-m a d e a n t i g e n o s d e P . falciparuóti-m e d e P . vivax. A f ó r m u l a final p a r a d i l u i ç ã o d a p a p a d e h e m á -cias V D = (2.5 X N ) — 1, o n d e V D é o v o l u m e d o d i l u e n t e n e c e s s á r i o p a r a r e s s u s p e n d e r u m a p a r t e d a p a p a d e h e m á c i a s e N é o n ú m e r o m é -d i o -d e h e m á c i a s p a r a s i t a -d a s c o m e s q u i z o n t e s p o r c a m p o m i c r o s c ó p i c o , f o r n e c e u m p a r â m e t r o i m p o r t a n t e n a p a d r o n i z a ç ã o d o t e s t e . D e v e -se c o n s i d e r a r c o m o i d e a l a d i l u i ç ã o q u e f o r n e c e c e r c a d e 2 0 h e m á c i a s p a r a s i t a d a s p o r c a m p o m i c r o s c ó p i c o c o m o b j e t i v a 4 0 x . D e t e r m i n a d a a d i l u i ç ã o ó t i m a d o a n t í g e n o , f o r a m e s t u d a d a s d i f e r e n t e s v a r i á v e i s t é c n i c a s p a r a se o b t e r u m m á x i m o d e s e n s i b i l i d a d e , e e s p e c i f i c i d a d e n a I F I . N a o p t i m i z a ç ã o d o t e s t e d e i m u n o f l u o r e s -c ê n -c i a i n d i r e t a -c o m a n t i g e n o s d e P . f a l -c i p a r u m p a r a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g G e I g M , e m p r e g a n d o - s e o t e s t e " t " d e S t u d e n t , p a r a a m o s t r a s p a r e a d a s , v e r i f i c o u s e n ã o h a v e r d i f e -r e n ç a e s t a t í s t i c a s i g n i f i c a t i v a e n t -r e as t é c n i c a s d e f i x a ç ã o d a s l â m i n a s e m a c e t o n a e d e e s t a b i l i -z a ç ã o d a s l â m i n a s e m d e s s e c a d o r , q u a n d o o s s o r o s f o r a m d i l u í d o s e m P B S c o n t e n d o 1 % d e T w e e n 8 0 . E s t a o b s e r v a ç ã o foi v á l i d a t a n t o p a -r a a p e s q u i s a d e a n t i c o -r p o s I g G , c o m a n t í g e n o s d e c u l t u r a (t = 1.5; G L = 9; a = 5°7o) o u c o m a n t í g e n o s o b t i d o s a p a r t i r d e s a n g u e d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s (t = 2 . 3 ; G L = 9; a = 5 % ) , c o m o n a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g M (t = 1.0; G L = 9; a = 5 % ) , c o m a n t í g e n o s d e c u l t u r a . H o u v e d i f e r e n ç a s i g n i f i c a t i v a e n t r e as t é c n i c a s d e e s t a b i l i z a ç ã o d a s l â m i n a s e m d e s s e c a d o r , c o m s o r o s d i l u í d o s e m P B S c o n t e n d o \°/o d e T w e e n -80 e as d e m a i s t é c n i c a s e s t u d a d a s . N ã o f o r a m p e s q u i s a d o s a n t i c o r p o s I g M c o m a n t í g e n o s d e P . f a l c i p a r u m o b t i d o s a p a r t i r d e s a n g u e d e p a c i e n tes p o i s a p r e s e n ç a d e a n t i c o r p o s p r e j u d i c a o a n -t í g e n o e falsos r e s u l -t a d o s p o s i -t i v o s o u n e g a -t i v o s f o r a m o b s e r v a d o s ^ 34. par a o p r e p a r o d o a n t í g e n o d e P . vivax a d i f i c u l d a d e m a i o r r e l a c i o n a se c o m a o b t e n ç ã o d e s a n g u e h u m a n o . É n e c e s -s á r i o q u e o p a c i e n t e -seja p r i m o i n f e c t a d o , c o m a l t a p a r a s i t e m i a ( + + + ) e q u e n ã o t e n h a s i d o ' T A B E L A 7

Sensibilidade do teste i m u n o e n z i m á t i c o E L I S A c o m a n t í g e n o s d e P. falciparum e d o teste de i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a c o m a n t í g e n o s de P. falciparum (IFI-Pf) e P. vivax (IFI-Pv) p a r a p e s q u i s a de a n t i c o r p o s I g G c o m limite de confiança de

9 5 % de p r o b a b i l i d a d e , e m p a c i e n t e s c o m diferentes formas de malária.

Casuística E L I S A IFI-Pf IFI-Pv

P r i m o infectados P. falciparum P. vivax 7 1 % ( 2 9 , 0 - 9 6 , 3 ) 4 0 % ( 5,3 - 85,3) 7 1 % ( 2 9 , 0 - 9 6 , 3 ) 4 0 % ( 5,3 - 85,3) 2 9 % ( 3 8 - 7 1 ) 6 0 % ( 1 4 , 6 - 95 ) N ã o p r i m o i n f e c t a d o s c o m

infecção atual p e l o P . falciparum P. vivax 100% ( 8 9 , 8 - 100,0) 8 5 % (54,5 - 98,0) 1 0 0 % ( 8 9 , 8 - 1 0 0 , 0 ) 9 2 % ( 6 3 , 9 - 9 9 , 8 ) 8 2 % ( 6 5 , 5 - 9 3 , 2 ) 1 0 0 % ( 7 5 , 3 - 100,0) Mista 1 0 0 % (66,4 - 1 0 0 , 0 ) 1 0 0 % ( 6 6 , 4 - 1 0 0 , 0 ) 8 9 % (15,7 - 9 9 , 7 )

(8)

t r a t a d o . O ideal seria a o b t e n ç ã o d e a n t í g e n o s d o s a n g u e d e m a c a c o s Saimirí seireus, e x p e r i m e n -t a l m e n -t e i n f e c -t a d o s * . 3 2. N a o p t i m i z a ç ã o d o teste d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a os r e s u l t a -d o s o b t i -d o s f o r a m s e m e l h a n t e s a o s o b t i -d o s c o m a n t í g e n o s d e P . f a l c i p a r u m . P e l a a n á l i s e e s t a t í s tica d o t e s t e " t " d e S t u d e n t , p a r a a m o s t r a s p a -r e a d a s , n ã o h o u v e d i f e -r e n ç a e s t a t í s t i c a significa-tiva e n t r e as t é c n i c a s d e f i x a ç ã o d a s h e m á c i a s em a c e t o n a e d e e s t a b i l i z a ç ã o e m d e s s e c a d o r q u a n -d o , os s o r o s f o r a m -d i l u í -d o s e m P B S c o n t e n -d o 1 % d e T w e e n - 8 0 p a r a a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g M (t = 1.5; G L = 9; a = 5 % ) . P a r a a p e s q u i sa d e a n t i c o r p o s I g G j á h o u v e d i f e r e n ç a e s t a t í s t i -ca s i g n i f i c a t i v a (t = 3 . 2 ; G L = 9; a = 5°7o). E m r e l a ç ã o as d e m a i s t é c n i c a s s e m p r e h o u v e d i f e r e n -ç a s s i g n i f i c a t i v a s . O t e s t e d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a o p t i m i z a d o p a r a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s a n t i P . falciparum f o r n e c e u e x c e l e n t e s r e s u l t a d o s q u a n d o a p l i c a d o e m p o p u l a ç ã o d e á r e a e n -d ê m i c a o u n a s e l e ç ã o -d e -d o a -d o r e s e m b a n c o s -d e s a n g u e d e á r e a s n ã o e n d ê m i c a s . A s c o n d i ç õ e s m e n c i o n a d a s n e s t e t r a b a l h o p e r m i t i r ã o q u e la-b o r a t ó r i o s d e m e n o r p o r t e p o s s a m i n t r o d u z i r e m s u a r o t i n a o teste d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a c o m r e s u l t a d o s c o n f i á v e i s . C o m r e l a ç ã o à o b t e n ç ã o e p r e p a r a ç ã o d e c o m p o n e n t e s a n t i g ê n i c o s d e P . f a l c i p a r u m a p a r t i r d e c u l t u r a , p r o c u r o u s e s e l e c i o n a r c u l t u r a s c o m p a r a s i t e m i a e l e v a d a e f o r m a s e m e s q u i -z o n t e s ^ . C o m p a r a s i t e m i a s i n f e r i o r e s a 5 % foi feita a c o n c e n t r a ç ã o d a s h e m á c i a s p a r a s i t a -d a s e m P l a s m a g e l . A u t i l i z a ç ã o -d o P l a s m a g e l a l é m d e ser m a i s s i m p l e s f o r n e c e u r e s u l t a d o s s u p e r i o r e s a o s o b t i d o s e m g r a d i e n t e s c o l o i d a i s . C o m p a r a s i t e m i a s s u p e r i o r e s a 5 % n ã o foi n e c e s s á r i a a p r é v i a c o n c e n t r a ç ã o d a s h e m á c i a s p a r a s i t a d a s . E m r e l a ç ã o à e x t r a ç ã o d o s c o m p o -n e -n t e s a -n t i g ê -n i c o s d o P . f a l c i p a r u m m e l h o r e s r e s u l t a d o s f o r a m o b t i d o s q u a n d o a o P B S foi a d i c i o n a d a u r é i a 8 M . O a n t í g e n o a s s i m o b t i d o foi e s t á v e l , p o d e n d o ser a r m a z e n a d o e m g e l a d e i r a a 4 ° C p o r v á r i a s s e m a n a s . O t e s t e i m u n o e n z i m á t i c o p a d r o n i z a d o s e g u i u a m e t o d o l o -gia d e s c r i t a i n i c i a l m e n t e p o r V O L L E R e m 1 9 7 44 S e m o d i f i c a d o p o r d i f e r e n t e s p e s q u i s a d o r e s ^ 3(\ 37. 4 2 . 43, 4 4 _ P a r a a p l i c a ç ã o d o t e s t e i m u n o e n z i m á t i c o foi i n i c i a l m e n t e d e t e r m i n a d a a c u r v a d o s e r e s p o s t a f r e n t e a s o r o s p a d r ã o p o s i t i v o s e n e g a t i v o s . O b s e r v a n d o s e u m a l i n e a r i d a d e c o n s t a n -te e n t r e as d i l u i ç õ e s d o s s o r o s e o l o g a r í t i m o d a d e n s i d a d e ó p t i c a o b t i d a s , p o d e - s e e m p r e g a r f ó r m u l a s q u e p e r m i t i r a m q u a n t i f i c a r c o m p r e -c i s ã o o s t í t u l o s d o s s o r o s a p a r t i r d e u m a o u d u a s d i l u i ç õ e s . A c u r v a d e d i s t r i b u i ç ã o d o s t í t u -los d e s o r o s d e i n d i v í d u o s c o m m a l á r i a p o r P . falciparum o u P . vivax e d e i n d i v í d u o s n ã o m a l á r i c o s m o s t r o u q u e s e t e s o r o s d e p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s f o r a m n ã o r e a g e n t e s n o t e s t e E L I S A e m b o r a a p r e s e n t a s s e m e x a m e p a r a s i t o -l ó g i c o p o s i t i v o . D e s t e s , 3 c a s o s e r a m p r i m o in-f e c t a d o s p e l o P . vivax e 2 p e l o P . in-f a l c i p a r u m , o q u e e s t á d e a c o r d o c o m o s d a d o s r e f e r i d o s n a li-t e r a li-t u r a1- - -4. O e s t u d o c o m p a r a t i v o d o t e s t e E L I S A , e I F I c o m a n t í g e n o s d e P . f a l c i p a r u m ( I F I - P f ) e P . vivax ( 1 F I - P v ) p a r a p e s q u i s a d e a n t i c o r p o s I g G , r e v e l o u q u e p a r a s o r o s d e i n d i v í d u o s p r i -m o i n f e c t a d o s a -m b o s o s t e s t e s a p r e s e n t a v a -m f a l s o s r e s u l t a d o s n e g a t i v o s e que" s e n s i b i l i d a d e foi s e m p r e m e n o r p a r a o s i s t e m a h e t e r ó l o g o . P a -r a s o -r o s d e p a c i e n t e s n ã o p -r i m o i n f e c t a d o s c o m m a l á r i a a t u a l p e l o P . f a l c i p a r u m o u m i s t a a s e n s i b i l i d a d e p a r a a m b o s o s t e s t e s , E L I S A e I F I P f foi d e 1 0 0 % , f a t o o b s e r v a d o a p e n a s p a -r a I E I - P v q u a n d o o s p a c i e n t e s a p -r e s e n t a v a m inf e c ç ã o a t u a l p e l o P . v i v a x . T a m b é m infoi o b s e r -v a d o q u e a m é d i a g e o m é t r i c a d o s t í t u l o s f o r a m s e m p r e s u p e r i o r e s c o m o s s i s t e m a s h o m ó l o g o s . C o m r e l a ç ã o à e s p e c i f i c i d a d e , o b s e r v o u - s e u m s o r o f a l s o p o s i t i v o n o t e s t e E L I S A . O s r e s u l t a d o s o b t i d o s n o p r e s e n t e t r a b a l h o s u g e r e m ser o t e s t e E L I S A u m a b o a a l t e r n a t i v a p a r a s u b s t i t u i r o t e s t e d e i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a , q u a n d o n ã o se d i s p õ e d e m i c r o s c ó p i o d e f l u o r e s c ê n c i a . O q u e l i m i t a , n o m o m e n t o , a u t i l i z a ç ã o d o t e s t e E L I S A , e m l a r g a e s c a l a , é a o b t e n ç ã o d e a n t í g e n o s e a q u a l i d a d e d o s s u p o r tes i n e r t e s , a l é m d e n e c e s s i t a r d e m e l h o r a v a l i a -ç ã o n o s p a c i e n t e s p r i m o i n f e c t a d o s . S U M M A R Y H u m a n m a l a r i a : s t a n d a r d i z a t i o n o f s e r o l o g i c tests for individual d i a g n o s t i c and

s e r o e p i d e m i o l o g i c s u r v e y s T h e i n d i r e c t i m m u n o f 1 u o r e s c e n c e a n t i b o d y test ( I F A ) is n o r m a l l y e m p l o y e d as r e f e r e n c e test in t h e s e r o l o g y o f m a l a r i a . In t h i s r e p o r t w e s t a n d a r d i z e d a n d o p t i m i z e d t h e t e s t , for o u r c o n d i t i o n , u t i l i z i n g P . f a l c i p a r u m o b t a i n e d f r o m h u m a n b l o o d o n c u l t u r e a n d P . vivax o b t a i n e d f r o m h u m a n b l o o d as a n t i g e n s , for d e t e c t i o n o f I g G a n d I g M a n t i b o d i e s . S o m e t e c h n i c a l v a r i a b l e s , w e r e t e s t e d a n d b e s t r e s u l t o

(9)

w e r e o b t a i n e d w h e n sera w e r e d i l u t e d in P B S c o n t a i n i n g 1 % T w e e n - 8 0 a n d t h e s l i d e s , c o n t a i n i n g t h e a n t i g e n i c p r e p a r a t i o n w e r e f i x e d in c o l d a c e t o n e or s t a b i l i z e d o n d r i e d air w i t h s i l i c a . T h e E L I S A test w a s s t a n d a r d i z e d f o r P . f a l c i p a r u m a n t i b o d i e s a n d t h e c o m p a r i s o n o f the I F A a n d E L I S A s h o w e d : a) in P . f a l c i p a r u m p r i m e i n f e c t e d p a t i e n t t h e s e n s i t i v i t y w a s 7 1 % for b o t h t e s t s ; b ) in P . v i v a x p r i m e i n f e c t e d p a t i e n t s t h e s e n s i t i v i t y w a s 4 0 % for b o t h t e s t s ; c) in n o n p r i m e i n f e c t e d p a t i e n t s w i t h P . f a l c i p a r u m m a l a r i a t h e s e n s i t i v i t y w a s 1 0 0 % for b o t h t e s t s ; d) in n o n p r i m e i n f e c t e d p a t i e n t s w i t h P . v i v a x m a l a r i a t h e s e n s i t i v i t y w a s 8 5 % for E L I S A a n d 9 2 % f o r I F A ; e) in p a t i e n t s w i t h P . v i v a x a n d P . f a l c i p a r u m m a l a r i a t h e s e n s i t i v i t y w a s 1 0 0 % for b o t h t e s t s . T h e s p e c i f i c i t y w a s 9 5 % f o r E L I S A a n d 1 0 0 % for I F A in n o n m a l a r i a i n d i v i d u a l s . T h e results s h o w e d t h a t t h e E L I S A test c o u l d b e a n a l t e r n a t i v e f o r I F A for I g G a n t i b o d i e s in t h e s e r o l o g y o f m a l a r i a . A G R A D E C I M E N T O S A o C N P q — P r o j e t o d o P o l o n o r o e s t e — P r o c e s s o n? 7 0 . 0 3 5 0 / 8 5 p e l o s u p o r t e f i n a n c e i -r o . A o L a b o r a t ó r i o d e M a l á r i a d a S U C E N p e -l o f o r n e c i m e n t o d e c u -l t u r a d e P . f a -l c i p a r u m n o i n í c i o d o t r a b a l h o e p e l o f o r n e c i m e n t o d e s o r o s d e p a c i e n t e s c o m m a l á r i a . A V e r a d e P a u l a Q u a r t i e r d e O l i v e i r a , R i v a l d o d e S o u z a C a r d o s o e P a u l o d e O l i v e i r a p e -la a s s i s t ê n c i a t é c n i c a n a e x e c u ç ã o d o p r o j e t o . R E F E R E N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S

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