PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
KARIN SILVA CAUMO
CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Acanthamoeba EM ÁGUA DE PISCINAS DA CIDADE DE PORTO ALEGRE, RS
PORTO ALEGRE 2009
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CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Acanthamoeba EM ÁGUA DE PISCINAS DA CIDADE DE PORTO ALEGRE, RS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Marilise Brittes Rott Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Paula Guedes Frazzon
PORTO ALEGRE 2009
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Quero primeiramente agradecer a Deus, que me deu inspiração e vontade de buscar cada dia ser melhor e fazer um trabalho melhor, que esteve comigo em todos os momentos dando-me paciência e determinação para a concretização de meus projetos.
À Drª. Marilise Brittes Rott, minha orientadora, pela sua dedicação e confiança, pelo apoio e por todas as oportunidades proporcionadas de aprendizagem e incentivo. Sua ética científica, sua habilidade de ensinar e o seu empenho incansável em aprimorar o conhecimento serviram-me de exemplo como profissional e professor a ser seguido.
À Drª. Ana Paula Guedes Frazzon, minha co-orientadora, pela sua amizade, incentivo e generosidade sem limites na entrega de seus conhecimentos que tornaram possíveis a concretização deste projeto na parte de biologia molecular.
Às minhas queridas amigas e bolsistas de iniciação científica, Amanda Piccoli Frasson e Lua Ferreira Panatieri, sem elas o trabalho seria muito mais difícil.
Aos professores do programa de Pós-graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente em especial ao Profº e Coordenador José Carlos Germani, pelo seu empenho em buscar melhorias para a realização dos projetos.
Aos professores do Setor de Parasitologia: Profº Kanan, pelo empréstimo de materiais e colaboração em muitos momentos. Ao Prof° Carlos, Profª Neusa e Profª Márcia, pela convivência, amizade e incentivo.
À Silvia Pavan, pelo valioso auxílio técnico prestado em diversas fases e aspectos deste trabalho.
Aos inumeros colegas que passaram pelo Laboratório de Parasitologia em especial aos colegas do grupo da Acanthamoeba, que tornaram meus dias mais agradáveis.
Aos meus pais, Altair e Helena, sem os quais eu não teria chegado até aqui. Não lhes dedico meu trabalho, por que a eles dedico toda minha vida.
Ao meu Querido noivo, Marco Amaral, pelo seu amor, dedicação e incentivo. Ao CNPq pelo auxílio financeiro ao longo destes dois anos.
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Autor: Karin Silva Caumo
Orientadora: Profª. Drª. Marilise Brittes Rott Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Paula Guedes Frazzon
RESUMO
Foram coletadas amostras de água de piscinas térmicas e não térmicas na cidade de Porto Alegre, RS, Brasil entre os meses de maio de 2006 e março de 2007, com o objetivo de determinar a presença do gênero Acanthamoeba, bem como realizar a caracterização fenotípica e genotípica dos isolados. Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli. A identificação dos isolados foi baseada na morfologia dos cistos e trofozoítos e na amplificação por PCR com oligonucleotídeos gênero-específico. O potencial patogênico foi avaliado usando testes de osmotolerância e termotolerância. Das 65 amostras analisadas, 13 (20%) foram positivas para amebas de vida livre e identificados morfologicamente como pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Destas, 9 possuíam características compatíveis com o grupo morfológico II e 4 com o grupo III. Todos os isolados identificados morfologicamente quando submetidos à Reação de PCR, confirmaram pertencer ao gênero Acanthamoeba e 38% (5/13) dos isolados foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Neste estudo, o método molecular de RAPD (“Random Amplified Polymorphic-DNA”) foi utilizado para investigar a relação genética entre os 13 isolados de piscinas e dois isolados de referência da ATCC. De 10 oligonucleotídeos decaméricos testados, quatro foram selecionados por gerarem produtos de amplificação passíveis de análise. A similaridade entre os isolados foi calculada utilizando-se o coeficiente de Jaccard e o dendrograma construído pelo método da média das distâncias entre grupos (“Average Linkage”). Quatro grupos distintos (G1-G4) de isolados foram formados de acordo com a similaridade genética entre eles. Sugeriu-se que os isolados do G1 por agruparem-se aos isolados de referência de A. castellanii (ATCC 30010 e 50492) possam pertencer a esta espécie. Os dados fenotípicos, tais como, morfologia e testes de tolerância foram relacionados aos dados genotípicos de RAPD e permitiram a caracterização dos isolados. Os resultados deste primeiro estudo de isolamento e caracterização de Acanthamoeba de água de piscinas na cidade de Porto Alegre-RS, Brasil confirmam a presença de isolados potencialmente patogênicos que podem representar um risco à saúde humana.
Palavras-chave: Acanthamoeba, amebas de vida livre, piscinas, patogenicidade, RAPD. 1
Dissertação de Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente. Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, RS, Brasil (100 p.). Fevereiro, 2009.
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Author: Karin Silva Caumo Advisor: Profª. Drª. Marilise Brittes Rott Co-advisor: Profª. Drª. Ana Paula Guedes Frazzon
ABSTRACT
Water samples were collected from both heated and unheated swimming pools in the city of Porto Alegre, RS, Brazil between May 2006 and March 2007, to determine the presence of Acanthamoeba in the water of swimming pools as well as perform the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. Amoebae were isolated in monoxenic culture with Escherichia coli. The identification of the isolates was based on the trophozoites and cysts morphology and on the amplification through PCR with genus-specific oligonucleotides. The potential pathogenic was assessed by osmotolerance and temperature tolerance assays. From the 65 samples analyzed, 13 (20%) were positive for free-living amoebae, and the isolates morphologically identified as belonging to the genus Acanthamoeba. Out of these, 9 presented characteristics compatible with morphological group II, and 4 with group III. All the morphologically identified isolates, when submitted to PCR, were confirmed as belonging to the genus Acanthamoeba, and 38% (5/13) of the isolates were considered potentially pathogenic according to osmotolerance and temperature tolerance assays. In this study, the molecular RAPD method (Random Amplified Polymorphic-DNA) was used to investigate the genetic relationship among 13 isolates from swimming pools and two strains from the ATCC reference. From the ten decameric oligonucleotides tested, four were selected for generating products of amplification possible to be analyzed. The similarity between isolates was calculated using the Jaccard coefficient and the dendrogram constructed by using the method of the average distances between groups (“Average Linkage”). Four distinct groups (G1-G4) of isolates were separated according to genetic similarity between them. It was suggested that the isolates from G1 once group up with the reference isolates of A. castellanii may belong to this species. The phenotypic data such as morphology and tolerance tests were related to RAPD genotypic data and led to the characterization of isolates. The results of this study about isolation and characterization of Acanthamoeba in swimming pools water at Porto Alegre, RS, Brazil confirm the presence of potentially pathogenic isolates which can present risks to human health.
Keywords: Acanthamoeba, free-living amoebae, swimming pools, pathogenicity, RAPD.
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Master of Science dissertation in Agricultural and Environmental Microbiology, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (100 p.). Fevereiro, 2009.
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Figura 1 - Trofozoítos de Acanthamoeba ... 13
Figura 2 – Classificação taxonômica de amebas de vida livre ... 15
Figura 3 - Ciclo de vida de Acanthamoeba ... 18
Figura 4 - Trofozoíto de Acanthamoeba multinucleado obtido de cultivo em meio líquido e corado com tricrômico ... 19
Figura 5 - Morfologia do cisto de Acanthamoeba do grupo I ... 20
Figura 6 - Morfologia do cisto de Acanthamoeba do grupo II ... 21
Figura 7 - Morfologia do cisto de Acanthamoeba do grupo III ... 21
Figura 8 - Olho infectado por Acanthamoeba exibindo epitélio ulcerado, infiltração no estroma e opacidade na córnea, típicos de ceratite aguda ... 28
Figura 9 - Fatores de risco que contribuem para ceratite por Acanthamoeba spp. ... 29
Figura 10 - Cistos e trofozoítos de Acanthamoeba em cultivo monoxênico ... 50
Figura 11 - Cistose trofozoítos de Acanthamoeba em placa de ágar não-nutriente com crescimento de fungo filamentoso ... 50
Figura 12 - Cultivo em meio líquido (PYG) de AVL com a presença de bactérias ... 51
Figura 13 - Trofozoítos e cistosde Acanthamoeba em cultivo axênico ... 51
Figura 14 - Médias dos valores correspondentes aos parâmetros físico-químicos da água de piscinas térmicas e não-térmicas ... 53
Figura 15 - Trofozoíto característico do gênero Acanthamoeba ... 57
Figura 16 - Dupla parede dos Cistos de Acanthamoeba ... 57
Figura 17 - Cistos de Acanthamoeba do isolado PO1 corados com tricrômico ... 59
Figura 18 - Trofozoítos de Acanthamoeba do isolado PTI3 corados com tricrômico .... 59
Figura 19 - Cistos e trofozoítos de Acanthamoeba do isolado PTO5 corados com tricrômico ... 59 Figura 20 - Cistos e trofozoítos de Acanthamoeba do isolado PTI5 corados com
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Figura 21 - Trofozoítos e cisto de Acanthamoeba do isolado PTM6 corados com
tricrômico ... 59
Figura 22 - Cistos de Acanthamoeba do isolado PTM6 corados com tricrômico ... 59
Figura 23 - Trofozoítos de Acanthamoeba do isolado P21 ... 60
Figura 24 - Cisto de Acanthamoeba do isolado P21, grupo II ... 60
Figura 25 - Isolado de Acanthamoeba (PTI6), cistos do grupo II ... 60
Figura 26 - Isolado de Acanthamoeba (PTA2), cistos do grupo II ... 60
Figura 27 - Isolado de Acanthamoeba (PTI5), cistos do grupo II ... 60
Figura 28 - Isolado de Acanthamoeba (PTI2), cistos do grupo III ... 60
Figura 29 - Isolado de Acanthamoeba (PTI8), cistos do grupo III ... 60
Figura 30 - Análise molecular do gene 18S ssu rDNA ... 65
Figura 31 - Perfis de RAPD de 15 isolados de Acanthamoeba obtidos com o oligonucleotídeo iniciador OPC 05 ... 67
Figura 32 - Perfis de RAPD de 15 isolados de Acanthamoeba obtidos com o oligonucleotídeo iniciador OPC 06 ... 68
Figura 33 - Perfis de RAPD de 15 isolados de Acanthamoeba obtidos com o oligonucleotideo iniciador OPC 09 ... 68
Figura 34 - Perfis de RAPD de 15 isolados de Acanthamoeba obtidos com o oligonucleotídeo iniciador OPC 10 ... 69
Figura 35 - Dendrograma obtido a partir dos valores de similaridade genética por RAPD utilizando o coeficiente de Jaccard e a análise de agrupamento pelo Método de Ligação Média entre isolados de piscinas do gênero Acanthamoeba e isolados de referência...69
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Tabela 1 - Genótipos de Acanthamoeba e suas associações com doenças humanas (ceratites e encefalites) ... 23 Tabela 2 - Oligonucleotídeos iniciadores empregados nas reações de amplificação de RAPD para a caracterização de Acanthamoeba ... 45 Tabela 3 - Relação de clubes visitados, número de piscinas, tipo de piscina, número de amostras positivas e isolados obtidos ... 49 Tabela 4 - Caracterização morfológica de isolados de AVL de água de piscinas ... 58 Tabela 5 - Diferenciação da patogenicidade de isolados de Acanthamoeba por testes de tolerância... 63
ix 1. INTRODUÇÃO...11 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 13 2.1 O gênero Acanthamoeba ... 13 2.2 Classificação taxonômica ... 14 2.3 Distribuição Ambiental ... 15
2.4 Morfologia e ciclo de vida ... 17
2.4.1 Classificação morfológica de Acanthamoeba ... 20
2.5 Outras classificações ... 22
2.6 RAPD - “Random Amplified Polymorphic DNA”: marcador molecular para a caracterização de Acanthamoeba ... 24
2.7 Infecções causadas por Acanthamoeba...26
2.7.1 Ceratite por Acanthamoeba . ... 27
2.7.2 Encefalite Amebiana Granulomatosa (EGA) ... 30
2.8 Acanthamoeba e bactérias endossimbiontes ... 31
2.9 Fatores de virulência que contribuem para infecções por Acanthamoeba... 32
2.9.1 Marcadores de patogenicidade de Acanthamoeba ... 33
2.10 Presença de Acanthamoeba em piscinas... 34
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 36
3.1 Organismos e cultivo ... 36
3.1.1 Isolados de referência da ATCC ... 36
3.1.2 Isolados de água de piscinas ... 36
3.1.3 Cultivo dos isolados de Acanthamoeba ... 36
3.1.4 Isolado bacteriano ... 37
3.1.5 Cultivo de Escherichia coli ... 37
3.2 Isolamento e identificação de Amebas de Vida Livre (AVL) a partir de água de piscinas ... 37
3.2.1 Coleta e concentração de amostras de água de piscinas ... 37
3.2.2 Isolamento de amebas de vida livre ... 38
3.2.3 Obtenção de culturas monoxênicas ... 38
3.2.4 Obtenção de culturas axênicas ... 39
3.2.5 Indução ao encistamento ... 39
3.2.6 Coloração de cistos e trofozoítos ... 40
3.3 Identificação morfológica de isolados do gênero Acanthamoeba ... 40
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3.4 Estudo da patogenicidade de isolados de Acanthamoeba por testes de tolerância 41
3.4.1 Teste de Osmotolerância ... 42
3.4.2 Teste de Termotolerância ... 42
3.5 Identificação molecular dos isolados de Acanthamoeba ... 43
3.5.1 Extração de DNA total de Acanthamoeba ... 43
3.5.2 Quantificação do DNA de Acanthamoeba ... 44
3.5.3 Confirmação do gênero Acanthamoeba por Reação em Cadeia da Polimerase .... 44
3.5.4 Amplificação do DNA de Acanthamoeba por RAPD ... 45
3.5.5 Análise dos fragmentos amplificados por PCR e RAPD ... 46
3.5.6 Cálculo das estimativas de distância genética entre os isolados ... 46
3.6 Análises dos dados... 47
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 48
4.1 Isolamento de amebas de vida livre em água de piscinas ... 48
4.2 Avaliação dos parâmetros físico-químicos da água de piscinas ... 52
4.3 Identificação morfológica dos isolados de AVL ... 55
4.3.1 Teste de exflagelação ... 55
4.3.2 Identificação morfológica dos isolados de AVL do gênero Acanthamoeba ... 56
4.4 Estudo da patogenicidade de isolados de Acanthamoeba por testes de tolerância 62 4.5 Identificação molecular dos isolados de Acanthamoeba ... 65
4.5.1 Confirmação do gênero Acanthamoeba por Reação em Cadeia da Polimerase .... 65
4.5.2 Caracterização de isolados do gênero Acanthamoeba por RAPD ... 66
5. CONCLUSÕES ... 76
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 77
7. APÊNDICES ... 95
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, com o aumento do número de casos clínicos de ceratite por Acanthamoeba em diversos países, muitos pesquisadores têm apresentado interesse no estudo destes organismos, pois podem se mostrar patogênicos ao homem causando um impacto negativo na saúde de milhares de pessoas. Acanthamoeba é um protozoário de vida livre, ubiqüitária na natureza e muito encontrada em ambientes aquáticos antropogênicos. Apresenta forma de resistência em condições ambientais adversas, o que permite a sua sobrevivência a tratamentos físico-químicos da água para consumo humano e de uso recreacional. Estas amebas são organismos anfizóicos, pois podem ser encontrados livres no ambiente ou como parasitos facultativos no homem, com o potencial para causar infecções envolvendo o cérebro, pele, pulmão e olhos. Dentre as infecções causadas por Acanthamoeba, a ceratite amebiana é a única síndrome relacionada à água e tornou-se significativamente importante principalmente devido ao aumento de usuários de lentes de contato, mais predispostos ao desenvolvimento de infecções oculares.
Vários estudos têm sido desenvolvidos em sistemas de água, rios e piscinas a fim de determinar a abundância de amebas de vida livre em ambientes aquáticos. No Brasil, alguns trabalhos de isolamento destas amebas a partir de diversas fontes ambientais já foram realizados, entretanto os dados são escassos quanto à sua caracterização. A determinação correta da taxonomia dentro do gênero, etapa inicial de análise de qualquer organismo posterior ao processo de isolamento, é um fator essencial para a realização de estudos relacionados à ecologia, patogenicidade e epidemiologia. O uso de técnicas de biologia molecular poderá ser utilizado para o refinamento da identificação morfológica clássica, dando mais confiabilidade aos resultados. Estudos moleculares têm sido realizados na busca de padrões genéticos nestes organismos que auxiliem na sua caracterização. Entre as técnicas baseadas em marcadores moleculares, o RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”) é uma ferramenta muito útil, por ser uma forma rápida e fácil para avaliar a diversidade genética entre organismos, sem a necessidade de grandes quantidades de DNA.
Alguns trabalhos têm mostrado que isolados patogênicos de Acanthamoeba exibem crescimento à temperatura e osmolaridade aumentadas e estes determinantes fisiológicos
podem ser usados na diferenciação e prévia caracterização de isolados clínicos e ambientais. Um ponto bastante interessante a ser esclarecido e de grande interesse em saúde pública é se todas as amebas de vida livre (AVL) encontradas normalmente no ambiente são potencialmente patogênicas, ou se só alguns desses organismos seriam capazes de provocar infecções.
Levando em consideração que a piscina é um elemento relacionado à saúde da comunidade e que a água reservada nesses tanques, pode veicular amebas de vida livre potencialmente patogênicas, o objetivo do presente trabalho foi determinar a presença do gênero Acanthamoeba em água de piscinas da cidade de Porto Alegre - RS, Brasil, bem como avaliar o potencial patogênico dos isolados e determinar o perfil genotípico a partir da técnica de RAPD. A caracterização fenotípica e genotípica dos isolados de água de piscinas, poderá prestar informações importantes sobre as formas amebianas presentes nessas águas, úteis tanto do ponto de vista acadêmico, como também para a população em geral. O entendimento da diversidade destes organismos e o papel ocupado por estes protozoários nas águas das piscinas poderão auxiliar na aplicação de medidas de controle.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O gênero Acanthamoeba
As amebas de vida livre (AVL) são protozoários unicelulares com ampla distribuição ambiental. Podem ser encontradas no solo, ar atmosférico e ambientes aquáticos, tais como, água doce e salgada (RODRIGUEZ-ZAGORA, 1994; LIU et al., 2006). Acanthamoeba, Hartmannella e Naegleria são as principais AVL potencialmente patogênicas para o homem e animais e estão relacionadas com meningoencefalites, ulcerações da pele e infecções da córnea (SCHUSTER & VISVESVARA, 2004a). O gênero Acanthamoeba é um grupo de aproximadamente 25 espécies distribuídas mundialmente (BOOTON et al., 2005). Isolados patogênicos do gênero têm ganho cada vez mais relevância médica principalmente como agentes causadores de ceratite amebiana, uma vez que, atingem individuos imunocompetentes (Figura 1).
Figura 1 - Trofozoítos de Acanthamoeba
A Acanthamoeba foi primeiramente isolada de poeira em 1913 por Puschkarew e chamada de Amoeba polyphagus (PAGE, 1967). Em 1931, Volkonsky criou a denominação de gênero Acanthamoeba. Em 1930, Castellani isolou uma ameba que estava contaminando uma placa de cultura de levedura, e foi subseqüentemente chamada de Acanthamoeba castellanii. Page (1967) reescreveu A. polyphagus como Acanthamoeba polyphaga. O interesse médico e epidemiológico com relação as AVL começou quando Culbertson et al. (1958) durante a produção de vacinas para a poliomielite, observaram o desenvolvimento de placas de algum organismo contaminante da cultura celular. O fluido dessas placas quando inoculado em ratos e macacos levava-os à morte por encefalite, os contaminates destas culturas eram cistos e trofozoítos de amebas identificadas como pertencente ao gênero Acanthamoeba.
2.2 Classificação taxonômica
Com relação à taxonomia das AVL, as primeiras identificações eram baseadas em critérios morfológicos. Os trabalhos mais recentes incluem novos dados provenientes de estudos de seqüenciamentos genômicos dos genes 16S e 18S rDNA (DE JONCKHEERE, 2003; STOTHARD et al., 1998). De acordo com o sistema de classificação taxonômico os gêneros Acanthamoeba e Balamuthia foram classificados como pertencentes à família Acanthamoebidae. B. mandrillaris, originalmente descrita como uma ameba da ordem Leptomyxida, foi incluída na família Acanthamoebidae (CORLISS, 1998) com base nos dados do seqüenciamento do gene 16S rDNA (ZETTLER et al., 2000; BOOTON et al., 2003) (Figura 2).
Atualmente a Sociedade Internacional de Protistologistas criou outro sistema de classificação. De acordo com este novo esquema, os eucariotos tem sido classificados em seis grupos, ou “super-grupos”, chamados de Amoebozoa, Opisthokonta, Rhizaria, Archaeplastida, Chromalveolata e Excavata. Acanthamoeba e Balamuthia foram incluídas no grupo Amoebozoa: (Acanthamoebidae), Hartmannella também foi incluída no grupo
Amebozoa (Tubulinea: Tubulinida) enquanto, N. fowleri e Vahlkampfia no grupo Excavata (Heterolobosia: Vahlkampfiidae) (ADL et al. 2005; VISVESVARA & SCHUSTER, 2008a).
2.3 Distribuição ambiental
Acanthamoeba é o gênero mais comum dentre as amebas de vida livre, estima-se que possa ser também o protozoário de vida livre mais comum, o que confere ao gênero uma grande importância ecológica, uma vez que apresenta uma distribuição cosmopolita e tem sido isolada de uma grande variedade de habitats (SCHUSTER & VISVESVARA, 2004a).
São isoladas de praticamente todos os ambientes como solo (MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003; BOOTON et al., 2004; LORENZO-MORALES et al., 2005a) água doce
Reino: Protista Sub-Reino Protozoa Filo: Sarcomastigophora Sub-Filo Sarcodina Super-Classe Rhizopoda Classe: Lobosea Sub-Classe: Gymnamoebia
Ordem: amoebida Schizopyrenida Família: Entamoebidae Hartmannellidae Acanthamoebidae Vahlkampfiidae
Gênero: Entamoeba Hartmannella Acanthamoeba Balamuthia Naegleria Vahlkampfia
Figura 2 - Classificação taxonômica de amebas de vida livre
de lagos e rios (ETTINGER et al., 2003; MORALES et al., 2005b; LORENZO-MORALES et al., 2006), piscinas (TSVETKOVA et al., 2004; GÓRNIK & KUZNA-GRYGIEL, 2004; GIANINAZZI et al. 2009), sistemas de rede pública (BERNANDER & KALLING, 1998), nas águas aquecidas de sistema hospitalar (ROHR et al., 1998), correntes subterrâneas, água mineral engarrafada e água marinha (LORENZO-MORALES et al., 2005c). Também encontradas em soluções de limpeza contidas em estojos de lentes de contato (MARTINEZ & VISVESVARA, 1997; RADFORD et al., 1998; SHARMA et al., 2000; PARIJA et al., 2001; PENS et al., 2008). Ainda podem ser encontradas no ar (KINGSTON & WARHURST, 1969), nos sistemas umidificados, nos materiais cirúrgicos, nos cultivos celulares e mesmo em aparelhos de ar condicionado (FORONDA, 1996). No homem podem ser encontradas no nariz, na traquéia de pacientes com vias respiratórias afetadas, nas secreções bronquiais, no ouvido e no sistema nervoso central (BYRNE & BURD, 1995; KODET et al., 1998).
Anticorpos anti-Acanthamoeba podem ser detectados no soro de humanos e animais, devido à ampla distribuição destes organismos na natureza e intenso contato com estas populações, sugerindo que as infecções podem ser comuns, porém auto-limitada em um hospedeiro competente (MA et al., 1990; SELL et al., 1997; ARMSTRONG, 2000; MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003). Segundo Chappell et al. (2001) mais de 80% da população de indivíduos aparentemente normais têm anticorpos anti-Acanthamoeba.
Algumas espécies de Acanthamoeba podem comportar-se como parasitos facultativos de seres humanos e animais domésticos existindo sob a forma de vida livre ou parasitária, sendo denominadas anfizóicas (SCHUSTER & VISVESVARA, 2004a). Sua presença no homem é completamente acidental, sendo as patologias a elas associadas, raras e oportunistas. Quando se encontram na forma trofozoítica, se alimentam de bactérias, fungos, outros protozoários e algumas cianobactérias, atuando como fagótrofos nas superfícies aeróbias do solo e sedimentos (DE JONCKHEERE, 1991). Quando invadem o organismo e colonizam o hospedeiro, se nutrem dos seus tecidos (ARMSTRONG, 2000).
2.4 Morfologia e ciclo de vida
Os organismos do gênero Acanthamoeba, isolados pela primeira vez em 1930 por Castellani e inicialmente classificados como Hartmannella, são encontrados sob duas formas em seu ciclo de vida: o trofozoíto, que é a forma vegetativa da célula e o cisto, forma de resistência, que é formado quando as condições do meio não são favoráveis (Figura 3) (PAGE, 1988).
Os trofozoítos se alimentam de bactérias, algas, fungos, leveduras, matéria orgânica ou por inclusão de partículas líquidas. A divisão celular é assexuada ocorrendo por fissão binária e não possuem um estágio flagelar (PRESTON & KING, 1984). São células com tamanhos de 14 a 40 µm de diâmetro, variando significativamente entre isolados pertencentes a diferentes espécies/genótipos (VISVESVARA & SCHUSTER, 2008a). O citoplasma do trofozoíto de Acanthamoeba é abundante e apresenta-se granuloso com movimentos polidirecionais através da emissão de pseudópodes globosos e hialinos, de onde surgem finos pseudópodes semelhantes a espinhos, chamados de acantopódios. Os acantopódios, estruturas características do gênero, são projeções aciculiformes da membrana celular importantes na adesão a superfícies (biológica ou inerte), movimentos celulares e captura de organismos (KHAN, 2006). Geralmente os trofozoítos são uninucleados com um grande nucléolo central, entretanto, células multinucleadas são comuns quando a Acanthamoeba é mantida em culturas líquidas (Figura 4) (MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003). O citoplasma apresenta diversos vacúolos, possui um vacúolo contrátil proeminente, que desaparece temporariamente e reaparece em um movimento de sístole-diástole, responsável pelo controle osmótico da célula, além de vacúolos digestivos. São organismos aeróbicos, mas seus trofozoítos podem se adaptar em ambientes com pouco oxigênio, durante um curto período de tempo (LLOYD et al., 1983; TURNER et al., 2006).
O encistamento das amebas é uma forma de proteção contra fatores adversos como a dessecação, falta de nutrientes e uma variedade de agentes químicos (desinfetantes e antimicrobianos) e físicos (calor, frio, radiação ultravioleta) (AKSOZEK et al., 2002). A viabilidade dos cistos de Acanthamoeba tanto no meio ambiente natural como em laboratório, armazenadas em água a 4°C, é de aproximadamente 25 anos, mantendo pelo menos quando
cultivados in vitro, sua capacidade invasiva por oito anos. Presume-se que no meio natural, a virulência se mantém passados estes 25 anos (MAZUR et al., 1995). A patogenicidade de Acanthamoeba se vê diminuída em torno de 40% quando os cistos são submetidos a períodos de criopreservação superiores há cinco anos, enquanto Naegleria fowleri tem sua virulência aumentada durante os primeiros 30 meses de congelamento (JOHN & JOHN, 1996). Cistos de espécies de Acanthamoeba causadoras de ceratite têm sobrevivido em torno de 14 dias em soluções oftálmicas, incluindo desinfetantes usados para limpeza de lentes (BRANDT et al., 1989). Cond içõe s favor áve is Cond içõe s d es favor áve is (c) (b) (a) (d)
Figura 3 - Ciclo de vida de Acanthamoeba. (a) Cistos de Acanthamoeba, forma de resistência em condições
desfávoráveis, caracterizados pela dupla parede. Barra = 5 µm; (b) Sob condições favoráveis o trofozoíto emerge do cisto. Barra = 6 µm; (c) Forma infectiva de Acanthamoeba, também conhecida como trofozoíto. Barra = 10 µm; (d) Reprodução assexuada por divisão binária. Barra= 10 µm
O tamanho dos cistos do gênero Acanthamoeba pode variar de 10-20 µm de diâmetro. São compostos por celulose (não presente no estágio de trofozoíto), que representa 10% do peso seco total do cisto e diversas proteínas. Possuem duas paredes: o endocisto e o ectocisto. De forma geral, o ectocisto é mais esférico, enquanto o endocisto apresenta diversas formas, que dependendo do isolado, podem variar de triangulares a estreladas. Os cistos apresentam um opérculo, local por onde a ameba sai ao desencistar assim que as condições ambientais se tornam favoráveis. Os dois envoltórios são separados entre si, mas se unem nos ostíolos, que são poros usados para monitorar as alterações ambientais. A distância entre as paredes do cisto e o número de pontos em que o endocisto se comunica com o ectocisto (braços do endocisto) também são variáveis (PAGE, 1988; GIAZZI, 1996; SCHUSTER & VISVESVARA, 2004a).
Figura 4 - Trofozoíto de Acanthamoeba
multinucleado obtido de cultivo em meio líquido e corado com tricrômico. Microscópio óptico (1000X).
Barra = 8 µm
2.4.1 Classificação morfológica de Acanthamoeba
A diferenciação dos gêneros das AVL normalmente é feita através da morfologia dos cistos e trofozoítos, sendo relativamente simples a identificação do gênero Acanthamoeba. Entretanto, a taxonomia do gênero ainda é bastante indeterminada em nível de espécie.
Em 1977, Pussard & Pons propuseram a divisão do gênero Acanthamoeba em três grupos morfológicos com 18 espécies, baseados no tamanho e na forma dos cistos. Os grupos estão assim organizados:
Grupo I – As espécies deste grupo são caracterizadas por apresentarem cistos grandes (16 a 30 µm de diâmetro) quando comparados aos do grupo II e III (VISVESVARA & SCHUSTER, 2008a). Os cistos se caracterizam pela forma estrelada da parede cística interna (endocisto) e a parede externa (ectocisto) é mais ou menos esférica (PUSSARD & PONS, 1977). Suas espécies não são consideradas patogênicas, porém já foi relatado por Fernandez e Crespo em 1992 um caso de infecção cerebral granulomatosa por Acanthamoeba astronyxis (Figura 5).
Figura 5 - Morfologia do cisto de Acanthamoeba do grupo I.
Endocisto estrelado. Microscópio de contraste de fase (1000X). Barra= 6 µm
Grupo II – Neste grupo encontram-se as espécies de Acanthamoeba mais amplamente e comumente isoladas, seus cistos possuem um tamanho médio com diâmetro de 18 µm ou menos, o endocisto pode apresentar-se de forma estrelada, oval, triangular ou quadrangular e o ectocisto segue mais ou menos o contorno do endocisto (KHAN, 2006) (Figura 6).
Grupo III – Compreende as espécies cujos cistos medem aproximadamente 18 µm ou menos de diâmetro, com endocisto arredondado ou globoso, nunca estrelado. O ectocisto fino e liso ou fracamente franzido, justaposto ao endocisto é, às vezes, difícil de ser observado (KHAN, 2006; VISVESVARA & SCHUSTER, 2008a).
Figura 6 - Morfologia do cisto de
Acanthamoeba do grupo II.
Endocisto arredondadoa ou poligonalb e ectocisto enrugadoc. Microscópio de contraste de fase (1000X). Barra = 4 µm
Fonte: Karin Caumo
a
b
Figura 7 - Morfologia do cisto de
Acanthamoeba do grupo III.
Endocisto arredondado e ectocisto fino e liso. Microscópio de contraste de fase (1000X). Barra = 6 µm
Subseqüentemente, a classificação de Pussard & Pons ganhou aceitação, e Page (1988) utilizando os critérios morfológicos sugeridos, juntamente com o comportamento dos trofozoítos em diferentes temperaturas e tipo de locomoção criou uma chave dicotômica para identificação das AVL. Ainda hoje, estes estudos são as principais referências para a identificação morfológica do gênero Acanthamoeba (MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003; WALOCHNIK et al., 2000). Atualmente 25 espécies do gênero Acanthamoeba já foram identificadas (BOOTON et al. 2005).
2.5 Outras classificações
A identificação de espécies de Acanthamoeba empregando unicamente critérios morfológicos é muito subjetiva, uma vez que resultados obtidos em estudos taxonômicos apresentam variações importantes quando o uso de isoenzimas e biologia molecular são aplicados. As características morfológicas dos cistos são influenciadas pelas condições ambientais. Alguns trabalhos relatam que mesmo controlando as condições de cultivo e de encistamento, observa-se que diferentes espécies apresentam características similares em seus cistos e que em cultivos monoclonais aparecem cistos de diversas morfologias (VISVESVARA, 1991; KILVINGTON et al., 1991). Mais recentemente, novos métodos têm sido propostos para a identificação de AVL, utilizados tanto para auxiliar o diagnóstico de infecções humanas, como também para identificação de AVL em amostras ambientais (KILVINGTON & BEECHING, 1995; LEHMANN et al, 1998; MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003). Estes métodos, consistem em análises de DNA, RFLP (restriction fragment length polymorphism) e PCR da subunidade 18S de rDNA, padrões de restrição de DNA total, padrões de restrição de DNA mitocondrial, amplificação de seqüências específicas por PCR, RAPD (random amplified polymorphic-DNA), cariotipagem por eletroforese em campo pulsado (PFGE) entre outras. No gênero Acanthamoeba, em que várias espécies são encontradas, os estudos buscam o estabelecimento de relações filogenéticas entre elas (GAST et al, 1996; STOTHARD et al., 1998).
O critério mais promissor para a classificação de Acanthamoeba tem sido a utilização da seqüência do 18S rDNA. Através deste método, baseado na comparação da seqüência conservada deste gene, o gênero Acanthamoeba está dividido em 15 diferentes genótipos (T1 a T15), que estão relacionados com a virulência da ameba (GAST, 2001; SCHUSTER & VISVESVARA, 2004a) (Tabela 1). Cada genótipo exibe 5% ou mais de seqüências divergentes entre diferentes genótipos. Maghsood et al. (2005) propôs a subdivisão do genótipo T2 em dois grupos, T2a e T2b, devido a uma seqüência de dissimilaridade de 4,9% entre eles que está muito próximo do ponto de corte de 5% entre diferentes genótipos. Isto pode ajudar a diferenciar isolados patogênicos de não patogênicos dentro deste genótipo. Com a vantagem do uso das seqüências do gene 18S rDNA sobre a classificação baseada na morfologia, autores têm sugerido que cada tipo de seqüência poderia ser considerado como uma espécie separada (KHAN, 2006). A maioria das infecções humanas por Acanthamoeba têm sido associadas ao genótipo T4 com aproximadamente 90% dos casos de ceratite ligados a este genótipo (MAGHSOOD et al., 2005).
Tabela 1 - Genótipos de Acanthamoeba e suas associações com doenças humanas (ceratites e encefalites)
Genótipos Doenças
T1 Encefalites
T2a Ceratites
T2b- ccap 1501/3c-a-like sequence NA
T3 Ceratites T4 Encefalites e Ceratites T5 NA T6 Ceratites T7 NA T8 NA T9 NA T10 Encefalites T11 Ceratites T12 Encefalites T13 NA T14 NA T15 NA
NA - ainda não foi associado com nenhuma doença. Fonte: Khan (2006, p. 570).
Outros estudos têm sido realizados para a discriminação de isolados de Acanthamoeba, uma vez que, o DNA ribossomal, em particular o gene 18S rRNA, é muito útil para a classificação de espécies e estudos filogenéticos, mas devido à pressão seletiva combinada à evolução, genes rRNA são altamente conservados, limitando o poder discriminatório de organismos proximamente relacionados (ADAM et al., 2000). Autores têm proposto o estudo de outras regiões, tais como, o primeiro espaçador interno transcrito (ITS1), localizado entre o gene 18S rRNA e o 5,8S rRNA que contém uma variabilidade suficiente para a tipificação molecular constituindo-se em um instrumento apropriado para a diferenciação de espécies que são morfologicamente indistinguíveis e de organismos proximamente relacionados (BALDWIN et al. 1995; CASEY et al., 2003). Schönian et al. (2001) relatou que análises por enzimas de restrição da região ITS1 de espécies de Leishmania claramente identificam todas as espécies de relevância médica, fornecendo evidências de que a região ITS1 pode conter informações sobre virulência.
Estes estudos podem ajudar no desenvolvimento de métodos mais precisos para a classificação taxonômica de Acanthamoeba e também no esclarecimento do papel destes organismos no ecossistema, interação com bactérias, bem como na causa primária e secundária de infecções humanas, contribuindo para um diagnóstico preciso desse grupo de patógenos, o que terá grande importância tanto do ponto de vista clínico como epidemiológico.
2.6 RAPD - “Random Amplified Polymorphic DNA”: marcador molecular para a caracterização de Acanthamoeba
O RAPD foi proposto inicialmente por Welsh & McClelland e Williams et al. em 1990. É um método multi-loci muito útil na caracterização molecular de organismos e se baseia na amplificação de seqüências polimórficas de DNA, utilizando para tanto uma variante de PCR onde somente um oligonucleotídeo pequeno (cerca de 10 pb) é utilizado e com baixa temperatura de associação. Este é um método simples, que não necessita do conhecimento prévio de seqüências de DNA e permite analisar uma grande quantidade de
locus simultaneamente, onde os polimorfismos existentes entre os isolados e as espécies analisadas são detectados, mediante uma eletroforese, com diferenças entre os padrões de fragmentos de DNA amplificados (WELSH & MCCLELLAND, 1990; WILLIAMS et al., 1990).
O polimorfismo em nível de DNA se caracteriza pela presença ou ausência de um determinado segmento amplificado de um oligonucleotídeo iniciador ou por padrões diversos obtidos por amplificação com vários oligonucleotídeos iniciadores, sempre baseado na composição de duas ou mais amostras (ANDERSON & FAIRBANKS, 1990). Com esta técnica é possível escanear o genoma inteiro para obter um conjunto de marcadores polimórficos de DNA. Como estes iniciadores apresentam seqüências nucleotídicas arbitrárias, o RAPD não requer, para o desenho destes, nenhuma informação sobre a seqüência do DNA a ser amplificada.
As principais vantagens do RAPD, com relação a outras técnicas são a sua facilidade, rapidez, a utilização de quantidades mínimas de DNA e principalmente a grande quantidade de polimorfismo gerado por um único marcador. Os resultados da aplicação dessa técnica são padrões de bandas, semelhantes àqueles obtidos por RFLP. Assim como o método de RFLP, o RAPD indiretamente indica diferenças em seqüências, uma vez que mudanças nessas seqüências podem criar novos pontos de associação para o oligonucleotídeo, assim como alterar outros anteriormente existentes, conseqüentemente mudando o padrão de bandas apresentado. Dentro das aplicações da técnica de RAPD, se encontram a realização de mapas genéticos, o diagnóstico molecular, a taxonomia molecular, epidemiologia, diferenciação de isolados, entre outras (MYERS et al., 1993; SAULNIER et al., 1993). Em relação aos agentes parasitos, se tem demonstrado que esta técnica é capaz de discriminar entre gêneros e espécies de diferentes protozoários parasitos (NOYES et al., 1996; ALONSO, 1999; ORTEGA-RIVAS et al., 2003).
O RAPD apresenta baixa reprodutibilidade entre laboratórios e até mesmo dentro do mesmo laboratório. Os produtos resultantes da amplificação vão depender de muitos fatores como, por exemplo, o tamanho da seqüência do iniciador, as condições de reação, o termociclador empregado, entre outros. Sendo assim, a técnica requer cuidados no preparo de soluções estoques e componentes da reação, na manipulação de micropipetas, reagentes e enzimas, e na programação de termocicladores. Portanto em virtude da técnica de RAPD ser
sensível a pequenas modificações é recomendado a otimização cuidadosa das condições experimentais para que os resultados sejam mais confiáveis e reprodutíveis (CAIXETA et al., 2006).
Apesar da utilidade desses padrões como indicadores da variabilidade genética, ainda há limitações inerentes à análise de dados de RAPD devido à falta de certeza de que as bandas são homólogas não sendo possível fazer análises filogenéticas. Como não se tem indicação da natureza dessas seqüências que podem ser tanto de regiões de grande importância biológica (reguladoras, estruturais, codificadoras de proteínas), quanto a regiões cuja seqüencia não tem função, é difícil estabelecer a significância dos diferentes níveis de similaridade entre os isolados. Por isso, o RAPD se torna mais útil em análises genéticas iniciais de espécies não caracterizadas e não como uma ferramenta conclusiva. O caminho mais plausível a ser seguido na caracterização de isolados por RAPD, parece ser a somatória dos enfoques morfológicos com o refinamento das análises através de outros métodos moleculares (SINGH, 1997). Ou seja, com o aumento da utilização de diversas ferramentas ligadas à biologia molecular, com o conhecimento progressivo do genoma dos parasitos e com a utilização da técnica adequada para cada situação, pode-se somar esse novo conhecimento ao montante de informações já disponíveis, e assim refinar a classificação morfológica clássica (HUYSE & VOLCKAERT, 2002).
2.7 Infecções causadas por Acanthamoeba
Devido à ampla distribuição de Acanthamoeba na natureza, o contato humano com estes organismos é freqüente e inevitável. As patologias que a Acanthamoeba pode chegar a causar no homem estão intimamente relacionadas com a via de transmissão e, sobretudo, com o estado imunológico do paciente. As infecções sistêmicas e as que afetam o sistema nervoso central atingem pacientes que apresentam uma imunodepressão geral, enquanto as infecções corneanas são favorecidas por uma imunossupressão local (ARMSTRONG, 2000).
Embora já tenham sido encontrados como oportunistas em infecções em uma grande variedade de locais, como, pele, ouvido, pulmões, fígado, pâncreas, baço, próstata, tireóide,
trato urogenital, etc., causando sinusite, pneumonite, dermatite, entre outras, os organismos do gênero Acanthamoeba são responsabilizados principalmente por dois tipos de patologia em humanos: ceratite por Acanthamoeba e encefalite amebiana granulomatosa. Infecções na pele, pulmões e cérebro estão relacionadas a pacientes imunodeficientes ou imunodeprimidos incluindo pacientes com AIDS e mulheres grávidas, respectivamente (MARCIANO-CABRAL & (MARCIANO-CABRAL, 2003). A ceratite como resultado de infecção da córnea tem sido associada com contaminação da água e usuários de lentes de contato, atingindo imunocompetentes (GIANINAZZI et al., 2009).
2.7.1 Ceratite por Acanthamoeba
A ceratite por Acanthamoeba é uma infecção invasiva da córnea, que se caracteriza pela perda gradual da visão, chegando, em alguns casos, a provocar cegueira (RADFORD et al., 1998). As lesões oculares ocorrem, provavelmente, a partir de um microtraumatismo do olho. A contaminação do olho pelas amebas pode ocorrer a partir da água contaminada ou de partículas do ar ou do solo que contenham amebas. Recentemente tem sido descritos muitos casos de ceratite por Acanthamoeba entre usuários de lentes de contato, principalmente, entre aqueles que fizeram uso de solução salina caseira para limpeza e conservação das lentes, ou que nadaram usando lentes (OBEID et al., 2003). Quando o trofozoíto entra em contato com a córnea, o próximo passo para o estabelecimento da infecção é a aderência e penetração no epitélio. As espécies de Acanthamoeba patogênicas aderem-se através de uma adesina às glicoproteínas manosiladas expostas em alguma lesão do epitélio córneo. O contato com a manose induz o trofozoíto a produzir proteases (serino-protease, cisteino-protease, elastase e metaloproteases) responsáveis pelas lesões características da infecção (HE, et al., 1990; MARCIANO-CABRAL & CABRAL, 2003; HUSTON, 2004). A presença de um infiltrado em anel no estroma corneano é um sinal sugestivo de ceratite por Acanthamoeba e uma ceratoneurite radial é considerada como patognomônico dessa infecção (Figura 8) (WALOCHNIK et al., 2000; OBEID et al., 2003; RUTHES et al., 2004).
Os principais sintomas de uma ceratite por Acanthamoeba são: sensação de corpo estranho no olho, irritação, dor severa, tipicamente desproporcional ao tamanho da lesão, edema da pálpebra com pequena secreção, fotofobia e visão alterada com perda gradual da mesma (VISVESVARA & STHER-GREEN, 1990; FERNANDEZ & CRESPO, 1992; OBEID et al., 2003; RUTHES et al., 2004). A infecção é de difícil diagnóstico e tratamento. Falhas no controle da infecção podem levar a permanente perda da visão.
A ceratite em humanos foi descrita em 1973, na Inglaterra, seguida por publicação nos Estados Unidos (NAGINGTON et al., 1974; JONES et al., 1975). No Brasil, os primeiros casos foram descritos em 1988 (NOSÉ et al., 1988). Relatos de casos de ceratite por Acanthamoeba vêm aumentando significativamente nos últimos anos, paralelamente à popularização do uso de lentes de contato, principalmente hidrofílicas. Inicialmente a ocorrência da doença estava relacionada com traumatismos oculares, principalmente em áreas rurais. Estudos atuais demonstram que mais de 90% dos casos ocorrem em usuários de lentes de contato. Os fatores que predispõem à ceratite nos usuários de lentes de contato são o uso de
Figura 8 - Olho infectado por
Acanthamoeba exibindo epitélio
ulcerado, infiltração no estroma e opacidade na córnea, típicos de ceratite aguda.
soluções não estéreis, banho de piscina usando lentes de contato e desinfecção inadequada das lentes após o uso (RADFORD et al.,2002). Apesar disso, 10 a 15% de casos de ceratite por Acanthamoeba ocorrem em pessoas que não usaram lentes de contato (ILLINWORTH & COOK, 1998). A figura 9 demonstra os fatores de risco que contribuem para a ceratite por Acanthamoeba: (a) nadar, especialmente usando lentes de contato; (b) lavar os olhos com água de torneira usando lentes de contato; (c) trabalhar com o solo sem proteção ocular; (d) exercer atividades relacionadas à água (como piscinas ou praias); (e) manipular lentes de contato com as mãos sujas; (f) usar solução salina caseira para a limpeza e conservação das lentes de contato.
Sete espécies têm sido mais freqüentemente associadas a infecções oculares: Acanthamoeba castellanii (T4), A. lugdunensis (T4), A. polyphaga (T4), A. rhysodes (T4), A. culbertsoni (T3), A. hatchetti (T11) A. griffini (T3) (YU et al., 2004). Mais de uma espécie foi descrita em até 20% das infecções (ILLINGWORTH & COOK, 1998). Aparentemente não há
Figura 9 - Fatores de risco que contribuem para ceratite por Acanthamoeba spp.
diferença na manifestação clínica entre diversas espécies de Acanthamoeba quando causando ceratite. Apenas alguns isolados apresentam potencial patogênico e alguns marcadores podem ser utilizados para diferenciar isolados patogênicos de não patogênicos, tais como, a atividade proteolítica, termotolerância, osmotolerância e efeito citopático (KHAN, 2006).
Apesar da ampla variabilidade de genótipos, apenas os isolados dos genótipos T2, T3, T4, T6 e T11 têm sido associados com ceratite (WALOCHNIK et al., 2000; DE JONCKEERE, 2003). O genótipo T4 apresenta a dominância de 90% nos casos de ceratite causadas por Acanthamoeba.
O número de casos de ceratite amebiana provocada por Acanthamoeba diagnosticados, aumentou dramaticamente durante os últimos vinte anos, calcula-se que mais de 3.000 casos aconteceram nos Estados Unidos (QVARNSTROM et al., 2006). A incidência anual de ceratite por Acanthameba foi estimada em 1,36 por milhão nos EUA (VISVESVARA & STHER-GREEN, 1990) em 3,06 por milhão na Holanda e em 1,2 por milhão no país de Gales. Na Inglaterra a incidência é de 0,2 a 1 indivíduo para cada 10.000 usuários de lentes de contato por ano (RADFORT et al., 2002). Uma investigação de 22 centros de oftalmologia nos Estados Unidos, em fevereiro de 2007, conduzida pelo CDC (“Centers for Disease Control and Prevention”) revelou um aumento nacional do número de casos de ceratite por Acanthamoeba entre 2004 e 2006. Este aumento foi associado com o uso da solução para lentes de contato “Advanced Medical Optics Complete MoisturePlus” contaminada (VISVESVARA & SCHUSTER, 2008a).
2.7.2 Encefalite amebiana granulomatosa (EAG)
EAG é considerada uma infecção oportunista, pois quase todos os casos relatados até o momento se referem a indivíduos imunologicamente debilitados especialmente aqueles que já sofreram algum tipo de terapia ou situação imunossupressora como alcoolismo, gravidez, quimioterapia, ou uso de antibióticos de amplo espectro e pacientes com AIDS (FERRANTE, 1991; VISVESVARA, 1991; TURNER et al., 2000). Os mecanismos associados com a patologia não estão muito claros, mas as complicações patofisiológicas envolvem o sistema
nervoso central, onde há a indução de uma resposta pró-inflamatória, a partir da invasão pela barreira hematoencefálica e a ligação ao tecido, seguida de lesão neuronal (KHAN, 2003; SCHUSTER & VISVESVARA, 2004a; KHAN, 2006).
A invasão pode ocorrer pela pele (ulcerações) ou pelo trato respiratório (neuroepitélio), seguindo então por via sangüínea até o sistema nervoso central (MARTINEZ & VISVESVARA, 1997). O período de incubação pode variar de semanas a meses. Após esse período, vários sintomas aparecem: dor de cabeça acompanhada de febre, náuseas, vômitos, letargia, mudança da personalidade e demência (MARCIANO-CABRAL et al., 2000). Como o desenvolvimento da doença é fulminante, geralmente o diagnóstico só é obtido após a necropsia, por análise do fluido cérebro-espinhal ou do próprio tecido cerebral, através da análise microscópica das formas trofozoíticas, porém, a constatação de altos níveis de anticorpos Acanthamoeba-específicos pode ajudar na confirmação da suspeita da infecção. Além dessas análises, métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) estão sendo desenvolvidos para o diagnóstico de EAG por Acanthamoeba, a fim de aumentar a chance de cura (KHAN, 2003; SCHUSTER & VISVESVARA, 2004a).
2.8 Acanthamoeba e bactérias endossimbiontes
A complexa ecologia da Acanthamoeba e seu papel na dispersão de microrganismos patogênicos em sistemas de água têm gerado a realização de vários estudos, devido à habilidade destas amebas atuarem como hospedeiro de bactérias patogênicas, tais como: Legionella spp., Mycobacterium avium, Listeria monocytogenes, Burkholderia pseudomallei, Vibrio cholerae, Escherichia coli sorotipo O 157, Francisella tularensis, Helicobacyter pylori e Afipia felis (GREUB & RAOULT, 2004). As amebas como importantes predadores no controle das comunidades microbianas, acabam tornando-se reservatórios ambientais de patógenos, comportando-se como “cavalo de Tróia” do mundo microbiano (BARKER & BROWN, 1994). Aproximadamente 20 a 24% dos isolados clínicos e ambientais de Acanthamoeba carreiam bactérias e patógenos intracelulares obrigatórios como Chlamydia e Legionella (GREUB & RAOULT, 2004;SCHMITZ-ESSER et al., 2008).
Amebas presentes em fontes de água podem sobreviver a vários processos de purificação como o uso de biocidas e desinfetantes como cloro e ozônio (ROHR et al., 1998; AKSOZEK et al., 2002; THOMAS et al., 2006) e quando infectadas por bactérias resistentes a amebas (BRA), assim denominadas por resistirem ao processo de digestão quando fagocitadas por elas, acabam por aumentar a resistência das bactérias, pois impedem que os produtos utilizados para a desinfecção atinjam estes microrganismos, propiciando a dispersão e permanência de bactérias patogênicas no ambiente (CIRILLO et al., 1994). A microbiota bacteriana externa é importante para o desenvolvimento da Acanthamoeba, já que aumenta sua taxa de crescimento e sua capacidade de colonização, além disso, assegura sua sobrevivência em meios líquidos (CENGIZ et al., 2000).
Vários endossimbiontes de Acanthamoeba são também parasitos de macrófagos humanos (por exemplo, Legionella) e sua habilidade de sobreviver na ameba, pode ser uma fase pré-adaptativa para infectar células humanas (VISVESVARA & SCHUSTER, 2008a). A associação ameba-bactéria poderá provocar a perda da susceptibilidade a certos antibióticos, como ocorre no caso de L. pneumophila e Micobacterium avium quando infectam espécies de Acanthamoeba. O mecanismo pelo qual adquirem este tipo de resistência é desconhecido e não há evidencias que estes fenótipos possam manter-se fora da ameba (BARKER & BROWN, 1994).
2.9 Fatores de virulência que contribuem para infecções por Acanthamoeba
A capacidade de Acanthamoeba produzir doenças em humanos é um processo multifatorial relacionado a fatores de virulência considerados diretos e indiretos.
Os fatores de virulência diretos são descritos separadamente como mecanismos contato-dependente e contato-independente. Os mecanismos contato-dependente estão relacionados à habilidade da ameba se ligar a células hospedeiras, etapa crucial na patogênese de infecções por Acanthamoeba. Esta etapa conduz a efeitos secundários, tais como, interferência com rotas de sinalização intracelular do hospedeiro, secreções de toxinas e a fagocitose das células hospedeiras, finalmente levando à morte celular (KHAN, 2006). Já os
mecanismos contato-independente estão relacionados à produção de dois tipos de enzimas hidrolíticas: proteases, que hidrolisam pontes peptídicas e fosfolipases que hidrolisam fosfolipídios (CAO et al., 1998; KHAN et al., 2000).
A habilidade da Acanthamoeba de sobreviver em um hospedeiro e sob condições ambientais adversas pode ser considerada um fator contribuinte para causar doenças e são chamados de fatores indiretos de virulência (KHAN, 2006). Dentre os fatores indiretos de virulência podemos citar: alteração fenotípica – cisto x trofozoíto, morfologia – presença de acantopódios no trofozoíto, resistência a drogas, ubiqüidade, associação a biofilmes, fatores relacionados ao hospedeiro e tolerância fisiológica (crescimento em diferentes pH, tolerância à temperatura e osmotolerância) (GRAY et al., 1995; TURNER et al., 2000; KHAN et al., 2001, 2002; DUDLEY et al., 2005; GARATE et al., 2006).
2.9.1 Marcadores de patogenicidade de Acanthamoeba
O crescimento a altas temperaturas e alta osmolaridade são marcadores de patogenicidade de Acanthamoeba e alguns trabalhos têm mostrado que isolados patogênicos exibem crescimento nestas condições (DE JONCKHEERE, 1983; WALOCHNIK et al., 2000; KHAN et al., 2001). Estes determinantes fisiológicos podem ser usados na diferenciação e prévia caracterização de isolados clínicos e ambientais correlacionados a testes de efeito citopático (KHAN et al. 2001).
Estes marcadores são características genotípicas de algumas AVL que podem se expressar em um hospedeiro, conferindo a elas a capacidade de melhor adaptação e viabilidade (ODOM et al., 1997; SCHUSTER & VISVESVARA, 2004b). O mecanismo pelo qual a Acanthamoeba patogênica adapta-se a altas temperaturas e osmolaridade mantendo sua atividade metabólica ainda é desconhecido (KHAN, 2006).
2.10 Presença de Acanthamoeba em piscinas
Cistos e trofozoítos de Acanthamoeba têm sido detectados em fontes de água no mundo todo (RADFORD et al., 1998; BOOTON et al., 2002; ETTINGER et al., 2003; SEAL et al., 2003; KILVINGTON et al., 2004; LORENZO-MORALES et al., 2005c). A presença destas amebas na superfície da água representa um risco para a saúde humana, uma vez que, o contato com estes organismos é a principal via de contágio (VESALUOMA et al., 1995). O uso recreacional de água de piscinas é claramente importante para a exposição de humanos a Acanthamoeba e consequentemente para o desenvolvimento de ceratite amebiana.
A presença de isolados de Acanthamoeba potencialmente patogênicos em piscinas tem sido documentada em vários estudos (DE JONCKHEERE, 1979a, 1979b; RIVERA et al., 1993; TSVETKOVA et al., 2004; GÓRNIK & KUŹNA-GRYGIEL, 2004; GIANINAZZI et al., 2009). Na Polônia, estudos demonstraram a presença de AVL do gênero Acanthamoeba em amostras de água coletadas de piscinas internas e externas na cidade de Szczecin (GÓRNIK & KUŹNA-GRYGIEL, 2004). Do mesmo modo, na Finlândia, amostras de água de piscinas foram positivas para o gênero Acanthamoeba (VESALUOMA et al., 1995). Ainda na Europa foram detectadas amebas potencialmente patogênicas na água de piscinas da Suíça (GIANINAZZI et al., 2009). Em estudo realizado no Chile, vários gêneros de AVL foram isolados da água de piscinas públicas, dentre eles o gênero Acanthamoeba (MUÑOZ et al., 2003)
No Brasil, existem alguns trabalhos que relatam a presença de Acanthamoeba em águas de uso recreacional, porém poucos trabalhos realizaram a caracterização dos isolados quanto a aspectos de patogenicidade, variabilidade genética, especificidade, entre outras características necessárias para um melhor entendimento do papel destes organismos na água de piscinas. Moura (1980) a partir de piscinas de clubes da cidade do Rio de Janeiro isolou diversos gêneros de AVL, sendo que algumas amostras apresentaram moderada ação patogênica para camundongos. Salazar et al. (1982) isolaram amebas do gênero Naegleria e Acanthamoeba a partir de coleções de água na cidade do Rio de Janeiro. Em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, no ano de 1984, AVL foram encontradas em água de piscinas (CHAVES, 1985). Alves (2006) isolou AVL a partir de água de piscinas do Distrito Federal,
entre os isolados observou-se a presença do gênero Acanthamoeba também observada em quase 100% dos isolados obtidos por Falchi (2006) em amostras de água de diferentes pontos da Laguna dos Patos.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Organismos e cultivo
3.1.1 Isolados de referência da ATCC (“American Type Culture Collection”)
Os isolados empregados como controles neste trabalho foram: Acanthamoeba castellanii Neff (ATCC 30010) e Acanthamoeba castellanii T4 (ATCC 50492).
3.1.2 Isolados de água de piscinas
Isolados de Acanthamoeba obtidos de água de piscinas de clubes recreativos da cidade de Porto Alegre - RS foram isolados e identificados conforme descrito nos itens 3.2 e 3.3.
3.1.3 Cultivo dos isolados de Acanthamoeba
Os organismos foram rotineiramente mantidos em culturas monoxênicas (Item 3.2.3) e também em culturas axênicas em meio líquido contendo proteose peptona 2 %, extrato de levedura 0,2 % e glicose 1,8 % (PYG) (ANEXO A), suplementado com penicilina G potássica (400 UI/mL) e estreptomicina (400 µL/mL) e incubados a 30 °C. Subcultivos foram realizados a cada duas semanas.
3.1.4 Isolado bacteriano
Foi utilizado um isolado de referência de Escherichia coli (ATCC 25922) não patogênico para a realização de culturas monoxênicas.
3.1.5 Cultivo de Escherichia coli
Os cultivos de E. coli foram realizados em meio ágar triptona de soja (TSA) e incubados a 37 °C por 18 h. Para o preparo da suspensão bacteriana, 1 mL de solução salina de Page (ANEXO A) foi adicionada à superfície do meio de cultura com colônias de E.coli que foram gentilmente raspadas com alça de platina. A suspensão bacteriana foi removida para um novo tubo e submetida à temperatura de 56 °C por 2 h para inativação.
3.2 Isolamento e identificação de Amebas de Vida Livre (AVL) a partir de água de piscinas
3.2.1 Coleta e concentração de amostras de água de piscinas
Um total de 65 amostras de água de piscinas foi coletado entre os meses de maio de 2006 e março de 2007 de 22 clubes recreativos da cidade de Porto Alegre, RS. As coletas das amostras foram realizadas sob autorização da diretoria dos clubes através de um Ofício de autorização (ANEXO B). No estudo foram incluídas piscinas térmicas e não térmicas tratadas com cloro e seus compostos. Foram coletados três frascos de água com volume de 100 mL de cada piscina analisada, sendo que cada frasco foi considerado como uma amostra. A água foi obtida da superfície das piscinas e parâmetros físicos e químicos da água, tais como
temperatura, pH e cloro residual livre foram levados em consideração no momento da coleta. O pH e o cloro foram aferidos no momento da coleta por método colorimétrico. As amostras foram acondicionadas em isopor com gelo para o transporte e levadas ao laboratório de Parasitologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) para processamento e análise imediatamente após as coletas.
Para a concentração de amebas de vida livre, primeiramente as amostras de água foram filtradas com gaze estéril dobrada, para remover folhas e sujidades. Após, foram centrifugadas a 250 x g / 10 min, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi suspenso em aproximadamente 0,5 mL de solução salina de Page (RIVERA et al., 1993; DE CARLI, 2001).
3.2.2 Isolamento de amebas de vida livre
O sedimento obtido foi transferido para placas de ágar não-nutriente (ANN) 1,5 % (ANEXO A) cobertas com uma suspensão de Escherichia coli (ATCC 25922) inativada pelo calor a 56 °C/2 h. As placas foram seladas com filme plástico (Parafilm®) e incubadas a 30 °C por até 15 dias. Para cada amostra de água, três placas foram preparadas. O exame das placas foi realizado diariamente durante o período de incubação em microscópio óptico (aumento de100X) para observar a presença de amebas de vida livre (trofozoítos e/ou cistos). As placas negativas para AVL foram descartadas após o período de observação.
3.2.3 Obtenção de Culturas monoxênicas
Para as amostras de água que foram positivas para amebas de vida livre, isto é, que se verificava a presença de trofozoítos e cistos nas placas, a partir da microscopia óptica, realizou-se subcultivos dos isolados para obter cultura monoxênica, com a finalidade de
manter os isolados e eliminar possíveis contaminantes ambientais, tais como fungos filamentosos, leveduras e bactérias.
As áreas das placas com AVL foram marcadas com um círculo para localização dos isolados. Posteriormente as placas foram abertas sob condições de esterilidade, com auxílio de uma lâmina estéril, um pedaço de ágar da área marcada foi cortado. O pedaço de Agar era então removido com a face voltada para baixo e transferido para uma nova placa de ANN coberta com Escherichia coli (ATCC 25922). As placas foram seladas e incubadas a 30 °C por 10 dias.
3.2.4 Obtenção de culturas axênicas
Para o cultivo de AVL em meio líquido sem a presença de bactérias e outros contaminantes, os isolados de água de piscinas em culturas monoxênicas de no máximo 72 h de crescimento, constituídas de muitos trofozoítos, foram colocadas sob bolsas de gelo durante 15 min para desprender os trofozoítos da superfície do ágar. Uma alíquota de 5 mL do meio PYG foi adicionada à superfície do ágar e raspado gentilmente com alça de platina. A suspensão de AVL foi transferida para um tubo cônico estéril contendo 5 mL de PYG (ANEXO A) suplementado com antibióticos (400 UI/mL de Penicilina G Potássica e 400 µg/mL de Estreptomicina) e incubada a 30 °C. Subcultivos para novos tubos contendo PYG e antibióticos foram realizados em intervalos variáveis de no máximo sete dias com a finalidade de eliminar a associação com bactérias dentro de duas a três semanas.
3.2.5 Indução ao encistamento
Para obtenção de cistos, culturas axênicas de amebas foram centrifugadas a 250 x g por 10 min e os trofozoítos transferidos para tubos contendo 5 ml de solução salina de Page. Após 72 horas o sedimento era examinado para detectar a presença de cistos.
3.2.6 Coloração de cistos e trofozoítos
Culturas líquidas contendo cistos e trofozoítos foram primeiramente centrifugadas a 250 x g por 10 min. O sobrenadante foi retirado e o sedimento foi suspenso em 1 ml de tampão fosfato pH 7,2 (PBS). Este procedimento de lavagem foi realizado três vezes, após foi adicionado o fixador de Schaudinn (ANEXO A). Alíquotas de 100 µL foram espalhadas sobre lâminas de vidro limpas e desengorduradas. As lâminas foram secas em estufa bacteriológica a 37 °C durante três horas aproximadamente. Depois de fixadas, foram coradas pelo tricrômico conforme Garcia & Brückner, 1997 (ANEXO A).
3.3 Identificação morfológica de isolados do gênero Acanthamoeba
3.3.1 Exflagelação dos organismos
Com a finalidade de identificar e excluir amostras de Naegleria fowleri que poderiam ter sido isoladas das amostras de água de piscinas foi realizada a técnica de exflagelação. Após o isolamento de AVL e obtenção de culturas monoxênicas com formas trofozoíticas, adicionou-se 10 mL de água destilada estéril sobre a superfície do ágar não-nutriente para obtenção de uma suspensão de AVL. Após, esta suspensão foi transferida para garrafas de cultivo celular e incubadas a 37 °C. As garrafas foram examinadas a cada 30 minutos durante 4 horas em microscópio invertido para verificar a emissão de flagelos (DE CARLI, 2001; SILVA & ROSA, 2003).
