16°
TÍTULO: EFEITOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO NAS CONTAGENS TOTAL E DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS EM RATOS DIABÉTICOS.
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: FISIOTERAPIA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO CATÓLICO SALESIANO AUXILIUM INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): KELVIN ANEQUINI SANTOS AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): JOSÉ ALEXANDRE CURIACOS DE ALMEIDA LEME ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): OSVALDO TADEU DA SILVA JUNIOR COLABORADOR(ES):
RESUMO
Diabetes mellitusé hoje um dos maiores problemas de saúde em todo o mundo. Um dos maiores problemas decorrentes da doença, são os efeitos deletérios ao sistema imunológico, porem a atividade física tem se apresentado comouma forma de tratamento não medicamentosa e primordial para a manutenção e possível tratamento para essa doença metabólica. Desta forma, O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos do ambiente enriquecido nas contagens total e diferencial de leucócitos em ratos diabéticos. Para isso, os animais foram distribuídos em grupo controle sedentário, animais diabéticos mantidos em gaiola convencionalDiabético Gaiola Enriquecida, animais diabéticos mantidos em um ambiente enriquecido. Semanalmente, durante o período experimental de 8 semanas, foram coletadas amostras de sangue para as análises global e diferencial de leucócitos e os resultados foram analisados estatisticamente utilizando o teste t de student. Os valores de contagem total dos leucócitos não apresentaram alterações durante o estudo. Foi possível observar uma piora na contagem parcial de leucócitos dos ratos sedentários que não realizavam a atividade voluntária indicando uma pré-disposição para leucopenia. Já os animais mantidos em gaiola enriquecida nas análises diferenciais de leucócitos, o linfócitos T e A, não apresentaram alteração nas coletas pré e pós, já os monócitos e neutrófilos tiveram uma ligeira redução, enquanto os eosinófilos, basófilos e bastonetes apresentaram um aumento significativo. Assim,diante dos dados encontrados, é possível observar alterações apontando que a atividade voluntária promovida pelo ambiente enriquecido, é capaz demodular as concentrações de leucócitos do sistema imune em animais diabéticos.
Palavras-chave: Diabetes, Leucócitos, Sistema imunológico.
INTRODUÇÃO
O diabetes já foi considerado um mal menor para a saúde mundial e na atualidade tornou-se uma das principais ameaças para a saúde humana deste século (ZIMMET et al., 2001).Segundo o Comitê de Peritos sobre o diagnóstico e classificação da diabetes mellitus (1997), o diabetes é uma doença metabólica
caracterizada por hiperglicemia resultante de defeitos na secreção ou na ação de insulina.
Qualquer evento que desequilibre a homeostase do organismo como por exemplo a hiperglicemia crônica presente no diabetes, resulta em uma resposta inflamatória, estabelecendo assim, uma íntima relação com o sistema imunológico (SCHUETZ et al, 2011).
O sistema imunológico é composto por um conjunto de células (leucócitos) e moléculas queatuam na defesa e regeneração do organismo. Estas ações são realizadas basicamente no combate contra microorganismos, na remoção de células mortas e detritos celulares e estabelecendo a memória imunológica (SCHULENBURG et al., 2004).
A modulação da resposta do sistema imunológico é realizada por vários fatores, sejam estes genéticos ou ambientais. Isto porque o sistema imune é sensível tanto aos agentes infecciosos quanto às mudanças na homeostase orgânica (LEANDRO, 2007).
Um modelo experimental para estudar o comportamento de animais, é através da alocação de um grupo de animais e um ambiente enriquecido.
O ambiente enriquecido é um conjunto de vários e complexos estímulos inanimados e sociais (SZTAINBERG e CHEN, 2010) com efeitos importantes ao animal. Este modelo de laboratório animal tem sido concebido para a padronização de manutenção dos animais em bom estado de saúde, facilitando o controle de alimentação, temperatura ambiental, higiene, aumentando a possibilidade de explorar seus comportamentos contribuindo para o avanço da ciência (OLSSON e DAHLBORN, 2002).
Grande parte destes efeitos no estado de saúde dos animais é creditada à atividade física realizada na gaiola enriquecida, sendo considerado um promotor de atividade física (KOBILO et al., 2010).
Estudos envolvendo a utilização doambiente enriquecido e sua relação com os leucócitos em animais diabéticos ainda não foram realizados.Desta forma, o presente estudo tem por objetivo investigar os efeitos do ambiente enriquecido na resposta imunológica em ratos wistar diabéticos.
OBJETIVOS
O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos do ambiente enriquecido nas contagens total e diferencial de leucócitos em ratos diabéticos.
METODOLOGIA
Para desenvolver este estudo, ratos da linhagem Wistar (RattusNorvegicusAlbinusWistar) com idade em torno de 3 meses foram mantidos em gaiolas coletivas, a temperatura controlada por ar condicionado de 25 ± 1º C e em ciclo claro/escuro de 12/12 horas, com livre acesso a água e ao alimento.
O experimento seguira as recomendações das Resoluções Brasileiras de Bioética de Experimentos com Animais (lei federal nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal- CONCEA). Este projeto foi submetido para apreciação no Comitê de Ética em Experimentação Animal do Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium- Unisalesiano.
Distribuição dos grupos
Os animais serão distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos:
Diabético Sedentário (DS) - Animais diabéticosmantidosem gaiola convencional;
Diabético Gaiola Enriquecida (DGE) – Animais diabéticos mantidos em um ambiente enriquecido;
Indução do diabetes
Após jejum de 12 horas, para a indução do diabetes experimental, os animais receberam estreptozotocina (50 mg/kg) dissolvida em tampão citrato (0,01 µM, pH 4,5)por via intraperitoneal e o volume de injecção foi 1 ml/rato. Após este procedimento, os ratos foram recolocados nas gaiolas recebendo no primeiro dia
pós estreptozotocina, uma solução de água e glicose (15%), além de ração (LUCIANO;LIMA, 1997; LEME et al., 2010). Cinco dias após a administração da droga, foi realizado um teste de glicemia utilizando Monitor de Glicose Sanguínea OptiumXceed®para comprovação do estado diabético dos animais, sendo considerados diabéticos apenas aqueles que apresentarem glicemia igual ou superior a 250 mg por 100 ml de sangue.
Análise global de leucócitos
No inicio e ao final do período experimental foram coletadas amostras de 25µL de sangue da parte distal da cauda de cada rato utilizando capilar heparinizado, sem a utilização de anestesia. A coleta foi feita por volta das 14 horas da tarde. A amostra coletada foi dispensada emmicrotubo de 1,5 mLe diluído em 500 µl de solução de Turk. Após suave agitação, a solução será gotejada na câmara de Neubauer e realizada a contagem total de leucócitos em microscópio (OLIVEIRA et al., 2002).
Análise diferencial de leucócitos
No inicio e ao final do período experimental foram coletadas amostras de uma gota de sangue da parte distal da cauda de cada rato que foi dispensada em lâmina de vidro e, posteriormente, feito o esfregaço desta. Após seca , a lâmina foi mergulhada nos corantes do panótico rápido. Depois de secas, as lâminas serão analisadas em microscópio, com a utilização de óleo de imersão entre a objetiva e o material observado. Foram contadas 50 células em cada lamina sendo diferenciados os tipos de leucócitos entre estas células analisadas (OLIVEIRA et al., 2002).
Análise estatística
Após o teste de normalidade, os resultados serão analisados estatisticamente utilizando o teste t Student ou Mann-Whitney (para dados não paramétricos) através do software SPSS®.
No presente estudo foram investigadas as possíveis alterações nas contagens totais e diferenciais de leucócitos sanguíneos, em dois grupos , um mantido em ambiente enriquecido e outro na gaiola convencional.
O estudo da contagem total (global) de leucócitos no inicio do experimento não apresentou diferença significativaentre os grupos. Na análise realizada ao final do experimento, os animais Diabéticos Sedentário apresentaram uma redução no numero total de leucócitos em relação aos animais que eram mantidos em Ambiente Enriquecido.
Figura 1. Contagem total de leucócitos (n° de células x 103/mm3 de sangue) dos animais dos grupos DS (Diabético Sedentário) e DGE (Diabético Gaiola Enriquecida) mantidos em ambiente enriquecido previa(1) e posteriormente (2) ao período experimental (8 semanas).Teste t Student; p<0,05 n=8 ratos/ grupo. A≠ DC
A tabela 2 apresenta os resultados da contagem diferencial de leucócitos nos grupos estudados. Grupos Leucócitos DS Pré DGE Pré DS Pós DGE Pós Linfócitos T 55,3±9,3 55,6±10,3 64,7±8,7 67,8±5,4 Linfócitos A 6,7±3,5 7,1±4,4 21,8±8,5 8,3±7,2 Monócitos 4±3 8,8±4,7* 4,1±1,8 5,7±2,3 Neutrófilos 27,6±10,1 21,6±8,6 1,4±1,9 3,7±2,5* Eosinófilos 0,6±1 1,7±2,5 1,1±1,1 4,1±3* Basófilos 2±2,4 3±3,5 0,7±1,5 7,7±6,5* Bastonetes 3,8±3,8 2,1±1,5 6±3,4 0,4±0,8* 0 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 Pré Pós
Contagem Total
SD GEDTeste t Student; p<0,05 n=8 ratos/ grupo. A≠ DC
Tabela 2. Média da contagem diferencial de leucócitos (%) e global (n° de células x 103/mm3 de sangue) realizada semanalmente dos animais dos grupos DS (Diabético Sedentário) e DGE (Diabético Gaiola Enriquecida)mantidos em ambiente enriquecido previa e posteriormente ao período experimental de 8 semanas).
Na contagem diferencial de leucócitos, não houve diferença significativa para Linfócitos T e Linfócitos A entre nos grupos estudados.
Quanto a porcentagem de monócitos, ocorreu uma redução para o grupo DGE, enquanto o DS permaneceu inalterado.
Já os níveis de neutrófilos foram reduzidos em ambos os grupos, masno grupo DGE esta queda foi menos acentuada, que pode ser interpretado como um efeito protetor proporcionando um melhor ambiente anti-inflamatório.
Para os eosinófilos, basófilos e bastonetes o grupo DGE apresentou um aumento significativo nas concentrações sanguínea, enquanto o grupo DS não apresentou alterações significativas.
O presente estudo demonstrou que o diabetes tem as principais ameaças para a saúde,assim pode trazer um conjunto de prejuízos ao sistema imunológico. A principio, a redução da concentração sanguínea de leucócitos pode ser um efeito a longo prazodessas alterações metabólicas, que neste estudo pode ser observada no grupo DS .
Animais mantidos em ambiente enriquecido apresentaramuma maior proteção a leucopenia decorrente dos efeitos deletérios do diabetes.
A informação sobre as alterações no tipo de leucócitos também é relevante para compreender os efeitos do ambiente.Estudos anterioresbuscaram avaliar as consequencias do ambiente em parâmetros como: peso corporal, alimentação, hidratação e níveis de corticosterona. (OLSSON e DAHLBORN, 2002).
CONCLUSÃO
Os resultados do presente estudo permitem concluir que a manutenção de ratos wistar em ambiente enriquecido durante o período de 8 semanas,foi capaz de promover modificações na quantidade diferencial de leucócitos, propiciando um
ambiente anti-inflamatório com maior proteção sobre os efeitos deletérios da diabetes.
REFERÊNCIAS
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION (ADA).Diabetes Statistics.Disponivelem : http://www.diabetes.org/diabetes-basics/diabetes-statistics Acesso em: 02 fev. 2016
American Diabetes Association.Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 34(Suppl 1), S62–S69, 2011.
BEAUQUIS J.;et al. Short-term environmental enrichment enhances adult neurogenesis, vascular network and dendritic complexity in the hippocampus of type 1 diabetic mice. PlosOne,n 15, v.5, 2010.
CURI, Rui et al. Entendendo a Gordura-Os ÁcidosGraxicos. EditoraManoleLtda, 2001.
CHURCH, T. Exercise in obesity, metabolic syndrome, and diabetes .Progress in cardiovascular diseases, v. 53, n. 6, p. 412-418, 2011.
DE HEREDIA, F.P.; GÓMEZ-MARTÍNEZ, S.; MARCOS, A. Obesity, inflammationandtheimmune system. Proceedings of the Nutrition Society, v. 71, n. 02, p. 332-338, 2012.
Escribano, B.M et al..Benefits of moderate training to the nonspecific immune response of colts.EquineVet J Suppl. 2002:182-5.
GERALDO, J.M.; ALFENAS, R.C.G. Role of diet on chronic inflammation prevention and control: current evidences. ArquivosBrasileiros de Endocrinologia&Metabologia, v. 52, n. 6, p. 951-967, 2008.
GREENBERG, A.S.; OBIN, M.S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. The American journal of clinical nutrition, v. 83, n. 2, p. 461S-465S, 2006.
GOES, T.; et al. Environmental enrichment for adult rats: Effects on trait and state anxiety.Neuroscience letters, v. 584, p. 93-96, 2015.
JANEWAY, junior et al. Imunobiologia: o sistema imune na saúde e na doença. Artmed, 2007.
JORDÃO, L. F.; et al . Effects of enriched environment on maximal lactate steady state of wistar rats. BioscienceJournal, 31(4),2015
KOBILO, T.; et al. Running is the neurogenic and neurotrophic stimulus in environmental enrichment. Learn Mem. n.30, v.18, p. 605-9, 2011.
LEANDRO, C. G. et al. Mecanismos adaptativos do sistema imunológico em resposta ao treinamento físico. RevBrasMedEsporte, v. 13, n. 5, p. 343-348, 2007.
OLIVEIRA, C.A.M.; ROGATTO, G.P.; LUCIANO, E. Efeitos do treinamento físico de alta intensidade sobre os leucócitos de ratos diabéticos. Rev Bras Med Esporte, Niterói , v. 8, n. 6, p. 219-224, Dec. 2002.
OLSSON, I.A.S., DAHLBORN, K..Improvinghousingconditions for laboratorymice: a reviewof ‘environmentalenrichment’. Lab. Anim. 36, 243–273, 2002.
PEDERSEN B.K., et al. Immunity in athletes. J Sports Med Phys Fitness 1996;36:236-45
SANTOS, Ed W.C.O. Estudo da função de macrófagos peritoniais de camundongos submetidos à dieta hipoprotéica e dieta hiperlipídica. 2013. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo.
SILVA, K.M.F. Obesidade induzida por dieta em diferentes tempos: efeitos sobre análises murinométricas, hematológicas e imunológicas de ratas. 2014.
Tese de Doutorado. Universidade Federal de Pernambuco.
SCHULENBURG, H.; KURZ, C.L.; EWBANK , J.J. Evolutionoftheinnateimmune system: theworm perspective. Immunol Rev. 2004;198:36-58.
SCHUETZ, P., CASTRO, P., & SHAPIRO, N. I. Diabetes andSepsis: PreclinicalFindingsandClinicalRelevance. Diabetes Care, 34(3), 771–778, 2011.
SZTAINBERG, Y., CHEN, A. Protocol: Na environmental enrichment model for mice. Nature Protocols, 9, 5, 2010.
WASINSKI, F. et al. Exercise and caloric restriction alter the immune system of mice submitted to a high-fat diet. Mediators of inflammation, v. 2013, 2013.
WOMACK, J. et al. Obesity and immune cell counts in women.Metabolism, v. 56, n. 7, p. 998-1004, 2007.
WOODS, J.A.; PENCE, B.D. Physical Activity, Exercise, and the Immune System: Three Lines of Research That Have Driven the Field. 2015.
WU, Dayong et al. Diet‐induced obesity has a differential effect on adipose tissue and macrophage inflammatory responses of young and old mice.Biofactors, v. 39, n. 3, p. 326-333, 2013.
ZIMMET, P.; ALBERTI, K. G. M. M.; SHAW, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature, v. 414, n. 6865, p. 782-787, 2001.
