Estudo da expressão dos genes da família Dact no desenvolvimento de membros de camundongos Mus musculus (C57BL6)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

Paula Cristina Rugno Delatti

Estudo da expressão dos genes da família Dact no

desenvolvimento de membros de camundongos Mus musculus

(C57BL6).

CAMPINAS

Estudo da expressão dos genes da família Dact no

desenvolvimento de membros de camundongos Mus musculus

(C57BL6).

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual

de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural: área de Biologia Tecidual.

Orientador: LÚCIA ELVIRA ALVARES

CAMPINAS

(2017)

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA PAULA CRISTINA RUGNO DELATTI E ORIENTADA PELA PROFA _DRA.

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira – CRB 8/6972

Informações para a Biblioteca digital:

Título em outro idioma: Expression analysis of the Dact gene family during mouse

limb development. Palavras-chave em inglês: Dapper genes In situ hybridization Limb development Tissue differentiation.

Área de concentração: Biologia Tecidual

Titulação: Mestra em Biologia Celular e Estrutural Banca Examinadora:

Lúcia Elvira Alvares [Orientador] Chao Yun Irene Yan

Murilo de Carvalho.

Data da defesa: 12/04/2017

Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural.

Delatti, Paula Cristina Rugno, 1991 D375e

Estudo da expressão dos genes da família Dact no desenvolvimento de membros de camundongos (Mus musculus) / Paula Cristina Rugno Delatti. – Campinas, SP: [s.n.], 2017.

Orientador: Lúcia Elvira Alvares.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

1. Genes Dapper. 2.Hibridação in situ. 3.Desenvolvimento de membros. 4. Diferenciação tecidual. I. Alvares, Lúcia Elvira,1968-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa_{. Dra. Lúcia Elvira Alvares}

Profa_{. Dra. Chao Yun Irene Yan}

Dr. Murilo de Carvalho

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

esse trabalho e todas as outras conquistas da minha vida. Muito obrigada por serem tão maravilhosos, por todo amor, carinho e incentivo dados; por cada sacrifício realizado e por serem sempre a minha fortaleza e meus melhores amigos.

Agradeço também ao meu irmão, Bruno, por ter me ajudado muito, desde o início, quando ainda estudava para o vestibular. Por ter me incentivado em todas as fases escolares da minha vida, acreditando em mim e me dando forças para conquistar meus sonhos. Obrigada por ser o melhor irmão do mundo, pela sua amizade, amor e carinho.

Gostaria de agradecer à minha família como um todo, mas em especial às minhas madrinhas, Sumara e Sueli, por serem segundas mães para mim, sempre me incentivando com muito amor e carinho. E às minhas avós, é claro, pelo amor inestimável e por sempre terem torcido pelo meu sucesso.

Quero agradecer ao meu namorado, Luís Fernando, o meu melhor amigo, meu amor, meu companheiro de vida e de mestrado (risos) por todo carinho, amor, dedicação, companheirismo, incentivo e por me fazer feliz todos os dias.

E agradeço às minhas amigas queridas, Heloísa, Gabriela, Karina e Giovana, pelos anos de amizade, pelo amor que nos une, por todas as conversas e apoio nos momentos difíceis. E à minha afilhada Sofia pelo amor mais lindo e puro que existe.

Agradeço imensamente à Professora Lúcia, por ter aberto as portas do seu laboratório para mim, por ser minha orientadora e muitas vezes conselheira; por todo carinho e atenção, além dos ensinamentos transmitidos.

Gostaria de agradecer a todos os meus colegas e amigos de laboratório, aos que já saíram e aos que vão ficar, à Débora, Marina, Fernanda, Renata, Raquel, Ricardo, Bruno, Mika, Thaísa, Diego, Caíque, Amanda, Valquíria e Aline por toda amizade e companheirismo. Em especial à Vivi, minha roommate querida. À Carol, pela amizade incomparável, por ter me ajudado sempre que eu precisei, demonstrando preocupação e empolgação. E acima de tudo à Lucimara, que foi a primeira pessoa que eu conheci quando entrei no laboratório e quem me ensinou

agradecer também à Simone, por ter aparecido em um momento tão difícil para mim e ter me ensinado e ajudado tanto, por sempre demonstrar preocupação e estar disposta a me auxiliar. E o meu muito obrigada à querida Bianca, a pessoa que mais me ajudou na realização desse trabalho; obrigada por toda atenção, pelos ensinamentos transmitidos, e foram muitos; e obrigada por ter sido uma espécie de “co-orientadora” para mim além de uma amiga querida.

Agradeço imensamente aos melhores técnicos de laboratório que existem, Naty e Kiko, que me ajudaram sempre que precisei, com muita eficiência e preocupação; Ao Prof. Dr. Paulo Pinto Joazeiro pela colaboração neste projeto; ao Prof. Dr. José Xavier-Neto por ceder seu laboratório no LNBio para que alguns procedimentos pudessem ser realizados.

Agradeço à minha amada universidade UNICAMP, pela formação proporcionada e por ter sido meu lar em todos esses anos, pelas grandes experiências vividas aqui e pelos amigos que me trouxe.

Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia pela formação concedida e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio financeiro, que permitiram a realização deste trabalho.

funções cruciais durante o desenvolvimento embrionário. Em particular, estas proteínas são importantes moduladoras das vias de sinalização Wnt/β-catenina e TGF-β, uma vez que elas são requeridas para regular os níveis de sinalização parácrina em diferentes contextos celulares, maximizando a eficiência de vários processos biológicos. Dada a importância das vias Wnt e TGF-β para a correta formação do corpo do embrião de vertebrado, esta pesquisa visou caracterizar o padrão de expressão dos genes Dact1, Dact2 e Dact3 em membros de camundongos no estádio E14,5, uma etapa do desenvolvimento marcada pela diferenciação tecidual. Em adição, foram estabelecidos os padrões de expressão dos marcadores moleculares Col2a1, Sox9, Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e Bmp7 visando compará-los com os perfis de expressão dos genes Dact. O padrão de expressão dos genes estudados foi definido por ensaios de hibridação in situ em cortes histológicos de membros, utilizando-se sondas de RNA antisenso gene específicas. Cortes sagitais de embriões de camundongos no estádio E14,5 também foram incluídos nas análises de expressão dos genes Dact. Finalmente, marcações por imunofluorescências foram realizadas para confirmar a expressão das proteínas Sox9 e Runx2 em tecidos específicos dos membros em E14,5. Nossos resultados mostraram que os genes Dact são expressos em um amplo repertório de tecidos nos membros em desenvolvimento de camundongo. A pele, o tecido cartilaginoso, o tecido muscular e o endotélio de vasos sanguíneos de pequeno calibre são os tecidos de maior nível de expressão. Surpreendentemente, a análise dos marcadores moleculares revelou que apenas o gene Col2a1 mostrou um padrão característico de marcador molecular, com sua expressão associada unicamente ao tecido cartilaginoso em desenvolvimento. Os demais genes incluídos neste estudo como marcadores moleculares apresentaram perfis de expressão complexos, abrangendo vários tecidos. Por exemplo, Sox9 e

Runx2, marcadores do tecido cartilaginoso e ósseo, respectivamente, são fortemente

expressos no músculo esquelético em formação no membro. Esta expressão foi confirmada ao nível proteico por ensaios de imunofluorescência, revelando que não apenas os mRNAs mas também as proteínas codificadas por estes genes estão presentes em células do tecido muscular em desenvolvimento. O estudo dos cortes sagitais dos embriões em E14,5 mostrou que os mesmos tecidos que expressam os

são expressos em altos níveis no sistema nervoso central e periférico, assim como nos primórdios de vários órgãos do embrião, como pulmões, fígado e rins. Em conjunto, os resultados desta pesquisa mostram que os genes Dact são expressos em múltiplos tecidos, dentre os quais estão vários que requerem sinais Wnt e TGF-β para se desenvolver corretamente.

embryonic development. In particular, these proteins are important modulators of the Wnt/β-catenin and TGF-β signaling pathways, since they are required to regulate the levels of paracrine signaling in different cellular contexts, maximizing the efficiency of many biological processes. Given the importance of the Wnt and TGF-β pathways for the correct formation of the vertebrate embryo body, this research aimed to characterize the expression pattern of the Dact1, Dact2 and Dact3 genes in mouse limbs at stage E14.5, a stage of development marked by tissue differentiation. In addition, the expression patterns of the molecular markers Col2a1, Sox9, Runx2,

MyoD, Dcx, Bmp2 and Bmp7 were established to make comparisons with the

expression profiles of the Dact genes. The expression patterns of the genes studied were defined by in situ hybridization assays in histological sections of limbs, using gene-specific antisense RNA probes. Sagittal sections of mouse embryos at the E14.5 stage were also included in Dact gene expression analyses. Finally, immunofluorescence stainingwas performed to confirm the expression of Sox9 and

Runx2 proteins in limb specific tissues at E14.5. Our findings showed that Dact genes

are expressed in a broad repertoire of tissues in the developing mouse limbs. Skin, cartilaginous tissue, muscle tissue and endothelium of small-caliber blood vessels are the tissues of highest level of expression. Surprisingly, an analysis of the molecular markers revealed that only Col2a1 gene showed a characteristic pattern of molecular marker, with its expression associated to developing cartilaginous tissue only. The other genes included in this study as molecular markers presented complex expression patterns, encompassing several tissues. For example, Sox9 and Runx2, markers of cartilage and bone tissue, respectively, are strongly expressed during limb skeletal muscles formation. This expression was confirmed at the protein level by immunofluorescence assays, showing that not only the mRNAs but also the proteins encoded by these genes are present in cells of the developing muscle tissue. The study of sagittal sections of embryos at E14.5 showed that the same tissues expressing

Dact genes in limbs also express these genes along the main axis of the embryo's

body. In addition, analysis of these sections revealed that Dact genes are highly expressed in the central and peripheral nervous system, as well as in the primordia of various organs of the embryo’s body, such as lungs, liver and kidneys. Together, the

Figura 1: Sinalização molecular na formação do botão do membro...19

Figura 2: Botão do membro em desenvolvimento, evidenciando os eixos

próximo-distal e anteroposterior – Microscopia eletrônica de varredura de um embrião Mus

musculus no estádio E10,5 do desenvolvimento embrionário...20

Figura 3: Padronização anteroposterior do botão do membro e identidade dos

dígitos...22

Figura 4: Padronização dorsoventral do botão do membro...24

Figura 5: Estágios da ossificação endocondral no desenvolvimento de membros de camundongos...28

Figura 6: Fluxograma da sequência experimental realizada durante este projeto de

pesquisa...37

Figura 7: Representação esquemática do vetor pCR4-TOPO contendo os sítios: de

inserção dos fragmentos de cDNA dos genes Dact de interesse; de ligação dos

primers M13 direto e reverso; dos promotores onde se ligam as enzimas T3 RNA

polimerase e T7 RNA polimerase...43

Figura 8: Padrão de expressão dos genes Dact em cortes longitudinais de membro

anterior de embrião de camundongo E14,5...56

Figura 9: Padrão de expressão dos marcadores moleculares em cortes longitudinais

de membro anterior de embrião de camundongo E14,5...59

Figura 10: Imunofluorescências para os genes Sox9 e Runx2, em membros de

embrião de camundongo E14,5...61

Figura 11: Padrão de expressão dos genes Dact em cortes longitudinais de embrião

Tabela 1: Lista dos primers empregados na síntese dos templates para geração das

sondas de RNA antisenso...46

Tabela 2: Temperaturas empregadas nas etapas de pré-hibridação, hibridação e

lavagem com solução X durante os ensaios de hibridação in situ...49

Tabela 3: Descrição dos anticorpos utilizados na técnica de imunofluorescência...51

Tabela 4: Resumo dos resultados obtidos nos ensaios de hibridação in situ para os

genes Dact1, Dact2, Dact3, Sox9, Runx2, MyoD, Col2a1, Dcx, Bmp2 e Bmp7, em cortes histológicos de membros de embriões de camundongo E14,5...63

1 Introdução. ... 16

1.1 Desenvolvimento dos membros em vertebrados. ... 16

1.1.1 A formação dos botões dos membros. ... 16

1.1.2 Organizadores e a padronização dos eixos corporais do membro. ... 19

1.2 Diferenciação tecidual nos membros em desenvolvimento. ... 25

1.3 As proteínas DACT e sua importância no desenvolvimento. ... 30

2 Objetivos. ... 35

2.1 Objetivo Geral. ... 35

2.2 Objetivos específicos. ... 35

3 Materiais e métodos. ... 37

3.1 Coleta, estadiamento e dissecção dos membros de embriões de camundongo. 37 3.2 Inclusão em parafina e cortes histológicos. ... 38

3.3 Inclusão em historresina, cortes histológicos e coloração de Rosenfeld (Giemsa)...39

3.4 Síntese de sondas de RNA antisenso para os genes Dact1, Dact 2 e Dact3. . 39

3.4.1 Produção das sondas a partir de clones vetoriais. ... 39

3.4.2 Transformação em bactérias competentes. ... 39

3.4.3 Extração de DNA plasmidial e validação dos clones. ... 40

3.4.4 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) – Dact1, Dact 2 e Dact3. ... 40

3.4.5 Síntese das sondas – Dact1, Dact 2 e Dact3. ... 41

3.5 Síntese de sondas de RNA antisenso utilizando primers específicos – Col2a1, Sox9, Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e Bmp7. ... 43

3.5.1 Extração de RNA total de embrião de camundongo E14,5. ... 44

3.5.2 Síntese de cDNA. ... 44

3.5.3 Reação em cadeia de polimerase (PCR) – Col2a1, Sox9, Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e Bmp7. ... ... 45

3.5.4 Síntese das sondas – Col2a1, Sox9, Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e Bmp7...47

3.6 Hibridação in situ em lâminas. ... 47

4 Resultados. ... 53

4.1 Expressão dos genes Dact em membros no estádio E14,5. ... 53

4.2 Comparação com os marcadores moleculares. ... 57

4.3 Investigação da expressão dos Dacts no sistema músculo esquelético axial. ... 64

4.4 Outros sítios de expressão dos genes Dact. ... 66

5 Discussão. ... 69

5.1 Os genes Dact são expressos em vários tecidos do membro em E14,5. ... 69

5.2 Novos sítios de expressão dos genes Dact em embriões de camundongo em E14,5. ... ... 73

5.3 Análise dos marcadores moleculares no membro em E14,5. ... 74

6 Conclusões. ... 78

7 Referências Bibliográficas. ... 80

8 Apêndices. ...95

1 Introdução.

1.1 Desenvolvimento dos membros em vertebrados.

O surgimento dos membros foi um evento marcante na história evolutiva dos vertebrados. Os membros possuem diversas funções como locomoção, sustentação do peso corporal e manutenção do equilíbrio, bem como auxílio à caça e à alimentação. Seu surgimento permitiu que animais vertebrados conquistassem o meio terrestre e, adaptações subsequentes possibilitaram que os membros pudessem ser utilizados para o voo e para um retorno ao ambiente aquático. Assim, uma grande variedade de nichos ecológicos é atualmente ocupada pelos tetrápodes em diferentes ecossistemas.

Caracterizado como um processo ontogenético complexo, o desenvolvimento dos membros é regido pelas mesmas vias de sinalização que governam o desenvolvimento de outras partes do corpo do embrião. Dentre elas, destacam-se as vias de sinalização Wnt (nome gerado pela fusão de Wingless e

Integrated),TGF-β (Transforming Growth Factor β), Shh (Sonic hedgehog) e FGF

(Fibroblast Growth Factor)(Niswander, 1997; Gilbert, 2003; Carroll et al., 2005; Tickle, 2006; Shubin et al., 2006; Tickle et al., 2001).A atividade integrada destas e de outras vias de sinalização gera padrões de expressão gênica específicos ao longo do tempo e espaço, os quais promovem diferentes processos durante a gênese dos membros, como a padronização do botão do membro, a especificação e determinação das células progenitoras, a migração de células para o campo morfogenético dos membros, a diferenciação tecidual e o crescimento.

Nos itens abaixo, iremos abordar as diferentes etapas do desenvolvimento dos membros, destacando os principais processos biológicos e moléculas envolvidas em cada fase.

1.1.1 A formação dos botões dos membros.

Durante o desenvolvimento inicial, enquanto o corpo do embrião alonga-se e cresce longitudinalmente, surgem os botões dos membros em pontos específicos ao longo do eixo anteroposterior, lateralmente aos somitos. À região da placa

mesodérmica lateral que origina o botão do membro é dado o nome de campo morfogenético do membro. Esta região abriga um conjunto de células mesenquimais, que, diante de sinais moleculares específicos, são capazes de formar um membro e todas as estruturas que o compõem (Tickle, 2015; Gilbert, 2010). No campo morfogenético dos membros ocorre uma gama de interações teciduais entre os mesodermas paraxial, intermediário e lateral, além do ectoderma. Estas interações envolvem a síntese de ácido retinóico, bem como as vias de sinalização Wnt e FGF que, em conjunto, coordenam a expressão dos genes Hox (Homeobox genes) e dos genes Tbx (T box genes) (Gilbert, 2010).

Durante a formação dos botões dos membros, o fator FGF8 é expresso pelo mesoderma pré-somítico e intermediário, definindo os limites da segmentação e formação dos somitos (Carroll, 2013). A sinalização de FGF8 é importante para a padronização do eixo anteroposterior do corpo do embrião, mas é inibida nas regiões em que o mesoderma lateral forma os membros. Esta inibição é mediada pelo ácido retinóico, sintetizado pela atividade da enzima Retinaldeído desidrogenase (Raldh1a2) nos somitos recém-formados (Niederreither et al., 1997; Berggren et al., 1999; Zhao et al.,2009). As células de toda a placa mesodérmica lateral passam a expressar FGF10 que, sob influência das proteínas Wnt2b (membro anterior) e Wnt8c (membro posterior), promovem a manutenção desta expressão apenas nos sítios da placa mesodérmica lateral que formarão os membros anteriores e posteriores (Gilbert, 2013) (Figura 1).

Em adição à sinalização mediada por FGFs/Wnts, a expressão dos genes

Hox auxilia no posicionamento dos botões dos membros ao longo do eixo do corpo do

embrião. A expressão dos genes Hox na placa mesodérmica lateral é regulada pelo ácido retinóico no momento de determinação do campo do membro (Marshall et al., 1996) e induzida pela sinalização FGF durante a gastrulação (Tickle, 2015). Uma combinação específica dos mesmos determina a posição e padronização do membro ao longo do eixo anteroposterior do corpo do embrião. Genes dos agrupamentos HoxA e HoxD são expressos nos membros anteriores e posteriores em desenvolvimento, enquanto conjuntos diferentes de genes do agrupamento HoxC são expressos nos membros anteriores e posteriores (Simon et al., 1997; Zakany et al., 2007). O botão do membro anterior, por exemplo, desenvolve-se na região mais anterior do tronco do embrião expressando Hoxc6, no local de transição da vértebra cervical para a torácica

(Gilbert, 2010). Sabe-se também que a atividade dos genes Hox5 e Hox9 é necessária para o desenvolvimento dos membros anteriores e membros posteriores, respectivamente (Xu et al., 2013; Xu & Wellik, 2011).

Apesar da importância dos genes Hox para o estabelecimento da identidade dos membros, é a expressão diferencial dos fatores de transcrição Tbx que definem o destino do membro como anterior ou posterior. O gene Tbx5 é transcrito na placa mesodérmica lateral anterior, no local de formação do membro anterior. Por sua vez, os genes que codificam os fatores de transcrição Tbx4 e Pitx-1 (paired-like homeo domain transcription factor 1) são expressos na placa mesodérmica posterior e dão à região identidade de membro posterior (Chapman et al., 1996; Gibson-Brown et al., 1996; Takeuchi et al., 1999; Gilbert, 2010; Carroll, 2013).

Uma vez estabelecido o campo do membro e seu posicionamento ao longo do corpo do embrião, o broto do membro surge por meio da proliferação das células mesenquimais da placa mesodérmica lateral, que está expressando FGF10 sob a influência da sinalização Wnt, formando uma protuberância sob o ectoderma local. No botão do membro anterior, Wnt2b induz a expressão de FGF10, que atua via Wnt3a induzindo a expressão de FGF8 no ectoderma sobrejacente, que dará origem à crista ectodérmica apical ou AER (Apical ectodermal ridge) (Gilbert, 2010; Tickle, 2015) (Figura 1).

Figura 1: Sinalização molecular na formação do botão do membro. A: Expressão de FGF10 pela

placa mesodérmica lateral, estabilizada por Wnt8c expresso na região de formação do membro posterior. B: Expressão de FGF10 pela placa mesodérmica lateral, estabilizada por Wnt2b na região de formação do membro anterior. C: FGF10 expresso nessas duas regiões da placa mesodérmica lateral, induz expressão de FGF8 no ectoderma sobrejacente, que dará origem a AER. Essa indução é realizada via Wnt3a, expresso no ectoderma sobrejacente. FGF8 estabelece um feedback positivo induzindo FGF10 no mesênquima subjacente (Figura adaptada de Gilbert, 2010).

1.1.2 Organizadores e a padronização dos eixos corporais do

membro.

“Organizadores” ou centros de sinalização molecular regem o processo de desenvolvimento dos botões dos membros, estabelecendo e organizando os três eixos corporais destas estruturas: o próximo distal (PD), o anteroposterior (AP) e o dorsoventral (DV). Além disto, estes centros controlam a diferenciação dos elementos musculares, cartilaginosos e ósseos durante seu desenvolvimento. O botão do membro possui regiões sinalizadoras específicas, a crista ectodérmica apical (AER),

a zona de progresso (ZP) e a zona de atividade polarizada (ZPA), que cooperam para o desenvolvimento e padronagem dos membros ao longo dos três eixos (Figura 2).

Figura 2: Botão do membro em desenvolvimento, evidenciando os eixos próximo-distal e anteroposterior – Microscopia eletrônica de varredura de um embrião Mus musculus no estádio E10,5 do desenvolvimento embrionário. A imagem ampliada evidencia o botão do membro anterior

com os eixos próximo-distal e anteroposterior e a Crista Ectodérmica Apical (AER) marcada em verde (Figura adaptada de Zeller et al., 2009).

A padronização do membro ao longo do eixo próximo-distal acontece por meio de uma série de interações entre o mesênquima do botão do membro e os sinais secretados pela AER. Esta importante região organizadora consiste em um epitélio espesso localizado na extremidade distal do membro, originado pela indução do ectoderma distal pelo mesoderma somático subjacente, e que formará o principal centro sinalizador para o membro em desenvolvimento (Niswander et al., 1993). Nesse contexto, sinais de FGF10 vindos do mesênquima subjacente, por meio das vias de sinalização das BMPs (Bone morphogenetic proteins) e de Wnt3a no ectoderma sobrejacente, induzem a expressão de fatores FGF4 e FGF8 na AER do broto do membro que por sua vez, estabelecem um feedback positivo induzindo

FGF10 no mesênquima subjacente (Ahn et al., 2001; Barrow et al., 2003; Gilbert,

As células do mesênquima subjacente à AER e que estão sob influência dos fatores FGF secretados pela mesma recebem o nome de zona de progresso (ZP). As células da ZP se mantém em um estado de proliferação mitótica, expressando

FGF10 devido ao feedback positivo entre o mesênquima e a AER. Tal interação

permanece durante todo o desenvolvimento do membro e dessa forma, as células mesenquimais da ZP não se diferenciam e não se condensam em nódulos de cartilagem, impulsionando a padronização e o crescimento próximo-distal do botão do membro (Kawakami et al., 2001; Gilbert, 2010).

A proliferação das células mesenquimais da ZP promove a expansão dos grupos progenitores dos três segmentos esqueléticos dos membros: o estilópode (úmero/fêmur), o zeugópode (rádio e ulna/tíbia e fíbula) e o autópode (ossos da mão/pé). Cada célula da ZP é especificada de acordo com o tempo em que ela passa se dividindo dentro da ZP. Quanto mais tempo uma célula integra a ZP, mais tempo ela passa expressando FGF10 sob influência da AER, se dividindo enquanto o membro cresce e se alonga distalmente. As células que saem da ZP deixam de expressar FGF10 por estarem mais distantes da AER, tornando-se responsivas a sinais TGF-β produzidos pelas outras células mesenquimais ao redor e por elas mesmas, se diferenciando e condensando-se em nódulos de cartilagem (Gilbert, 2010).

Os genes Hox9-13 dos agrupamentos HoxA e HoxD participam da sequência de formação dos elementos esqueléticos dos membros. Interessantemente, a perda de genes parálogos de grupos específicos dos Hox causa a perda completa de informações de padronagem dentro de um segmento específico dos membros. Por exemplo, a perda de parálogos de Hox10 resulta em severas malformações dos ossos do segmento proximal do membro, o estilópode. Por sua vez, a perda de parálogos de Hox11 causa severo comprometimento dos ossos do compartimento medial do esqueleto apendicular, o zeugópode. E, finalmente, a perda de parálogos de Hox13 resulta na ausência completa de elementos esqueléticos do autópode (Zakany et al., 2007).

Paralelamente à padronização próximo-distal do botão do membro, a identidade anteroposterior do mesmo é definida por sinais vindos de um pequeno grupo de células mesenquimais indiferenciadas, presentes na margem posterior do botão do membro, que correspondem à zona de atividade polarizadora (ZPA). Sinais

dos FGFs da AER em conjunto com a expressão de ácido retinóico e dos genes Hand2 (the basic helix-loop-helix transcription fator), Tbx4/5 e Hox5 são responsáveis por induzir a expressão do fator parácrino Shh na ZPA. Este fator, por sua vez é secretado pela ZPA e torna-se diferencialmente expresso nas regiões anterior e posterior dos membros, atuando dessa forma, no estabelecimento deste eixo (Yang & Niswander, 1995; Gilbert, 2010) (Figura 3).

Figura 3: Padronização anteroposterior do botão do membro e identidade dos dígitos. A

padronização do botão do membro no eixo anteroposterior e a identidade dos dígitos é dependente do gradiente de concentração e tempo de expressão de Shh. Na região posterior, próximo à ZPA, local de alta concentração de Shh formam-se os dígitos 4 e 5; na região anterior do botão do membro, local onde os sinais de Shh não chegam, forma-se o dígito 1; enquanto os dígitos 2 e 3 são formados na região intermediária do botão do membro, com concentração média de Shh em relação à ZPA e à região anterior (Figura adaptada de Schoenwolf, 2014).

A identidade dos dígitos é especificada pelo gradiente do fator Shh. Uma vez secretado pela ZPA, o Shh se distribui pelo membro, da região posterior, onde a ZPA está localizada, para a anterior, definindo quais dígitos serão formados ao longo do eixo anteroposterior do botão do membro. Na margem posterior, local com maior quantidade de moléculas Shh, haverá a formação do dígito 5 (“dedinho”) e conforme a concentração de Shh diminui a identidade dos outros dígitos é definida, sendo o dígito 1 (“dedão”) o mais anterior, formado no local onde o Shh não chegou (Figura 3).

A identidade dos dígitos também é definida por outros fatores. Um gradiente de proteínas BMPs através do botão do membro, que é induzido e mantido pelo próprio Shh, auxilia na especificação dos dígitos (Gilbert, 2013). A expressão pré-existente das proteínas Gli3 (Transcriptional activator Gli3) e Hand2 também parece conferir identidade anteroposterior ao botão do membro, inibindo-se reciprocamente em ambas as margens. Enquanto Gli3 é expressa no mesênquima anterior do botão,

Hand2 é expressa na margem posterior, auxiliando na indução da expressão de Shh

pela ZPA (Panman& Zeller, 2003; Carroll, 2013; Osterwalder et al., 2014; Tickle, 2015). Outro fator importante neste contexto é a expressão diferencial e em fases temporais dos genes Hox ao longo do botão do membro, que além de participarem na padronização do eixo próximo-distal estão envolvidas na identidade anteroposterior do mesmo. A atividade dos genes Hox5 e Hox9 também influencia na ativação da expressão de Shh pela ZPA, auxiliando a formação do gradiente de expressão ao longo do eixo anteroposterior, o que define a padronização do botão do membro nesse eixo (Carroll, 2013; Tickle, 2015).

O terceiro eixo do botão do membro a ser padronizado é o dorsoventral, que define as faces dorsal e ventral do membro. Tal polaridade depende de sinais moleculares vindos das células mesenquimais e do ectoderma do botão do membro. Sinais Noggin vindos dos somitos inibem a sinalização das BMPs na ectoderme dorsal do botão do membro. Assim, as células da porção dorsal do ectoderma do botão do membro expressam o gene Wnt-7a que induz a expressão do fator de transcrição

Lmx1b (LIM homeobox transcription factor 1 beta) no mesênquima dorsal do botão do

membro, conferindo às células dessa região características de dorso do membro (Figura 4). Por sua vez, altos níveis de sinalização das BMPs na região ventral do ectoderma do botão do membro induzem a expressão do fator de transcrição En-1 (Engrailed 1), que impede a expressão de Wnt-7a, conferindo a essa região o destino de região ventral do membro (Riddle et al., 1995; Gilbert, 2010; Carroll, 2013).

Figura 4: Padronização dorsoventral do botão do membro. A expressão gênica difere ao longo do

eixo dorsoventral do botão do membro. Wnt7a é expresso no ectoderma dorsal e induz a expressão de Lmx1b no mesênquima dorsal; enquanto En-1 é expresso no ectoderma ventral e impede a expressão de Wnt7a. Essa expressão diferencial dá ao botão do membro as características de região dorsal e ventral, respectivamente (Figura adaptada de Carrol, 2013).

A padronização e organização dos três eixos corporais no botão do membro estão intimamente correlacionadas por um sistema de autorregulação e manutenção próprio, envolvendo feedbacks entre suas regiões “organizadoras”. O gene Wnt-7a expresso no ectoderma dorsal do botão do membro e os fatores FGFs expressos pela AER, regulam a expressão de Shh na ZPA, este por sua vez ativa a expressão de Grem1 (Gremlin 1) no mesênquima subectodermal, o qual inibe as

BMPs. Em decorrência da presença de Grem1, a via de sinalização das BMPs não

consegue atuar, portanto não ocorre inibição da expressão dos fatores FGFs da AER. Logo, a expressão dos FGFs pela AER é mantida. Esse loop de sinalização estabelece o feedback positivo FGF/Shh em que a manutenção da ZPA depende da funcionalidade da AER que depende da funcionalidade da ZPA (Carroll et al., 2005; Tickle, 2006; Gilbert, 2010; Carroll, 2013; Tickle, 2015).

O aumento do antagonista Grem1 diminui as atividades mesenquimais dos BMPs, permitindo a sinalização FGF/Shh. Essa sinalização sustenta o crescimento do membro e proporciona a formação do mesmo por completo, coordenando a especificação, proliferação, determinação, diferenciação e crescimento dos seus

componentes (Gilbert, 2003; Zeller et al., 2009). Conforme o membro cresce distalmente, as sinalizações Wnt, Shh e FGF diminuem na região proximal, ativando a expressão dos fatores TGF-β eSox9, que levam à diferenciação condrogênica (Gilbert, 2006; Zeller et al., 2009).

1.2 Diferenciação tecidual nos membros em desenvolvimento.

O desenvolvimento dos membros em camundongo inicia-se com a formação do botão do membro. Este cresce, até formar um membro completo equivalente ao membro do organismo adulto. Em um período de cinco dias, que vai do estádio E9,5 ao E14,5, o membro cresce em tamanho e seus tecidos se diferenciam, dando origem a todos os tecidos que compõem o membro: a pele, o tecido conjuntivo, a cartilagem, os ossos, os músculos, nervos e vasos sanguíneos (Martin, 2002).

A mesoderme no membro tem o potencial de formar a cartilagem, o osso, o tecido conjuntivo, os músculos e os vasos sanguíneos. Em parte, o destino celular é pré-determinado pelo local de origem da célula no corpo do embrião. Células originárias da placa mesodérmica lateral dão origem aos tecidos ósseo, conjuntivo, cartilaginoso e vascular, enquanto células migratórias do miótomo somítico originam o tecido muscular (Tajbakhsh et al., 1999; Deries et al., 2016). O tipo de tecido gerado depende de sinais moleculares advindos das estruturas adjacentes às células que estão se desenvolvendo (Brent et al., 2002).

O comprometimento das células mesenquimais com a linhagem condrogênica é um evento chave na formação dos ossos. Com exceção dos ossos do crânio, partes da mandíbula e dos ossos chatos da cintura escapular e pélvica, que se formam por meio da ossificação intramembranosa, todos os demais ossos são formados pelo processo de ossificação endocondral. Assim, durante o desenvolvimento embrionário o esqueleto axial e apendicular dos vertebrados é formado a partir de pequenos moldes cartilaginosos que progressivamente se convertem em tecido ósseo (Hall e Miyake, 1992, Ornitz e Marie, 2002). Neste processo, a condrogênese antecede a esqueletogênese. Isto porque cada elemento esquelético é primeiramente estabelecido a partir de progenitores mesenquimais,

formando moldes cartilaginosos que posteriormente são substituídos pelo tecido ósseo, dando origem ao esqueleto do embrião (Mackie et al., 2008).

Durante o desenvolvimento dos membros, as células mesenquimais que compõem a região proximal do botão do membro deixam de expressar FGF10 e tornam-se responsivas aos sinais TGF-β produzidos por elas mesmas, uma vez que estão distantes dos sinais FGF vindos da AER e das vias de sinalização Wnt e Shh, ativas na região distal do membro (Gilbert, 2006; Zeller et al., 2009). A partir de então, a região proximal do membro direciona o início da formação de nódulos de cartilagem. As moléculas sinalizadoras da família TGF-β atuam como indutoras positivas da proteína de matriz extracelular fibronectina, responsável pela condensação das células mesenquimais e formação de nódulos cartilaginosos. Interessantemente, as proteínas sinalizadoras TGF-β são indutoras do seu próprio inibidor, o que resulta na formação de regiões que expressam TGF-β e fibronectina, alternadamente (Gilbert, 2013). Isso garante que apenas parte do mesênquima siga o destino condrogênico, enquanto as regiões restantes irão compor os outros tecidos do membro.

Os nódulos de células mesenquimais condensadas, por influência das moléculas de sinalização TGF-β, BMPs, FGFs, Shh, PKA (protein kinase a) e pelo fator de transcrição Hif1-α (hypoxia-inducible factor 1α), passam a expressar o fator de transcrição Sox9 (sex determining region Y – box 9), molécula chave no processo de condrogênese (Kozhemyakina et al.; 2015). O gene Sox 9 ativa a expressão de

Sox 5 e 6, e mantém a sua própria, induzindo a diferenciação das células

condrogênicas, dando origem aos primórdios de cartilagem, que consistem em aglomerados de condrócitos imaturos arredondados que continuam expressando os fatores Sox (Bi et al., 1999; Akiyama et al., 2002). Tais condrócitos, ainda imaturos, expressam os fatores Sox 5, 6 e 9 e passam a secretar moléculas estruturais específicas da matriz cartilaginosa, como colágeno tipo IIα1 (Col2a1), agrecan (Acan), glicosaminoglicanos e proteoglicanos (Zhao et al.; 1997; Kozhemyakina et al.; 2015). A matriz produzida e depositada acaba por envolver as células e a separá-las entre si, as quais passam então a ser reconhecidas como condrócitos diferenciados (Lorda-Diez et al., 2011).

As células situadas no centro dos primórdios de cartilagem passam por etapas de proliferação e maturação, durante as quais as características celulares e os perfis de expressão dos condrócitos mudam progressivamente. Os pequenos

condrócitos localizados distalmente dão origem aos condrócitos achatados no centro dos nódulos cartilaginosos. Em fase de proliferação, eles se multiplicam e se empilham em colunas longitudinais (Kozhemyakina et al., 2015). A fase seguinte de transição para condrócitos pré-hipertróficos é marcada pela expressão do receptor do hormônio paratireódiano Pth1r (Parathyroid hormone 1 receptor) e Ihh (Indian hedgehog) (DeLise et al.,2000; Li & Dong, 2016). Nessa fase da maturação, o ciclo celular dos condrócitos é interrompido e o volume do seu citoplasma aumenta aproximadamente 20 vezes (Cooper et al., 2013), dando origem às células que são denominadas de condrócitos hipertróficos, que expressam colágeno tipo Xα1 (Col10a1). Com a indução de Pth1r, Ihh e, subsequentemente, de Col10a1, os fatores de transcrição Sox5, Sox6, Sox9, Col2a1 e Acan deixam de ser expressos (Kozhemyakina et al., 2015; Li & Dong, 2016).

Em uma etapa mais avançada, os condrócitos hipertróficos deixam de expressar Col10a1 e progridem para se tornar condrócitos hipertróficos tardios, que expressam VEGFA (Vascular endotelial growth fator A), Mmp13 (Matrix

metalloproteinase 13) e a fosfoproteína 1 segregada, também conhecida como

osteopontina ou sialoproteína óssea 1. A expressão de VEGFA e Mmp13, anuncia a invasão da placa de ossificação por células endoteliais, osteoclastos e precursores de osteoblastos (Kozhemyakina et al., 2015; Li & Dong, 2016).

Os precursores de osteblastos que surgem tanto no pericôndrio (Maes et al., 2010) como nos condrócitos hipertróficos (Yang et al., 2014), são induzidos por Runx2 (Runt-related transcription factor 2), Wnt/beta-catenina e Osterix, diferenciando-se em osteoblastos, que trabalham em conjunto com osteoclastos para remodelar a matriz de formar o osso trabecular (Li & Dong, 2016).

Conforme a cartilagem cresce longitudinalmente, os condrócitos hipertróficos morrem por apoptose e são substituídos por osso em uma região conhecida como centro de ossificação primário. A produção e maturação de condróctios se torna restrita à epífise, em uma estrutura denominada de placa de crescimento. E um centro de ossificação secundário surge dentro da epífise, separando a placa de crescimento das extremidades distais dos ossos longos (Schoenwolf, 2011; Kozhemyakina et al., 2015).

Um esquema de mudanças progressivas que ocorre a partir das células mesenquimais até o início do processo de ossificação durante a ossificação endocondral é mostrado na Figura 5.

Figura 5: Estágios da ossificação endocondral no desenvolvimento de membros de camundongos. A: No estádio E11,5 do desenvolvimento as células mesenquimais se condensam e

formam os nódulos de cartilagem, moldes cartilaginosos para o futuro osso em formação. B: No estádio E13,5 as células se diferenciam em condrócitos (em vermelho), e iniciam-se os processos de maturação e hipertrofia. A peça cartilaginosa é revestida pelas células do pericôndrio (em branco). C: No estádio E15,5, com a vascularização do centro da peça cartilaginosa, os condrócitos hipertróficos começam a ser substituídos por células da linhagem óssea, determinando o centro de ossificação primário (Figura adaptada de Kozhemyakina et al.; 2015).

Simultaneamente ao processo de ossificação endocondral, células provenientes dos somitos originam os músculos dos membros a partir das células progenitoras musculares Pax3 (paired box gene 3) positivas (Tajbakhsh et al., 1999; Deries et al., 2016). Para que isso ocorra, estas células precursoras musculares se desprendem do lábio ventro-lateral do dermomiótomo e migram para os brotos dos membros em desenvolvimento. Ao chegarem a este compartimento, as células miogênicas invadem o mesênquima dos botões dos membros e passam por sucessivos rounds de divisão celular para compor uma população de células

progenitoras suficientemente grande para formar as massas musculares dos membros (Babiuk et al., 2003; Sambasivan et al., 2011; Murphy et al., 2011; Duprez, 2002; Murphy et al., 2011). Na região distal dos membros, sinais FGFs vindos da AER mantém as células dessa região indiferenciadas. Desta maneira, a diferenciação das células musculares e a formação dos miotubos tem início na região proximal do membro em desenvolvimento e prossegue distalmente conforme o membro cresce (Robson et al., 1996; Engel et al., 2004; Emerson et al., 2004).

Concomitantemente à formação dos tecidos cartilaginoso, ósse e muscular, os vasos sanguíneos, os nervos e a pele estão se desenvolvendo no membro em desenvolvimento.

A pele no membro de camundongos é formada por dois componentes: a epiderme, uma camada superficial originária do ectoderma, e a derme, uma camada mais interna que se desenvolve a partir do mesênquima do membro (Sadler, 2011). Inicialmente o embrião é revestido por uma camada de células ectodérmicas, que ao se dividir dá origem a periderme e a ectoderme basal. No estádio E12,5 esses dois componentes consistem em apenas duas camadas de células e determinam a epiderme. Posteriormente a camada ectodermal se estratifica originando uma epiderme com 4 a 5 camadas de células no estádio E14,5. É nesse momento que ocorre a primeira indicação de derme no membro, quando uma camada de 2 a 3 células de profundidade se encontra abaixo da epiderme e se distingue da malha mais frouxa do mesênquima (Martin, 2002).

Uma fina rede capilar se forma paralelamente à formação da pele. Em E12,5 é possível ver um raso plexo vascular cutâneo abaixo de uma fina camada avascular sob a epiderme em formação. Na região da AER, capilares invadem o mesênquima até alcançar a epiderme. Em E14,5 assim como em estádios anteriores persiste uma camada avascular e aneural, que na região proximal do membro é invadida por vasos e nervos que se encontram próximo da epiderme em rápida maturação (Martin, 2002).

Os vasos sanguíneos dos membros formam-se inicialmente como uma rede anastomosada com ramos da aorta próxima e das veias cardinais (Gilbert, 2010). Os botões dos membros são supridos pelas ramificações das artérias intersegmentares, que se originam a partir da aorta dorsal, formando uma rede de finos capilares através do mesênquima (Moore, 2008). O padrão vascular primitivo

consiste em um grande plexo venoso formado ao longo do mesênquima do membro com uma artéria central ou axial primária desenvolvendo-se no centro com ramificações extensas (Moore, 2008; Gilbert, 2010).

O padrão vascular se modifica com o desenvolvimento dos membros em decorrência da formação de vasos a partir daqueles preexistentes (angiogênese). À medida que o membro cresce, alguns dos ramos menores tornam-se dominantes. A artéria axial primária torna-se artéria branquial na região do braço e as artérias ulnar e radial na região do antebraço, que são suas ramificações terminais. Na região da perna, a artéria axial primária torna-se a artéria femoral (Moore, 2008). A ocorrência de anastomose de novos ramos com os anteriores leva à formação dos sistemas vasculares maduros dos membros (Gilbert, 2010).

Os axônios motores migram a partir da medula espinhal e penetram no botão dos membros em desenvolvimento, e crescem no interior das masssas musculares dorsais e ventrais, constituindo os nervos motores (Moore, 2008). Os músculos individuais dos membros são freqüentemente supridos por mais de um segmento espinhal. O membro anterior recebe inervação via plexo branquial, a partir dos nervos espinhais C4-8 e T1, enquanto o membro posterior é inervado pelos nervos L1-6 via plexo lombar. No estádio E12,5 os rudimentos dos principais troncos nervosos do membro já estão formados (Martin, 2002).

A inervação sensitiva cutânea é estabelecida à medida que os nervos periféricos e as células da crista neural migram para os membros em desenvolvimento (Gilbert, 2010). Os axônios sensorias penetram nos botões dos membros após os axônios motores, usando-os como orientação e as células da crista neural, precursoras das células de Shwann, encontram-se ao redor das fibras nervosas motoras e sensoriais dos membros (Moore, 2008). Inicialmente os nervos sensoriais do membro se formam em um padrão segmentado regular como ocorre ao longo do corpo do embrião. No entanto, à medida que os membros crescem distalmente, os dermátomos crescem também, produzindo um padrão de inervação sensorial oblíquo e mais complexo (Moore, 2008; Gilbert, 2010).

1.3 As proteínas DACT e sua importância no desenvolvimento.

proteínas adaptadoras restritas ao grupo dos cordados, que desempenham múltiplas funções no desenvolvimento embrionário e manutenção da homeostase pós-natal. O número de genes que compõem esta família varia de um, nos anfíbios, a quatro em peixes teleósteos, havendo três genes em mamíferos e dois em aves (Fisher et al., 2006; Alvares et al., 2009; Gillhouse et al., 2004; Cheyette et al., 2002; Gloy et al., 2002). Por serem proteínas adaptadoras, as DACTs são moléculas destituídas de atividade catalítica própria, mas que promovem um aumento na eficiência de processos biológicos específicos, ao interagir com outras proteínas através de seus diversos domínios estruturais. Dessa forma, elas auxiliam no funcionamento das vias de transdução de sinal, facilitando interações moleculares entre diferentes proteínas (Ranganathan e Ross 1997; Hall e Lefkowitz 2002).

Em termos estruturais, as proteínas DACT contêm um zíper de leucina na região N-terminal e um domínio PDZ (Post synaptic density-95/Discs large/Zonula

occludens-1) na extremidade C-terminal, os quais se ligam à proteina Dsh

(Disheveled) para modular sinais da via de sinalização Wnt canônica e Wnt/polaridade celular planar (PCP) (Fisher et al., 2006; Cheyette et al., 2002; Kivimãe et al., 2011). Interessantemente, evidências sugerem que os parálogos Dact apresentam atividades de sinalização comuns, bem como específicas, de tal forma que uma única proteína DACT pode ter mais de um papel dependendo do contexto biológico onde atuam (Hikasa e Sokol, 2004; Brott e Sokol, 2005). De fato, o trabalho de Kivimãe et al. (2011) revelou que as proteínas DACT são capazes de interagir com uma ampla gama de parceiros moleculares, incluindo Vangl (VANGL planar cell polarity protein), Dvl (dishevelled segment polarity protein), CK1δ/ε (discs overgrown), PKA (protein

kinase A) e PKC (protein kinase C), bem como com as proteínas catenina, GSK3

(glycogen synthase kinase 3), LEF/TCF, HDAC1 (hystone deacetylase 1) e TGFβ, além de interagirem consigo mesmas e umas com as outras por meio de seu zíper de leucina na região N-terminal. Interessantemente, enquanto as três proteínas DACT de mamíferos parecem compartilhar funções na modulação das vias de sinalização Wnt/canônica e PCP, apenas a proteína DACT2 tem sido associada à sinalização TGF-β. Sabe-se que DACT2 atua como um potente inibidor desta via, por ser capaz de se ligar aos receptores ALK4 e 5 e encaminhá-los para degradação mediada por lisossomos (Su et al., 2007).

As proteínas DACT colaboram em vários processos do desenvolvimento embrionário, participando da especificação do tecido neural, formação dos olhos e do coração (Cheyette et al., 2002; Gloy et al., 2002; Hikasa e Sokol, 2004; Waxman et al., 2004; Zhang et al., 2004; Brott e Sokol, 2005). Em adição, os genes Dact são fundamentais para promover os movimentos morfogenéticos durante a gastrulação e neurulação (Hikasa e Sokol, 2004). Em embriões de camundongos, os genes Dact estão expressos principalmente no sistema nervoso central. Contudo, níveis mais reduzidos de expressão são observados na mesoderme pré-somítica, nos somitos, no mesênquima do botão do membro e de outros tecidos, no timo, nos rins e nas glândulas salivares (Fisher et al., 2006).

No período pós-natal, alterações nos níveis de expressão dos genes Dact, muitas vezes em consequência de modificações epigenéticas em seus promotores, têm sido associadas a diferentes tipos de câncer, tais como carcinoma epidermóide esofágico e oral, carcinoma hepatocelular, câncer colo-retal, câncer de intestino e de pulmão (Guo et al., 2017; Liu et al., 2016; Schussel et al., 2015; Yu et al., 2014; Wang et al., 2015; Zhang et al., 2013; Jia et al., 2013; Jiang et al., 2008). Uma vez que o papel básico dos genes Dact é modular as vias de sinalização Wnt e TGF-β nos mais diferentes contextos celulares, o seu envolvimento no desenvolvimento de tumores é de certa forma esperado, uma vez que estas duas vias têm papéis bem conhecidos nos processos de tumorigênese e progressão tumoral.

Resultados publicados por nosso grupo de pesquisa revelaram que a expressão dos genes Dact é observada durante a ontogênese dos membros de galinha, pelo menos até o oitavo dia do desenvolvimento embrionário (Sensiate et al., 2013). Os principais sítios de expressão dos genes Dact nos membros de embriões de galinha incluem inicialmente células mesenquimais indiferenciadas dos botões dos membros e, mais tarde, os moldes cartilaginosos do esqueleto apendicular, bem como as articulações e tendões em desenvolvimento, indicando que o papel destes genes é fundamental para que ocorra a correta formação de diferentes tecidos do membro (Sensiate et al., 2013).

Dada a importância das vias Wnt e TGF-β para a correta formação do corpo do embrião de vertebrado e a estreita correlação dessas vias com os genes Dact1,

Dact2 e Dact3, esta pesquisa visou caracterizar o padrão de expressão desses genes

caracterizada pela diferenciação tecidual. Em adição, foi estabelecido o padrão de expressão dos marcadores moleculares Col2a1, Sox9, Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e

Bmp7 visando estabelecer comparações com os perfis de expressão dos genes Dact.

O padrão de expressão dos genes estudados foi caracterizado por ensaios de hibridação in situ em cortes histológicos dos membros, utilizando-se sondas de RNA antisenso gene específicas. Cortes sagitais de embriões de camundongos no estádio E14,5 também foram incluídos nas análises de expressão dos genes Dact. Finalmente, foram realizadas imunofluorescências para confirmar a expressão das proteínas Sox9 e Runx2 em tecidos específicos dos membros em E14,5. Nossos resultados revelaram que os genes Dact são expressos em um amplo repertório de tecidos do membro e de outras regiões do corpo do embrião de camundongo, sugerindo uma participação importante destes genes no processo de diferenciação tecidual em mamíferos.

2 Objetivos.

2.1 Objetivo Geral.

Caracterizar o padrão de expressão dos genes da família Dact (Dact1,

Dact2 e Dact3) durante a fase de diferenciação tecidual dos membros de embriões de

camundongo (Mus musculus).

2.2 Objetivos específicos.

1. Estabelecer o padrão de expressão dos genes Dact nos tecidos que compõem o membro de embriões de camundongo no estádio E14,5

2. Caracterizar o padrão de expressão dos marcadores moleculares Col2, Sox9,

Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e Bmp7 nos membros de embriões E14,5

3. Comparar os perfis de expressão dos genes Dact com aquele obtido para os marcadores moleculares

4. Investigar se os mesmos tecidos que expressam os genes Dact no compartimento dos membros também expressam estes genes em outras regiões do corpo do embrião E14,5.

3 Materiais e métodos.

Um resumo dos procedimentos experimentais realizados durante o desenvolvimento deste projeto é apresentado na Figura 6. Nos itens abaixo, é apresentado um detalhamento dos métodos empregados nesta pesquisa.

Figura 6: Fluxograma da sequência experimental realizada durante este projeto de pesquisa.

3.1 Coleta, estadiamento e dissecção dos membros de embriões de

camundongo.

A obtenção dos embriões de camundongo (Mus musculus) da linhagem C57/Bl6/JUnib foi realizada da seguinte forma: em uma gaiola foram colocadas de três ou quatro fêmeas com um macho para acasalamento. No dia seguinte, foi feita a observação da presença do plug vaginal pela manhã. Caso estivesse presente, este dia era computado como correspondente ao dia gestacional 0,5. Portanto, a coleta dos embriões no estádio E14,5 ocorreu 14 dias após a observação do plug vaginal e corresponde ao estádio TS22,5 (Theiler, 1989).

As fêmeas prenhes foram eutanasiadas em câmara saturada de CO2, certificando-se da morte do animal por deslocamento cervical. O útero gravídico foi retirado e lavado em solução salina PBS (Phosphate buffered saline) [1X] feita com água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). O manejo desses animais ocorreu sob autorização do protocolo 3780-1 da Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA/UNICAMP.

Com o auxílio de uma lupa, pinças e uma placa de Petri fornada, os embriões foram retirados do envoltório uterino, lavados em PBS [1x], procedendo-se a remoção das membranas extraembrionárias. Neste passo, o estádio de desenvolvimento em que o embrião se encontrava foi conferido e registrado. O estadiamento previsto foi confirmado pela análise visual dos critérios morfológicos característicos descritos por Theiler (1989).

Os membros anteriores, direito e esquerdo de cada embrião foram dissecados e transferidos com uma espátula autoclavada para um tubo cônico estéril, devidamente identificado. Os membros dissecados, assim como os embriões inteiros, foram fixados em Paraformaldeído 4% (PFA 4%) (Merck), overnight a 4°C.

No dia seguinte, os materiais fixados foram lavados três vezes por 5 min em PBS [1x] à temperatura ambiente. Em seguida, foi efetuada a desidratação incubando-se os espécimens em 30% etanol/PBS [1x] por 60min, em 50% etanol/PBS [1x] por 60min e em 70% etanol/PBS [1x] por 60min. Finalmente, o material desidratado foi armazenado em solução 70% etanol/PBS [1x] a -20°C.

3.2 Inclusão em parafina e cortes histológicos.

Para a realização dos cortes histológicos utilizados nos ensaios de hibridação in situ e imunofluorescência, os materiais foram incluídos em parafina. Para isso, os membros e embriões inteiros foram desidratados em uma série crescente de etanol (Synth) dissolvido em PBS [1X], nas seguintes concentrações: 70%, 80%, 95% e 100%. Em seguida, os espécimens foram diafanizados em etanol/xilol (1:1) e xilol 100% (Synth). A embebição em parafina foi feita a 60°C por 3 horas. Os materiais incluídos em blocos foram mantidos em geladeira até a realização dos cortes histológicos.

Os cortes histológicos foram realizados em micrótomo rotativo (Leica RM2145) na espessura de 7µm para os ensaios de hibridação in situ e, de 6µm, para os ensaios de imunofluorescência. Durante a preparação das lâminas histológicas, os cortes realizados foram transferidos para água tratada com DEPC em banho-maria a 37,5°C colocada sobre lâminas adesivas (Starfrost). As lâminas foram mantidas em estufa a 38°C overnight para secagem e, posteriormente, armazenadas a 4°C até seu uso.

3.3 Inclusão em historresina, cortes histológicos e coloração de

Rosenfeld (Giemsa).

Para fins de análises morfológicas, membros de embriões de camundongo E14,5 foram desidratados em série crescente de etanol/água destilada 70%, 80%, 95% com banhos de 30 min cada e, adicionalmente, três banhos de 30 min em etanol 100%. Em seguida, os materiais foram processados para embebição em Resina Glicol-metacrilato (HistoResin Kit - Leica) seguindo-se as recomendações do fabricante.

O material incluído em historresina foi cortado em micrótomo rotativo (Leica RM2145), na espessura de 3µm. Em seguida foi feita a coloração de Rosenfeld (May Grunwald (Merck), Giemsa (Merck), Metanol (Synth)) de acordo com as técnicas histológicas convencionais.

3.4 Síntese de sondas de RNA antisenso para os genes Dact1, Dact

2 e Dact3.

3.4.1 Produção das sondas a partir de clones vetoriais.

Os clones para a síntese das sondas dos genes Dact foram cedidos pela Dra. Susanne Dietrich da School of Biomedical and Health Sciences do King’s College

London na Inglaterra. Eles foram preparados no vetor pCR4 –TOPO contendo um

fragmento de cDNA do éxon 4 de cada gene. A sequência de cada um dos clones foi previamente checada por seqüenciamento.

Para obtenção do DNA plasmidial foi realizada inicialmente a transformação de bactérias competentes e, sem seguida, mini-preparações de DNA. O processo todo está descrito nos próximos itens.

3.4.2 Transformação em bactérias competentes.

A transformação foi feita com 10 ng de DNA, o qual foi adicionado diretamente a 50 μL de bactérias E. coli (DH5α) competentes. Após terem sido mantidas em gelo por 30 min, as células foram submetidas a choque térmico a 42°C

por 45 seg. Em seguida, foi adicionado 1 ml de meio de cultura LB (Luria-Bertani) e as bactérias permaneceram em shaker a 250 rpm por 1 hora a 37°C. Após esse período, 100 μL do produto da transformação foram plaqueados em placas de meio LB contendo 1,5% de ágar contendo 100 mg/ml de ampicilina. As placas foram incubadas em estufa a 37°C overnight.

3.4.3 Extração de DNA plasmidial e validação dos clones.

As colônias isoladas obtidas na transformação foram inoculadas em tubos contendo 5 ml de meio LB líquido (100 mg/ml ampicilina). Os inóculos foram mantidos sob agitação constante de 250 rpm a 37°C, overnight. Um volume de 1,5 ml de cada cultura foi destinado à obtenção de DNA plasmidial utilizando-se o QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), conforme instruções do fabricante.

Para verificar se os clones obtidos continham, de fato, o fragmento dos genes Dact, as amostras de DNA plasmidial purificadas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose (VWR) 1% e, aquela com o peso molecular esperado (vetor mais fragmento do gene) foi submetida à reação de sequenciamento para validação do ensaio.

3.4.4 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) – Dact1, Dact 2 e Dact3.

As reações de PCR preparadas continham 30 ng de DNA plasmidial, 1 μL de dNTPs (10 mM), 3 μL de MgCl2 (25 mM), 2,5 μL de DMSO (Dimetilsulfóxido), 0,25 μL de Taq DNA Polymerase (Fermentas), 5 μL 10X Taq Buffer with KCl (Fermentas), 1 μL de cada um dos primers (direto e reverso) e água tratada com DEPC para completar o volume para 50 μL. A temperatura de anelamento (TA) empregada nas PCRs foi de 50°C, que corresponde à temperatura padrão dos primers universais M13. As PCRs foram realizadas no Termociclador Eppendorf Mastercycler Pro, nas seguintes condições:

Pré-desnaturação:

 95ºC, 1 min

Primeira fase (5 ciclos):

 95ºC, 30 seg  65ºC, 30 seg  72ºC, 1 min

Segunda fase (30 ciclos):

 95ºC, 30 seg  TA, 1 min  72ºC, 1 min

Extensão final:

 72ºC, 10 min

Os produtos das PCRs foram purificados utilizando-se o MinElute PCR

Purification Kit (250) (QIAGEN), de acordo com as recomendações do fabricante. A

qualidade das amostras foi checada por eletroforese em gel de agarose 1,5% e, a quantificação, realizada em NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Scientific).

3.4.5 Síntese das sondas – Dact1, Dact 2 e Dact3.

Os DNAs gerados nas PCRs foram submetidos à transcrição in vitro para gerar as sondas de RNAs antisenso utilizadas como sonda. Para tanto, foram empregadas as enzimas RNA polymerase T3 ou T7 (Promega) para Dact1/Dact2 e

Dact3, respectivamente (Figura 7). A reação de síntese continha1μg de DNA; 10μL de

5XTranscription Buffer (Promega); 4 μL de 0,1M de Dithiothreitol (DTT) (Thermo Scientific); 2 μL de DIG RNA Labelling Mix (Roche), mix contendo ribonucleotídeos e UTP conjugado à Digoxigenina; 1 μL de RNAsin (Promega), um inibidor de RNase; 1 μL de T3 ou T7 RNA Polimerase (Promega) e água tratada com DEPC para completar

o volume final de 50 μL. A reação foi incubada a 37°C por duas horas. Finalmente, para remover o DNA utilizado como molde, foram adicionados à reação 2 μL de

DNAse I RNase-free (Thermo Scientific), procedendo-se incubação por 30 min a 37°C.

Após a avaliação da integridade das sondas em gel de agarose 1%, foi efetuada a purificação destas em coluna utilizando-se o kit Sigma Spin TM

Post-Reaction Purification Clean-up (Sigma-Aldrich) segundo recomendações do

fabricante. Ao final deste processo, a integridade das sondas foi novamente verificada em gel de agarose 1% por meio da avaliação da intensidade e definição da banda obtida, bem como do peso molecular esperado. Para quantificação das sondas foi empregado o equipamento NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Scientific), fazendo-se a leitura da absorbância nos comprimentos de onda 260/290 nm. Antes do uso, cada sonda foi diluída na concentração de 1 μg/ml em solução de pré-hibridação contendo 50% de Formamida (Sigma), SSC [5X] (Saline-Sodium

Citrate), 2% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), 2% Blocking powder (Roche), 250μg/ml

tRNA e 100μg/ml heparina, preparada em água tratada DEPC. As sondas foram armazenadas a -20o_{C até o momento de uso.}

Figura 7: Representação esquemática do vetor pCR4-TOPO contendo os sítios: de inserção dos fragmentos de cDNA dos genes Dact de interesse; de ligação dos primers M13 direto e reverso; dos promotores onde se ligam as enzimas T3 RNA polimerase e T7 RNA polimerase. Para a

síntese da sonda de RNA antissenso utiliza-se a RNA polimerase que transcreve o fragmento do cDNA do gene de interesse no sentido 3’ – 5’. Os genes Dact1 e Dact2 foram clonados na orientação 5’ – 3’ mostrada na figura. Portanto, a síntese das sondas de RNA antissenso para estes genes foi feita com a enzima T3 RNA polimerase. Para o gene Dact3 cuja inserção ocorreu no sentido oposto (3´-5´) ao mostrado na figura, a síntese das sondas antissenso utiliza a enzima T7 RNA polimerase.

3.5 Síntese de sondas de RNA antisenso utilizando primers

específicos – Col2a1, Sox9, Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e Bmp7.

Para a síntese de sondas de RNA antissenso referentes aos marcadores moleculares Col2a1, Sox9, Runx2, MyoD, Dcx, Bmp2 e Bmp7 foram utilizados primers gene específicos e RNA total extraído de embrião de camundongo E14,5. Os passos deste processo estão descritos nos itens a seguir.

3.5.1 Extração de RNA total de embrião de camundongo E14,5.

Imediatamente após coleta, embriões inteiros de camundongo E14,5 foram transferidos para tubos de 1,5 ml contendo 1mL de TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em seguida, realizou-se a homogeneização do conteúdo com o auxílio de agulha e seringa até que todo o tecido fosse dissolvido. As amostras homogeneizadas foram incubadas por 5 min à temperatura ambiente. Para cada 1mL de TRIZOL, adicionou-se 200 μL de Clorofórmio (Synth) adicionou-seguido de agitação manual durante 15 adicionou-segundos. Após 30 min à temperatura ambiente, as amostras foram submetidas à centrifugação por 15 min a 12000 rpm a 4°C. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo de 1,5 ml e a ela foram acrescentados 500 μL de álcool isopropílico (Synth). Após suave homogeneização, as amostras foram mantidas por 10 min à temperatura ambiente para maximizar o processo de precipitação do RNA. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a 12000 x g por 10min a 4°C. Ao pellet formado adicionou-se 1 ml de etanol 70%, gelado, para nova centrifugação por 10 min à 7500 x g a 4°C. O sobrenadante foi descartado e ao pellet acrescentado 1mL de etanol absoluto gelado. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 7000 rpm a 4°C por 5 min. Finalmente, após secagem à temperatura ambiente, o pellet foi solubilizado em 40 μL de água tratada com DEPC e o RNA estocado a -80°C.

3.5.2 Síntese de cDNA.

A partir do RNA total obtido, foi realizada a síntese de cDNA utilizando-se o RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, GlenBurnie, MD, USA). O kit utiliza a Transcriptase Reversa RevertAid™ H Minus M-MuLV, que tem uma mutação pontual que elimina completamente a atividade de RNase H da transcriptase reversa. Portanto, não ocorre a degradação do RNA durante a síntese de cDNA, resultando em rendimentos mais elevados de cDNA. O primer oligo (dT)18 anela apenas à extremidade final 3' do RNA, ou seja, à cauda poli (A) do mRNA. Para reação foi utilizado 1μg de RNA total, 1 μL de primer oligo (dT)18 (0,2 μg/μL), 7 μL de água tratada com DEPC, 4 μL de 5X Reaction Buffer; 1 μL de Ribolock Ribonuclease