Os genes Dact são expressos em vários tecidos do membro em E14,5

E14,5.

Os ensaios de hibridação in situ revelaram um padrão de expressão amplo para os genes da família Dact nos membros de embriões de camundongo em desenvolvimento, com alguns tecidos apresentando níveis mais elevados de expressão. Dentre estes tecidos, destacam-se a pele em formação, os elementos cartilaginosos que originarão os ossos dos membros, o tecido muscular em desenvolvimento e o endotélio de vasos sanguíneos de pequeno calibre.

Um dos principais sítios de expressão dos três genes Dact são as células da linhagem condrogênica. No estádio E14,5, a cartilagem recém-formada no membro em desenvolvimento está em processo de ossificação endocondral, e será substituída por tecido ósseo posteriormente (Kozhemyakina et al., 2015). Nesse momento, os condrócitos em diferenciação e maturação estão expressando os três genes Dact.

Sabe-se que, durante o desenvolvimento dos membros, sinais Wnt secretados pelo ectoderma atuam por intermédio da via de sinalização da β-catenina para bloquear a expressão de Sox9, fator de transcrição chave na diferenciação da linhagem condrogênica (Lefebvre & Dvir-Ginzberg, 2016). Com isto, os sinais do ectoderma inibem a formação de tecido cartilaginoso no botão do membro (Kozhemyakina et al., 2015). Estudos em doenças humanas, como o carcinoma hepatocelular, e em cultura de células de mamíferos, como pré-adipócitos e células HeLa, demonstraram que o gene Dact1 atua como antagonista da via de sinalização Wnt/β-catenina (Gao et al., 2008; Lagathu et al., 2009; Yau et al., 2005). Em adição, o gene Dact3 foi identificado como um regulador negativo da via de sinalização Wnt/ β-catenina em estudo de câncer de colo retal (Jiang et al., 2008). Desse modo, a expressão dos genes Dact1 e Dact3 nos moldes cartilaginosos dos membros sugere que eles podem estar atuando como inibidores da via de sinalização Wnt/β-catenina, promovendo a condrogênese no membro, bem como a expressão de Sox9 pelas células progenitoras da linhagem condrogênica.

De acordo com os resultados descritos, Dact2 está expresso nos moldes cartilaginosos dos dígitos, mas não na região de formação da futura articulação. Este padrão de expressão é compatível com a participação de Dact2 na via de polaridade

celular planar, que é essencial para o processo de condrogênese (Gao et al., 2011). Outro mecanismo de ação de Dact2 bem estabelecido é como inibidor da via de sinalização TGFβ, conforme demonstrado em peixes e mamíferos (Zhang et al., 2004; Su et al., 2007). A ausência de transcritos Dact2 nas articulações é coerente com a necessidade de manter a via TGF-β ativa nestes locais. Sabe-se que a atividade da via TGF-β é necessária para a formação da interzona promovendo a formação das células desta região, além de garantir a manutenção de condrócitos indiferenciados nos locais onde serão formadas as articulações (Spagnoli et al., 2007; van der Kraan, 2017).

No tecido cartilaginoso de seres humanos e camundongos, fatores parácrinos da família TGF-β são expressos no molde endocondral, mais intensamente no pericôndrio que recobre a cartilagem (Millan et al., 1991; Pelton et al., 1991; Lawler et al., 1994; Serra & Chang, 2003). Estudos de ganho e perda de função sugerem que sinais TGF-β desencadeiam a condrogênese (Carrington et al., 1991; Leonard et al., 1991; Chimal-Monroy & Diaz de Leon, 1997; Merino et al., 1998; Karamboulas et al., 2010) e são necessários para a formação da população de células progenitoras Sox9 positivas e o subsequente desenvolvimento do molde cartilaginoso do osso (Blitz et al., 2013), mas dispensável para que o processo de ossificação endocondral ocorra (Baffi et al., 2004). Estes dados sugerem que os sinais TGF-β estão mais relacionados com o início da formação dos moldes cartilaginosos e que talvez, em estádios anteriores ao E14,5, Dact2 ainda não esteja expresso nas células condrogênicas como vimos ser expresso no estádio E14,5, o que estaria de acordo com o descrito por Fisher e colaboradores (2006) de que os genes Dact estão pouco expressos nos estádios iniciais do desenvolvimento de camundongos.

Interessantemente, sabe-se que os três genes Dact formam complexos com os parálogos da proteína Dvl (Dishevelled segment polarity protein) (Kivimae et al., 2011), fator chave na via de sinalização Wnt. Estudos em carcinoma hepatocelular, câncer de pulmão e câncer de colo retal em humanos, sugerem um papel inibitório de

Dact2 na via de sinalização Wnt/ β-catenina (Zhang el al., 2013; Jia et al., 2013; Wang

et al., 2015). Estes achados indicam que, assim como os genes Dact1 e Dact3, Dact2 também poderia modular esta via e que através dela também poderia estar promovendo o processo de condrogênese e a ativação da expressão de Sox9.

Outro sítio do membro em que os três genes Dact apresentam um padrão de expressão similar é a pele em desenvolvimento. Estudos conduzidos em

mamíferos revelaram que, tanto a formação da pele no embrião como a sua regeneração, dependem de uma intrincada rede de regulação gênica que é controlada por moléculas sinalizadoras secretadas, com papel de destaque para os Wnt e TFG- β (Kishi et al. 2012). De fato, a epiderme é mantida pelas células tronco localizadas na sua camada mais basal e a sinalização Wnt está envolvida na manutenção dessa população celular progenitora da pele e, portanto, desempenha um papel decisivo em múltiplos passos durante o desenvolvimento da pele (Hsu et al., 2014). Em adição, células tronco foliculares secretam sinais Wnt e TGF-β, que coordenam seu próprio comportamento e de melanócitos (Nishimura et al., 2010; Rabbani et al., 2011). Nesse contexto, os genes Dact presentes na pele em desenvolvimento, podem estar modulando as vias de sinalização Wnt e TGF-β, participando da regulação das linhagens de células progenitoras da pele e da formação das camadas da epiderme. Interessantemente, os genes Dact são fortemente expressos no sistema nervoso de embriões de camundongo em desenvolvimento, um tecido que, assim como a pele, tem origem ectodérmica (Fisher et al., 2006).

A expressão dos genes Dact, principalmente Dact1 e Dact2, nas células do tecido muscular em desenvolvimento também pode ser explicada por sua capacidade de modular a via de sinalização Wnt. Durante o desenvolvimento embrionário, sinais Wnt controlam a expressão de fatores reguladores da miogênese, em particular dos fatores miogênicos (Myf5, MyoD, miogenina e MFR4), os quais são essenciais para a formação da linhagem miogênica e sua subsequente diferenciação para compor os músculos esqueléticos (von Maltzahn et al., 2012). Sabe-se, por exemplo, que em embriões de galinha, células pré-miogênicas que expressam os fatores de transcrição

Pax3 e Pax7 são geradas nos somitos por sinais Wnt1, Wnt3a, Wnt4 e Wnt6 advindos

do ectoderma e do tubo neural (Otto et al., 2006). Sem estas células, não ocorre a gênese da linhagem de células precursoras miogênicas. Em adição, em embriões de camundongo, a expressão de Pax3, Myf5 e MyoD nos somitos é induzida por sinais Wnt que ativam uma via não canônica mediada por PKA e CREB (cAMP response

element binding protein) (Chen et al., 2005). Sabe-se, ainda, que a β-catenina é crítica

para a determinação do tipo de fibra muscular e número de miofibras em embriões de vertebrados (Hutcheson et al., 2009). Dado o papel fundamental dos genes Dact na modulação de diferentes vias Wnt, incluindo a via Wnt canônica e a mediada por PKA (Kivimãe et al., 2011), é provável que esses genes atuem no desenvolvimento da musculatura esquelética regulando a atividade dessas vias.

Outro sítio de expressão encontrado neste trabalho, que ainda não foi descrito para os genes Dact na literatura, corresponde às células endoteliais de pequenos vasos sanguíneos presentes na região do pericôndrio e do tecido muscular, as quais expressam níveis elevados de Dact3 e Dact2. É interessante ressaltar que a cartilagem em processo de ossificação endocondral torna-se vascularizada devido à indução por VEGF (Vascular endotelial growth fator). Este fator é expresso pelos condrócitos hipertróficos e induz a formação de vasos na cartilagem endocondral, controlando a vascularização do pericôndrio (Kozhemyakina et al.; 2015; Duan et al.; 2015), que precede a invasão da placa de ossificação por células endoteliais, osteoclastos e precursores de osteoblastos (Kozhemyakina et al., 2015; Li &Dong, 2016). Neste contexto, é possível que os genes Dact3 e Dact2 estejam participando do controle de vias de sinalização envolvidas no recrutamento de células precursoras ósseas durante o processo de ossificação endocondral, uma vez que são expressos tanto na cartilagem hipertrófica como no endotélio dos pequenos vasos em formação, locais de expressão do fator VEGF.

Além disso, alguns estudos in vitro e in vivo mostraram que VEGF é necessário para estimular as células endoteliais a formarem tubos endoteliais e aumentar a vascularização dos tecidos (Drake & Little, 1995; Flamme et al., 1995; Carmeliet et al., 1996; Ferrara et al., 1996; Shalaby et al., 1997). Em adição aos papéis desempenhados por TGF-β, FGF e integrinas na diferenciação das células endoteliais e nas interações de células endoteliais com moléculas de matriz em estádios vasculogênicos (Dickson et al., 1995; Varner et al., 1995).

Vários estudos descreveram a expressão de múltiplos ligantes, receptores e proteínas sinalizadoras da família TGF-β nos vasos sanguíneos (Pelton et al., 1990; Schmid et al., 1991; Roberts & Sporn, 1992; Pepper, 1997). Estudos em modelos de angiogênese in vitro indicam que as TGF-β influenciam o crescimento das células endoteliais e sua migração, bem como o processo de fusão das mesmas em tubos endoteliais, regulando o tamanho do lúmen e o calibre do vaso sanguíneo (Roberts & Sporn, 1989; Merwin et al., 1990; Pepper, 1997). Apesar de

Dact2 ter um papel bem estabelecido como um modulador da via TGF-β, atuando

como um inibidor dessa via (Su et al., 2007), a expressão de Dact2 observada nos vasos sanguíneos em desenvolvimento possivelmente envolve o papel desse gene na modulação da via de sinalização Wnt/PCP (Kivimãe et al., 2011). Visto que, a via de sinalização Wnt/PCP está associada à correta formação de células endoteliais em

estruturas vasculares (Cirone et al., 2008). De maneira semelhante, o gene Dact3 deve participar do processo de vasculogênese por intermédio da via Wnt/PCP, dada sua capacidade de interagir com moléculas envolvidas nesta via (Kivimãe et al., 2011).