Análise dos marcadores moleculares no membro em E14,5

O estabelecimento do padrão de expressão dos marcadores moleculares selecionados para a comparação com os genes Dact nos membros em desenvolvimento de embriões E14,5 revelou resultados inesperados, com vários dos marcadores apresentando um amplo padrão de expressão gênica, distinto daquele previamente estabelecido na literatura.

Dentre os marcadores estudados, Col2a1 foi o único gene que teve um resultado conforme o esperado, marcando exclusivamente os moldes cartilaginosos dos membros. Tal resultado é coerente, uma vez que este gene codifica a cadeia pró- alfa II, um dos principais componentes do colágeno do tipo II (Mendler et al., 1989). O colágeno do tipo II é encontrado primariamente na cartilagem, um tecido flexível, mas resistente que, conforme explicado neste trabalho, compõe grande parte do esqueleto durante o desenvolvimento embrionário.

Outro marcador, Dcx, codifica uma proteína expressa na linhagem de condrócitos articulares (Zhang et al, 2007). Nossos resultados mostraram que, conforme esperado, este gene é expresso nas interzonas dos dígitos de camundongos em E14,5, o que possibilitou a identificação da linhagem condrogênica articular. Transcritos desse gene também foram encontrados levemente expressos no tecido muscular, condizendo com os achados de Ogawa e colaboradores, 2015, que identificaram células progenitoras musculares como sítio de expressão de Dcx. Porém, transcritos desse gene foram encontrados levemente expressos em outros tecidos do membro em desenvolvimento, como a pele, o pericôndrio e o mesênquima, sítios de expressão de Dcx que ainda não foram descritos na literatura.

Sox9, gene que codifica um fator de transcrição chave na diferenciação da

linhagem condrogênica (Lefebvre & Dvir-Ginzberg, 2016), está presente em outros tecidos do membro E14,5, além da cartilagem em desenvolvimento, o tecido normalmente associado à sua expressão. Contudo, surpreendentemente, foi evidenciada uma marcação forte e aparentemente específica no tecido muscular, ainda não descrita na literatura. Esta expressão foi confirmada pelos ensaios de imunofluorescência, demonstrando que a proteína SOX9 é expressa na musculatura esquelética em formação no membro. Tal resultado pode ser explicado, uma vez que

Sox9 é um fator de transcrição, e fatores de transcrição são proteínas capazes de se

ligar a sequências do DNA promovendo ou inibindo a transcrição de um determinado gene (Reményi et al., 2004). Possivelmente, no músculo esquelético, Sox9 está atuando na modulação da atividade gênica de genes envolvidos na formação deste tecido, embora tais genes não tenham sido identificados ainda.

Alguns estudos relataram que no desenvolvimento do tecido cartilaginoso e do epitélio intestinal, Sox9 inibe a via de sinalização Wnt/β-catenina por promover a fosforilação da β-catenina (Akiyama et al., 2004; Bastide et al., 2007; Topol et al., 2009). Sabe-se que sinais Wnt estão relacionados positivamente com o processo global da miogênese. Esta via é necessária para a geração de células pré-miogênicas

Pax3 e Pax7 positivas nos somitos, induzindo a expressão de genes miogênicos como Myf5 e MyoD, que estão envolvidos na indução da miogênese esquelética e, portanto,

na formação das fibras musculares (Cossu & Borello, 1999; von Maltzahn et al., 2012; Otto et al., 2006; Chen et al., 2005; Hutcheson et al., 2009). Desse modo, nós hipotetizamos que, no contexto da miogênese esquelética, o fator de transcrição Sox9 atue modulando sinais Wnt para promover a correta formação deste tecido.

Similarmente a Sox9, Runx2, um fator de transcrição que regula a diferenciação da linhagem osteogênica (Vimalraj et al, 2015), foi encontrado expresso especificamente no tecido muscular, além da cartilagem endocondral, sítio em que era esperado. Tal resultado foi confirmado por ensaio de imunofluorescência e indica que, possivelmente, como ocorre para Sox9, Runx2 deve estar modulando a atividade gênica no músculo esquelético.

O marcador miogênico MyoD, um fator de transcrição que regula a indução e a diferenciação da linhagem celular que origina a musculatura esquelética (Bergstrom et al, 2001) também está dentre os genes com padrão de expressão distinto daquele descrito na literatura. Nossos resultados revelaram que, além de ser

expresso no tecido muscular, MyoD é expresso na cartilagem endocondral. Embora este resultado necessite ser confirmado por análises imunohistoquímicas, pode-se especular algum papel para MyoD na regulação da atividade de genes no tecido cartilaginoso.

Os genes que codificam os fatores parácrinos da família TGF-β, Bmp2 e

Bmp7, além de serem expressos nos moldes endocondrais como os outros

marcadores estudados, estão levemente expressos em outros tecidos do membro. Dentre eles, estão a pele em formação, o pericôndrio, o mesênquima do membro e o tecido muscular. As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são fatores de crescimento multifuncionais, que atuam como moléculas sinalizadoras e, potencialmente, poderiam participar de diversos processos do desenvolvimento, incluindo a regulação de genes nos tecidos em diferenciação (Chen et al., 2004; Xiao et al., 2007). Tal característica indica que as Bmps nos membros em desenvolvimento podem estar participando da regulação gênica dos processos de diferenciação nos tecidos em que são expressos.

Em conjunto, nossos resultados apontam para a expressão de genes normalmente associados a processos biológicos bem estabelecidos (ex. Sox9 e condrogênese; MyoD e miogênese) no membro de embriões de camundongo E14,5, cuja importância funcional é ainda desconhecida. De fato, um estudo visando caracterizar os padrões de expressão gênica durante diferentes etapas do desenvolvimento dos membros revelou a expressão de 3520 transcritos por análises de microarray. Segundo os autores deste artigo, muitos destes transcritos são intensamente expressos nos membros e provavelmente participam, direta ou indiretamente, de vários aspectos da padronização, crescimento e função dos tecidos nos membros (Taher et al., 2011). De acordo com esse estudo, milhares de genes são recrutados para atuar durante o desenvolvimento do membro, podendo envolver até 35% do genoma dos vertebrados durante o processo. Levando-se em consideração tais achados, nossos resultados evidenciam que os genes Dact e os marcadores moleculares estudados são amplamente expressos nos tecidos dos membros, como possíveis componentes desta rica rede gênica existente durante o desenvolvimento dos membros.