Expressão dos genes Dact em membros no estádio E14,5

Para estabelecer uma associação entre a atividade dos genes Dact e o desenvolvimento de tecidos específicos dos membros de camundongo, foi caracterizado o padrão de expressão espacial destes genes no estádio E14,5 (TS22,5). A escolha deste estádio foi feita considerando-se que, nesta etapa do desenvolvimento, estão acontecendo múltiplos processos de diferenciação tecidual, incluindo a ossificação endocondral, a formação de tendões, vasos sanguíneos, nervos e musculatura esquelética, assim como o início do desenvolvimento das articulações (Taher et al. 2011; Kozhemyakina et al, 2015).

A expressão dos genes Dact foi caracterizada por hibridação in situ em cortes histológicos do membro anterior. Os cortes avaliados abrangem os compartimentos estilópode (úmero), zeugópode (rádio e ulna) e autopóde (carpos, metacarpos e falanges). Para referência morfológica, cortes em historresina equivalentes aos utilizados para os estudos de expressão gênica foram preparados e corados com coloração de Rosenfeld. Pelo menos quatro experimentos independentes foram realizados para cada gene, nos quais aproximadamente 15 cortes foram preparados para análise. Como controle negativo, em cada ensaio de hibridação in situ foram adicionadas duas lâminas que passaram pelo processo de hibridação apenas com a adição de solução de pré-hibridação (Figura suplementar 1). Em complemento, foi estabelecido o padrão de expressão de um painel de marcadores moleculares para desenvolvimento de tecido cartilaginoso, ósseo e muscular. Os marcadores escolhidos foram: Sox9, fator de transcrição chave na diferenciação da linhagem condrogênica (Lefebvre & Dvir-Ginzberg, 2016); Col2a1, o principal componente do tecido cartilaginoso (Kosher et al, 1989); Runx2, regulador da diferenciação da linhagem osteogênica (Vimalraj et al, 2015); Dcx, proteína expressa na linhagem de condrócitos articulares (Zhang et al, 2007); Bmp2, participa da formação de cartilagem e tecido ósseo (Wu et al, 2016); Bmp7, indutor da osteogênese (Wu et al, 2016) e MyoD, fator de transcrição que regula a diferenciação da musculatura esquelética (Bergstrom et al, 2001).

A coloração de Rosenfeld possibilitou a visualização de todos os tecidos em diferenciação no membro E14,5 (Figura 8 A-E). Desta forma, foi possível observar os detalhes morfológicos de cada tecido em que houve expressão dos genes Dact, a

saber: epiderme e derme, mesênquima do membro, pericôndrio, tecido cartilaginoso e tecido muscular (Fig. 8 B-E), facilitando a identificação dos tipos celulares marcados com as diferentes sondas nos ensaios de hibridação in situ.

O padrão de Dact1 revelou múltiplos sítios de expressão no membro em desenvolvimento (Fig.8 F-J). Este gene é fortemente expresso em células epiteliais da epiderme, em toda a extensão do membro, principalmente no citoplasma das mesmas (Fig.8 G). Células mesenquimais que formam a derme primitiva, localizadas sob a epiderme, também expressam Dact1 em níveis reduzidos (Fig.8 G). No blastema dos dígitos, transcritos Dact1 estão presentes em células progenitoras indiferenciadas (Fig.8 F, retângulo). Células da linhagem condrogênica em diferenciação e maturação no esqueleto apendicular em desenvolvimento também expressam Dact1 (Fig.8 H-I). No pericôndrio, camada que envolve as peças cartilaginosas em desenvolvimento, células do tipo fibroblasto expressam Dact1 (Fig.8 H). A marcação no pericôndrio é mais evidente na região do autópode, onde o processo de condrogênese está em uma fase mais inicial do que nos demais compartimentos do membro. Neste compartimento, mRNAs de Dact1 marcam as articulações sinoviais em formação (Fig.8 F). Condrócitos proliferativos, pré- hipertróficos e, com um pouco mais de intensidade, condrócitos hipertróficos dos moldes cartilaginosos do úmero, rádio e ulna também expressam Dact1 (Fig.8 I). Finalmente, células dos músculos esqueléticos em diferenciação destacam-se como um dos principais sítios de expressão de Dact1 nos membros (Fig.8 J). Neste tecido, os transcritos de Dact1 localizam-se predominantemente no citoplasma e na região perinuclear quando comparadas ao núcleo, de marcação menos intensa (Fig.8 J).

O perfil de expressão de Dact2 é semelhante àquele descrito para Dact1 (Fig.8 K-O). Na pele em formação, sua expressão abrange as células epiteliais da epiderme, bem como células mesenquimais da derme do membro em desenvolvimento (Fig.8 L). Nas células epidérmicas, os transcritos de Dact2 marcam mais intensamente o citoplasma do que o núcleo das células (Fig.8 L). Os blastemas dos dígitos em desenvolvimento correspondem a outro sítio de expressão de Dact2 (Fig.8 K). Assim como Dact1, Dact2 é expresso em diferentes tipos celulares que participam do processo de ossificação endocondral. No pericôndrio, células do tipo fibroblasto expressam Dact2 (Fig.8 M). Neste tecido, observa-se ainda um padrão pontilhado, marcando estruturas semelhantes às células endoteliais de pequenos vasos (Fig.8 M). Nos dígitos, há uma leve expressão de Dact2 nos condrócitos em

proliferação (Fig.8 K, M). No tecido cartilaginoso dos ossos úmero, rádio e ulna, condrócitos proliferativos, pré-hipertróficos e, com mais intensidade, condrócitos hipertróficos expressam Dact2 (Fig.8 N). No tecido muscular, uma forte expressão de

Dact2 é observada nas regiões periféricas das células musculares em diferenciação,

compreendendo o citoplasma cortical (Fig.8 O). Em algumas regiões do tecido muscular os transcritos de Dact2 são observados como marcações pontilhadas, possivelmente refletindo a expressão deste gene em células endoteliais de pequenos vasos sanguíneos em formação (Fig.8 O).

Dact3 tem um padrão de expressão semelhante ao dos outros membros

desta família, com algumas particularidades (Fig.8 P-T). Na epiderme, sua expressão assemelha-se aquela identificada para Dact1, porém ela é menos intensa e não abrange as células mesenquimais subjacentes (Fig.8 Q). Células da linhagem condrogênica também expressam Dact3. No pericôndrio, seus transcritos estão distribuídos em uma marcação pontilhada, associada ao endotélio de vasos sanguíneos de pequeno calibre (Fig.8 R). No tecido cartilaginoso, mRNAs para Dact3 são encontrados em alguns condrócitos proliferativos localizados nos dígitos e ossos em formação (Fig.8 P, S). Transcritos de Dact3 também marcam condrócitos pré- hipertróficos e, com maior intensidade, condrócitos hipertróficos (Fig.8 S). Nos músculos esqueléticos, Dact3 é expresso nas células da linhagem miogênica, mas, de forma muito mais intensa, em estruturas de aspecto pontilhado (Fig.8 T). Assim como no pericôndrio, esta marcação é gerada por mRNAs de Dact3 localizados no endotélio dos vasos sanguíneos em desenvolvimento.

Figura 8. Padrão de expressão dos genes Dact em cortes longitudinais de membro anterior de embrião de camundongo E14,5. A-E: Morfologia do membro corado com Giemsa. A: Membro anterior

E14,5, evidenciando o tecido cartilaginoso em rosa. B: Pele em desenvolvimento, evidenciando o núcleo de uma célula epidérmica (seta branca). C: Pericôndrio (Pc) do molde cartilaginoso do dígito, evidenciando os condrócitos proliferativos (Cp) e o mesênquima (Ms) do membro. D: Cartilagem endocondral. E: Músculo, evidenciando o núcleo da célula muscular (seta preta) e um vaso sanguíneo (seta branca). F-J: Hibridação in situ para o gene Dact1. F: Dact1 no membro, evidenciando o blastema dos dígitos (retângulo preto) e os condrócitos articulares (asterisco preto). G: Dact1 na pele em desenvolvimento, evidenciando o núcleo de uma célula da epidérmica (seta branca). H: Dact1 no molde cartilaginoso do dígito, evidenciando o pericôndrio (Pc), os condrócitos proliferativos (Cp) e o mesênquima (Ms) do membro. I: Dact1 na cartilagem endocondral. J: Dact1 no músculo, evidenciando o núcleo da célula muscular (seta preta). K-O: Hibridação in situ para o gene Dact2. K: Dact2 no membro, evidenciando o blastema dos dígitos (retângulo preto) e os condrócitos proliferativos (asterisco vermelho). L: Dact2 na pele em desenvolvimento, evidenciando o núcleo de uma célula da epidérmica (seta branca). M: Dact2 no molde cartilaginoso do dígito, evidenciando o pericôndrio (Pc), os condrócitos proliferativos (Cp) e o mesênquima (Ms) do membro. N: Dact2 na cartilagem endocondral. O: Dact2 no músculo, evidenciando o núcleo da célula muscular (seta preta) e um vaso sanguíneo (seta branca). P-T: Hibridação in situ para o gene Dact3. P: Dact3 no membro. Q: Dact3 na pele em desenvolvimento, evidenciando o núcleo de uma célula da epidérmica (seta branca). R: Dact3 no molde cartilaginoso do dígito, evidenciando o pericôndrio (Pc) e os condrócitos proliferativos (Cp).

S: Dact3 na cartilagem endocondral. T: Dact3 no músculo, evidenciando um vaso sanguíneo (seta

branca). Barras: 20µm.