Faculdade de Odontologia
Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Dissertação
Avaliação comparativa em mandíbulas e tíbias de ratos submetidos à terapia com bisfosfonatos nitrogenados e não nitrogenados: análise imaginológica e
histomorfométrica.
Stephanie Joana Roman Martelli
Stephanie Joana Roman Martelli
Avaliação comparativa em mandíbulas e tíbias de ratos submetidos à terapia com bisfosfonatos nitrogenados e não nitrogenados: análise imaginológica e
histomorfométrica.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Odontologia da
Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em
Odontologia, área de concentração
Diagnóstico Bucal.
Orientador: Prof.ª Dr.ª Ana Carolina Uchoa Vasconcelos
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Melissa Feres Damian
Universidade Federal de Pelotas / Sistema de Bibliotecas Catalogação na Publicação
M376a Martelli, Stephanie Joana Roman
MarAvaliação comparativa em mandíbulas e tíbias de ratos submetidos à terapia com bisfosfonatos nitrogenados e não nitrogenados : análise imaginológica e histomorfométrica / Stephanie Joana Roman Martelli ; Ana Carolina Uchoa
Vasconcelos, orientadora ; Melissa Feres Damian, coorientadora. — Pelotas, 2018.
Mar71 f. : il.
MarDissertação (Mestrado) — Programa de Pós-Graduação
em Diagnóstico Bucal, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Pelotas, 2018.
Mar1. Bisfosfonato. 2. Osteonecrose associada ao uso de bisfosfonatos. 3. Tomografia computadorizada cone beam. 4. Histomorfometria. I. Vasconcelos, Ana Carolina Uchoa, orient. II. Damian, Melissa Feres, coorient. III. Título.
Black : D7 Elaborada por Fabiano Domingues Malheiro CRB: 10/1955
Stephanie Joana Roman Martelli
Avaliação comparativa em mandíbulas e tíbias de ratos submetidos à terapia com bisfosfonatos nitrogenados e não nitrogenados: análise imaginológica e
histomorfométrica.
Dissertação apresentada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Mestre em Odontologia, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Faculdade de Odontologia de Pelotas, Universidade Federal de Pelotas.
Data da defesa: 07/03/2018
Banca examinadora:
Prof.ª Dr.ª Ana Carolina Uchoa Vasconcelos
Doutora em Estomatologia pela Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUC-RS).
Prof.ª Dr.ª Ana Paula Neutzling Gomes
Doutora em Patologia Bucal pela Universidade de São Paulo
Prof.ª Dr.ª Caroline de Oliveira Langlois
Doutora em Odontologia (área de concentração Radiologia Odontológica e Imaginologia) pela Universidade Luterana do Brasil
Prof.ª Dr.ª Sandra Beatriz Chaves Tarquinio (suplente)
Doutora em Patologia Bucal pela Universidade de São Paulo
Prof. ª Dr. ª Elizabete Bagordakis Pinto (suplente)
Doutora em Estomatopatologia (área de concentração Patologia) pela Universidade Estadual de Campinas
Aos meus pais, Marta e Nelson, e à minha família, pelo amor, incentivo e apoio, mesmo estando distantes.
Aos meus queridos amigos, pelo companheirismo, compreensão e pela felicidade proporcionada pela nossa convivência. Agradeço muito por terem estado presentes sempre, me dando suporte em todos os momentos.
À minha orientadora e “mãe”, Prof. Dra. Ana Carolina Uchoa Vasconcelos, pelo apoio, confiança e empenho dedicado à elaboração deste e outros trabalhos. Também pela amizade, paciência e orientação pessoal, essenciais para concluir minha formação.
À minha co-orientadora, Prof. Dra. Melissa Feres Damian, pelos conhecimentos transmitidos, pela disponibilidade em ajudar e pelo incentivo.
Ao Centro de Diagnóstico das Doenças da Boca da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas, em especial às professoras, pela disponibilidade de recursos concedidos em todas as minhas pesquisas e pelo acolhimento durante toda a minha formação.
Aos funcionários, em especial à Ivana, pela ajuda e paciência em ensinar como realizar as atividades no laboratório. Teu suporte foi essencial à elaboração deste trabalho.
Aos demais professores que tornaram possível minha caminhada até aqui.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, à Faculdade de Odontologia e à Universidade Federal de Pelotas, pela oportunidade de fazer o curso.
A tudo e a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para minha formação.
A presente dissertação foi redigida segundo o Manual de Normas para Dissertações, Teses e Trabalhos Científicos da Universidade Federal de Pelotas de 2013, adotando o Nível de Descrição 2 – estrutura em Capítulos, descrita no Apêndice D do referido manual. <http://sisbi.ufpel.edu.br/?p=documentos&i=7> Acesso em: 05/12/2017.
MARTELLI, Stephanie Joana Roman. Avaliação comparativa em mandíbulas e
tíbias de ratos submetidos à terapia com bisfosfonatos nitrogenados e não nitrogenados: análise imaginológica e histomorfométrica. 2018. 71f. Dissertação
(Mestrado em Odontologia) – Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2018.
Bisfosfonatos (BFs) são fármacos empregados na prevenção e no tratamento de doenças caracterizadas por excessiva reabsorção óssea. A osteonecrose dos maxilares associada ao uso de medicamentos (OMAM) é uma condição que se caracteriza por exposição óssea persistente no complexo maxilomandibular de pacientes expostos a terapia antirreabsortiva e/ou antiangiogênica, sem histórico de radioterapia em região de cabeça e pescoço. O presente estudo teve como objetivo realizar a avaliação comparativa da estrutura óssea de mandíbulas e tibias de ratos usuários e não usuários de BFs, por meios imaginológicos e histomorfométricos. Trinta e quatro espécimes de ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) foram distribuídos em três grupos: (1) ratos tratados com ácido zoledrônico; (2) ratos tratados com clodronato; e (3) ratos que receberam solução salina. As mandíbulas e tíbias dos animais foram submetidas à tomografia computadorizada de feixe cônico (TCFC), com posterior processamento, análise e obtenção da densidade óssea (DO) por meio de Unidades Hounsfield (UH) com o software OsiriX 7.0. A partir dos espécimes foram obtidas 68 lâminas histológicas para as mandíbulas e 34 para as tíbias, coradas em hematoxilina e eosina (HE). As lâminas histológicas foram digitalizadas, e utilizando-se o programa Adobe Photoshop CC, realizou-utilizando-se quantificação da proporção de volume ósseo (VO). Os dados obtidos foram analisados com os testes ANOVA e t de Student, utilizando o programa Stata 15.0. Na análise de DO, não se observou diferença significativa entre os grupos de tratamento, nem entre mandíbula e tíbia. Não houve diferença significativa quando comparados os valores de VO entre os grupos teste e controle. No entanto, na comparação entre ossos, as mandíbulas do grupo controle apresentaram maior proporção, estatisticamente significativa, que as tíbias do mesmo grupo. A partir dos resultados obtidos no presente estudo permite-se concluir que (1) a DO não é alterada pela localização óssea, nem pelo tipo de terapia administrada, e (2) a terapia com BFs nitrogenados e não-nitrogenados não foi capaz de alterar o VO, em mandíbulas e tíbias, nos grupos teste.
Palavras-chave: Bisfosfonato; Osteonecrose associada ao uso de bisfosfonatos; Tomografia computadorizada cone beam; Histomorfometria.
MARTELLI, Stephanie Joana Roman. Imaginological and histomorphometrical
evaluation of mandibles and tibias of rats submitted to zoledronic acid and clodronate treatment. 2018. 71p. Dissertation (Master degree in Dentistry).
Graduate Program in Dentistry. Federal University of Pelotas, Pelotas, 2018.
Bisphosphonates (BPs) are synthetic analogs of the inorganic pyrophosphate, used for prevention and treatment of diseases with excessive bone resorption. The medication-related osteonecrosis of the jaw (MRONJ) is a condition characterized by persistent bone exposure in the maxillofacial region of patients exposed to this class of drugs, with no history of head and neck radiotherapy. The objective of the present study was to compare, histologically and imagiologically, the bone structure of mandibles and tibiae of rats that were treated with BPs and rats that did not received BPs. Thirty-four rat especimens (Rattus novergicus, Wistar strain) were divided in 3 groups: (1) 12 mandibles and tibiae of rats treated with zoledronic acid; (2) 12 mandibles and tibiae of rats treated with clodronate; (3) control group, containing 10 mandibles and tibiae of rats that received saline solution. All individuals were exposed to cone beam computed tomography (CBCT). The images were processed and analised to obtain the bone density (BD) in Hounsfield Units (HU), using the software OsiriX 7.0. Sixty-eight histological slides were obtained from the mandibles and 34 from the tibiae, stained with hematoxilin and eosin (HE). The histological sections were scanned, and using the software Adobe Photoshop CC, the proportion of bone volume (BV) was quantified. The statistical analysis was made using ANOVA and Student’s t-test, performed by the software Stata 15.0. There was no statistically significant difference comparing the BD neither among the drug groups, nor between mandible and tibia. The comparison of BV among BPs and control group was not significant different. However, comparing the two bones, the mandibles in control group presented higher BV than tibiae of the same group. Based on the results, it is possible to conclude that (1) BD is not altered by bone type, neither by the kind of drug administered, and (2) the therapy with zoledronic acid and clodronate did not affect the BV in mandibles and tibias of tests groups.
Keywords: Bisphosphonate; Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw;
AAOMS American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons
ATP Adenosina Trifosfato
BD Bone Density
BF Bisfosfonato
BP Bisphosphonate
BRONJ Bisphosphonate-Related Osteonecrosis of the Jaws
BV Bone Volume
CBCT Cone Beam Computed Tomography
CD Células Dendríticas
CL Clodronate
DICOM Digital Imaging and Communications in Medicine
DO Densidade Óssea
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FDA Food and Drugs Administration
FDF Farnesildifosfato
FOV Field of view – Campo de Visão
GGDF Geranilgeranildifosfato
HE Hematoxilina e Eosina
HU Hounsfield Units
ITQ Inibidores de Tirosina Quinase
LB Linfócitos B
LT Linfócitos T
µm Micrômetro
MicroTC Microtomografia Computadorizada
MRONJ Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws
OCs Osteoclastos
OMAM Osteonecrose dos Maxilares Associada ao uso de Medicamentos
ONMAB Osteonecrose dos Maxilares Associada ao uso de Bisfosfonatos
OPG Osteoprotegerina
PET-CT Positron Emission Tomography
PRP Plasma Rico em Plaquetas
RANKL Receptor activator of nuclear fator kappa-B ligand
ROI Region of Interest – Região de Interesse
RP Radiografia Panorâmica
SPSS Statistical Package for Social Sciences
TC Tomografia Computadorizada
TCFC Tomografia Computadorizada de Feixes Cônicos
TIFF Tagged Image File Format
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
1 Introdução ... 10
2 Revisão de Literatura ... 13
2.1 Medicamentos relacionados a OMAM ... 13
2.1.1 Bisfosfonatos ... 13
2.1.2 Denosumab ... 14
2.1.3 Drogas antiangiogênicas ... 15
2.2 Osteonecrose dos maxilares associada ao uso de medicamentos ... 15
2.2.1 Etiopatogênese ... 17
2.2.2 Características imaginológicas ... 20
2.2.3 Características histológicas ... 21
2.2.4 Prevenção e Tratamento ... 22
2.3 Efeitos dos BFs em diferentes tipos ósseos ... 23
3 Capítulo 1 – Artigo ... 26
4 Considerações finais ... 44
Referências ... 46
1 Introdução
Bisfosfonatos (BFs) são drogas antirreabsortivas empregadas na prevenção e no tratamento de doenças caracterizadas por excessiva reabsorção óssea (ALLEN et al., 2015; SENEL et al., 2010). Esses fármacos podem ser classificados em nitrogenados e não nitrogenados, respectivamente, de acordo com a presença ou ausência de nitrogênio em sua composição (KELLINSALMI et al., 2005; SIGUA-RODRIGUEZ et al., 2014).
Descrita, inicialmente, em 2003, a osteonecrose dos maxilares associada ao uso de BFs (ONMAB) é uma condição que se caracteriza por exposição óssea persistente no complexo maxilomandibular de pacientes expostos ao fármaco, não submetidos à radioterapia da região de cabeça e pescoço (FLEISHER et al., 2016; RUGGIERO et al., 2015). A nomenclatura desta enfermidade passou por modificações em 2014, devido à descoberta de que outras drogas antirreabsortivas e/ou antiangiogênicas poderiam ocasionar efeito colateral similar, intitulando-se osteonecrose dos maxilares associada ao uso de medicamentos (OMAM) (RUGGIERO et al., 2015). O risco do desenvolvimento da OMAM tem sido relacionado a uma variedade de fatores, dentre os quais se destacam: tipo, dosagem, duração da terapia, medicamentos associados e realização de procedimentos orais invasivos (RUGGIERO et al., 2014).
O achado clínico habitual da OMAM consiste em área de mucosa ulcerada com exposição de osso desvitalizado localizada, mais frequentemente, na região póstero-lingual da mandíbula (MARX, 2003; PAPAIAKOVOU et al., 2017; RUGGIERO et al., 2013). Os achados imaginológicos são inespecíficos, mas podem indicar a magnitude e progressão da osteonecrose (FLEISHER et al., 2016). Ao exame histológico, podem-se observar áreas de necrose óssea, as quais poderão estar associadas com a presença de colônias bacterianas e infiltrado celular inflamatório crônico (SIGUA-RODRIGUEZ et al., 2014). A apresentação clínica da OMAM é semelhante para todas drogas associadas, sejam antirreabsortivas ou antiangiogênicas, envolvendo as mesmas áreas afetadas na mandíbula e os mesmos fatores predisponentes (PAPAIAKOVOU et al., 2017).
Apesar do mecanismo etiopatogênico da OMAM ainda não ser bem elucidado, hipotetiza-se que seja multifatorial. A literatura aponta uma possível interação entre
diversos fatores, como a supressão da remodelação óssea, inibição da angiogênese, toxicidade local a variados tipos celulares, alteração na imunomodulação, predisposição genética e associação com microrganismos (ALLEN et al., 2015; FLEISHER et al., 2016).
O tratamento da OMAM ainda não apresenta um consenso na literatura, devido, em parte, à precariedade de estudos clínicos randomizados e à provável etiologia multicausal. De forma geral, existem modalidades de terapia não cirúrgica, que visam controlar dor, infecção e progressão da doença, e tratamentos cirúrgicos para intervenção em tecido ósseo necrótico. A avaliação odontológica, prévia ao início da terapia antirreabsortiva/antiangiogênica, mostra-se essencial para prevenção da osteonecrose. Também, a interrupção da terapia por tempos determinados pode auxiliar na prevenção e resolução de lesões (FLEISHER et al., 2016, PAPAIAKOVOU et al., 2017). O desenvolvimento de uma abordagem eficaz depende de pesquisas que investiguem os fatores específicos que desencadeiam a lesão, bem como métodos para o diagnóstico precoce da OMAM.
A OMAM é uma condição exclusiva dos ossos maxilares, e apesar dos avanços em sua compreensão, ainda não estão completamente elucidados os motivos para o não acometimento de ossos longos (FLEISHER et al., 2016). Embora ambos tipos ósseos, maxilares e periféricos, sejam constituídos por populações celulares semelhantes – osteoblastos, osteócitos e osteoclastos, sabe-se que não apresentam a mesma origem embrionária. Neste sentido, diferenças biomecânicas e funcionais, como a taxa de remodelação óssea, podem ser significativas (GONG et al., 2017). Da mesma forma, as respostas à terapia antirreabsortiva/antiangiogênica podem ser distintas (OYHANART et al., 2015). Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo realizar a avaliação comparativa da estrutura óssea de mandíbulas e tíbias de ratos usuários e não usuários de BFs, por meios imaginológicos e histomorfométricos.
2 Revisão de
Literatura
2 Revisão de Literatura
2.1 Medicamentos relacionados a OMAM 2.1.1 Bisfosfonatos
2.2.1.1 Estrutura química e classificação
Os BFs são análogos sintéticos do pirofosfato inorgânico, um regulador fisiológico do metabolismo ósseo, que apresenta alta afinidade pelo cálcio. Esses compostos são obtidos pela substituição do átomo de oxigênio pelo carbono, tornando-se mais resistentes à degradação enzimática. A estrutura química dos BFs é formada por dois grupamentos fosfatos ligados, covalentemente, ao carbono central. Associados ao átomo de carbono encontram-se os radicais R1 e R2. O grupo R1 fornece a afinidade pelos cristais ósseos e o grupo R2 é responsável pela potência e atividade farmacológica (RUSSELL, 2007; SIGUA-RODRIGUEZ et al., 2014).
Esses compostos podem ser classificados em três categorias, de acordo com a presença ou ausência/localização do nitrogênio. Clodronato, etidronato e tiludronato estão inseridos na primeira geração, na qual o grupamento R2 não apresenta nitrogênio. Alendronato, pamidronato, ibandronato, neridronato e olpadronato possuem nitrogênio no grupo R2, e fazem parte da segunda geração. Risedronato e zoledronato compõem a terceira geração, e são caracterizados pela presença de nitrogênio em cadeia cíclica, no radical R2 (RUGGIERO et al., 2009; RUSSELL et al., 2008).
2.2.1.2 Mecanismos de ação
Os BFs possuem alta afinidade pela hidroxiapatita óssea, e assim, são rapidamente carreados da circulação sistêmica e depositados na superfície óssea mineral, particularmente nos sítios de atividade osteoclástica. O meio ambiente ácido associado aos osteoclastos (OCs) em fase de reabsorção, propicia a liberação do BF da superfície óssea e a subsequente captação pelas células osteoclásticas (BROWN, 2017; MIGLIORATI et al., 2005).
Os BFs nitrogenados e não nitrogenados interferem na função osteoclástica através de mecanismos distintos. Aqueles que possuem nitrogênio atuam diretamente na via biossintética do mevalonato inibindo a farnesildifosfato (FDF) e a geranilgeranildifosfato (GGDF), que são requeridas para a formação de proteínas de
sinalização celular. Tais proteínas regulam processos da função osteoclástica, como o arranjo do citoesqueleto, morfologia celular, transporte vesicular e apoptose (FLEISHER et al., 2016; RUSSELL et al., 2007). Os não aminados possuem ação citotóxica por produção de análogos do trifosfato de adenosina (ATP) os quais, por serem resistentes à hidrólise, acumulam-se nos OCs, o que resulta em apoptose por inativação de enzimas metabólicas intracelulares (RUSSELL et al., 2007; VASCONCELOS et al., 2012). Após incorporados ao tecido ósseo, os BFs não são metabolizados e estima-se que tenham uma meia vida de 11,2 anos (FLEISHER et al., 2016).
2.2.1.3 Efeitos adversos
Apesar de infrequentes, os BFs produzem efeitos adversos como fadiga, distúrbios gastrointestinais, anemia, edema, alterações da mucosa esofágica, alterações da função renal, e aumento do risco de fraturas de fêmur atípicas (BROWN, 2017; RUGGIERO et al., 2009). Em 2003, foram relatadas alterações orais em pacientes usuários dessa classe de medicamento (MARX, 2003), inicialmente intitulada como osteonecrose dos maxilares associada ao uso de BFs (ONMAB).
2.1.2 Denosumab
O denosumab é um anticorpo monoclonal humano, do tipo IG2, direcionado contra o receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Inicialmente aprovado para o tratamento de osteoporose pela Food and Drug Administration (FDA), em 2010, tem sido administrado para outras condições associadas à disfunção óssea (BAGAN et al., 2016; PAPAIAKOVOU et al., 2017). Por mimetizar os efeitos fisiológicos da citocina osteoprotegerina (OPG), impede a formação do complexo RANK-RANKL, e bloqueia a ativação de OCs, suprimindo a formação e diferenciação dessas células – agindo, portanto, como uma droga antirreabsortiva (PAPAIAKOVOU et al., 2017; RUGGIERO et al., 2014). Contrariamente aos BFs, o denosumab não se incorpora à estrutura óssea, resultando em uma menor meia-vida (25-32 dias versus 10-12 anos dos BFs), com consequente retorno da remodelação óssea a níveis fisiológicos após interrupção da terapia. Ainda, a literatura sugere que a potência farmacológica seja maior em relação aos BFs (BAGAN et al., 2016; PAPAIAKOVOU et al., 2017). Por não ser metabolizado pela via renal, o denosumab não apresenta contraindicação para pacientes nefropatas. Desde 2010, estima-se que cerca de 30
casos de osteonecrose dos maxilares associado ao denosumab foram descritos em literatura inglesa (YOSHIMURA et al., 2017).
2.1.3 Drogas antiangiogênicas
Na última década, a evolução dos protocolos terapêuticos oncológicos, deveu-se à busca pela redução da toxicidade em tecidos não neoplásicos. Desta forma, drogas capazes de controlar o crescimento e sobrevivência de células malignas por meio da interferência de rotas moleculares específicas envolvidas na carcinogênese, como a sanguínea, tem sido desenvolvidas. O bevacizumab constitui um anticorpo monoclonal figurado para inibir, de forma seletiva, todas as isoformas do vascular endothelial growth factor (VEGF), e representa a primeira classe de droga inibidora da angiogênese - aprovado na prática clínica, em 2004, inicialmente para tratamento de câncer colorretal (ASHRAFI et al., 2017). O VEGF é uma proteína de sinalização que estimula a formação de vasos sanguíneos, e, portanto, esses fármacos inibem a angiogênese através da interferência na cascata de sinalização. A evidência de que o VEGF é essencial para a diferenciação e formação óssea possibilita inferir que as propriedades antiangiogênicas do bevacizumab podem comprometer a integridade microvascular, culminando com o comprometimento ósseo e interferindo na cicatrização de tecidos moles (ASHRAFI et al., 2017).
O sunitinib é um inibidor de tirosina quinase (ITQ) capaz de dificultar a função dos receptores de superfície celular que iniciam o crescimento, diferenciação e sobrevivência de células malignas. Adicionalmente, inibe o KIT (CD117) e o receptor estimulante de colônias do fator 1 (CSF1R) (FANTASIA et al., 2015; FLEISHER et al., 2016; RUGGIERO et al., 2014). Essas drogas mostram-se eficazes no tratamento de tumores gastrointestinais, carcinomas renais, pulmonares e tumores neuroendócrinos (FANTASIA et al., 2015; RUGGIERO et al., 2014).
2.2 Osteonecrose dos maxilares associada ao uso de medicamentos
A OMAM caracteriza-se por: (1) terapia prévia ou atual com drogas antirreabsortivas e/ou antiangiogênicas; (2) exposição óssea, na região maxilofacial, persistente por mais de 8 semanas após identificação profissional; (3) ausência de histórico de radioterapia na região de cabeça e pescoço ou de metástase óssea evidente (ALLEN, 2015; FLEISHER et al., 2016; KHAN et al., 2015; RUGGIERO et al., 2015).
De acordo com Brown (2017), a prevalência entre pacientes oncológicos que recebem BFs pela via intravenosa varia de 0% a 12,2%, com índices consideravelmente menores, oscilando de 0,001% a 0,15%, entre pacientes que recebem BFs por via oral para tratamento da osteoporose (BROWN, 2017). Para o denosumab, quando utilizado para o tratamento antineoplásico, estima-se que a incidência da OMAM varie entre 0,7% e 1,9%, com média de 0,04% naqueles pacientes que o utilizam como agente antiosteoporótico (BAGAN et al., 2016; KHAN et al., 2015). Em relação às drogas antiangiogênicas, a incidência de OMAM no tratamento oncológico com bevacizumab é estimada entre 0,3% e 0,4% (FANTASIA et al., 2015).
A OMAM poderá ocorrer espontaneamente ou, mais comumente, em local de lesão prévia, como exodontia, doença periodontal, ou trauma dentoalveolar (FLEISHER et al, 2016; RIZZOLI et al., 2008; PAZIANAS et al., 2007). Ainda, a duração da terapia com BFs, tipo e forma de administração do medicamento são fatores predisponentes ao surgimento dessa condição, especialmente associada ao uso dos aminobisfosfonatos (FLEISHER et al., 2016; SENEL et al., 2010). Ruggiero (2011) afirma que os agentes quimioterápicos e os esteroides administrados a pacientes oncológicos podem interferir na cicatrização óssea e devem ser considerados como fatores de risco. Pacientes imunocomprometidos também poderão apresentar atraso no processo de remodelação óssea (CAVANNA et al., 2007; KHAN et al., 2015).
Clinicamente, a OMAM caracteriza-se por área de mucosa ulcerada com exposição de osso desvitalizado, de coloração branco-amarelada, localizada, mais frequentemente, em região póstero-lingual mandibular (MARX et al., 2005, RUGGIERO et al., 2014). No entanto, o estágio inicial da doença não envolve exposição óssea (PAPAIAKOVOU et al., 2017). Esse achado clínico pode ser precedido por dor e/ou desconforto na região envolvida, embora regiões de osso necrótico exposto possam permanecer assintomáticas. O tamanho pode variar desde um sítio de exodontia não cicatrizado até o completo envolvimento do maxilar. Ocasionalmente, pode haver parestesia, dor, edema e fístula intra ou extraoral (RUGGIERO, 2015). Um sistema de estadiamento clínico foi desenvolvido por Ruggiero et al. (2006) e atualizado pela última vez em 2014, pela AAOMS, com o
objetivo de categorizar os casos para direcionamento terapêutico e prognóstico (Tabela 1) (FLEISHER et al., 2016; RUGGIERO et al., 2011).
Tabela 1 - Estadiamento da Osteonecrose Associada ao Uso de Medicamentos de acordo com a American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons (2014).
ESTÁGIO CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Categoria de Risco Ausência de osso exposto ou necrótico em pacientes tratados com drogas antirreabsortivas ou antiangiogênicas.
Estágio 0 Sintomas e achados clínicos não específicos (como dor nos
ossos maxilares e osteosclerose) estão presentes, mas não há evidência clínica de osso exposto.
Estágio 1 Osso necrótico e exposto, ou osso sondável através de fístula, em pacientes assintomáticos. Não há evidência de infecção.
Estágio 2 Osso necrótico e exposto, ou osso sondável através de fístula,
associado à infecção, evidenciada pela dor e pela presença de eritema na região. Pode conter drenagem purulenta ou não.
Estágio 3 Osso necrótico e exposto, ou osso sondável através de fístula, associado a dor, infecção, e um ou mais dos seguintes sintomas: fratura patológica, fistula extraoral, comunicação oral-antral ou oral-nasal, e osteólise estendendo-se até o assoalho do seio maxilar ou borda inferior da mandíbula.
2.2.1 Etiopatogênese
Várias teorias têm sido postuladas para explicar a patogênese da OMAM, que parece ter base multifatorial (ALLEN; BURR, 2009; ALLEN, 2015). Acredita-se que o impacto dos fármacos, em especial os BFs, nos diferentes tipos celulares seja capaz de contribuir para a dificuldade da reconstituição tecidual após dano/lesão, o que resulta nas manifestações clínicas (ALLEN; BURR, 2009). Deste modo, cinco principais linhas de pesquisa buscam entender o mecanismo de desenvolvimento da doença: metabolismo ósseo, infecção, angiogênese, genética e tecidos moles.
2.2.1.1 Metabolismo Ósseo
A homeostase óssea depende do equilíbrio entre osteoblastos e OCs. Os OCs são células gigantes multinucleadas especializadas em reabsorção óssea, a qual depende da citocina RANKL, essencial na sua formação, atividade e sobrevivência, em condições fisiológicas e patológicas. O RANKL, sintetizado por osteoblastos, linfócitos T e B (LT e LB), osteócitos, macrófagos e fibroblastos, liga-se ao RANK - presente na superfície de precursores de OCs, CDs, fibroblastos e LTs - promovendo a ativação de OCs (LAPÉRINE et al., 2016; VASCONCELOS et al., 2013). A OPG, produzida em parte por LBs maduros, também medeia a reabsorção óssea, sendo um antagonista do RANKL - inibindo a interação RANK/RANKL (FLEISHER et al., 2016; LAPÉRINE et al., 2016).
Os BFs, nitrogenados e não nitrogenados, inibem a atividade dos OCs causando desorganização do citoesqueleto, perda da borda “em escova” (requerida para reabsorção óssea), defeitos no sistema de transporte vesicular, interferência na quimiotaxia, recrutamento, ativação e diferenciação de precursores, além de estímulo à apoptose (BROWN, 2017; FLEISHER et al., 2016). Quando o remodelamento ósseo se encontra prejudicado pela inibição da atividade osteoclástica, a matriz sofre degradação e, consequentemente, há acúmulo de osso não vital (BI et al., 2010, KELLINSALMI et al., 2005, SENEL et al., 2010, SONIS et al., 2009, VASCONCELOS et al., 2012, XU et al., 2013).
2.2.1.2 Microrganismos
Vários estudos observam, in vivo, a presença de conglomerados bacterianos e fúngicos em lesões de OMAM (HANSEN et al., 2006, SEDGHIZADEH et al., 2008, 2009, 2012). Esses estudos revelam, ainda, que em todos os espécimes foram detectados sítios de reabsorção óssea ativos, contendo grande número de bactérias de múltiplas espécies. O avanço do biofilme para o interior das lacunas pareceu ser responsável pelas bordas irregulares encontradas ao longo do tecido reabsorvido. Células eucarióticas, como OCs, não foram encontradas nas cavidades ou próximas a elas, sugerindo uma ação direta do biofilme bacteriano na reabsorção óssea. Apesar disso, não há consenso em relação ao fato de o processo infeccioso ocupar posição primária ou secundária na fisiopatologia da condição (ALLEN; BURR, 2009).
2.2.1.3 Angiogênese
A angiogênese descreve o mecanismo de crescimento de novos vasos sanguíneos a partir daqueles já existentes (MAAHS et al., 2011). Estudos in vitro e in vivo apontam a capacidade antiangiogênica dos BFs (BI et al., 2010; NAIDU et al., 2008; WALTER et al., 2009; YAMADA et al., 2009; WOOD et al., 2002). Tais efeitos tem sido demonstrados na inibição da proliferação, migração e adesão das células endoteliais (WALTER et al., 2009; YAMADA et al., 2009). Kobayashi et al. (2010) afirma que a capacidade do ácido zoledrônico em inibir, in vitro, a proliferação e a migração de células endoteliais ocorrem de maneira dose-dependente (KOBAYASHI et al., 2010).
2.2.1.4 Genética
Fatores genéticos estão associados com a imunidade, cicatrização de feridas e proteção celular. A literatura recente enfatiza que a baixa expressão de genes específicos pode estar associada com o aumento da susceptibilidade à OMAM (PAPAIAKOVOU et al., 2017). Estudos de farmacogenômica sugerem que polimorfismos nos genes da farnesil pirofosfato sintase e/ou do citocromo P450 CYP2C8 possam predispor indivíduos ao desenvolvimento de OMAM. Considerando-se que nem todos os pacientes com comorbidades e esquemas terapêuticos semelhantes desenvolvem a doença, reforça-se a suspeita de um envolvimento genético (ALLEN, 2015).
2.2.1.5 Tecidos Moles
Os efeitos dos BFs sobre as células epiteliais da mucosa oral são pouco esclarecidos. O estudo de Vasconcelos et al. (2012) mostrou, em modelo animal tratado com BFs nitrogenados e não nitrogenados, que o envolvimento dos tecidos moles como iniciadores do desenvolvimento da osteonecrose é menos provável do que se acreditava. No entanto, pesquisas in vitro, demonstraram que os BFs são capazes de agir sobre fibroblastos e queratinócitos, reduzindo a proliferação celular, retardando a migração celular e induzindo a apoptose (ALLEN et al., 2015; LANDESBERG et al., 2011).
2.2.2 Características imaginológicas
Radiografia panorâmica (RP) e periapical, tomografia computadorizada (TC), tomografia computadorizada de feixes cônicos (TCFC), ressonância magnética e cintilografia óssea estão entre os exames por imagem que podem ser usados para avaliar a magnitude e a progressão da OMAM (BEDOGNI et al., 2007). As características mais frequentes nas imagens incluem esclerose óssea, osteólise,
espessamento da lâmina dura, irregularidade cortical, radiolucências,
fragmentação/formação de sequestro, comunicação buco-sinusal e alvéolos dentários persistentes pós-extração (TREISTER et al., 2010; TORRES et al., 2011).
O estadiamento da patologia, segundo a AAOMS, inclui características clínicas e imaginológicas. No entanto, a inspeção visual tende a identificar apenas sinais superficiais, não refletindo necessariamente a total extensão do acometimento ósseo. Há relatos de casos de OMAM em que não há evidências clínicas de lesão, porém, imaginologicamente, pode-se observar áreas compatíveis com necrose óssea (BEDOGNI et al., 2014).
A RP proporciona uma excelente visualização dos ossos maxilares em sua totalidade, sendo uma ferramenta imaginológica útil e acessível para avaliação de pacientes sob terapia com drogas antirreabsortivas e/ou antiangiogênicas. Esse exame é capaz de revelar lesões osteolíticas, principalmente quando há áreas compatíveis com sequestro ósseo ou osteólise combinada à osteoesclerose (LEITE et al., 2014). No entanto, a perda mineral deve alcançar de 30% a 50% para que seja visível neste tipo de imagem (CANKAYA et al., 2011). Essa modalidade apresenta, ainda, outras desvantagens como a falta de definição das margens entre áreas afetadas pela osteonecrose e osso saudável e a visão bidimensional limitada de estruturas tridimensionais. Além disso, por ser uma radiografia convencional, a imagem pode sofrer magnificação, distorção e sobreposição de estruturas, exigindo correto posicionamento do paciente e técnica apropriada (LEITE et al., 2014).
A TC mostra-se útil na visualização de detalhes do osso trabecular e cortical, além de permitir estimar a real extensão das áreas de osteonecrose. No entanto, apresenta maior custo e alta exposição à radiação, comparativamente à RP (CANKAYA et al., 2011). A TCFC consiste em uma técnica de imagem que utiliza menor quantidade de radiação, comparativamente à técnica convencional, com a
capacidade de capturar múltiplas imagens, à semelhança da TC. As informações obtidas são processadas e reconstruídas em diferentes planos (reconstruções multiplanares), e caso necessário, tridimensionalmente (CANKAYA et al., 2011). Em estudo in vivo, Cankaya et al. (2011), concluíram que a TCFC apresenta alta detectabilidade para a OMAM, sendo possível avaliar a distribuição mineral e a densidade óssea. Porém, Martelli et al. (2017) concluíram, após estudo in vivo, que a TCFC não constitui um exame sensível para detectar os primeiros sinais de alteração óssea em indivíduos sob terapia com BFs nitrogenados e não nitrogenados. Como desvantagem, as imagens geradas podem conter inconsistências e arbitrariedades nos valores de cinza, devido a fatores como o tamanho do voxel e da janela (field of view – FOV) utilizados na aquisição das imagens, ou o tipo de detector do tomógrafo (CAMPOS et al., 2014; PAUWELS et al., 2013).
A microtomografia computadorizada (microTC) está sendo amplamente utilizada na análise estrutural de ossos, dentes, cerâmicas, polímeros e bioscaffolds. Esse exame permite a obtenção de informações longitudinais de alta qualidade em ossos e dentes, porém sua alta dose de radiação e elevado custo constituem desvantagens que tem limitado seu uso em pesquisas (ANDERSON et al., 2014). Hesse et al. (2014) utilizaram microTC para avaliação de lacunas de osteócitos em amostras de tecido ósseo necrótico de pacientes com OMAM e de tecido ósseo vital de pacientes saudáveis. A morfologia do sistema lacuno-canalicular, através do qual ocorre a intercomunicação entre os osteócitos, está indiretamente associada ao metabolismo dos ossos e, portanto, relacionada à qualidade desse tecido. Assim, os autores realizaram a quantificação tridimensional do volume das lacunas, além de sua forma e distribuição espacial. Os volumes lacunares dos espécimes com OMAM apresentaram a mesma variação dos espécimes saudáveis, concluindo-se que esse não é um fator chave no desenvolvimento de OMAM.
2.2.3 Características histológicas
Marx et al. (2012) compararam, histopatologicamente, amostras obtidas por meio de ressecção óssea em pacientes apresentando osteomielite supurativa, osteorradionecrose e OMAM. Em todos os casos de OMAM foi identificado tecido ósseo necrótico evidenciado por osteoplastos vazios, ausência de osteoblastos na periferia, sistemas de Havers e canais de Volkmann vazios, e ainda, todo o espaço
medular mostrou-se acelular. Em 76% dos espécimes foi possível observar microrganismos localizados na superfície óssea (MARX et al., 2012). De acordo com a revisão sistemática de Hinson et al. (2014), o microrganismo mais comumente identificado em espécimes de OMAM é Actinomyces sp., seguido por Streptococcus. Colônias de Candida, Staphylococcus e Klebsiella, embora menos comuns, também foram identificadas.
2.2.4 Prevenção e tratamento
Embora, na última década, esforços tenham sido realizados no sentido de entender a etiopatogenia da OMAM, ainda não há consenso sobre o manejo da condição (FLEISHER et al., 2016; KHAN et al., 2015; SIGUA-RODRIGUEZ et al., 2014). O principal foco do tratamento deve ser o controle da dor e da infecção, especialmente naqueles pacientes com estado de saúde mais gravemente comprometido. Tal estratégia pode ser instituída com o uso de antimicrobianos tópicos e/ou sistêmicos (FLEISHER et al., 2016; MARX et al., 2005; PAPAIAKOVOU et al., 2017). Ainda, destaca-se que a avaliação odontológica prévia ao início da terapia é indispensável (PAPAIAKOVOU et al., 2017).
Nos casos em que procedimentos odontológicos ou cirurgias orais não possam ser evitados, sugere-se que sejam realizados de forma mais atraumática. Adicionalmente, como medida preventiva/terapêutica, a literatura sugere que seja feito
um drug holiday, isto é, um período de interrupção da terapia
antirreabsortiva/antiangiogência. Em geral, é recomendado que haja interrupção por 3 meses antes da realização de qualquer procedimento cirúrgico intraoral que envolva tecido ósseo (PAPAIAKOVOU et al., 2017).
Aplicação de fatores de crescimento tem sido amplamente explorados na prevenção e tratamento da OMAM. Estudos clínicos apresentam a efetividade do concentrado plaquetário autólogo na redução do tempo da ferida cirúrgica após extrações dentárias, prevenindo, desta forma, o desenvolvimento da doença (DEL FABRO et al., 2015). Administração de leucócitos e plaquetas ricos em fibrina, a segunda geração do concentrado plaquetário, mostra-se associada ao aumento da atividade osteoblástica (DINCA et al., 2014; LONGO et al., 2014; TSAI et al., 2016). Aplicação de proteínas morfogenéticas do tipo 2 tem apresentado resultados
satisfatórios em pacientes com doença refratária ao tratamento convencional (KIM et al., 2016).
2.3 Efeitos dos BFs em diferentes tipos ósseos
Os ossos da região maxilofacial originam-se exclusivamente do
neuroectoderma e formam-se principalmente através de ossificação do tipo intramembranosa, ao passo que os periféricos tem origem no mesoderma e desenvolvem-se por ossificação endocondral e intramembranosa. Apesar de ambos tipos ósseos apresentarem estrutura semelhante e serem constituídos por populações celulares similares – osteoblastos, osteócitos e osteoclastos, diferenças nas propriedades mecânicas, bem como na taxa de remodelação óssea, podem ser observadas (GONG et al., 2017). Da mesma forma, as respostas à terapia antirreabsortiva e/ou antiangiogênicas podem diferir entre os tipos ósseos. A OMAM é uma condição exclusiva dos maxilares, e apesar dos avanços em sua compreensão, ainda não estão bem esclarecidos os motivos para o não acometimento de ossos longos (FLEISHER et al., 2016).
Oyhanart et al. (2015) demonstraram em ratos em crescimento, através de análise morfométrica e histomorfométrica, que o alendronato, um BF nitrogenado, altera o desenvolvimento da mandíbula e de ossos longos, na ausência de procedimentos cirúrgicos. Tal efeito decorre da alteração do mecanismo de modelação e remodelação óssea, que afeta o processo de ossificação endocondral que ocorre em ossos longos e em parte da mandíbula. Os autores observaram diminuição significativa no comprimento da tíbia, fêmur e mandíbula, e menor espessura da cartilagem epifisária da tíbia de animais que receberam o fármaco, em comparação com o grupo controle (OYHANART et al., 2015).
Vermeer et al. (2017) investigaram a diferente resposta de OCs e seus precursores em mandíbula e ossos longos de ratos adultos, frente à terapia com o aminobisfosfonato ácido zoledrônico. Os autores observaram, através de histomorfometria, que a taxa de remodelação óssea na tíbia e fêmur diminuiu significativamente após 6 meses de terapia com o fármaco, o que não ocorreu em mandíbula. No osso maxilar, houve redução significativa no número de células com potencial osteoclastogênico que puderam ser isoladas da medula óssea (VERMEER et al., 2017).
Conforme supracitado, a interação entre as moléculas RANK/RANKL/OPG é essencial para maturação dos OCs e regulação do metabolismo ósseo (FLEISHER et al., 2016). Utilizando o método ELISA para determinação da concentração de RANKL e OPG em mandíbulas e tíbias de ratos tratados com ácido zoledrônico, Cankaya et al. (2013) observaram aumento da OPG em ambos ossos. No entanto, em relação ao RANKL, os níveis em mandíbula apresentaram-se diminuídos e na tíbia, aumentados, em comparação com o grupo controle. Ainda, a menor proporção de RANKL/OPG foi observada na mandíbula dos animais que receberam a droga. Os resultados apontam para uma inibição da ativação de OCs, com possível diferença no mecanismo de ação entre mandíbula e ossos longos (CANKAYA et al., 2013). Tal hipótese é corroborada pelo estudo de Gong et al. (2017), no qual também foram observadas diferenças, através de ELISA, entre os ossos maxilares (maxila ou mandíbula) e ossos periféricos (íleo e tíbia) de ratos. A administração de ácido zoledrônico resultou em uma diminuição na razão RANKL/OPG nos maxilares, e um aumento desta proporção nos ossos periféricos. Em adição, nesta mesma pesquisa, mostrou-se que células da medula óssea dos maxilares são mais suscetíveis aos efeitos do BF do que dos ossos periféricos, uma vez que apresentaram menor taxa de proliferação em cultura (GONG et al., 2017).
Em relação às propriedades mecânicas após terapia com ácido zoledrônico, Camacho et al. (2012) compararam a resistência à fratura do côndilo mandibular e cabeça do fêmur em ratos, através de teste biomecânico. Os resultados mostraram que o tratamento aumenta a resistência à fratura em ambos os ossos, proporcionalmente à dose recebida pelos animais. Ainda, utilizando microscopia eletrônica de varredura, observou-se ausência de microfraturas no grupo experimental, em comparação à presença dessas em 30% do grupo controle. Assim, a diminuição no risco de fratura em usuários de BF ocorre pela manutenção ou melhora das propriedades biomecânicas em ambos tipos ósseos (CAMACHO et al., 2012).
3 Capítulo 1
Artigo
3 Capítulo 1 – Artigo
O seguinte artigo foi formatado de acordo com as normas da revista Oral Diseases – Qualis A1 e fator de impacto 2.011, e submetido para publicação.
Imaginological and histomorphometrical evaluation of mandibles and tibias of rats submitted to zoledronic acid and clodronate treatment
Short title: Medication-related osteonecrosis of the jaws. Research Article
Stephanie Joana Roman Martelli¹, Melissa Feres Damian, PhD², André Ribeiro
Schinestsck³, Andreia Morales Cascaes, PhD², Ana Carolina Uchoa Vasconcelos,
PhD²
¹ Master Student, Graduate Program in Dentistry, Federal University of Pelotas, Rua
Gonçalves Chaves 457, 96015-560, Pelotas, RS, Brazil.
² Professor, Graduate Program in Dentistry, Federal University of Pelotas, Rua
Gonçalves Chaves 457, 96015-560, Pelotas, RS, Brazil.
³ Post Graduate Student, Graduate Program in Dentistry, Federal University of Pelotas,
Rua Gonçalves Chaves 457, 96015-560, Pelotas, RS, Brazil.
Corresponding author: Stephanie Joana Roman Martelli, Serviço de Patologia Bucal, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Rua Gonçalves Chaves, 457, Sala 607, Pelotas-RS, Brasil. CEP: 96015-560. Tel./fax: +55 53 3225 6741.
Abstract
Objectives: To evaluate imaginologically and histomorphometrically mandibles and tibiae of rats treated with bisphosphonates (BPs).
Methods: Thirty-four rat specimens (Rattus novergicus, Wistar strain) were distributed into 3 groups: (1) 12 rats treated with zoledronic acid; (2) 12 rats treated with clodronate; and (3) the control group, containing 10 rats that received saline solution. Mandibles and tibias were exposed to cone beam computed tomography (CBCT). The images were analised to obtain the bone density (BD), using the software OsiriX 7.0. Histological slides were obtained from the specimens and, using the software Adobe Photoshop CC, the proportion of bone volume (BV) was quantified.
Results: There was no statistically significant difference comparing the BD neither among the drug groups, nor between mandible and tibia. The comparison of BV among BPs and control group was not significant different. However, comparing the two bones, the mandibles in control group presented higher BV than tibiae of the same group.
Conclusions: Based on the results, it is possible to conclude that (1) BD is not altered by bone type, neither by the kind of drug administered, and (2) the therapy with zoledronic acid and clodronate did not affect the BV in mandibles and tibias of tests groups.
Introduction
Bisphosphonates (BPs) are antiresorptive drugs, which are the most commonly prescribed for osteoporosis treatment (Allen, 2015; Oyhanart et al, 2015). They are also used in other conditions related to altered bone turnover, such as Paget’s disease, multiple myeloma, and bone metastasis originated from malignant neoplasias (Sigua-Rodriguez et al, 2014; Fleisher et al, 2016). The nitrogen-containing BPs (N-BPs) present higher pharmacological potency and exert their mechanism of action inhibiting the mevalonate biosynthetic pathway, affecting the production of signalling molecules that modulate osteoclast (OC) function. The non-nitrogen-containing BPs (non-N-BPs), on the other hand, are metabolized into adenosine triphosphate (ATP) cytotoxic analogs that accumulate inside the OCs. Thus, BP therapy alters bone metabolism and reduce bone resorption, due to the interference and/or inhibitory effects over cells involved in this physiological proccess, specially the OCs (Russell, 2007, 2007; Sigua-Rodriguez et al, 2014; Oyhanart et al, 2015; Fleisher et al, 2016).
The BP-related osteonecrosis of the jaws (BRONJ) was initially described as a side effect of BP therapy in 2003 (Marx, 2003). In 2014, the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons (AAOMS) updated the nomenclature, due to reports of other antiresorptive agents (as denosumab) and antiangiogenic drugs (as sunitinib and bevacizumab) associated with the disorder, which was renamed to medication-related osteonecrosis of the jaws (MRONJ) (Ruggiero et al, 2014; Khan et al, 2015; Fleisher et al, 2016). The condition’s etiology seems to be multifactorial and, clinically, most commonly develops after dentoalveolar surgery or another kind of trauma, although spontaneous occurrence is possible (Sigua-Rodriguez et al, 2014; Khan et al, 2015).
MRONJ occurs exclusively in the jaws, and despite the advances in its comprehension, it is not completely clear why it does not develop in long bones. It is supposed that it may be a consequence of: high bone turnover rate of the jaws; presence of teeth and gum, facilitating the entrance of microrganisms and predisposing for infections; and oral structures subjected to a variety of stresses, such as physiologic, iatrogenic or inflammatory, causing trauma to the mucosa with exposure of bone (Fleisher et al, 2016). Although both types of bone, jaws and peripheral/long bones, show similar structure and are composed by the same cell population –
osteoblasts, osteocytes and OCs, they exhibit distinct embrionary origin and their biomechanical and functional differences, as the bone turnover rate, might be significant (Gong et al, 2017). Moreover, the response to antiresorptive therapy might be diverse considering different bones (Oyhanart et al, 2015).
The clinical and imaginological examination, associated with the patient’s medical history, are the most reliable diagnostic approach to MRONJ (Khan et al, 2015; Ruggiero, 2015). Imaging techniques play an essential role not only to infer the disease progression, but also to early detect MRONJ and tailor therapeutic management for each patient (Hamada et al, 2014; Eleutherakis-Papaiakovou and Bamias, 2017). Advanced imaging procedures like computed tomography (CT), cone beam CT (CBCT) and positron emission tomography (PET)-CT may be more sensible to detect lesions, compared to conventional images such as panoramic radiography (Eleutherakis-Papaiakovou and Bamias, 2017). Furthermore, CBCT has become an important tool in dentistry, due to its lower radiation dose compared to CT, and studies have shown that it exhibits high sensibility in measuring mineral distribution, detect periosteal thickening and bone densiy (BD) alterations (Cankaya et al, 2011; Guggenberger et al, 2014). The microcomputed tomography (microCT) modality has been widely employed for high quality structural analysis of bone, teeth and other materials. However, the high cost and radiation dose limit the use in research (Anderson et al, 2014).
A number of in vivo studies demonstrate BPs effects in bone tissue following procedures (Cankaya et al, 2011; Maahs et al, 2011; Vasconcelos et al, 2012; Barba-Recreo et al, 2014; Gong et al, 2017). Nevertheless, there is a lack of data about the comparison between different types of bones and between antiresorptive drugs. Hence, the objective of the present study was to compare by means of histomorphometrical and imaginological parameters, among mandibles and tibiae, and N-BP (zoledronic acid) and non-N-BP (clodronate), in order to investigate possible different effects over the bone structure.
Methods
The present study was approved by the Ethics Committee for Animal Use of the Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, and the procedures were carried out in accordance with the institutional guidelines for animal care and use.
Animals
The sample was comprised of 34 adult female rats (Rattus norvegicus, Wistar strain), which had a mean age of 120 days and a mean weight of 230g (VASCONCELOS et al., 2012). The sample size was based in the previous studies of Maahs et al. (2011) and Vasconcelos et al. (2012), which used similar methodologies. The animals were randomly allocated to 3 groups, each according to the BP used: (1) zoledronic acid (ZA) group: 12 animals were treated with the N-BP ZA (Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland) intraperitoneally (0.6 mg/kg, every 28 days) (Macerata, 2002; Maahs et al, 2011; Vasconcelos et al, 2012); (2) clodronate (CL) group: 12 animals treated with the non-N-BP CL (Jenahexal Pharma GmbH, Thuringia, Germany), intraperitoneally (20 mg/kg, every 28 days) (Vasconcelos et al, 2012); and (3) control group: 10 animals received saline solution (0.9% sodium chloride). The intraperitoneal administration is commonly used in laboratory rodents, due to the difficulty in intravenous access and possibility to administer large amounts of fluids. In addition, it reduces the risk of adverse effects and provides more comfort to the animal (Turner et al, 2011).
After 120 days of the drug administration, the animals were euthanized by deep anesthesia with isoflurane (Cristalia, Porto Alegre, RS, Brazil) in an appropriate anesthesia chamber. The specimens were then examined using a no.5 clinical probe (SS White, Duflex, Rio de Janeiro, RJ, Brazil) to determine the presence/absence of macroscopic bone lesion. Afterwards, the mandibles and left tibiae were dissected and fixed for 24h in 10% buffered formalin (TopGlass, Porto Alegre, RS, Brazil).
CBCTs
All samples were submitted to CBCT, using a Prexion 3D® tomograph (Terarecon, San Mateo, CA, USA). The mandibles and tibiae were allocated in plastic boxes, each composed by three 2,5x6,0cm compartments containing 1 mandible or 1 tibia each, immersed in formalin to attenuate radiation. The boxes were positioned in the machine with the aid of polystyrene boxes, to acquire ideal height for the
tomographic scanning. The following technical parameters were applied: 90 kVp, 4 mA, voxel resolution 0.1 mm, 37s, and a 56x52mm field of view (FOV). The obtained images were stored in a hard drive in Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) format.
Tomographic analysis
The tomographic images were visualized and evaluated using the Osirix 7.0 software (OsiriX, http://www.osirix-viewer.com) by a calibrated and blinded examiner. The Multiplanar Reconstructions Screen (MPR Screen) visualization was used to observe the sagittal, coronal and axial planes and to determine the region of interest (ROI). For determination of mandibular ROI, the images were manipulated so the sagittal axis was placed in the center of the long axis of the left side of the mandible, parallel to the cortical bone. The axial axis was positioned next to the incisor tooth root. For each mandible, an anterior and a posterior ROI were determined, generating a double sample number for each group. For the anterior ROI, the coronal axis was placed where the bone tissue started to circle the left incisor tooth root, and the BD measures were made in the bone superior to the root (Figure 1A). For the posterior ROI, the coronal axis was moved to the distal region of the last molar tooth on the left side, measuring the BD posteriorly to the molar tooth root (Figure 1B). For determination of ROI in tibia, the images were manipulated so the sagittal and coronal axes were positioned over the center of the long axis, and the axial axis placed next to the midpoint of the long axis. The BD was measured in the superior and inferior regions of cortical bone, in the central portion of diaphysis (Figure 1C).
The BD values were obtained from the sagittal plane image for all ROIs, using the Point tool, in Hounsfield Units (HU). For each region, two consecutive slices were analyzed, measuring 3 points in each anterior and posterior slice of mandible, and 6 points for each tibia slice (3 for the superior cortical and 3 for the inferior cortical).
At last, the mean BD value for the mandible was obtained combining the anterior and posterior region of each specimen, and combining the superior and inferior cortical for each tibia.
Following the tomographic exposure, all the mandibles and tibiae were decalcified in 10% nitric acid solution with urea. After processing, the mandibles were hemi-sectioned, and the left side was selected for analysis, similar to the tomography exam. Subsequently, an anteroposterior section was made anterior to the first molar tooth, resulting in an anterior and a posterior fragment, that were paraffin-embedded separately. The tibiae were sectioned on the midpoint of the sagittal axis, and each fragment was paraffin-embedded individually. The paraffin blocks were cut into 4-µm sections and stained with hematoxylin and eosin (H&E).
Histomorphometry
Sixty-eight histological slides were obtained from the 34 mandibles. For the tibiae, 34 slides were obtained. The sections were digitized using a Leica DM3000 light microscope (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany), connected to a Leica DFC7000 T camera (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) and a AMD Phenon II X4 3.4 GHz computer with Leica Application Suite software (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany). The images were captured using 10x objective and stored in TIFF (Tagged Image File Format) format. For each slide, as many fields as necessary were captured to cover all the bone tissue presented in the interest region. In total, 255 images were obtained for the mandibles, and 710 images for the tibiae.
A calibrated and blinded examiner, using the software Adobe Photoshop CC (Adobe Systems, San Jose, California, USA) analyzed the images. The bone tissue present in each field was selected, using selection tools, and quantified using the pixel value of the Histogram (Mahl et al, 2009)(MAHL et al., 2009). Blood vessels, medullary spaces, empty spaces and cartilage were removed from the selection. Then, considering the mean pixel value for each specimen, a bone volume (BV) proportion was gathered, corresponding to the proportion of total image area occupied by bone tissue (Figure 2) (Mahl et al, 2009; Oyhanart et al, 2015).
Statistical analysis
For tomographic analysis, the examiner calibration occurred by the evaluation of 10 random tomographic images, twice, in different moments. For histological analysis, the calibration consisted in the evaluation of 20 random histological images, twice, in different moments. The results of these two distinct calibrations were
subjected to a paired t-test and Pearson’s correlation coefficient, showing the absence of a significant difference (p>0.05) and a strong correlation (r>0.9). The comparison among the BPs and control group, for each bone, was done by means of ANOVA test, with significance level of 5%. The Student’s t-test was chosen to compare the different bones, mandible and tibia, with significance level of 5%. The statistics were processed by the Stata 15.0 software (StataCorp, College Station, Texas, USA).
Results
Macroscopic evaluation
On macroscopic examination, neither mandibles, nor tibiae exhibited visible bone lesions.
Tomographic analysis
The results for the tomographic evaluation of BD are shown in Table 1.
Mandible
No significant differences were found in the BD values among ZA, CL and control groups (p=0.419), with the anterior and posterior regions combined.
Tibia
No significant differences were observed among the ZA, CL and control groups (p=0.871).
Mandible vs. tibia
By comparison of the two bones in each group, no significant differences could be observed for ZA (p=0.449), CL (p=0.602) or control (p=0.487) groups.
Histomorphometry
The results of histomorphometric evaluation of BV proportion are shown in Table 2. Mandible
No significant differences in the BV proportion was observed among ZA, CL and control groups (p=0.939), with the anterior and posterior regions combined.
Tibia
Mandible vs. tibia
Although the mandible exhibited a higher proportion of BV in all groups, comparing the two bones, no significant differences could be observed for ZA (p=0.056) and CL (p=0.089) groups. For control group, a statistical difference was found (p=0.032), with higher proportion in the jaw, compared to tibia.
Discussion
In this study, the comparison of mandibular cortical BD values among two distinct BPs and control, measured by CBCT, did not present statistical difference. It was shown that cortical bone density in BP-treated patients with MRONJ stages 0 to 3, compared to healthy patients, did not differ significantly when assessed with CT. In addition, the cortical bone width and cancellous bone density were increased in the patients with MRONJ (Taniguchi et al, 2016). Individuals with MRONJ presented decreased intracortical CBCT density, when compared to age-gender matched controls in the study by Gönen et al (2017), although the cortical bone thickness was also increased. The cancellous bone density values were not significant. The authors point that the results indicate that BP alters cortical bone metabolism, possibly by suppressing intracortical bone remodeling in the mandible (Torres et al, 2012; Gonen et al, 2018).
The comparative evaluation of a jaw and a long bone BD values did not show significant difference in this research. Gong et al (2017) performed dental extractions in the jaws and drill hole defects in ilium and tibia of rats that received ZA. No difference in the BV fraction of jaw bone between ZA group and controls was observed, using microCT. However, both BV fraction and cortical bone thickness were increased in the peripheral bones, comparing to control. UsingELISA, in the same study, the authors demonstrated a decreased RANKL/OPG ratio in the jaws and an increased ratio in peripheral bones. Altogether, this indicates that ZA strongly suppresses alveolar bone remodeling undergoing tooth extraction, in conjunction with more active bone formation in the peripheral bones following injury (Gong et al, 2017).
Vermeer et al (2017), using microCT to evaluate BV fraction and tissue mineral density (TMD) in jaws, tibiae and femurs of mice not submitted to any surgical intervention, in three different times (1, 3 and 6 months). The authors observed that BV fraction and TMD parameters were significant higher in the jaws when compared
with long bones (Vermeer et al, 2017). These results were similar for TMD in all time points of drug administration. The same authors demonstrated in vivo that jaw bone marrow cells internalize more BPs comparing to long bones, suggesting bone-site-specific responses to BPs (Vermeer et al, 2013).
The comparative results for CL in the present study, regarding long bones BD, are in accordance with the literature. Koivukangas et al (2001, 2003) demonstrated that the long-term treatment with CL, in both growing rats and adult rats, does not result in BD value changes in femur and tibia, measured using peripheral quantitative CT (Koivukangas et al, 2001, 2003). Moreover, the resistance to fracture remained unchanged for the long bones, which was similar to the observations of another study (Lepola et al, 1996; Koivukangas et al, 2001, 2003). There is no data in English language literature about the effects of CL in mandible - which does not allow the comparison with this study.
Oyhanart et al. (2015) evaluated, histologically, the BV in the interradicular bone area of mandible and tibia of growing rats that received alendronate, without any surgical intervention. The authors observed increased BV in the experimental group, compared to control, in conjunction with a decrease in the total thickness of epiphyseal cartilage of tibia (Oyhanart et al, 2015). The histomorphometric measurement of mineral apposition rate in adult rats showed that ZA reduces bone formation in the jaws after 3 months of treatment, but not after 6 months. In long bones (tibia and femur), this reduction was observed after 3 and 6 months of treatment (Vermeer et al, 2017). In the same research, it was shown that the long-term treatment with ZA reduced the number of jaw bone marrow cells, without affecting the number of long bone marrow cells. The results show that N-BPs can differently affect long bone and jaw bone turnover in vivo.
Studies that evaluate the effects of non-N-BP on jaws and long bones show similar results to this research. The volume of cancellous bone and the mineral apposition rate of femur and tibia of rats were not altered by the treatment with CL, in a long-term administration, although the bone growth rate of femur decreased (Lepola et al, 1996; Koivukangas et al, 2001, 2003). In addition, Vasconcelos et al (2012) quantified vital bone on maxilla of adult rats that received CL, intraperitoneally (on the same dose used in the present study), by means of histological analysis - without
osseous surgical procedures. The authors concluded that the proportion of vital bone was significantly greater in the control group compared to the CL group. Curiously, the present study found a significant statistical difference on control group, with higher proportion in the jaw, compared to tibia. It is known that BPs promote nearly complete suppression of bone turnover, but in this study, we could not explain why a greater effect was observed in control group, when compared with test groups.
Hence, it is possible to infer that bone interventions and age of subject might alter osseous tissue response under N-BP therapy, which may also occur in a bone-site-specific manner. The absence of difference among groups and bones in the present study may be partially explained by (1) BP dose and administration period, (2) absence of different time-point evaluations, and (3) adult animals. Though our BP administration regimen was sufficient to induce osteonecrosis (Vasconcelos et al, 2012; Martelli et al, 2017), the cumulative dose of ZA administered by Vermeer et al (2017) was considerably higher than ours (0.5 mg/kg weekly vs. 0.6 mg/kg monthly). Additionally, the same study evaluated different time-points, showing the interference of time-related response. The differences in study design, including the stage of development of individuals, difficult proper comparison among studies. Additionally, even though CL is the most prescribed non-N-BP, there are a few reports in literature about the effects of this class of BF using animal model.
Figure 1. BD quantification using OsiriX 7.0. (A) Quantification of mandibular anterior ROI. (B) Quantification of mandibular posterior ROI. (C) Quantification of tibial ROI.
Table 1. Tomographic analysis. Bone density quantification, in Hounsfield units (HU).
Group N Mandible
Mean (SD)
Tibia Mean (SD)
Zoledronic acid (ZA) 12 1619.32 (99.66) 1569.67 (199.56) **p = 0.449 Clodronate (CL) 12 1567.59 (143.54) 1598.81 (145.48) **p = 0.602 Control 10 1550.54 (136.85) 1612.22 (238.65) **p = 0.487
*p = 0.419 *p = 0.871
SD = standard deviation; p = p value.
*ANOVA test, comparison among BP and control groups, for each bone.
**Student’s t-test, comparison between different bones, for each drug group.
Table 2. Histomorphometrical analysis. Proportion (%) of bone volume (BV).
Group N Mandible
% (SD)
Tibia % (SD)
Zoledronic acid (ZA) 12 66.92 (7.52) 59.41 (10.51) **p = 0.056 Clodronate (CL) 12 66.27 (17.32) 55.93 (10.27) **p = 0.089 Control 10 68.11 (8.98) 55.75 (14.25) **p = 0.032
*p = 0.939 *p = 0.698
SD = standard deviation; p = p value.
*ANOVA test, comparison among BP and control groups, for each bone.
**Student’s t-test, comparison between different bones, for each drug group.
Figure 2. Quantification of bone volume (BV) using Photoshop CC. (A) Mandibular histological section. (B) Tibial histological section.
