UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Faculdade de Odontologia
Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Tese de doutorado
Avaliação da biocompatibilidade e análise da alteração de cor dentária induzida por diferentes materiais obturadores de canais radiculares de dentes
decíduos
Katerine Jahnecke Pilownic
Katerine Jahnecke Pilownic
Avaliação da biocompatibilidade e análise da alteração de cor dentária induzida por diferentes materiais obturadores de canais radiculares de dentes
decíduos
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, da Faculdade de Odontologia, da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Odontologia, Área de Concentração Odontopediatria.
Orientadora: Profa. Drª. Fernanda Geraldo Pappen Co-orientadora: Profa. Drª. Ana Regina Romano
Katerine Jahnecke Pilownic
Avaliação da biocompatibilidade e análise da alteração de cor dentária induzida por diferentes materiais obturadores de canais radiculares de dentes
decíduos
Tese apresentada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutor em Odontologia, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, área de concentração Odontopediatria, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Pelotas.
Data da defesa: 02 de maio de 2017. Banca examinadora:
Profa. Dra.Fernanda Geraldo Pappen (Presidente)
Doutora em Endodontia, pela Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP. Profa. Dra. Marília Leão Goettems
Doutora em Odontologia, área Odontopediatria, pela Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS.
Dra. Aline Oliveira Ogliari,
Doutora em Odontologia, área Materiais dentários, pela Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS.
Profa. Dra. Nádia de Souza Ferreira
Doutora em Odontologia, área Endodontia, pela Universidade Estadual Paulista, São José do Campos, SP.
Profa. Dra. Luiza Helena Silva de Almeida
Doutora em Odontologia, área Odontopediatria, pela Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS.
Profa. Dra. Gabriela dos Santos Pinto
Doutora em Odontologia, área Odontopediatria, pela Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS (Suplente).
Profª.Drª. Maria Laura de Menezes Bonow
Doutora em Odontologia, área Odontopediatria, pela Universidade de São Paulo, São Paulo, SP (Suplente).
Notas Preliminares
A presente dissertação foi redigida segundo o Manual de Normas para Dissertações, Teses e Trabalhos Científicos da Universidade Federal de Pelotas de 2013, adotando o Nível de Descrição 4 – estrutura em Artigos, descrita no Apêndice D do referido manual. <http://sisbi.ufpel.edu.br/?p=manual> Acesso em: 20 de março de 2017.
Resumo
PILOWNIC, Katerine Jahnecke. Avaliação da biocompatibilidade e análise da alteração de cor dentária induzida por diferentes materiais obturadores de canais radiculares de dentes decíduos. 2017.67f.Projeto de tese (Doutorado em Odontologia) – Programa de Pós-graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2017.
Este estudo avaliou a biocompatibilidade de diferentes materiais obturadores de canais radiculares de dentes decíduos e o seu potencial de alteração de cor. Foram avaliados os seguintes materiais: um material à base de MTA, um material à base de hidróxido de cálcio e iodofórmio (Vitapex), Óxido de zinco e eugenol (OZE), e um material à base de hidróxio de cálcio (Calen) espessado com óxido de zinco (ZO). Para a avaliação da biocompatibilidade, os materiais foram inseridos em tubos de polietileno e implantados no tecido subcutâneo dorsal de quinze ratos Wistar (Rattus norvegicus). Após 15, 30 e 60 dias, os animais foram eutanasiados, os tubos e tecidos circundantes foram removidos e histologicamente processados. As amostras foram avaliadas quanto à intensidade da resposta inflamatória, a espessura da cápsula fibrosa, presença de calcificação e células gigantes. Para a análise do potencial de discoloração, setenta e cinco blocos cubóides de esmalte-dentina foram preenchidos com os diferentes materiais obturadores e selados com ionômero de vidro fotoativado. A alteração de cor (∆E00) foi calculada baseada nas coordenadas de cor medido com o espectrofotômetro (VITA Easyshadecompact) antes e depois da inserção dos materiais e após 1 semana, 1, 3, 6 e 9 meses. A alteração de cor ∆E00 foi calculada pelo CIEDE 2000 para cada espécime a partir do baseline. Os resultados do teste de biocompatibilidade mostraram que os materiais apresentaram decréscimo na severidade da inflamação a partir de 30 dias. Da mesma forma, em todos os grupos, a cápsula fibrosa, inicialmente espessa, se tornou mais delgada ao longo do período experimental. Células gigantes foram observadas em todos os grupos experimentais principalmente no período de 15 dias, enquanto a ocorrência de calcificação foi observada com mais frequência no grupo Calen+ZO. O teste de avaliação da capacidade de indução de alteração de cor revelou que o tempo teve efeito nos valores de ∆E00 (p <0,0001), assim como os materiais (p = 0,004). As interações entre tempo e os materiais provocaram alterações de (∆E00) (p < 0,0001). O material à base de MTA apresentou menores valores de alteração de cor (∆E= 3,02) ao longo do tempo enquanto o óxido de zinco e eugenol demonstrou os maiores valores (∆E= 5,42) (p= 0,018). O material à base de MTA apresenta propriedades satisfatórias podendo ser uma alternativa aos materiais obturadores convencionais, para utilização em canais radiculares de dentes decíduos.
Palavras-chave:dentes decíduos; escurecimento; biocompatibilidade; endodontia; obturação.
Abstract
PILOWNIC, Katerine Jahnecke. Biocompatibility evaluation and analysis of color alteration induced by endodontic materials used in primary teeth. 2017. 67 f.Doctoral thesis (PhD in Dentistry). Postgraduate Program in Dentistry. Federal University of Pelotas, Pelotas, 2017.
The aim of this study was to evaluate the biocompatibility and discoloration potential of experimental MTA-based endodontic filling material in comparison to zinc oxide eugenol (ZOE) cement, Calen paste thickened with zinc oxide, and Vitapex. In the biocompatibility assay, the materials were introduced into polyethylene tubes and implanted into the dorsal subcutaneous tissue of fifteen Wistar rats (Rattus norvegicus). After 15, 30 and 60 days, the animals were euthanized, the surrounding tubes and tissues were removed and processed for histopathological evaluation. The samples were analyzed for the intensity of the inflammatory response, the thickness of the fibrous capsule, presence of calcification and giant cells. For the analysis of discoloration potential, seventy-five cuboidal enamel-dentin blocks were filled with different endodontic filling materials and sealed with photoactivated glass ionomer cement. Standardized color measurements were performed using a spectrophotometer (Vita Easyshade, Vita-Zahnfabrik, Oberding, Germany) and expressed in ΔE*00 units at the following intervals: prior to and after placement of the filling and after 1 week,1 month, 3 months, 6 months, and 9 months. The results of biocompatibility showed the materials tested, as well as the control, had a lower inflammation severity in 30 and 60 days in relation to 15 days. Likewise, the thickness of fibrous capsule in all groups of materials in 15 days was thick and decreased over time. It was possible to observe the presence of giant cells in all groups, mainly in 15 days. The presence of calcification was observed around implantation sites in all groups, but more frequently in Calen + ZO samples. The findings of discoloration potential exhibited the time had a significant effect on color variation values (ΔE*00) (p <0.0001).The effect of the materials on color variation (ΔE*00) was also statistically significant (p = 0.004). Interactions between time and materials demonstrated a significant effect on the values (ΔE*00) (p <0.0001). The MTA-based experimental material showed the smallest color variation throughout the experimental time (ΔE*00= 3.02), where as the zinc oxide and eugenol cement (ZOE) showed the highest darkening (ΔE*00= 5.42) (p = 0.018). ).In conclusion, experimental MTA-based material has satisfactory properties for use as endodontic filling material.
Key words: primary teeth; discoloration; biocompatibility; endodontics; root canal filling.
Lista de Figuras
Projeto de Pesquisa
Figura 1 Bloco cubóide de esmalte-dentina (10x10x3,5mm) preparado a
partir do terço médio da coroa dente
bovino……….………...………... 22 Figura 2 Após preenchimento da cavidade com os materiais a serem avaliados, selamento com cimento de ionômero de vidro fotoativado... 23 Figura 3 Dispositivo confeccionado para fazer a mensuração de cor do terço cervical da coroa do dente bovino... 24
Artigo1
Figura1 Subcutaneous tissue reactions within the different experimental groups. Hematoxylin and eosin staining,10X………..46
Artigo 2
Figura1 Schematic presentation of performed procedures prior to color measurements………...58
Lista de Tabelas
Projeto de Pesquisa
Tabela 1 Composição dos materiais obturadores testados...19
Tabela 2 Distribuição dos implantes em relação aos materiais e períodos empregados no experimento... 20 Tabela 3 Distribuição dos materiais experimentais... 23
Artigo 1
Tabela 1 Percentage of tissue reaction according to different groups and different times of evaluation.……….. 48
Artigo 2
Tabela 1 Distribution of experimental materials... 59
Tabela 2 Color variation results (ΔE*00) byANOVA with repeated measures with regard to the effects of weather and their interaction groups………..60 Tabela 3 Mean and standard deviation of variation in color values (ΔE*00) in the different experimental groups……….. 61
Lista de Abreviaturas e Siglas
CIV Cimento de ionômero de vidro MTA Agregado de trióxido mineral OZE Óxido de Zinco e Eugenol
UFPel Universidade Federal de Pelotas
ZO Zinc oxide
L* luminosidade
a* croma
Sumário 1 Introdução... 10 2 Projeto de Pesquisa... 14 2.1 Antecedentes e Justificativas... 14 2.2 Objetivos... 2.2.1 Objetivo Geral... 2.2.2 Objetivos Específicos... 18 18 18 2.3 Metodologia... 18 2.3.1 Material testados... 18 2.3 Teste de biocompatibilidade... 19
2.3 Teste de alteração de cor... 21
2.4 Orçamento... 26
2.5 Cronograma de atividades... 27
3. Relatório do trabalho de campo... 28
4 Artigos... 32 4.1 Artigo 1... 32 4.2 Artigo 2... 49 5 Considerações finais... 62 Referências Bibliográficas... 64 Anexos ... 67
1 Introdução
Algumas propriedades dos materiais obturadores de dentes decíduos devem ser ponderadas durante a escolha para uso. Idealmente este material deve ser reabsorvível, radiopaco, bactericida, promover adequado preenchimento e aderência às paredes dos canais radiculares, facilmente removido quando necessário; além de não provocar danos aos tecidos periapicais e ao germe do dente permanente, e tampouco alteração da coloração das estruturas dentárias. No entanto, não existe um material único que preencha todos os requisitos desejáveis para um material obturador, além de não haver consenso na literatura sobre o melhor material a ser utilizado na endodontia de dentes decíduos (FUKS, 2000, KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992; MASS; ZILBERMAN, 1989; MORTAZAVI; MESBAHI, 2004, PINTO et al., 2011). É importante destacar que o uso de um material obturador com todos os requisitos desejáveis melhoraria o prognóstico do tratamento endodôntico de dentes decíduos (SEGATO et al., 2016).
A capacidade do material de ser reabsorvível é um dos principais requisitos para a sua indicação como material obturador de dentes decíduos (COULD, 1972, KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992). A reabsorção do material obturador deve ocorrer simultaneamente à reabsorção radicular durante a esfoliação, permitindo a natural erupção do dente permanente (RANLY; GARCIA-GODOY, 1991; QUEIROZ et al., 2009; SILVA et al., 2010). Além disso, em casos de sobre-obturação, o material deve ser reabsorvível e não tóxico aos tecidos periapicais bem como ao germe do permanente (KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992).
Diversos materiais têm sido utilizados na endodontia de dentes decíduos. O cimento de óxido de zinco e eugenol (OZE) foi o primeiro material a ser utilizado como obturador de canais radiculares de dentes decíduos. Desde então, vários autores têm relatado índices de sucesso moderados a altos na proservação de
dentes decíduos tratados endodonticamente com esse material (MASS, ZILBERMAN, 1989). O OZE apresenta características indesejáveis como ser irritante aos tecidos periapicais desencadeando reações inflamatórias de corpo estranho, nos casos de extravasamento. Além disso, apresenta baixa capacidade de reabsorção, deixando partículas de óxido de zinco e de eugenol nos tecidos periapicais quando ocorre a reabsorção fisiológica (BARJA-FIDALGO et al., 2011; FUKS; EIDELMAN, 1991; MORTAZAVI; MESBAHI, 2004; PINTO et al., 2011). Quando extravasado pelo ápice radicular, existe o risco de deflexão da erupção dos dentes permanentes devido a sua dureza (COLL; SADRIAN, 1996). Alguns autores, afirmam ainda que o OZE tem limitada ação antimicrobiana (COX; HEMBREE; MCKNIGHT, 1978; TCHAOU et al., 1996).
As pastas à base de hidróxido de cálcio também são indicadas como material obturador de canais radiculares de dentes decíduos devido a sua natureza hidrossolúvel, baixa solubilidade e biocompatibilidade (CERQUEIRA et al. 2008; CHAWLA et al. 2008). São também propriedades benéficas do hidróxido de cálcio sua atividade antimicrobiana, devido à dissociação iônica dos íons cálcio e hidroxila (FAVA; SAUNDERS, 1999; QUEIROZ et al., 2009; RANLY; GARCIA-GODOY,2000), capacidade de produzir a hidrólise da endotoxina bacteriana, indução de formação de tecido mineralizado, além da ativação da fosfatase alcalina e síntese de colágeno (DE SOUZA, 2009, MIZUNO; BANZAI, 2008, SILVA et al., 2008, SCHRODER, 1985, QUEIROZ et al., 2009).
Um material à base de hidróxido de cálcio disponível no mercado é a pasta Calen (S.S. White, Artigos Dentários, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), o qual apresenta o polietilenoglicol 400 como veículo. Este veículo viscoso permite a dissociação mais lenta dos íons hidroxila, diminuindo significativamente a velocidade de solubilização da pasta. Em dentes decíduos, a pasta Calen é indicada como material obturador devido à sua boa tolerância tecidual, natureza hidrossolúvel (viscoso) e baixa solubilidade (RANLY; GARCIA-GODOY, 2000). Alguns autores têm sugerido a adição de óxido de zinco à pasta Calen, o qual melhora ainda mais a consistência do material, e auxilia na redução da velocidade de fagocitose do material (FAVA; SAUNDERS, 1999; QUEIROZ et al., 2009).
As pastas de hidróxido de cálcio vêm sendo utilizadas ainda em associação com iodofórmio. Diversos estudos têm demonstrado que estes materiais são
facilmente reabsorvidos na região periapical em caso de extravasamento, e não causam reação de corpo estranho ou têm qualquer efeito indesejável aos dentes permanentes (CERQUEIRA et al. 2008; MATHEWSON; PRIMOSCH, 1995; MCDONALD; AVERY; DEAN, 2000). Além disso, os materiais contendo iodofórmio em sua composição apresentam uma atividade antibacteriana satisfatória (CERQUEIRA et al. 2008; MATHEWSON; PRIMOSCH, 1995; MCDONALD; AVERY; DEAN, 2000).
Dentre esses, o Vitapex (Neo Dental International Inc., Federal Way, WA, Estados Unidos), material na forma de pré-mistura de hidróxido de cálcio e iodofórmio, é tido como quase ideal para obturação de dentes decíduos (KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992). No entanto, como desvantagem, apresenta a rápida eliminação do iodofórmio pelo organismo, deixando espaços vazios no interior do canal radicular, o que pode comprometer o sucesso do tratamento endodôntico (KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992). Além disso, o uso de pastas iodoformadas pode provocar discoloração marrom-amarelada na coroa dentária, comprometendo a estética (GARCÍA-GODOY 1987). O potencial tóxico do iodofórmio, em contato com os tecidos vivos é considerado outra limitação do uso desse material (BARJA-FIDALGO et al., 2011; SILVA et al., 2010).
Um novo material à base de agregado mineral trióxido (MTA) destinado à obturação de canais radiculares de dentes decíduos está sendo desenvolvido. Segundo o fabricante, de forma semelhante ao MTA-Fillapex, o material experimental trata-se de uma pasta única e é composto por ester salicilato de glicol, dióxido de titânio, tungstato de cálcio, dióxido de silicone, tolueno sulfonamida e silicato de cálcio. Contudo, este material experimental contém menor proporção de salicilato, cerca de 30% de MTA, em comparação com MTA-Fillapex. O material experimental à base de MTA apresenta requisitos desejáveis para um material obturador de dentes decíduos como ação antibacteriana, radiopacidade satisfatória, baixa citotoxicidade e pH adequado (PILOWNIC, 2015). O uso de material endodôntico pronto para usar é desejável em odontpediatria, uma vez que pode reduzir o tempo de consulta. Adicionalmente, os materiais que necessitam ser manipulados podem ter as suas proporções alteradas modificando o desempenho clínico do material.
Os testes in vitro e in vivo são ensaios preliminares indispensáveis para o desenvolvimento de novos materiais odontológicos, já que buscam simular em
laboratório, condições biológicas mais próximas das reais. A biocompatibilidade de materiais odontológicos que possam entrar em contato com os tecidos vivos deve ser avaliada devido ao contato de substâncias que podem provocar reações no tecido periapical (KAPLAN et al. 2003; HO et al. 2006). A implantação do material no tecido conjuntivo subcutâneo é considerado um teste adequado para a avaliação da biocompatibilidade (OLSSON 1981; TORNECK 1966; PINTO et al. 2011; SILVA et al. 2010,).
No entanto, a terapia endodôntica não deve focar apenas nos aspectos biológicos e funcionais; a estética também deve ser levada em consideração durante o tratamento de canais radiculares inclusive de dentes decíduos (LENHERR et al.,2012; KRASTL et al.,2013). As crianças são conscientes sobre a sua estética dental e sobre a aparência de outras crianças (VALE et al., 2009) sendo o escurecimento dental, a principal percepção negativa delas em relação à boca (NEWTON; MINHAS, 2005; KERSHAW; NEWTON; WILLIAMS, 2008). O escurecimento da coroa dentária associado aos materiais obturadores está relacionado com o tempo de contato do material com a estrutura dentária, e com o pontencial cromogênico dos materiais utilizados no tratamento (PARSONS, 2001; PARTOVI, 2006; VAN DER BURGDT, 1985).
Assim, considerando a composição do material experimental à base de MTA, com a hipótese de que ele apresenta propriedades biológicas satisfatórias, será avaliada a reação tecidual induzida por esse material obturador experimental quando implantado no tecido conjuntivo subcutâneo comparando com os outros materiais obturadores de canais radiculares usados em dentes decíduos. A alteração de cor da estrutura dentária associada ao uso do material experimental à base de MTA também será testada.
2 Projeto de pesquisa
2.1 Antecedentes e justificativas
Apesar dos avanços na prevenção da cárie dentária e da melhor compreensão da importância de se manter a dentição decídua hígida, frequentemente, ocorre grande número de lesões cariosas profundas nos dentes decíduos, com comprometimento pulpar. Além disso, lesões traumáticas, principalmente nos dentes anteriores, apresentam uma prevalência elevada. A conservação dos dentes decíduos com alterações pulpares provocadas por lesão de cárie ou por traumatismo é um grande desafio terapêutico (CORRÊA et al., 2011). A terapia pulpar em dentes decíduos visa à manutenção do elemento dentário assim como a preservação da saúde da criança (GARCIA-GODOY, 1987). Sempre que o tecido pulpar torna-se irreversivelmente infectado, ou quando ocorre necrose, em decorrência de cárie ou traumatismo dental, a terapia pulpar dos dentes decíduos é indicada (AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRIC DENTISTRY, 2009). O tratamento endodôntico de dentes decíduos visa o reparo dos tecidos apicais e periapicais, levando a manutenção da integridade do germe dentário permanente (PINTO et al., 2011).
Algumas propriedades dos materiais obturadores de dentes decíduos devem ser ponderadas durante a escolha para uso. Idealmente este material deve ser reabsorvível, radiopaco, bactericida, promover adequado preenchimento e aderência às paredes dos canais radiculares, facilmente removido quando necessário; além de não provocar dano aos tecidos periapicais e ao germe do dente permanente, e tampouco alteração da coloração das estruturas dentárias. No entanto, não existe um material único que preencha todos os requisitos desejáveis para um material obturador, além de não haver consenso na literatura sobre o melhor material a ser utilizado na endodontia de dentes decíduos (FUKS, 2000; KUBOTA; GOLDEN;
PENUGONDA, 1992; MASS; ZILBERMAN, 1989; MORTAZAVI; MESBAHI, 2004; PINTO et al., 2011).
A capacidade do material de ser reabsorvível é um dos principais requisitos para a sua indicação como material obturador de dentes decíduos (COULD, 1972; KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992). A reabsorção do material obturador deve ocorrer simultaneamente à reabsorção radicular durante a esfoliação, permitindo a normal erupção do dente permanente (RANLY, GARCIA-GODOY, 1991; QUEIROZ et al., 2009; SILVA et al., 2010). Além disso, em casos de sobre-obturação, o material deve ser reabsorvível e não tóxico aos tecidos periapicais e germe do permanente (KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992).
Diversos materiais têm sido utilizados na endodontia de dentes decíduos. O cimento de óxido de zinco e eugenol (OZE) foi o primeiro material a ser utilizado como obturador de dentes decíduos. Desde então, vários autores têm relatado índices de sucesso moderados a altos na proservação de dentes decíduos tratados endodonticamente com esse material (MASS, ZILBERMAN, 1989). O OZE apresenta características indesejáveis como ser irritante aos tecidos periapicais, desencadeando reações inflamatórias de corpo estranho, nos casos de extravasamento. Além disso, apresenta baixa capacidade de reabsorção, deixando partículas de óxido de zinco e de eugenol nos tecidos periapicais quando ocorre a reabsorção fisiológica (BARJA-FIDALGO et al., 2011; FUKS; EIDELMAN, 1991, MORTAZAVI; MESBAHI, 2004; PINTO et al., 2011). Quando extravasado pelo ápice radicular, existe o risco de deflexão da erupção dos dentes permanentes devido a sua dureza (COLL; SADRIAN, 1996). Alguns autores, afirmam ainda que o OZE tem limitada ação antimicrobiana (COX; HEMBREE; MCKNIGHT, 1978; TCHAOU et al. 1996).
As pastas à base de hidróxido de cálcio também são indicadas como material obturador de canais radiculares de dentes decíduos devido a sua natureza hidrossolúvel, baixa solubilidade e biocompatibilidade (CERQUEIRA et al. 2008; CHAWLA et al. 2008). São também propriedades benéficas do hidróxido de cálcio sua atividade antimicrobiana, devido à dissociação iônica dos íons cálcio e hidroxila (FAVA; SAUNDERS, 1999; QUEIROZ et al., 2009; RANLY; GARCIA-GODOY, 2000) capacidade de produzir a hidrólise da endotoxina bacteriana, indução de formação
de tecido mineralizado, além da ativação da fosfatase alcalina e síntese de colágeno (DE SOUZA, 2009; MIZUNO; BANZAI, 2008; SILVA et al., 2008; SCHRODER, 1985; QUEIROZ et al., 2009).
Um material à base de hidróxido de cálcio disponível no mercado é a pasta Calen (S.S. White, Artigos Dentários, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), o qual apresenta o polietilenoglicol 400 como veículo. Este veículo viscoso permite a dissociação mais lenta dos íons hidroxila, diminuindo significativamente a velocidade de solubilização da pasta. Em dentes decíduos, a pasta Calen é indicada como material obturador devido à sua boa tolerância tecidual, natureza hidrossolúvel (viscoso) e baixa solubilidade (RANLY; GARCIA-GODOY, 2000). Alguns autores têm sugerido a adição de óxido de zinco à pasta Calen, o qual melhora ainda mais a consistência do material, e auxilia na redução da velocidade de fagocitose do material (FAVA; SAUNDERS, 1999; QUEIROZ et al., 2009).
As pastas de hidróxido de cálcio vêm sendo utilizadas ainda em associação com iodofórmio. Diversos estudos têm demonstrado que estes materiais são facilmente reabsorvidos na região periapical em caso de extravasamento, e não causam reação de corpo estranho ou têm qualquer efeito indesejável aos dentes permanentes (CERQUEIRA et al. 2008; MATHEWSON; PRIMOSCH, 1995; MCDONALD; AVERY; DEAN, 2000). Além disso, os materiais contendo iodofórmio em sua composição apresentam uma atividade antibacteriana satisfatória (CERQUEIRA et al. 2008; MATHEWSON; PRIMOSCH, 1995; MCDONALD; AVERY; DEAN, 2000).
Dentre esses, o Vitapex (Neo Dental International Inc., Federal Way, WA, Estados Unidos), material na forma de pré-mistura de hidróxido de cálcio e iodofórmio, é tido como quase ideal para obturação de dentes decíduos (KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992). No entanto, como desvantagem, apresenta a rápida eliminação de iodofórmio pelo organismo, deixando espaços vazios no interior do canal radicular, o que pode comprometer o sucesso do tratamento endodôntico (KUBOTA; GOLDEN; PENUGONDA, 1992). Além disso, o uso de pastas iodoformadas pode provocar discoloração marrom-amarelada na coroa dentária, comprometendo a estética (GARCÍA-GODOY 1987). O potencial tóxico do iodofórmio, em contato com os tecidos vivos é considerado outra limitação do uso desse material (BARJA-FIDALGO et al., 2011; SILVA et al., 2010).
Atualmente, está sendo desenvolvido um novo material destinado à obturação de canais radiculares de dentes decíduos. O material experimental à base de MTA (Mineral Trioxide Aggregate) apresenta requisitos desejáveis para um material obturador de dentes decíduos como ação antibacteriana, radiopacidade satisfatória, baixa citotoxicidade e pH adequado (PILOWNIC, 2015).
Os testes in vitro e in vivo são ensaios preliminares indispensáveis para o desenvolvimento de novos materiais odontológicos, já que buscam simular, em laboratório, condições biológicas mais próximas das reais. A biocompatibilidade de materiais odontológicos que possam entrar em contato com os tecidos vivos deve ser avaliada. É importante analisar as propriedades biológicas devido ao contato de substâncias que podem provocar reações no tecido periapical (KAPLAN et al. 2003, HO et al. 2006). A implantação do material no tecido conjuntivo subcutâneo é considerado um teste adequado para a avaliação da biocompatibilidade (OLSSON 1981; PINTO et al. 2011; SILVA et al. 2010;TORNECK 1966).
No entanto, a terapia endodôntica não deve focar apenas nos aspectos biológicos e funcionais; a estética também deve ser levada em consideração durante o tratamento de canais radiculares inclusive de dentes decíduos (KRASTL et al.,2013; ENHERR et al.,2012). As crianças são conscientes sobre a sua estética dental e sobre a aparência de outras crianças (VALE et al., 2009), sendo o escurecimento dental, a principal percepção negativa delas em relação à boca (NEWTON; MINHAS, 2005; KERSHAW; NEWTON; WILLIAMS, 2008). O escurecimento da coroa dentária associado aos materiais obturadores (VAN DER BURGDT, 1985; PARTOVI, 2006) está relacionado com o tempo de contato do material com a estrutura dentária, e com o pontencial cromogênico dos materiais utilizados no tratamento (PARSONS, 2001).
2.2 Objetivos
2.2.1 Objetivo geral
Avaliar propriedades físicas e biológicas de um material obturador de canais radiculares de dentes decíduos à base de MTA comparativamente a outros materiais obturadores de dentes decíduos.
2.2.2 Objetivos específicos
2.2.2.1 Avaliar a reação tecidual induzida por um material obturador experimental à base de MTA quando implantado no tecido conjuntivo subcutâneo.
2.2.2.2 Avaliar a capacidade de reabsorção do material experimental à base de MTA quando em contato com o tecido conjuntivo subcutâneo.
2.2.2.3 Avaliar a alteração de cor dentária induzida por materiais obturadores de canais radiculares de dentes decíduos.
2.2.2.4 Avaliara influência do fator tempo na progressão da discoloração dentária.
2.3 Metodologia
2.3.1 Materiais testados
2.3.1.1Os materiais obturadores utilizados nesse estudo serão: cimento de óxido de zinco e eugenol, pasta à base de hidróxido de cálcio (Calen) espessada com óxido de zinco, pasta à base de hidróxido de cácio e iodofórmio (Vitapex), e material experimental à base de MTA. Os materiais serão manipulados de acordo com as instruções dos fabricantes. A composição dos materiais está descrita na (Tabela 1).
Tabela 1- Composição dos materiais obturadores testados
Material Fabricante Composição
Cimento de óxido de zinco e eugenol Biodinâmica, Ibiporã, PR, Brasil Pó: Óxido de Zinco
Líquido: Eugenol, ácido acético glacial
Pasta Calen espessada com óxido de zinco
S.S. White, Artigos
Dentários, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
2.5 g Hidróxido de cálcio, 0.5 g Óxido de zinco, 0.05 g Colofônia, e 1.75 ml Polietilenoglicol 400 (veículo).A pasta Calen será espessada misturando 1.0 g da pasta com 1.0 g de óxido de zinco sobre uma placa de vidro.
Vitapex Neo Dental International
Inc,Federal Way, WA, Estados Unidos
30% Hidróxido de cálcio, 40.4% Iodofórmio, 22.4% Óleo de silicone, 6.9% inerte.
Material experimental à base de MTA Angelus, Londrina, PR, Brasil
Trióxido Mineral Agregado (MTA), Tungstato de Cálcio, Polietilenoglicol, Glicerina, Óxido de Silício e Silicone.
2.3.2 Teste de biocompatibilidade
Para realização do estudo, serão utilizados 18 ratos da espécie Wistar, com média de 4 meses de idade, pesando entre 250 e 300g, obtidos do Biotério da Universidade Federal de Pelotas. Previamente ao início do experimento, o projeto de pesquisa será submetido ao Comitê de Ética em experimentos com animais da Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil.
Os animais serão identificados individualmente pela cauda, e acomodados em uma casa convencional própria para o seu desenvolvimento. A alimentação dos animais, bem como os demais cuidados, seguirá os protocolos do Biotério da Universidade Federal de Pelotas.
Para implantação dos materiais no tecido subcutâneo dos animais, serão confeccionados tubos de polietileno (Abbott Laboratórios do Brasil, São Paulo, Brasil) de 1,0mm de diâmetro e 10mm de comprimento. Para evitar a extrusão dos
materiais, cada tubo terá uma das extremidades fechadas com guta-percha. O lado do tubo contendo guta-percha será usado como controle negativo. Os tubos serão desinfetados em solução de glutaraldeído a 2,2% onde serão mantidos por 12 horas. Antes de serem preenchidos com os materiais obturadores, os tubos serão lavados copiosamente em soro fisiológico e secos externamente com gaze estéril e internamente com cones de papel absorvente. Após o enchimento dos tubos com os diferentes materiais obturadores (tabela 2), os tubos serão imediatamente implantados no tecido subcutâneo dorsal dos ratos.
Tabela 2- Distribuição dos implantes em relação aos materiais e períodos empregados no experimento
Grupo Material Período
15 dias 30 dias 60 dias
I Cimento de óxido de zinco e eugenol 6 6 6
II Pasta Calen espessada com óxido de zinco 6 6 6
III Vitapex 6 6 6
IV Material experimental à base de MTA 6 6 6
V Guta-percha (controle) 24 24 24
Os ratos serão anestesiados através de injeção intraperitoneal com Xilazina 10mg/kg e Quetamina 25mg/kg. A pele dorsal dos animais será raspada e desinfetada com solução de iodo a 5%. Duas incisões longitudinais na região do dorso de cada animal, uma anterior e uma posterior, serão feitas utilizando uma lâmina de bisturi nº 15 (SOLIDOR; Lamedid Comercial e Serviços Ltda, Barueri,SP, Brasil).Cada animal receberá 4 implantes, 2 na região escapular e 2 na região pélvica. A colocação do material seguirá uma ordem previamente estabelecida, anotada em uma ficha apropriada, havendo rotatividade dos materiais obturadores em relação às regiões anatômicas.
Os animais serão eutanasiados num período de 15, 30 e 60 dias após a implantação dos tubos. Para tal, os animais receberão aprofundamento da anestesia com Barbitúrico 150 mg/kg, Tiopental sódico 150 mg/kg, via intraperitonial. Os tubos e os tecidos circundantes serão removidos e fixados em 10% de formalina
tamponada a um ph 7,0, em frascos unitários, com identificação do rato, grupo e localização do tubo (região anterior ou posterior). Os tubos serão removidos utilizando bisturi nº 11 (SOLIDOR; Lamedid Comercial e Serviços Ltda, Barueri, SP, Brasil) e processados para avaliação histológica por coloração com HE. As amostras serão avaliadas quanto à intensidade da resposta inflamatória, a espessura da cápsula fibrosa, presença de calcificação e células gigantes. Reações nos tecidos que estavam em contato com o material na abertura do tubo serão pontuadas como se segue: (0) nenhuma ou poucas células inflamatórias e nenhuma reação; (1) menos de 25 células e reação moderada, (2) entre 25 e 125 células e reação moderada, e (3) 125 ou mais células e severa reação. As cápsulas fibrosas foram classificadas como ''fina'' se espessura <150 mm ou ―grossa‖ se > 150 mm. A presença de células gigante e a calcificação serão registradas como presente ou ausente.
Uma média do número de células em cada grupo será obtida a partir da pontuação de 10 áreas separadas. Os resultados serão analisados pelo teste de Kruskal-Wallis ao nível de significância de 5%.
2.3.3 Teste de alteração de cor
Setenta e cinco incisivos bovinos serão extraídos, esterilizados e armazenados em água a temperatura ambiente. Após a remoção das raízes, com disco de diamante em baixa rotação, as coroas serão limpas cuidadosamente com curetas. A partir do terço médio da coroa, serão preparados blocos cubóides de esmalte-dentina (10x10m) utilizando uma broca 4138 (KG Sorensen). A espessura do bloco será padronizada em 3,5 mm com o auxílio de uma régua endodôntica. Na face interna, correspondente a dentina, será confeccionado um orifício com o diâmetro de 4 mm, utilizando uma broca de esférica 1014 (KG Sorensen Ind. e Com. Ltda., São Paulo, Brasil) objetivando deixar 2 mm de distância da parede vestibular (Figura 1).
Figura 1. Bloco cubóide de esmalte-dentina (10x10x3,5mm) preparado a partir do terço médio da coroa dente bovino.
Os espécimes serão imersos em hipoclorito de sódio 1% (Asfer Indústria e Comércio Ltda) durante 30 min e após secagem, serão imersos em EDTA 17% (Biodinâmica, Ibiporã, Pr, Brasil) por 3 minutos. Em seguida, os espécimes serão colocados por 3 minutos em hipoclorito de sódio e posteriormente, armazenados em água.
Os espécimes serão divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais, de acordo com o material obturador a ser avaliado (n = 15). As cavidades serão preenchidas com os seguintes materiais: Grupo 1, material experimental à base de MTA (Angelus, Londrina, PR, Brazil); Grupo 2, Vitapex (Neo dental Internacional, Federal Way / WA); Grupo 3, pasta Calen (S.S. White, Artigos Dentários, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) espessada com óxido de zinco (Biodinâmica Química e Farmacêutica Ltda., Ibiporã, PR, Brazil) na proporção 1:1; Grupo 4, óxido de zinco-eugenol (OZE) (Biodinâmica, Ibiporã, PR, Brasil). No grupo controle (Grupo 5), as cavidades serão mantidas sem material obturador (Tabela 3).
Todas as cavidades, inclusive as do grupo controle, serão seladas com Vitro Fil LC (DFL Ind e Comércio S.A, Rio de Janeiro, Brasil) (Figura 2). A polimerização será realizada utilizando um fotopolimerizador LED (Emitter A Fotopolimerizador/ Schuster Comércio de Equipamentos Odontológicos Ltda, Santa Maria, RS, Brasil) por 20 s. Cada espécime será colocado em um tubo Falcon contendo 15 ml com água. Os tubos serão armazenados a temperatura ambiente e mantidos no escuro durante os 3 primeiros meses. Durante o período seguinte e até o final dos 9 meses, as amostras serão expostas a luz solar de forma indireta (LENHERR,2012).
Figura 2 - Após preenchimento da cavidade com os materiais a serem avaliados, selamento
com cimento de ionômero de vidro fotoativado.
As medições de cor serão realizadas em uma sala escura usando um espectrofotômetro (Vita Easyshade, Vita- Zahnfabrik, Alemanha) sob condições
Tabela 3 – Distribuição dos materiais experimentais
Grupo N Material Fabricante
I 15 Material àbase de MTA Angelus®, Londrina, PR, Brasil
II 15 Vitapex Neo Dental InternationalInc, Federal Way, WA,EstadosUnidos
III 15 Pasta Calenespessada com óxido de zinco
S.S. White, Artigos Dentários, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
IV 15 Cimento de óxido de zinco e eugenol
Biodinâmica, Ibiporã, PR, Brasil
V 15 Sem material obturador (controle)
padronizadas. A estação de medição consistirá de uma mesa com superfície forrada por uma base preta e um tubo de ensaio de 15 ml (Falcon), o qual será cortado deixando apenas 1 cm de altura. O tubo será posicionado em sentido vertical, com seu maior diâmetro encostado na base preta, então o dente será posicionado dentro do tubo com superfície interna da face vestibular encostada na base preta. Por conseguinte, a ponta calibradora do espectrofotômetro será colocada dentro do tubo de ensaio e ao encostar o espécime, o calibrador será acionado pelo operador (Figura 3). O espectrofotômetro será calibrado antes da medição de cada espécime.
Figura 3 - Dispositivo confeccionado para fazer a mensuração de cor do terço cervical da
coroa do dente bovino.
Oito sessões de registro de cor serão realizadas com os seguintes intervalos de tempo: antes da inserção dos materiais na cavidade (T0); imediatamente à colocação dos materiais obturadores (T1); 1 semana após o preenchimento das cavidades com os materiais obturadores (T2); um mês (T3); 3 meses (T4); 6 meses (T5); 9 meses (T6) e 12 meses (T7) após o preenchimento. Com o intuito de evitar mudanças ópticas causadas por desidratação, o excesso de água será removido rapidamente por secagem com ar durante 1s antes de cada mensuração. Cada amostra terá a sua coloração três vezes aferida. Os dados serão tabulados e posteriormente analisados.
Os efeitos de escurecimento causados pelos materiais obturadores serão medidos através do espectrofotômetro e expressos em unidades de ∆E00. O valor de ∆E00 representa as alterações relativas de cor que um observador pode relatar para os materiais após um tratamento ou entre períodos de tempo.
O cálculo da diferença de cor será realizado a partir dos valores de L*, a* e b* obtidos das leituras de cor nos diferentes tempos experimentais em comparação ao T0 (Baseline). Dessa maneira será possível comparar a diferença de cor dos espécimes através da fórmula CIEDE 2000.
Onde o valor de L descreve a luminosidade que varia de preto (0) a branco (100), enquanto a* e b* indicam croma vermelho/verde e azul/amarelo.
Quanto menor o valor do ∆E 00, menor a diferença de cor entre a cor inicial do dente e cor final ao longo do tempo.
Os dados serão submetidos ao teste de Anova com Repeated Measurese comparação múltipla de Tukey para avaliar o efeito dos fatores tempo e material no escurecimento dentário (p = 0,05).
2.4 Orçamento
Material Quantidade Valor Unitário Valor total
Luva 3 cx R$15, 00 R$45,00 Gorro 1 cx R$7,79 R$7,79 Máscara 1 cx R$11,99 R$11,99 Pasta Calen 5 um R$43,90 R$219,5 Vitapex 5 um R$100,00 R$500,00 Óxido de zinco 50g 2 um R$ 5,23 R$10,46 Eugenol 2 um R$ 10,92 R$21,84 Hipoclorito de sódio 2,5% 1 l R$13,30 R$13,30 EDTA 17% 1 um R$8,08 R$8,08 Ácido nítrico 10% 1 um R$43,00 R$43,00 Lâmina bisturi 1cx R$ 18,20 R$18,20 Fio de seda 4-0 1 cx R$17,00 R$17,00 Isopropanol 17,2% 1 l R$17,75 R$17,75 Rolo de parafilme 1 um R$83,75 R$83,75 Anestésico 1 cx R$95,00 R$95,00 Formol 10% 1 um R$25,48 R$25,48 Soro fisiológico 1 l R$1,15 R$1,15 Broca 1014 2 um R$4,90 R$9,80 Ionômero de vidro 1 um R$43,23 R$43,23 TOTAL R$1.192,32
2.5 Cronograma de atividades Ano 2015 2016 Mês J J A S O N D J F M A M J J A S O N D Revisão da literatura X x x X X x x Qualificação do projeto x Piloto X Experimento 1 X X x x x X Experimento 2 x x x X x x X X x x X Digitação dos dados x x X x Análise dos dados x X x Redação da dissertação x x Redação dos artigos x x Defesa x
3 Relatório do Trabalho de campo
Neste capítulo estão relatadas as complementações e as mudanças ocorridas no planejamento e execução dos experimentos desta pesquisa.
3.1 O projeto de qualificação de tese por mim apresentado a banca, se intitulava ―Revascularização de dentes com polpa necrosada e rizogênese incompleta: estudo clínico randomizado‖. No entanto, não estou apresentando esse trabalho como tese de doutorado devido a dificuldade de conseguir pacientes que se enquadrassem nos critérios de inclusão do estudo.
3.2 O trabalho apresentado como tese de doutorado foi qualificado durante o meu mestrado.
3.3 No teste de biocompatibilidade houve uma perda da amostra durante o processamento histológico, o que reduziu o nosso n de 18 animais para 15.
3.4 As mensurações de cor seriam prorrogadas por mais três meses, no entanto, o espectrofotômetro (Vita Easyshade) da Faculdade de Odontologia de Pelotas encontrava-se danificado. As mensurações foram realizadas, portanto, pelo tempo máximo de 9 meses, sendo que esse tempo foi suficiente para verificarmos a discoloração dentária ocorrida nos espécimes. É importante salientar que o uso de outro equipamento poderia trazer desvio de resultados.
4 Artigos 4.1 Artigo 1*
Tissue reaction to a new MTA-based root canal filling material for primary teeth
K. J. PILOWNIC1; A. P. N. GOMES1; A. C. FELIX2; A. R. ROMANO1& F. G. PAPPEN1
1
Graduate Program in Dentistry, Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
2
Central Vivarium, Faculty of Veterinary, Federal University of Pelotas, Pelotas, Brazil
Correspondence address: Fernanda Geraldo Pappen Graduate Program, Dentistry, Federal University of Pelotas
R. Gonçalves Chaves, 457, sala 507, Pelotas, RS, Brasil. CEP: 96015-560 E-mail: ferpappen@yahoo.com.br
Abstract
Purpose: This study evaluated the tissue reactions to the experimental MTA-based material in comparison to Zinc Oxide and Eugenol cement (ZOE); Vitapex; and Calen paste thickened with zinc oxide (Calen+ZO). Methods: Fifteen Wistar rats had received four implants containing the tested filling materials. The tubes had one of the ends closed with gutta-percha used as negative control. After 15, 30 and 60 days, the animals were euthanized and the tubes and surrounding tissue were removed and processed for histopathologic evaluation. The specimens were evaluated for intensity of inflammatory response, fibrous capsule thickness, and for the presence of calcification and giant cells. The results were analyzed by the Kruskal-Wallis test. Results: On day 15, thick fibrous capsule and moderate inflammatory response were observed in Vitapex and experimental MTA-based material, while in ZOE and Calen+ZO groups, the intensity of inflammatory reaction was moderate to severe. On day 30, most of experimental MTA-based material specimens showed mild inflammatory reaction and a thin fibrous capsule. After 60 days, Calen+ZO group still showed moderate inflammation, while the others showed predominantly mild inflammatory reaction and a thin fibrous capsule. Conclusion: Experimental MTA-based material had showed to be biocompatible, representing an alternative for endodontic filling of primary teeth. Key Words: primary teeth; root canal filling materials; biocompatibility
Introduction
An ideal endodontic filling material for primary teeth must have several properties that make it suitable for use, such as resorption at a rate similar to that of the primary root, be harmless to the periapical tissues and permanent tooth germ and readily resorb if pressed beyond the apex.1,2
Several materials have been used for endodontic filling in primary teeth. Zinc oxide (ZO) and zinc oxide eugenol (ZOE) have been widely used in the primary dentition. 1,2,3 Nevertheless, due to their irritating potential 1,2 and low resorption capacity3 the use of these materials have been substituted by iodoform containing materials, or calcium hydroxide pastes, because of their antibacterial activity, biocompatibility and easy resorption.2,4,5 Other studies have also suggested the use of association of calcium hydroxide and zinc oxide
6,7
as well as calcium hydroxide and iodoform. 4,6,7
Recently, an experimental MTA-based material, ready to use, endodontic filling material for primary teeth had been developed (Angelus, Londrina, PR, Brazil). According to the manufacturer, the experimental MTA-based material has in its composition mineral trioxide aggregate (MTA), calcium tungstate, polyethylene glycol, glycerin, silicate oxide e silicon. Unpublished data demonstrated that this material has acceptable radiopacity, low cytotoxity, antimicrobial efficacy and proper pH.
The biocompatibility of all experimental dental materials that might come in contact with tissues should be examined. Biological properties are amongst the most important aspects of endodontic filling materials because the release of substances from the materials may generate reactions in the periapical
tissue. The subcutaneous connective tissue implantation method is one of the main methods used to evaluate the biocompatibility of a material.10-13
Therefore, the purpose of this study was to evaluate the tissue reaction induced by an experimental MTA-based material when implanted in subcutaneous connective tissues, in comparison with others endodontic filling materials used for primary teeth.
Materials and Methods
The materials tested were the experimental MTA-based material (Angelus, Londrina, PR, Brazil); Zinc Oxide and Eugenol cement (ZOE) (S.S.White Artigos Dentários Ltda., Rio de Janeiro, RJ, Brazil); Vitapex, a premixed calcium hydroxide and iodoform paste (Neo Dental International Inc, Federal Way, WA, USA); Calen, a premixed calcium hydroxide and polyethylene glycol-based paste (S.S.White Artigos Dentários Ltda.), thickened with zinc oxide (ZO) (1:1)(Biodinâmica Química e Farmacêutica Ltda.,Ibiporã, PR, Brazil).
The materials were inserted into sterile polyethylene tubes measuring 10 mm long and 1.0 mm internal diameter (Abbott Laboratorios do Brasil, São Paulo, Brazil). To avoid the materials extrusion, each tube had one of the ends closed with gutta-percha. The side of the tube containing gutta-percha was used as negative control. After complete filling, the tubes were immediately implanted on animal‘s dorsal subcutaneous tissue.
The Research Ethics Committee for Animal Use of the Federal University of Pelotas approved this study (Protocol #8977; 02/04/14). All procedures were carried out in accordance with institutional guidelines for animal care and use. Fifteen Wistar rats (Rattusnorvegicus; age, 6 months; weight, ~250 g) were
used in this study. The animals‘ tails were marked for individual identification. The rats were housed in plastic cages (twoper cage) placed in ventilated racks (Alesco, Monte Mor, SP, Brazil) at 22°C with a 12 hours light⁄dark cycle (lights on at 7:00 am, off at 7:00 pm). During the experiments, the rats were provided with a standard diet of rat chow (Nuvilab, Colombo, PR, Brazil) and filtered water ad libitum.
The animals were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (80mg kg-1 by weight) combined with xylazine (4mg kg-1 by weight; both from SDC ECommerce for Agricultural Products LTDA, Marilia, SP, Brazil). Dorsal trichotomy and antisepsis was performed using iodinated alcohol and sterile distilled water. 14
Four 2-cm incisions were made on the shaved backs in a head-to-tail orientation using a #15 Bard Parker blade (LamedidSolidor, Osasco, SP, Brazil). Using blunt-tipped scissors, the lateral tearing of the subcutaneous tissue provided four surgical cavities displayed in quadrants equidistant from the center of the animals' backs. Each animal received four implants, two in the scapular region and two in the caudal region. The tubes filled with materials were implanted into the spaces created by blunt dissection, according to a previously established placement order and site rotation, and the skin was closed using a 4-0 silk suture (Johnson & Johnson Produtos Profissionais Ltda, São José dos Campos, SP, Brazil). Sterile instruments and aseptic techniques were used throughout the experiments. The animals were placed in individual cages until they recovered from anesthesia. To aid recovery, paracetamol (0.06 mg g-1day-1) was added to their drinking water for 72 h.15
The animals were euthanized at 15, 30 and 60 days after the dorsal implantation (n=5/group at each time point). They were anesthetized with an intraperitoneal injection of chloral hydrate (350 mg/kg) (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA), and physiological saline (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA) followed by 10% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA) was perfused transcardially. The tubes and the surrounding tissues were removed and fixed in 10% buffered formalin at a pH of 7.0. The tubes were bisected transversely, and both halves were subsequently cut longitudinally with a sharp blade to allow the surfaces to maintain contact with the processing solutions. The specimens were paraffin embedded, sectioned serially to 3-mm slices, and stained with hematoxylin and eosin.
Tissue reactions in contact with the material at the opening of the tube were scored as follow: 0, no or few inflammatory cells and no reaction; 1, less than 25 cells and mild reaction; 2, between 25 and 125 cells and moderate reaction; and 3, 125 or more cells and severe reaction. Fibrous capsules were classed as ‗‗thin‘‘ or ‗‗thick‘‘ if the thickness was <150 mm or >150 mm, respectively. Calcification was recorded as present or absent. Also the presence of giant cells was recorded. In a random order, only one control in each animal was evaluated. The observer, who was a pathologist, was blinded to the treatment. The results were analyzed by the Kruskal-Wallis test at a 5% significance level.
Results
On day 15, thick fibrous capsule formation and moderate cell inflammatory infiltration by lymphocytes and macrophages were observed with
all the Vitapex and experimental MTA-based material specimens, while in ZOE and Calen+ZO groups, the intensity of inflammatory reaction was moderate to severe (p = 0.001). The capsule thickness surrounding the tubes was significantly thinner in the control specimens when compared with the experimental materials (p < 0.001) and the presence of giant cells in this period varied from 20 to 60% in the experimental groups (p > 0.005). The presence of calcificated precipitates was noticed in 40% of specimens from Calen+ZO and Vitapex on day 15, and it was not observed in ZOE and experimental MTA-based material groups (Table 1).
The Vitapex group showed a large capsule extension, with evident presence of macrophage foam cells on day 15 and 30. Mild to moderate inflammatory cell infiltration and a reduction in the thickness of the fibrous capsule was evident from day 30 onward (Fig.1C;H).
On day 30, moderate inflammatory cell infiltration was observed in 100% of Vitapex and Calen+ZO, and 80% of ZOE specimens, while most experimental MTA-based material specimens showed mild inflammatory reaction only (p = 0.001). The fibrous capsule thickness was also significantly thinner in the experimental MTA-based material group (p = 0.001). On this period, the presence of giant cells was mostly observed in Vitapex specimens, but was still noticed in the other groups (p > 0.005). Vitapex and Calen+ZO induced the deposition of calcified tissue more frequently than the other materials (p = 0.02).
In the control group, mild inflammatory reaction with lymphocytes and macrophages was observed at 15 and 30 days. After 60 days, inflammatory
response was absent in the areas in contact with gutta-percha. There was no giant cells or calcificated precipitated in the specimens from control group.
At 60 days, the inflammatory reaction was mild in most specimens of ZOE, experimental MTA and Vitapex, while 80% of specimens from Calen+ZO group still showed moderate inflammatory infiltrate (p = 0.001). The capsule extension was predominantly thin for all the materials (p > 0.005), and the presence of giant cells were recorded only in few ZOE specimens (p > 0.005). The occurrence of calcification, was more common in specimens from ZOE and Calen+ZO (p = 0.003).
Discussion
The biomechanical endodontic treatment of primary teeth remains far from ideal, especially due to their anatomical features and difficulties in obtaining a good radiographic view of the apex for determining the working length.16Due to the physiological root resorption process, materials used in endodontic treatment of primary teeth should be harmless to the periapical tissues and permanent tooth germs.17The experimental MTA-based material has been developed as an alternative to be used in the endodontic filling for primary teeth, and in the present study demonstrated promising results for the material in terms of subcutaneous implantation.
The method of implantation of endodontic filling materials in the subcutaneous tissue of rats, in part simulates the situation of the root canal, and is one of the most appropriate tests to evaluate materials biocompatibility. 12-13
biocompatibility of experimental MTA-based material. Besides, the inert nature of polyethylene tubes and their ability to expose a test material to living tissue in a controlled and effective manner justify its choice.18In the present methodology, one end of the tubes were sealed with gutta-percha in order to avoid material extrusion. Also, since gutta-percha is well tolerated by connective tissues, this tube extremity was used as negative control.9,13
Both, the control and the tested material specimens presented significantly less inflammation severity at longer time intervals (30 and 60 days) in comparison to 15 days specimens. Similarly, the capsule extension was mostly thick in all groups on day 15 and it declined by over the time, demonstrating that every tested material was well tolerated by the subcutaneous tissues. It was possible to observe collagen fiber formation at the area in contact with the all the tested materials. Studies had described that there is a meaningful relationship between inflammation and fibrous capsule thickness.19, 20, 21 Makkes et al.19 concluded that decreasing capsule thickness is a sign of biocompatibility, and the deferred harmful effects of a material are considered to be more important than its initial effects in biocompatibility tests.22
On day 60, the inflammatory reaction was absent in control group; mild in most specimens of ZOE, experimental MTA-based material and Vitapex, while most specimens from Calen+ZO group still showed moderate inflammatory infiltrate. Contrary to our findings, Nelson-Filho et al.23 and Queiroz et al.24 had reported that zinc oxide does not interfere the biocompatibility of calcium hydroxide. When used alone, Calen paste present recognized biocompatibility23,25, thus the persistent inflammation observed in Calen+ZO group may be attributed to the higher concentration of zinc in the medicament,
since zinc has the capacity to influence in the inflammatory process for reducing phagocytic capacity of macrophages and to interfere in the membrane of the lysosomes.10, 11
The tissue reaction demonstrated by ZOE in this study was similar to those described by other authors for ZOE and other ZOE-based sealers.26, 27 In the initial periods, ZOE demonstrated severe inflammation which had decline by over the time. ZOE cement is initially highly toxic because of its traces of unreacted eugenol, exerting a toxic reaction to cells.28,29 This profile tends to change significantly along the time, when the material becomes more biocompatible, due to the reduced availability of unreacted eugenol.
Although the conventional MTA is well known by its excellent biocompatibility,30,31 The composition of experimental MTA-based material differs from the traditional MTA: besides a portion of MTA, the experimental filling material also has in its composition calcium tungstate, polyethylene glycol, glycerin, silicate oxide and silicon. Our results demonstrated an optimal tissue reaction to the experimental MTA-based material, what had occurred probably due to the presence of MTA in its composition and the absence of toxic components. Also, despite the optimal clinical and radiographic success rates of Vitapex as a endodontic filling material of primary teeth,2,32 there are few information regarding its biocompatibility. Similarly to our results, Huang et al.4 also showed Vitapex to be biocompatible, since it resulted in high survival rate of cells after the experimental period.
In all the experimental groups, it was possible to observe the presence of giant cells, mainly within 15 days. The presence of giant cells may be
associated with the presence of material that the organism hardly breaks down31. However, the number of particles of materials present in the subcutaneous tissue had decreased by over the time, suggesting the capacity of these filling materials to be reabsorbed when in contact with connective tissue. The ability of the material to be resorbable is considered one of the main requirements for the indication of a endodontic filling material for primary teeth. The material resorption must occur simultaneously to root resorption during exfoliation, allowing normal eruption of permanent teeth. Also in cases of over-filling, the material should be resorbable and non-toxic to the periapical tissues and germ of the permanent.1,2
Calcific precipitation was observed around implantation sites in all experimental groups, but more frequently in Calen+ZO specimens. The production of calcific structures in subcutaneous investigations is a sign of osteoinductivity of the material.33The osteoinductivity and conductivity the materials may be attributed to the release of calcium and phosphorous as well as the formation of hydroxyapatite crystals over the material.25,34 Similar to our study, other authors had also reported the presence of calcification in conventional MTA and Calcium hydroxide based materials.30MTA does not have calcium hydroxide in its composition, but it has calcium oxide that could react with tissue fluids to form calcium hydroxide, what can explain the similar behavior of experimental-MTA, Calen+ZO and Vitapex regarding the induction of calcification. However, no prior study demonstrated the osteoinductivity of ZOE.
Within the limits of this study, our results showed that all endodontic filling materials were well tolerated by the subcutaneous tissues. The
experimental-MTA based material showed to be biocompatible, representing an alternative for the endodontic filling of primary teeth.
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