UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
TATIANE MELINA GUERREIRO
CONTAMINANTES EM ALIMENTOS:
DETERMINAÇÃO DE MARCADORES QUÍMICOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
CONTAMINANTS IN FOOD:
CHEMICAL MARKERS DETERMINATION BY MASS SPECTROMETRY
CAMPINAS 2018
TATIANE MELINA GUERREIRO
CONTAMINANTES EM ALIMENTOS:
DETERMINAÇÃO DE MARCADORES QUÍMICOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
CONTAMINANTS IN FOOD:
CHEMICAL MARKERS DETERMINATION BY MASS SPECTROMETRY
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências
Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences of the University of Campinas as part of the requirements to obtain the Doctor of Science degree
ORIENTADOR: RODRIGO RAMOS CATHARINO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA TATIANE MELINA GUERREIRO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO.
CAMPINAS 2018
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
TATIANE MELINA GUERREIROORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
MEMBROS:
1. PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO
2. PROFA. DRA. MÔNICA SIQUEIRA FERREIRA
3. PROF. DR. SEVERINO MATIAS DE ALENCAR
4. PROFA. DRA. CIBELE ZANARDI ESTEVES
5. PROFA. DRA. IZABELA DUTRA ALVIM
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
“Acordar para quem você é requer desapego de quem você imagina ser” Alan Watts
Esta página é sempre a mais difícil de ser escrita. Não que eu não me sinta grata, mas pelo fato do quão difícil que é pontuar somente algumas pessoas para se agredecer por tudo que passou e pelos frutos que ando colhendo hoje em dia. Este trabalho contou com a participação de muita gente e muitos momentos. Esta tese é o resultado de algo que eu idealizei há 4 anos atrás e que hoje chega ao fim. Por isso, sou muito grata por todos que tiveram a oportunidade de viver estes últimos anos comigo.
Nada melhor do que começar os agradecimentos com vocês, amigos do laboratório: Diogo, Mônica, Cibela, Jeany, Mohamed, Marta, Luisa e Estela muito obrigada por fazerem meus dias mais alegres, por toda ajuda no que fosse preciso, por me trazer queijo, por todas as conversas e por todas as risadas fica aqui meu abraço apertado para cada um de vocês! Por todo apoio e por me (des)orientar em cada etapa deste doutorado, muito obrigada Prof. Rodrigo! Só alegria, sempre!
Por conviver 24 horas comigo, vivendo todas as minhas emoções, cada alegria, cada lágrima, cada garrafa de vinho, cada receita que dá errado, cada viagem, cada copo de cerveja, cada machucado, cada manhã às 4h30, cada reggaeton... Fer, eu não tenho palavras para descrever o quanto você é importante para mim... Muito obrigada por todo companheirismo e amor. Eu te amo!
E por último, àqueles que sempre estiveram aqui para me proteger, me ensinar, me guiar, me motivar e principalmente por sempre acreditar em mim, mesmo quando nem eu mesma acreditei, muito obrigada Pai e Mãe! Eu tenho muito orgulho de ser sua filha! E não poderia esquecer da minha companheira de vida, aquela pessoa que a gente briga e mesmo assim sabe que nunca vai deixar de amar, muito obrigada Bilu! O pai e a mãe não poderiam ter acertado tanto quando fizeram você!
Muito obrigada por cada oportunidade que pude viver nesses últimos anos e também por cada momento de angústia, que sempre trouxeram muito aprendizado e crescimento. Muito obrigado doutorado, por além de ciência ter me ensinado muito sobre a vida!
A qualidade de alimentos é assegurada através dos limites de contaminantes químicos designados pelas legislações para o emprego de um controle de qualidade eficaz. A busca por métodos analíticos mais rápidos e com alta eficiência é o que move a pesquisa aplicada à área de ciência de alimentos. O emprego da espectrometria de massas é destaque na análise de marcadores químicos em alimentos, por ser uma técnica versátil para o estudo e identificação por análise direta de possíveis contaminantes. Além disso, a união de técnicas modernas de espectrometria de massas com a metabolômica, uma plataforma capaz de integrar dados estatísticos e experimentais para obtenção de resultados analíticos de alta confiabilidade, torna esse segmento extremamente fértil para a realização de melhorias e desenvolvimento. Para a realização destas análises, os compostos podem ser previamente escolhidos (target analysis) ou identificados pós-análise (metabolic fingerprinting). Neste contexto, amostras de diversos alimentos populares e amplamente consumidos no Brasil, como leite, carne vermelha e a bebida cachaça foram analisados empregando-se esta combinação com o objetivo de identificar marcadores químicos relacionados aos possíveis contaminantes destes alimentos.
ABSTRACT
Food quality is ensured through the limits of chemical contaminants designated by legislation for the use of effective quality control. The search for faster and more efficient analytical methods is what moves applied research to the area of food science. The use of mass spectrometry is highlighted in the analysis of chemical markers in foods, being a versatile technique for the study and identification by direct analysis of possible contaminants. Moreover, the union of modern techniques of mass spectrometry with metabolomics, a platform capable of integrating statistical and experimental data to obtain highly reliable analytical results, makes this segment extremely fertile for improvement and development. For the accomplishment of these analyzes, the compounds can be previously chosen (target analysis) or identified post-analysis (metabolic fingerprinting). In this context, samples of several popular and widely consumed foods in Brazil, such as milk, beef meat and the beverage cachaça were analyzed using this combination in order to identify chemical markers related to the possible contaminants in these foods.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Processo de ionização por spray de elétrons. (adaptado de Cech & Christie,
2001)... 21 Figure 1 PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples,
separated from fresh raw milk. (A) Scores plot of sodium hydroxide using positive mode data. (B) Scores plot of sodium hypochlorite using positive mode data. (C) Scores plot of hydrogen peroxide using the negative mode data. (D)
Scores plot of the formaldehyde using the negative mode data... 41 Figure 2 DI-HRMS fingerprints in the positive mode of adulterated milk samples (A =
fresh raw milk/control; B = milk added 1 % v/v of sodium hydroxide solution; C = milk added 1 % v/v of sodium hypochlorite solution)... 42 Figure 3 DI-HRMS fingerprints in the negative mode of adulterated milk samples (A =
fresh raw milk/control; B = milk added 1 % v/v of hydrogen peroxide solution; C = milk added 1 % v/v of formaldehyde solution)... 43 Figure 1SM PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples with
concentration of adulterant of 2.5% v/v separated from fresh raw milk. (A = Scores plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores plot of sodium hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot of hydrogen peroxide solution using the negative mode data; D = Scores plot of the formaldehyde solution using the negative mode data)... 49 Figure 2SM PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples with
concentration of adulterant of 5% v/v separated from fresh raw milk. (A = Scores plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores plot of sodium hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot of hydrogen peroxide solution using the negative mode data; D = Scores plot of the formaldehyde solution using the negative mode data)... 50 Figure 3SM PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples with
concentration of adulterant of 10% v/v separated from fresh raw milk. (A = Scores plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores plot of sodium hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot of hydrogen peroxide solution using the negative mode data; D = Scores plot of the formaldehyde solution using the negative mode data)... 51 Figure 1 HRMS spectra of the beef meat samples showing the presence of five
contaminants in all pieces of beef meat that were in contact with the vacuum-plastic packaging. A: negative control butcher's shop beef meat; B: packaging
spectrum; C: packed beef meat spectrum... 57 Figure 1 Scheme of the solution preparation for the standard addition method... 68 Figure 2 Sandwich injection scheme... 68 Figure 3 EIC chromatogram of solutions with 6 and 30 g/L of sugar and MS spectrum of
365 (sucrose)... 70 Figure 4 EIC chromatogram of 6 g/L of sugar (A) and with a sample of cachaça (B)
before and after QuEChERS extraction, injecting only the organic layer for both samples... 71 Figure 5 Overlapping chromatogram of standard addition method, which shows the
gradual increase of the peak area of ethyl carbamate... 73 Figure 6 Comparison between the standard addition curve (A) and the external calibration
LISTA DE TABELAS
Quadro 1 Comparação entre as diferentes tecnologias utilizadas em
metabolômica. (Adaptado de Wishart, 2008)... 19 Table 1 List of compounds found for each of the types of adulterants used.
*METLIN ID... 45 Table 1 Contaminants found in meat samples from plastic package. (a
Presented adducts are in accordance with Keller et al, 2008 (Keller,
Sui, Young, & Whittal, 2008))... 56 Table 1 Sugar percentage removal by EIC peak area... 69 Table 2 Recovery results by standard addition and external calibration
methods. (n=3)... 74 Table 3 Mean concentration (MC, n=3), absolute error of the measurements
(n=3) and final concentration (FC) of ethyl carbamate in the tested
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS MS Espectrometria de Massas, do inglês Mass Spectrometry QuEChERS Do inglês Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe
GC Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography LC Chromatografia Líquida, do inglês Liquid Chromatography QqQ Triplo quadrupolo
MRM Monitoramento de Reações Múltiplas, do inglês Multiple Reaction Monitoring EI Ionização por Elétrons, do inglês Electron Ionization
ESI Ionização por Spray de Elétrons, do inglês Electrospray Ionization
NMR Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear, do inglês Nuclear Magnetic Ressonance Spectroscopy
HRMS Espectrometria de Massas de Alta Resolução, do inglês High-Resolution Mass Spectrometry
MALDI Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz, do inglês Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
CID Dissociação Induzida por Colisão, do inglês Collision-Induced Dissociation
DOP Denominação de Origem Protegida
IGP Indicação Geográfica Protegida
EPG Especialidade Tradicional Garantida
PCA Análise de Componente Principal, do inglês Principal Component Analysis PLS-DA Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais, do inglês Partial
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 13
1.2 Contaminantes em Alimentos ... 14
1.3 Metabolômica em Alimentos ... 15
1.4 Técnicas analíticas para determinação de substâncias em alimentos utilizando a Metabolômica ... 16
1.4.1 Técnicas Cromatográficas ...………...………...………..…... 17
1.4.2 Curva de Calibração e Adição de Padrão ... 17
1.4.3 Espectrometria de Massas ...………...…... 18
1.4.4 Ionização por Elétrons (EI) ...…... 20
1.4.5 Ionização por Spray de Elétrons (ESI) ... 20
1.4.6 Tandem MS (MS/MS) ... 21
1.4.7 Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM)... 22
1.4.8 Espectrometria de Massas de Alta Resolução ...………... 23
1.5 Produtos Alimentícios ... 23 1.5.1 Leite ... 23 1.5.2 Carne ... 27 1.5.3 Cachaça ...……...………...……... 29 2. OBJETIVOS ... 32 2.1 Objetivos Específicos ... 32 3. METODOLOGIA ... 33
3.1 Infraestrutura utilizada no projeto ... 33
3.2 Análise Estatística dos Dados ... 33
3.3 Propostas Estruturais ... 33
4. RESULTADOS ... 34
4.1. Artigo I: Evaluating the Effects of the Adulterants in Milk using Direct-Infusion High-Resolution Mass Spectrometry... 34
4.2 Artigo II: Migration from Plastic Packaging into Meat ... 52
4.3 Artigo III: New Approach of QuEChERS and GC-MS Triple-Quadrupole for the Determination of Ethyl Carbamate content in Brazilian cachaças ... 62
5. DISCUSSÃO GERAL ... 80
6. CONCLUSÃO ... 82
7. REFERÊNCIAS ... 83
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, existe uma grande tendência no investimento em pesquisas capazes de realizar análises essenciais que garantam a qualidade e a segurança de alimentos. A avaliação e o desenvolvimento de métodos analíticos adequados para as necessidades de um país produtor como o Brasil, bem como a natureza dos seus produtos, requer dados confiáveis e assertivos sobre os alimentos comercializados ou potencialmente comercializáveis, tanto internamente quanto no exterior. O desenvolvimento de uma infraestrutura analítica eficiente garante à população alimentos nutritivos, com altos níveis de segurança em relação à contaminantes e, portanto, alimentos considerados de alta qualidade. Além disso, é possível evitar a rejeição de produtos que possuem potencial para exportação, visto que uma infraestrutura analítica eficiente possibilita a adequação com os mais altos padrões de qualidade internacionais.
Dessa forma, o uso de técnicas instrumentais rápidas, com alta precisão, exatidão, versatilidade e simplicidade operacional torna-se extremamente desejável dentro do escopo da análise de alimentos1,2. Nesse segmento, figuram com grande
destaque as técnicas baseadas em espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry). O desenvolvimento de novas fontes de ionização, as melhorias em analisadores (como por exemplo o aumento de sua sensibilidade e especificidade) e a criação de sistemas de aquisição de dados com grande rapidez qualitativa e quantitativa contribuíram para a aplicação da MS na análise de diversos compostos encontrados em alimentos3,4.
Neste cenário promissor, a MS tornou-se a principal ferramenta utilizada na metabolômica de alimentos. Com início no final dos anos 90, a análise do metaboloma e da impressão digital metabólica (metabolic fingerprinting) conquistaram grande aplicação em rotinas de análises de alimentos5,6. Agilidade na interpretação de dados e métodos simplificados para elucidação do perfil químico de amostras são características que trouxeram grande interesse na última década, tanto por parte da indústria quanto pela academia, visando incorporar e desenvolver essas metodologias em laboratórios especializados. Além disso, a exigência de estratégias analíticas altamente refinadas para garantir a qualidade de produtos que possuem composição nutricional superior fazem com que a plataforma metabolômica esteja em nível privilegiado, inclusive, nos próximos anos6,7.
1.2 Contaminantes em Alimentos
Os alimentos possuem uma composição complexa que engloba de maneira geral seus macronutrientes (proteínas, carboidratos e gorduras) e micronutrientes (vitaminas e minerais). No entanto, esta composição também pode ser uma fonte importante de compostos com potencial tóxico. Contaminantes podem ser definidos como qualquer substância indesejável presente nos alimentos, podendo ser classificados como fatores antinutricionais ou compostos naturalmente presentes na matriz de determinado alimento (p. ex.: oxalatos em espinafre); compostos adicionados intencionalmente ou acidentalmente (p. ex.: corpos estranhos, aditivos alimentares, pesticidas, medicamentos veterinários, componentes da embalagem) e, por fim, compostos originados durante o processamento (p. ex.: aminas aromáticas heterocíclicas, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, nitrosaminas, acrilamidas, carbamatos, entre outros)8.
A contaminação alimentar é um assunto de grande preocupação pois pode acarretar em diversos danos a saúde, o que resulta na aplicação de regulamentações rigorosas de seus níveis de concentração tanto pelo governo nacional quanto internacional, através da Comissão do Codex Alimentarius9. Este é um problema conhecido, que possui registro na história de mais de 8.000 anos atrás e, com o crescimento do agronegócio e da globalização, tornou-se recorrente em todo o mundo10. Além disso, a contaminação alimentar tornou-se mais grave nos últimos anos devido ao desenvolvimento da indústria e à consequente poluição ambiental, o que torna cada vez mais difícil proteger os consumidores destes possíveis eventos11.
A análise de contaminantes químicos relevantes é uma parte essencial dos programas de testes de segurança de alimentos para garantir a segurança do consumidor e a conformidade com os limites regulatórios. Técnicas analíticas modernas podem determinar contaminantes químicos conhecidos em matrizes alimentares complexas em níveis de concentração muito baixas. Além disso, eles também podem ser efetivos na descoberta e identificação de contaminantes químicos novos ou inesperados12,13. Desta forma, devido a importância global de se manter tanto a segurança quanto a qualidade alimentar temos que o desenvolvimento de novas técnicas analíticas responsáveis por auxiliar na identificação de contaminantes em alimentos, são cruciais para que estas substâncias sejam reguladas de maneira eficiente e concisa pelos órgãos reguladores.
1.3 Metabolômica em Alimentos
Durante o final do século 20 e o início do século 21, as metodologias clássicas de pesquisa biomédica abriram espaço para uma abordagem holística introduzida pela genômica, proteômica, transcriptômica e metabolômica, que incluíram novas estratégias analíticas com o objetivo de identificar e quantificar biomarcadores 14,15. De maneira geral, biomarcadores, ou marcadores químicos, são definidos como moléculas que traduzem uma característica; indicando um estado ou uma resposta que confere identidade às amostras analisadas, permitindo traçar correlações entre diferentes grupos15,16. Assim, a definição mais aceita de metabolômica é a de que este é um ramo
da ciência que trata da pesquisa e análise qualitativa e/ou quantitativa de todos os metabólitos de um sistema ou processo bioquímico17. Esses metabólitos são intrínsecos
ao nível de atividade bioquímica (ou fisiopatológica) desse organismo, via metabólica ou processo, facilitando sua correlação com o fenótipo ou resultado desenvolvido. A expansão da utilização de estratégias metabolômicas é salientada em estudos de diferentes áreas do conhecimento, como doenças humanas18, toxicologia 19, análise de
plantas 20, nutrição humana 21 e, mais recentemente, controle de qualidade e processo
22,23.
Atualmente a metabolômica em alimentos ocupa um lugar de destaque14,24, pois a preocupação em relação aos alimentos deixou de ser apenas relacionada com a prevenção de sua deterioração e extensão de sua vida de prateleira, enfocando hoje em dia a análise detalhada de seus macro e micronutrientes (água, carboidratos, proteínas, lipídios, vitaminas e sais minerais). Evidências crescentes demonstram que há uma estreita relação entre a dieta e algumas doenças, o que fornece grandes investimentos, tanto governamentais como particulares, para impulsionar as atividades de pesquisa relacionadas à metabolômica24,25. As propriedades médico-preventivas, além do valor nutricional dos constituintes naturais dos alimentos, de um lado, e os efeitos tóxicos de constituintes e contaminantes do outro, tornaram prioritário o conhecimento da total composição química dos alimentos através do emprego das mais diversas técnicas instrumentais, utilizando a ferramenta ômica25. Em diversos países, hoje não é mais
permitida a comercialização de alimentos sem que a sua composição seja do conhecimento do consumidor. Os benefícios decorrentes da redução de problemas relacionados à saúde, dos gastos com medicamentos e de atendimento hospitalar, aliados à maior produtividade de uma população sadia, retribuem os investimentos em pesquisas que visam proporcionar uma dieta adequada e saudável para a população.
Estes esforços requerem a busca por novas tecnologias para a análise de alimentos e, nesse contexto, a aplicação da ferramenta metabolômica vem trazendo diversos benefícios 24.
A metabolômica é didaticamente dividida em duas estratégias: análise de moléculas-alvo (“target analysis”) ou análise de identidade amostral (“metabolic fingerprinting”). Como os próprios nomes sugerem, na primeira deseja-se estabelecer o foco em uma via metabólica ou molécula em particular, onde métodos bastante específicos são desenvolvidos para essa finalidade. A segunda, por sua vez, tem por finalidade estabelecer uma “impressão digital” da amostra, baseando-se em sinais característicos de um grupo particular de moléculas/classes de compostos presentes na mesma, estabelecendo um “padrão químico”, muitas vezes mesmo sem a necessidade de quantificação e/ou elucidação estrutural26. Os compostos identificados através destas
estratégias metabolômicas podem ser validados e, posteriormente, utilizados como biomarcardores, também chamados de “compostos identificadores”, que conferem à amostra características importantes do ponto de vista de processamento, controle de qualidade, segurança e autenticidade de alimentos, sempre mediante à sua presença ou ausência27.
No Brasil há escassez de dados em pesquisa de metabolômica utilizada como ferramenta para o controle e rastreabilidade de alimentos28. A análise de constituintes e marcadores químicos presentes nos alimentos e seus efeitos metabólicos são desafiadores, uma vez que impactam diretamente nas pesquisas sobre nutrição e na forma como o alimento é introduzido na sociedade. Desta forma, o acompanhamento dos marcadores químicos associados aos alimentos desde a matéria-prima até o produto final, é essencial para garantir qualidade e segurança ao consumidor. O uso da análise metabolômica suportada por técnicas instrumentais rápidas com alta precisão, exatidão e versatilidade tornam-se indispensáveis na área de alimentos. As técnicas de MS ocuparam um papel de destaque na última década, pois preenchem tais requisitos28. Portanto, aliar a metabolômica à técnicas de MS torna-se uma tarefa de suma importância tecnológica e econômica para o campo de anáise de alimentos no Brasil.
1.4 Técnicas analíticas para determinação de substâncias em alimentos utilizando a Metabolômica
A maior parte dos contaminantes químicos conhecidos nos alimentos são pequenas moléculas orgânicas. Exceto para adulterantes de alto nível, eles estão
tipicamente presentes em alimentos em baixas concentrações (partes por milhão, bilhão ou trilhão). A análise de biomarcadores em matrizes alimentares se mostra tão desafiadora quanto as análises de amostras de fluidos biológicos e tecidos; visto que em ambos estão presentes peptídeos, aminoácidos, lipídeos, carboidratos, vitaminas, polifenóis, contaminantes e aditivos alimentares29. Na análise de alimentos, devido à sua complexidade, é comum a separação prévia dos analitos de interesse durante o preparo de amostras, através de protocolos de extração, sendo a mostra final geralmente analisada por técnicas cromatográficas. A grande ênfase dada ao preparo de amostras deve-se aos problemas relacionados ao tempo despendido nesse processo, ao grande consumo de reagentes e solventes e ao custo gerado30. O desenvolvimento do método
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) foi um avanço no preparo de amostras para a detecção de resíduos31. Esse método é utilizado eficientemente para a
limpeza e extração em amostras para a detecção tanto de pesticidas, quanto de outros contaminantes presentes em alimentos, como micotoxinas e fármacos32, 33.
1.4.1 Técnicas Cromatográficas
A cromatografia gasosa (GC, Gas Chromatography) acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) é uma importante ferramenta na análise de voláteis, principalmente quando associada aos métodos de clean-up de amostras como a extração em fase sólida, QuEChERs e uso dos probes para análise em tempo real 32,34. Embora o uso da cromatografia líquida (LC, Liquid Chromoatography) seja mais comum em estudos de ciências dos alimentos, sendo a junção LC-MS capaz de permitir a aplicação de procedimentos genéricos de preparo de amostra, extraindo grande quantidade de compostos com características físico-químicas distintas, a GC-MS apresenta-se como uma importante ferramenta na detecção de resíduos químicos em alimentos30.
1.4.2 Curva de Calibração e Adição de Padrão
Em química analítica, uma curva de calibração, também conhecida como curva padrão, é o método de escolha para determinação de uma substância específica em uma amostra desconhecida. O procedimento comumente utilizado envolve a comparação da amostra desconhecida com um conjunto de amostras padrão que possuem concentrações conhecidas para substância que se quer determinar35. Este tipo de abordagem é um dos
vários tipos que podem ser utilizados para o problema de calibração de instrumentos; outras abordagens incluem a utilização de um padrão interno ou realizar uma mistura de
padrão analítico diretamente à amostra desconhecida, sendo este ultimo método conhecido como adição de padrão ou spiking 36. Todas estas curvas são comumente empregadas para análise de compostos químicos em alimentos quando da sua determinação através de métodos cromatográficos, tais como LC ou GC.
No caso da metodologia de Adição de Padrão, quantidades conhecidas do analito padrão são adicionadas à amostra de concentração desconhecida e através do aumento do pico do cromatograma é possível deduzir quanto do analito havia na amostra originalmente desconhecida. Esta metodologia é especialmente apropriada quando a amostra em questão possui uma composição complexa, o que pode afetar a resposta analítica, gerando o efeito de matriz. Pode-se definir como matriz tudo que estiver presente em uma determinada amostra que for diferente do analito; desta forma, o efeito de matriz seria definido como uma alteração no sinal analítico causada por qualquer outro componente na amostra que não seja o analito 35. Este efeito é particularmente
comum no campo da análise de alimentos, visto que estes são considerados amostras complexas devido a sua composição ser extremamente variada, o que torna o emprego da curva de Adição de Padrão uma abordagem de destaque para determinação de substâncias em alimentos.
1.4.3 Espectrometria de Massas
A consolidação da MS como técnica de referência no âmbito da química analítica (quali e quantitativa) ocorreu nas décadas de 60 e 70. Porém, sua utilização em alimentos foi, por muito tempo, restrita por impedimentos tecnológicos. O emprego da MS atualmente é destaque na análise de marcadores químicos em alimentos de forma targeted e untargeted14. A identificação desses marcadores em metabolômica geralmente é feita por equipamentos com custo elevado. Entretanto, o ganho maior se baseia na grande quantidade de amostras que podem ser analisadas por dia ou por semana, tornando o uso desses equipamentos custo-efetivos16. Para a obtenção de informações completas sobre as características de cada amostra, diferentes métodos de ionização foram desenvolvidos ao longo dos anos43, como a ionização por elétrons (EI,
Electron Ionization) e a ionização por spray de elétrons (ESI, Electrospray Ionisation). As vantagens e desvanatgens das diferentes técnicas utilizadas para determinação de substâncias em alimentos utilizando a metabolômica estão resumida no Quadro 1.
Quadro 1. Comparação entre as diferentes tecnologias utilizadas em metabolômica. (Adaptado de Wishart, 200838).
Tecnologia Vantagens Desvantagens
Cromatografia Gasosa – Espectrometria de Massas (GC-MS)
Robustez Custo mediano
Quantitativo (com calibração)
Necessária pequena quantidade de amostra Alta sensibilidade
Ampla biblioteca para identificação de metabólitos
Detecta a maioria dos compostos orgânicos e alguns inorgânicos Excelente reprodutibilidade de separação de compostos
Amostra não recuperável
Necessita demaior preparo de amostra/derivatização Necessita de separação
Análise longa (20-30 min/amostra)
Não pode ser acoplada à técnicas de imageamento
Difícil identificação de novos compostos (uso de padrões)
Cromatografia Líquida – Espectrometria de Massas (LC-MS)
Excelente sensibilidade Versatilidade
Detecta a maioria dos compostos orgânicos e alguns inorgânicos Necessária pequena quantidade de amostra
Potencial para detecção de grande parte do metaboloma
Amostra não recuperável Instrumentação cara
Análise longa (20-30 min/amostra)
Baixa resolução de separação e reprodutibilidade (comparado a GC)
Menos robusto que a NMR e GC-MS
Limitada biblioteca para identificação de metabólitos
Difícil identificação de novos compostos (uso de padrões ou alta resolução) Espectrometria de massas (MS) Excelente sensibilidade Versatilidade Rapidez
Pode ser usado para imagem (MALDI-Imaging) e alta resolução (HRMS)
Diversos bancos de dados de metabólitos (p. ex.: HMDB, METLIN, LIPIDMAPS)
Identificação de compostos
Menor preparo de amostra/injeção direta
Potencial para detecção de grande parte do metaboloma Seletividade aliada ao experimento MS/MS
Amostra não recuperável Instrumentação cara
1.4.4. Ionização por Elétrons (EI)
A EI se caracteriza por ser um processo destrutivo, através da fragmentação das moléculas neutras presentes na amostra pela colisão com elétrons emitidos pela fonte de ionização. Essa técnica permite a análise de moléculas de baixa e média polaridade com faixa de massa abrangente39. No processo de ionização, um feixe de elétrons emitido pela fonte do equipamento colide com moléculas neutras presentes na amostra. A energia dos elétrons é transferida para as moléculas neutras durante a colisão, podendo exceder a energia de ionização, o que resulta na ionização por ejeção de elétrons. Além da ionização das moléculas neutras, durante o processo de transferência de energia podem ser gerados íons multiplamente carregados, íons rearranjados e fragmentos moleculares, entre outros, os quais em conjunto auxiliam na identificação e elaboração da proposta estrutural das moléculas em análise39, conforme representado a seguir:
ABC + 1e- → ABC+. + 2e- (ionização simples) ou ABC2+. + 3e- (ionização múltipla) ou
AC+ + B. + 2e- ou AC+. + B + 2e- (rearranjo/fragmentação)
Embora a EI tenha sido o primeiro método de ionização desenvolvido para espectrometria de massas no início do século 20, o uso dessa técnica ainda é relevante atualmente, principalmente quando combinada como fonte de ionização na GC-MS39,40.
1.4.5 Ionização por Spray de Elétrons (ESI)
O processo de ESI forma moléculas carregadas tanto positiva quanto negativamente (cátions e ânions, respectivamente), dependendo do tipo de solução na qual a amostra se encontra. Soluções ácidas favorecem a formação de cátions e soluções básicas, ânions; em ambos os casos, os íons são formados em solução.
Na Figura 1 encontra-se o processo de ionização por spray de elétrons. Observa-se que a solução injetada no equipamento é submetida a um spray eletrolítico que oxida os íons negativos, deixando as gotas produzidas no spray com excesso de íons positivos, pois neste caso trata-se do modo de análise ESI positivo. Este feixe de íons gerado é colimado, originando o “Cone de Taylor”. No caso do modo de análise ESI negativo, ocorre o processo inverso, pois através da redução dos íons positivos da solução, são geradas gotas com excesso de íons negativos.
Através de uma corrente contrária de nitrogênio, o solvente começa a ser evaporado e o volume das gotas começa a ser gradativamente reduzido. Ocorre então a repulsão crescente entre íons de mesma carga, com possível subdivisão das gotas até um
limiar no qual ocorre uma explosão coulômbica (coulomb explosion): formação de uma pluma de cátions isolados em fase gasosa. Desta maneira, estes íons eventualmente transferidos para a fase gasosa através deste processo brando e eficaz, denominado dessolvatação, podem ser selecionados e analisados por MS3. O método de ionização por ESI possui dentre suas vantagens o amplo espectro de massa e de polaridade de moléculas passíveis de ionização41.
Figura 1. Processo de processo de ionização por spray de elétrons. (adaptado de Cech & Christie, 200142).
1.4.6 Tandem MS (MS/MS)
O desenvolvimento de novos analisadores e as melhorias nas técnicas e controle de reações de fragmentação molecular (MSn) permitiram a aplicação da MS altamente específica para elucidação estrutural de compostos, ampliando ainda mais seu leque na área de alimentos. Assim, segmentos como segurança alimentar e toxicologia de alimentos são desafios potencialmente auxiliados por meio desse desenvolvimento tecnológico.
A técnica de espectrometria de massas em modo tandem, também chamada de MS/MS ou ainda MS2, utiliza dois ou mais analisadores de massas em sequência, logo
após a fonte de ionização. Os íons precursores são selecionados primeiro por um analisador de massas e focados na região de colisão, na qual sofrem nova fragmentação,
originando produtos iônicos que serão, então, caracterizados por um segundo analisador de massas43. Um dos equipamentos de MS/MS mais comuns é o do tipo triplo quadrupolo (QqQ), onde as moléculas são selecionadas pelo primeiro analisador de massas (quadrupolo, Q1), dissociadas por Dissociação Induzida por Colisão (CID, Collision-Induced Dissociation) no segundo quadrupolo ou câmera de colisão hexapolar (q), e por fim os fragmentos são analisados no último quadrupolo (Q2).
A LC e a GC são as técnicas de separação comumente acopladas à MS/MS, sendo utilizadas para separar os compostos, ionizá-los e introduzi-los no primeiro analisador de massas44,45. A grande vantagem do uso de MS/MS é o fato de ser uma
técnica confirmatória, pois cada pico/sinal pode ser verificado através de seu espectro de massas obtidos nos diferentes modos de operação. Portanto, é uma técnica altamente indicada para a análise e quantificação de moléculas presentes em baixas concentrações em matrizes complexas, como alimentos46.
1.4.7 Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM, Multiple Reaction Monitoring) O Monitoramento Seletivo de Reações (SRM, Selected Reaction Monitoring) ou MRM e uma técnica de fragmentação molecular utilizada em MS que permite o monitoramento de reações específicas por CID. A natureza destas reações dependem tanto da estrutura molecular quanto da massa de determinado íon47. Como resultado, melhorias significantes na seletividade analítica podem ser alcançadas utilizando o método MRM, pois esta ferramenta oferece alta sensibilidade aliada à análises custo-efetivas para quantificação simultânea de diversos compostos em um único experimento48.
A implementação de um experimento de MRM convencional envolve o uso de um espectrômetro de massas com QqQ. O funcionamento detalhado deste tipo de equipamento envolve um primeiro analisador (Q1) capaz de selecionar íons de uma determinada razão massa-carga (m/z), correspondente ao íon intacto de um analito alvo; esses íons são denominados íons precursores. O íon precursor é submetido a uma reação por CID na célula de colisão (q), que na presença de um gás inerte e pressão apropriada gera fragmentos iônicos do analito alvo. Os fragmentos com maior intensidade e especificidade podem ser selecionados para também serem analisados, porém em um segundo analisador (Q2). Este íons finalmente chegam no detector do equipamento e os sinais detectados são gravados como um cromatograma iônico para o par de íons precursor-fragmento49. Desta forma, o sistema QqQ permite uma análise rápida e
específica do analito alvo, características que podem ser amplificadas quando se combina esta técnica com cromatografia, sendo a GC a combinação mais comum para análise de alimentos46.
1.4.8 Espectrometria de Massas de Alta Resolução
Dada a complexidade das matrizes alimentares, uma resolução de massa limitada leva à resultados imprecisos. Sistemas de espectrometria de massas com tecnologia Orbitrap alcançam rotineiramente resolução de até 1.000.000 FWHM com precisão < 1 ppm. Os altos valores de resolução desses equipamentos têm como objetivo a alta exatidão na determinação de moléculas complexas. Além da alta resolução e exatidão, a técnica diferencia-se por fornecer informações que atuam na elucidação estrutural de moléculas desconhecidas, sendo possível atribuir fórmulas moleculares (CcHhNnOoSs)
inequivocamente para medidas de baixa massa molar (< 450 Da) utilizando o princípio de massas exatas e defeitos de massas37,50.
1.5 Produtos Alimentícios 1.5.1 Leite
O leite é um alimento extremamente complexo. Parte de seus componentes é produzida pelas células secretoras da glândula mamária dos animais mamíferos e outra porção é oriunda da corrente sanguínea dos mesmos. O fluido secretado pelas fêmeas dos mamíferos, cuja principal função é fornecer os requerimentos nutricionais de seus filhotes, deve suprir as suas necessidades energéticas (lipídios e carboidratos), proteicas (aminoácidos), vitamínicas e de minerais. A ordenha ininterrupta de bovinos saudáveis apresenta em média 3,7% de gordura, 3,4% de proteína, 4,8% de lactose, 0,7% de cinzas e 12,7% de sólidos totais51. Segundo o USDA (United States Department of Agriculture), a produção brasileira de leite terá um crescimento de 1,8% para o ano de 2018, atingindo 23,98 milhões de toneladas de leite, sendo que um terço dessa produção é destinada para o mercado interno52.
Os lipídios do leite, comumente chamados de gordura, formam uma emulsão com a fração aquosa do leite. Os triglicerídeos representam a maior fração dos lipídios presentes no leite de bovinos, aproximadamente 98%. Diglicerídeos, monoglicerídeos, ácidos graxos, fosfolipídios e colesterol também estão presentes em menor quantidade. A lactose, um dissacarídeo formado por uma molécula de galactose e uma de glicose, é o principal carboidrato do leite. As proteínas do leite estão distribuídas em duas frações
distintas: caseínas e proteínas do soro. A caseína corresponde a 80% do total proteico no leite bovino, e pode ser subdividida em quatro frações principais, s1, s2, e -caseína, que se agrupam na forma de micelas. As proteínas do soro apresentam formato globular, sendo que as principais encontradas no leite bovino são: lactoglobulina, -lactoalbumina, albumina do soro sanguíneo e imunoglobulinas.
O leite bovino também possui uma quantidade significativa de minerais, dos quais se destacam o cálcio, o fosfato e o citrato, além de vitaminas dos complexos A e B53. Também apresenta em sua constituição diversas enzimas naturais. Entre elas
destacam-se a fosfatase alcalina e a lactoperoxidase por serem marcadores de um adequado processamento térmico. O ponto de inativação da fosfatase alcalina (binômio tempo-temperatura) é similar ao requerido para a destruição dos microorganismos patogênicos mais resistentes ao tratamento, sendo assim, sua inativação garante um produto inócuo para o consumidor. A lactoperoxidase é uma das enzimas mais termorresistentes encontradas no leite e sua inativação é usada como marcador de utilização de temperaturas mais elevadas em processos de pasteurização53,54.
Designado para a completa nutrição de bezerros em fase de crescimento, o leite bovino também é um meio adequado para o crescimento acelerado de ampla variedade de microorganismos. A abundância de carboidratos, proteínas e gorduras combinados com o pH próximo da neutralidade favorecem o desenvolvimento da flora microbiana55. Diversos fatores afetam a qualidade final do leite. Os fatores intrínsecos incluem a raça do animal, o período de lactação, o número de parições, e a dieta oferecida à vaca. Os fatores extrínsecos, por sua vez, são aqueles capazes de afetar a qualidade do produto após sua produção, como por exemplo, o manejo e a higiene da ordenha, a velocidade e a temperatura de resfriamento, o transporte e o armazenamento do leite antes do seu processamento.
As raças mais comumente utilizadas para a produção de leite no mundo são: Holandesa preta e branca, Holandesa marrom e branca, Ayrshire, Guernsey e Jersey56. Esses animais são da espécie Bos taurus de alta produção, entretanto, por terem sido selecionados na Europa, estão totalmente adaptados ao clima frio da região57. No Brasil,
devido ao clima quente estes animais sofrem um stress térmico extremamente acentuado58. Segundo West, Mullinix & Bernard59, os aumentos da temperatura
ambiente, da umidade relativa do ar e da temperatura do animal estão relacionados à diminuição do consumo de matéria seca pelos animais e consequente diminuição da produção de leite. Visando amenizar o efeito da temperatura no plantel produtor de leite
é muito comum a utilização de raças adaptadas ao clima quente. No Brasil, utiliza-se o gado Zebu (Bos indicus) isolado, principalmente a raça Gir, ou o cruzamento com a raça Holandesa, resultando no Girolando60.
A lactação é um processo totalmente dependente da produção hormonal do animal. Sendo assim, os animais sexualmente maduros são os aptos à produção de leite. Khan & Shook61 relatam que animais mais velhos tendem a apresentar uma maior produção em todas as lactações, contudo este efeito tende a diminuir com o avanço das lactações. A alimentação do animal também interfere na produção de leite. A baixa ingestão de matéria seca e a baixa ingestão energética diminui a produção de leite62. A
forma de apresentar a ração para os animais também altera a produção de leite63. Isto se
deve ao fato do animal necessitar ingerir uma dieta balanceada. Contudo, alimentos energéticos, ricos em gordura (silagem), são muito mais palatáveis que aqueles ricos em fibras (capim). Quando estes são apresentados separadamente, os animais aumentam a ingestão de silagem e diminuem a ingestão de fibras, tornando suas dietas desbalanceadas. Sistemas que misturam os ingredientes da dieta antes de apresentá-la no cocho, conhecidas como Total Mixed Ration (TMR), e que, consequentemente, dificultam a separação de seus componentes pelos animais são os mais adequados para animais de alta produção64.
Com relação a qualidade do leite comercializado no país melhorar a qualidade e a segurança do leite ao longo de todo o sistema produtivo é a proposta de um recente edital lançado pela Secretaria de Desenvolvimento Agropecuário e Cooperativismo do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (SDC/Mapa). Esta tem como objetivo principal assessorar e capacitar os produtores rurais na estruturação das unidades de produção, especialmente na implementação de boas práticas agropecuárias65. Dentro das boas práticas agropecuárias estão incluídos o controle permanente da qualidade da água da propriedade rural, o registro e o acompanhamento de dados e dos procedimentos realizados na propriedade, o adequado armazenamento e transporte de matérias-primas, insumos e alimentos, a garantia da rastreabilidade dos animais e dos produtos originados na propriedade, a higiene e os procedimentos adequados de ordenha e pós-ordenha, a higiene, a limpeza, a manutenção e o dimensionamento adequados dos equipamentos de ordenha e de refrigeração do leite, a identificação, o registro e a segregação de animais sob tratamento veterinário ou pastagens sob uso de agrotóxicos, o manejo adequado de bezerras na propriedade rural, entre outros itens65.
Desta forma nota-se que o leite é um alimento que requer uma série de cuidados durante o seu processamento, sendo um dos alimentos amplamente comercializados tanto no Brasil quanto no mundo. Devido aos avanços da tecnologia o custo de sua produção tem aumentado, o que o torna alvo de possíveis adulterações. A autenticidade de alimentos é um aspecto importante para os consumidores, pois além de ser sinônimo de qualidade, envolve a confiabilidade no que está sendo comprado. Alguns atributos estão diretamente ligados à autenticidade de alimentos, como por exemplo: genética, origem geográfica, tratamentos de colheita e pós-colheita, condições de processamento e outros ingredientes que podem ser funcionais para a qualidade1. Atualmente, os
consumidores estão cada vez mais exigentes quanto às informações, segurança da origem e conteúdo dos seus alimentos. Além disso, os fabricantes de alimentos buscam fornecer e confirmar a autenticidade e denominação de origem dos componentes de seus produtos alimentícios, uma vez que esta é uma maneira de agregar valor aos produtos finais, além de atestar sua qualidade.
Determinar a autenticidade de alimentos pode impedir a falsa descrição, a substituição por ingredientes mais baratos, e a adulteração, bem como a rotulagem de origem incorreta. As agências reguladoras estão desenvolvendo normas legais e políticas para determinar formas de identificar e marcar os alimentos utilizando terminologia adequada. Por exemplo, regulamentações na União Européia66,67 fornecem rotulagem de Denominação de Origem Protegida (DOP), Indicação Geográfica Protegida (IGP) e Especialidade Tradicional Garantida (ETG), visando garantir a autenticidade de produto regionais e alimentos especiais. Essas leis, impostas na União Européia garantem que apenas os produtos genuinamente originários dessa região podem ser vendidos como tal, eliminando a concorrência desleal e produtos enganosos que podem ser de qualidade inferior ou feito de componentes diferentes.
No caso da certificação do leite no Brasil, com o incentivo do novo edital de boas práticas agropecuárias proposto pela SDC/Mapa65 já existem pecuaristas que receberam certificação de qualidade no estado de Minas Gerais, e a tendência é que esta informação se multiplique com o passar do tempo. Desta forma, nota-se a importância da garantia da qualidade para alimentos como o leite. Outro ponto importante seria o caso de adulterações, que no caso do leite visam sempre extender a sua vida de prateleira, controlando o desenvolvimento microbiológico e reduzindo a oxidação de componentes. Os adulterantes mais comumente utilizados para este fim são o peróxido de hidrogênio, formoldeído, hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio68,69. Neste ponto,
a MS apresenta-se mais uma vez como uma grande ferramenta de análise na identificação de possíveis adulterações de produtos alimentícios70,71, pois é uma técnica bastante sensível e versátil, que deve ser considerada para utilização com tais fins.
1.5.2 Carne
O Brasil ocupa um dos primeiros lugares em produção agrícola e pecuária no mundo. A pecuária é uma atividade econômica desenvolvida em áreas rurais que consiste na criação de animais com o objetivo de comercializá-los, suprindo assim as necessidades tanto da família como do criador. Fundamentalmente, a atividade em foco é ligada à criação de gado (bovinos), embora seja considerada também a produção de suínos, aves, equinos, ovinos e bufalinos. Esse ramo tem como responsabilidade principal disponibilizar para o mercado alimentos como carne, leite e ovos, produtos base da dieta humana. Além da carne, no caso dos bovinos são extraídas outras matérias-primas como o couro (produção de calçados), a pele (vestuário) e os ossos (produção de botões).
A pecuária exerce uma grande relevância nas exportações brasileiras, além de abastecer o mercado interno. Cerca de 20% da área do país (174 milhões de hectares) está atualmente ocupada por pastagens, sendo que a maior parte do rebanho de 215 milhões de cabeças é criada a pasto (estima-se que somente 3% do rebanho esteja em sistema intensivo)72. A década de 2000 foi marcada pela consolidação do Brasil como potência na produção e exportação de carne bovina, sendo que o Brasil assumiu a primeira colocação dentre os exportadores em 200473.
Entre as diversas raças bovinas existentes no Brasil a comumente utilizada é a raça nelore; uma das raças zebuínas. 80% do gado brasileiro é zebuíno (proveniente da Índia), os outros 20% são de raças européias. O nelore provou ser o melhor gado para o Brasil graças a sua adaptabilidade ao clima tropical do país. As raças europeias se adaptam melhor à região sul e são utilizadas para o que se chama de “cruzamento industrial”, isto é, cruzamento de gado zebu com gado europeu. Com relação à segurança da carne comercializada atualmente, os consumidores não estão mais interessados apenas em aspectos sensoriais, como por exemplo sabor, odor e textura. Existe agora uma preocupação com relação aos constituintes dos alimentos, visando principalmente à manutenção da saúde e qualidade de vida do consumidor. Devido a isso, a segurança alimentar é agora uma preocupação primordial na indústria de alimentos, e em particular na indústria de carne.
A embalagens de alimentos é uma forma importante para armazenar alimentos em diferentes temperaturas, prolongando a vida de prateleira do produto e protegendo os alimentos de agentes naturais (p. ex. o ar) que podem reduzir ou alterar a sua qualidade. Dentre diversos materiais, os plásticos têm surgido como uma solução prática, segura e confortável para embalagens de alimentos. Existem diferentes tipos de plástico, cada um com propriedades únicas e diferentes aplicações no setor de alimentos como, por exemplo, o policarbonato de alta densidade e o polietileno de baixa densidade, copolímeros de estireno, polipropileno, entre outros. Estes plásticos são fabricados a partir de vários polímeros e os aditivos são utilizados para alterar sua elasticidade, flexibilidade, cor, resistência e durabilidade. Tanto o plástico quanto os seus aditivos podem migrar a partir da embalagem para a comida ou bebida acondicionada ao longo do tempo, como resultado de um aumento na temperatura ou de algum choque mecânico74. A presença de componentes de plástico ou de aditivos nos
alimentos, se não for devidamente controlada, pode afetar as propriedades organolépticas dos alimentos e até mesmo produzir efeitos de desregulação endócrina75,
se os níveis excedem os valores legais ou toxicológicos. Muitos plastificantes e aditivos são considerados desreguladores endócrinos, e por isso podem afetar o sistema reprodutivo ou até mesmo agir como agentes cancerígenos. Alguns destes produtos químicos são os ésteres de ftalato, alquilfenóis, bisfenóis, entre outros74.
A União Europeia regulamenta que materiais em contato direto com alimentos não devem ser capazes de ceder os seus constituintes aos alimentos em quantidades que possam colocar em risco a saúde humana ou provocar uma alteração inaceitável da composição, ou deterioração das características organolépticas do alimento embalado76. Os materiais plásticos são especificamente regulamentados por uma comissão que estabelece uma lista positiva de substâncias, incluindo todos os monômeros, outras substâncias e aditivos que podem ser utilizados para a fabricação de embalagens plásticas, bem como as restrições para os níveis de migração desses produtos químicos em alimentos77. O uso de substâncias não incluídas na lista é proibido78. No Brasil
também existe este rígido controle pois recentemente a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) atualizou a norma brasileira que trata de embalagens plásticas, seguindo os mesmos requisitos apontados anteriormente, com o intuito de aumentar a segurança dos alimentos embalados no país79.
A carne bovina é amplamente comercializada e consumida no Brasil e nota-se que a maioria dos cortes apresentam-se em embalagens plásticas. Com o intuito de
verificar a segurança destas embalagens e se há passagem de algum de seus componentes para a carne a MS apresenta-se como uma grande ferramenta de análise, que pode oferecer resultados rápidos e eficientes, sendo uma técnica bastante versátil para análise de alimentos22,32,70,80.
1.5.3 Cachaça
A cachaça é uma bebida típica brasileira, sendo esta a denominação exclusiva de destilados de cana de açúcar produzidos no Brasil. As suas principais características são apresentar gradação alcoólica de 38% – 48% a uma temperatura de 20 ºC e ser obtida da destilação do mosto de cana de açúcar fermentado81. O processo de fabricação da
cachaça não é padronizado em vários aspectos. O primeiro seria a matéria-prima utilizada, neste caso a cana de açúcar, pois existem diversos tipos diferentes porém similares em sua composição82. Além disso, grãos como milho ou arroz também podem
ser incluídos no mosto com o objetivo de fornecer nutrientes para melhorar o desenvolvimento das cepas responsáveis pela fermentação83. Finalmente, o equipamento
utilizado pode ser proveniente de diversos tipos de materiais, pois a destilação pode ser realizada, por exemplo, em colunas de aço inox (no caso de processos industriais) e em alambiques de cobre (no caso da produçao artesanal)82.
O processo de maturação em barris de madeira é semelhante ao aplicado na produção de vinho, onde barris de carvalho, bálsamo, jequitibá, jatobá ou amburana podem ser empregados. Este último processo é opcional e é capaz de fornecer aromas, sabores e coloração da madeira para a cachaça84. Entretanto, com relação aos aspectos organolépticos, a cachaça deve preencher alguns parâmetros químicos que asseguram que o consumo moderado do produto não seja capaz de acarretar riscos para a saúde. Contaminantes como metanol, sec-butanol, n-butanol, cobre, etil carbamato, assim como o ácido acético, um composto de off-flavor responsável pela acidez característica da cachaça, são espécies chave diretamente relacionadas com o comprometimento da qualidade do destilado final82,85,86.
De acordo com uma avaliação da IARC (International Agency for Research on Cancer) de 2007, o etil carbamato é considerado carcinogênico para animais de laboratório e por isso foi listado como uma substância potencialmente carcinogênica para humanos, pertencendo ao Grupo 2A da Classificação de Substâncias Carcinogênicas87,88. Este composto é um etil éster do ácido carbâmico que é formado
precursores, como por exemplo ácido hidrociânico, uréia, citrulina, e N-carbamil através de reação com etanol88. Devido a esta característica, é fácil encontrar este composto em diversos tipos de comidas e bebidas como destilados, vinho, cerveja, pão, shoyu e iogurte89. O consumo de etil carbamato apenas de fontes alimentícias é insignificante. Entretanto, incluindo o consumo de bebidas alcoólicas regularmente, a exposição a este composto aumenta. Atualmente, a cachaça figura como a terceira bebida destilada mais consumida no mundo, e no Brasil é a segunda bebida alcoólica mais consumida, depois da cerveja90. Dado o seu amplo consumo, devem ser tomadas medidas em relação à
redução da concentração de etil carbamato nas bebidas alcoólicas. O Canadá, através do Health and Welfare Department em 1985, foi o primeiro país a determinar os limites de concentração de etil carbamato em vinhos, destilados, destilados de frutas e licores. Por isso, tornou-se referência para os Estados Unidos e União Européia quanto à legislação sobre o assunto91. Em 1990, o FDA publicou uma nota limitando o teor de etil
carbamato nos uísques americanos para 125 µg L-1 92. Segundo o Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o limite para esse contaminante em cachaças no Braisl é 150 µg L-1 81. A importância do controle dos níveis de etil carbamato, portanto, deve ser entendida como uma questão não apenas sobre aspectos relacionados à saúde e segurança, mas também econômicos, pois qualquer resultado fora de especificação pode representar uma barreira à exportação de cachaça para o mercado internacional.
Muitos métodos diferentes utilizando MS foram desenvolvidos nos últimos anos, sendo capazes de avaliar uma grande variedade de parâmetros de qualidade da cachaça93,94,95, assim como muitos protocolos para análise e extração do etil carbamato88. O uso da GC-MS com quadrupolo único é a técnica amplamente utilizada para análise deste contaminante, de forma que esta é capaz de promover com grande eficiência tanto a identificação quanto a quantificação de amostras de alimentos e bebidas alcoólicas88. Entretanto, existe um procedimento comum de adição de açúcar à cachaça com o intuito de reduzir o sabor alcoólico desta bebida, padronizando o seu sabor, melhorando a qualidade sensorial final. No caso da cachaça, a legislação brasileira permite a adição de até 6 g L-1 de sacarose, como procedimento de
padronização do sabor. Não obstante, se no rótulo estiver descrito “adoçado”, o produto final pode conter até 30 g L-1 de sacarose em sua composição96. Como a GC-MS é a
técnica de escolha para o controle de qualidade da cachaça, um alto conteúdo de sacarose pode facilmente contaminar o percurso interno do fluxo do GC, acarretando numa maior frequência de manutenções de equipamento, além de comprometer a
precisão dos resultados. Neste caso, o desenvolvimento de uma nova metodologia capaz de lidar com as quantidades excessivas de sacarose presentes na cachaça, mantendo a precisão e exatidão da análise torna-se necessário.
Relacionado com o preparo de amostra, carbamatos usualmente estão presentes em concentrações muito baixas e em matrizes complexas, como o caso das amostras de cachaça. Por causa disto, sua análise não pode ser realizada sem alguns tratamentos preliminares de amostras. Um procedimento de preparação de amostras deve fornecer a concentração de analitos e também a sua limpeza, melhorando assim a determinação do analito de interesse. Recentemente, a busca por métodos miniaturizados que são eficientes e não utilizam grandes quantidades de reagentes e solventes faz com que a melhoria dos métodos de extração esteja em foco. Assim, diferentes procedimentos de microextração foram desenvolvidos como alternativas, como a metodologia QuEChERS, que tem sido amplamente utilizada no pré-tratamento de amostras complexas. Esta técnica baseia-se num método de dois passos onde é primeiro realizado a extração, baseada no particionamento que ocorre através do fenômeno de salting-out, responsável pelo equilíbrio entre as camadas aquosa e orgânica. O segundo passo é uma extração dispersiva em fase sólida, que envolve a limpeza da amostra usando combinações de diferentes tipos de sais sorventes ou aminas primárias-secundárias com o objetivo de remover quaiquer substâncias interferentes 97,98.
Finalmente, nesta tese apresentamos uma nova metodologia para aplicação de QuEChERS, baseada unicamente na extração salting-out, como uma maneira de eliminar resíduos de açúcar e água de amostras de cachaça (artesanal e comercial), o que foi corroborado através de experimentos utilizando LC, sem comprometimento da identificação e quantificação do etil carbamato. Adicionalmente, realizamos a comparação desta nova metodologia com a atualmente empregada na análise do etil carbamato.
2. OBJETIVOS
O estudo dos diferentes produtos alimentícios apresentados (leite, carne e cachaça) abrange grande parte de processos presentes em atividades de grande importância no país. Desta forma, os objetivos principais deste trabalhao foram:
- Propor novas metodologias de análise de produtos alimentícios utilizando a plataforma metabolômica em conjunto com novas técnicas de Espectrometria de Massas com ionização por spray de elétrons (ESI-MS) e Cromatografia a Gás acoplada à Espectrometria de Massas (GC-MS);
- Minimizar ou eliminar o preparo de amostras nas análises destes produtos, diminuindo custos, tempo e principalmente o consumo de solventes orgânicos, adequando-se aos parâmetros de química verde.
2.1 Objetivos Específicos
Desenvolver novas metodologias analíticas para:
- Verificar parâmetros de qualidade do leite através do estudo da interação entre adulterantes (formol, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio e hipoclorito de sódio) com os componentes nutricionais do leite;
- Verificar o fenômeno de migração de componentes advindos da embalagem de carne vermelha embalada a vácuo;
- Identificar e quantificar o etil carbamato em amostras de cachaças (comerciais e artesanais) eliminando a interferência da sacarose na análise.
3. METODOLOGIA
As metodologias específicas para cada uma das frentes estudadas nesta tese serão abordadas em detalhes nos artigos apresentados na seção 4. Resultados.
3.1 Infraestrutura utilizada no projeto
O projeto foi desenvolvido no Laboratório Innovare de Biomarcadores, inserido na Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). A coordenação do Laboratório e do projeto está a cargo do professor Dr. Rodrigo Ramos Catharino, que possui ampla experiência em Análise de Alimentos. O grupo tem desenvolvido pesquisas de alta qualidade, com cunho relevante na busca de aplicações inovadoras em áreas como ciência de alimentos e ciências da vida. Os equipamentos utilizados no desenvolvimento desse projeto de pesquisa foram:
- Cromatógrafo a Gás Agilent GC-MS 7890/7000, com fonte de ionização EI, e analisador triplo quadrupolo (QqQ). Equipamento equipado com injetor automático, o que faciltou o desenvolvimento da metodologia .
- Espectrômetro de Massas ESI-LTQ-XL Orbitrap Discovery, Thermo Scientific: com fonte de ionização ESI, analisadores quadrupolo e armadilha iônica linear (linear ion trap - LTQ) associado a um analisador Orbitrap de alta resolução (30.000 FWHM) e precisão < 5 ppm, o que faciltou na identificação de compostos por meio do uso de banco de dados.
3.2 Análise Estatística de Dados
O emprego de análises multivariadas como a Análise de Componente Principal (PCA, Principal Component Analysis), a Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA, Partial Least-Squares Discriminant Analysis) ou de suas variantes estão comumente presentes para a classificação de amostras29. A análise multivariada foi realizada utilizando o sistema web MetaboAnalyst 3.099. Com o auxílio da análise de componentes pretende-se observar as principais diferenças entre as amostras (antes e após tratamento) visando a descoberta marcadores relacionados aos contaminantesde alimentos.
3.3 Propostas Estruturais
A identificação dos marcadores químicos foi realizada através da comparação entre as razões m/z em alta resolução e consulta de bancos de dados (NIST e METLIN).
4. RESULTADOS
A seguir estão apresentados os trabalhos desenvolvidos durante este doutorado, demonstrando a execução e discussões de cada umas das frentes anteriormente apresentadas.
4.3 ARTIGO I
Evaluating the Effects of the Adulterants in Milk using Direct-Infusion High-Resolution Mass Spectrometry100
Tatiane Melina Guerreiro1, Diogo Noin de Oliveira1, Carlos Fernando Odir
Rodrigues Melo1,Estela de Oliveira Lima1, Marta Ribeiro da Silva1 and Rodrigo Ramos Catharino1*
1 Innovare Biomarkers Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, University of
Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.
*Correspondence: Rodrigo Ramos Catharino (rrc@g.unicamp.br)
Abstract
Milk is an extremely complex food, capable of providing essential nutrients as well as being an important source of energy, and high-quality proteins and fats. Due to advances in technology, and to meet the increasing demand, production costs have increased, turning milk into a target of adulterations. Routine methods usually applied to certify the quality of the milk are restricted to microbiological tests, and assays that attest the nutritional composition within the expected values. However, potentially harmful byproducts generated by adulterating substances in general are not detected through these methodologies. In this contribution, we simulated the adulteration of freshly produced milk samples with four adulterants whose use already had reported for extended shelf life: formaldehyde, hydrogen peroxide, sodium hydroxide, and sodium hypochlorite. These samples were submitted to direct-infusion high-resolution mass spectrometry analysis and multivariate statistical analysis. This approach allows the characterization of a series of molecules modified by the adulterants, whatdemonstrates how these species affect the nutritious characteristics of this product.
