Vera Helena Vidal Dias
ATIVIDADE DA ENZIMA DE BIOTRANSFORMAÇÃO URIDINA
DIFOSFATO GLICURONOSILTRANSFERASE (UGT) EM
Chelonia mydas
(LINNAEUS, 1758)
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de mestre em Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Afonso Celso Dias Bainy
Florianópolis 2020
Dias, Vera Helena Vidal
Atividade da Enzima de Biotransformação Uridina
Difosfato Glicuronosiltransferase (UGT) em Chelonia mydas (Linnaeus, 1758) / Vera Helena Vidal Dias ; orientador, Afonso Celso Dias Bainy, 2020.
152 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2020.
Inclui referências.
1. Bioquímica. 2. Biomarcadores. 3. Biomonitoramento ambiental. 4. Sistema de Biotransformação. I. Celso Dias Bainy, Afonso . II. Universidade Federal de Santa
Vera Helena Vidal Dias
Atividade da enzima de biotransformação uridina difosfato glicuronosiltransferase (UGT) em Chelonia mydas (Linnaeus, 1758)
O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Alcir Luiz Dafre, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Profa. Maria Risoleta Freire Marques, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de mestre em Bioquímica.
____________________________ Profa. Ariane Zamoner Pacheco de Souza, Dra.
Coordenadora do Programa
____________________________ Prof. Afonso Celso Dias Bainy, Dr.
Orientador
Florianópolis 2020
Documento assinado digitalmente Afonso Celso Dias Bainy Data: 08/04/2020 18:41:37-0300 CPF: 450.235.570-49
Documento assinado digitalmente Ariane Zamoner
Data: 14/04/2020 06:26:46-0300 CPF: 019.637.269-01
Dedico este trabalho a todas/os aquelas/es que lutam pela conservação da biodiversidade.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus pela fé que mantém a esperança de dias melhores, mesmo diante de situações delicadas, e a confiança de que é possível realizarmos os sonhos por mais distantes que eles pareçam da realidade.
Quero agradecer também à minha família pelo apoio sempre presente, tão essencial e imprescindível. Agradeço por toda educação repleta de amor, pelos conselhos, carinhos, por serem meu porto seguro e por me fazerem acreditar nos meus potenciais. Amo vocês, mãe, mana, pai, vó e vô!
Agradeço, com muito amor, ao Renan. Meu companheiro de vivências, escolhas e aprendizados. Gratidão pelas nossas conversas, pelo seu apoio e cuidado, pelos lanchinhos separados para os intervalos nos dias de experimentos, pelos bolos deliciosos, sambas e risadas. É muito bom poder partilhar a vida com você.
Agradeço ao meu orientador professor Dr. Afonso Bainy pelas oportunidades de crescimento profissional ofertadas, confiança e ensinamentos. Meus agradecimentos também são destinados aos demais professores coordenadores do Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica (LABCAI), à professora Dra. Maria Risoleta Freire Marques e ao professor Dr. Guilherme Razzera por todo o apoio dispensado quando necessário.
A minha gratidão aos meus professores e professoras! Desde àquelas/es do ensino fundamental, como a profa. Andréia (ou “Déia” como a chamávamos), responsável pela minha alfabetização, e o meu primeiro prof. de Ciências, chamado Marcos. Passando pelas/os professoras/es do ensino médio, como a profª. Dra. Sirlei de Fátima Albino, responsável pelos meus primeiros passos na iniciação científica, e os meus primeiros orientadores, prof. Dr. Luiz Álvaro Monteiro Júnior e profª. Ma. Maria Amélia Pellizzetti. Chegando ao ensino superior, a todas as queridas professoras e aos queridos professores da Universidade de Coimbra (PT) e Universidade Federal de Santa Catarina. Ficam aqui meus agradecimentos a todos esses mestres na obra de amor que é o ato de educar.
Ao técnico Me. Jacó Joaquim Mattos fica um agradecimento especial. Jacó te agradeço pelos vastos ensinamentos compartilhados na área da bioquímica, agradeço seu aconselhamento científico, sua amizade. Você me ajuda a pensar fora da curva, faz-me vislumbrar novas possibilidades, ampliando minha esfera de pensamento. Agradeço muito a você, levarei muito do que aprendi contigo para a vida!
A todos os queridos “labcaianos” fica minha gratidão aos muitos aprendizados e momentos compartilhados intensamente com vocês nesses últimos três anos. Agradeço a Ba e a Dai por todo apoio e ajuda diante das minhas várias perguntas e inquietações, caça de amostras no freezer, processos de compras de reagentes e demais burocracias. Agradeço a Camis pelas contribuições e parceria em muitos dos ensaios enzimáticos realizados, pelas conversas, músicas e conselhos. Agradeço ao Clei pelos seus ensinamentos, super conselhos motivacionais, pelas expressões engraçadas, zoeiras e brincadeiras que dão mais graça ao nosso laboratório. Agradeço a Isis e a Fá pelos ensinamentos de histologia e biologia molecular, pelas inúmeras caronas e pela constante disposição em ajudar. Agradeço a Giulia, a Lígia e ao Thiago pela parceria e contribuição em algumas das etapas de bancada deste trabalho. Agradeço ao Miguel, parceiro de estudos na salinha das/os alunas/os pelo aprendizado compartilhado, risadas e amizade. Agradeço a Karin, ao Luiz e a Vanessa pelos aprendizados compartilhados no LABE e nos trabalhos de bancadas, risadas e conversas. A Ju Moser e a Luiza agradeço por serem tão queridas e comporem o grande arco-íris do LABCAI. Sinto-me muito grata por ter a oportunidade de trabalhar com pessoas que admiro muito profissionalmente, as quais me servem como modelos e fontes de inspiração, podendo, ainda, compartilhar das suas amizades.
À amiga e professora de yoga Mônica agradeço muito pelos aprendizados, mentalizações e momentos compartilhados de reunião de forças, concentração e harmonização que foram essenciais desde a graduação até o mestrado.
Agradeço também a todos os colegas e amigos do Núcleo de Estudos em Patologia Aquícola (NEPAq); da pós-graduação em Bioquímica, em especial a Karla e ao Tomás; e, aqueles que participaram da organização do Current Topics in Biochemistry (CurTo - 2019).
Aos professores Dr. Alcir Luiz Dafre, Dr. Carlos Peres Silva, Dra. Maria Risoleta Freire Marques e a Dra. Marília Nardelli Siebert, ficam os meus agradecimentos pela participação e contribuição nessa dissertação como membros de banca, qualificação e defesa. Bem como à professora Dra. Karim Hahn Luchmann e ao professor Dr. Marcelo Farina, membros suplentes da banca. Desde já agradeço a todos pela disponibilidade, pelo tempo dedicado na revisão e correção deste documento e pelas críticas construtivas.
Agradeço à Universidade Federal de Santa Catarina, onde realizei o sonho de estudar Ciências Biológicas, e, por ter me oportunizado inúmeras experiências de aperfeiçoamento profissional e pessoal, como a pós-graduação em Bioquímica.
Ao projeto TAMAR – Barra da Lagoa, Florianópolis, também ficam os meus agradecimentos. Especialmente à coordenadora Juçara que me recebeu juntamente com meu orientador e se dispôs a contribuir com o projeto. Ao biólogo Daniel por todo o suporte nos momentos de coleta de amostras. E à médica veterinária Joyce Helena, responsável pelas eutanásias e pela disponibilização dos protocolos com as informações clínicas de dois espécimes de tartarugas-verdes aplicadas no presente estudo.
Agradeço ao Projeto de Monitoramento de Praias – Bacia de Santos (PMP-BS) pela parceria firmada com o LABCAI que possibilitou a utilização de amostras de Chelonia mydas no presente estudo, bem como, por disponibilizar informações sobre os espécimes.
E, por último, mais igualmente importante, agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), agência financiadora dos dois anos de bolsa de estudos para a realização do mestrado.
Só nos importaremos se compreendermos. Só ajudaremos se nos importarmos. Só os salvaremos se os ajudarmos. Jane Goodall, 1990
The truth is rarely pure and never simple.
RESUMO
Uma série de contaminantes químicos pode ser liberada no ambiente associada às atividades humanas. Alguns contaminantes podem causar efeitos tóxicos nos organismos expostos, como as tartarugas-verdes (Chelonia mydas). Essa exposição desencadeia respostas biológicas, que podem, potencialmente, servir como biomarcador. A enzima uridina difosfato glicuronosiltransferase (UGT) pertence à fase II do sistema de biotransformação de xenobióticos, e sua atividade pode ser explorada como biomarcador. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo investigar a atividade da enzima UGT em amostras hepáticas microssomais de tartarugas-verdes. As amostras de tecido hepático foram provenientes de espécimes encontrados até seis horas após a morte nas praias da região da Bacia de Santos, desde Ubatuba, São Paulo, até Laguna, Santa Catarina. Também foram utilizadas amostras de fígado, intestino delgado e rim de dois espécimes de tartarugas-verdes que, após tratamento veterinário, precisaram ser eutanasiados. A atividade UGT foi quantificada pelo método adaptado de Collier e colaboradores (2000) e Ladd, Fitzsimmons e Nichols (2016), aplicando como substrato 4-metilumbeliferona (4-MU). Dentre os permeabilizadores testados, a atividade enzimática foi significativamente maior com alameticina e Brij®58, enquanto a aplicação de Triton®X-100 gerou inibição e maior desvio padrão, de modo a ser excluído dos demais ensaios. A aplicação de sacarolactona (5 mM) e UDP-N-acetilglicosamina (1 mM) não foi justificada no ensaio na atividade UGT hepática de C. mydas, uma vez que provocou a inibição e a ausência de alterações significativas, respectivamente. A adição do magnésio (Mg2+) e da albumina sérica bovina (BSA) aumentou a velocidade máxima (Vmax) dos ensaios que continham alameticina e Brij®58 isoladamente. No entanto a contribuição desses reagentes foi significativa apenas no meio de reação com alameticina, e não com Brij®58. Duas hipóteses não mutuamente exclusivas foram propostas: 1) a possibilidade de sequestro de algum inibidor da UGT presente no meio de reação pelo surfactante; 2) a interação do Brij®58 com aminoácidos hidrofóbicos da UGT que pode ter levado à alteração conformacional que, por sua vez, facilitou a ligação do substrato ao sítio ativo da enzima. Assim, foi sugerido que enquanto a adição de BSA e Mg2+ levam a um acréscimo de função no meio com alameticina, o mesmo não ocorre no meio com Brij®58. O maior valor de Vmax foi obtido na presença de alameticina (12,5 µg/mL), BSA (0,25 %) e Mg2+ (1 mM), condição que, portanto, dentre as quatro padronizadas, possibilita a detecção de menores valores de atividade UGT. A atividade UGT detectada em microssoma hepático de
C. mydas foi semelhante àquelas de outros estudos com aves e répteis que utilizaram substratos
não-seletivos, como 4-MU, e a inibição gerada por diferentes compostos seguiu padrão semelhante ao descrito na literatura. Em conclusão, esta investigação permitiu detectar a atividade UGT em microssoma hepático, intestinal e renal de C. mydas pela primeira vez, e, desenvolveu ensaios enzimáticos que podem ser aplicados em programas de biomonitoramento ambiental e contribuir em ações de conservação dessa espécie ameaçada.
Palavras-chave: Biomarcador. Biomonitoramento ambiental. Chelonia mydas.
ABSTRACT
Several chemical contaminants can be released into the environment associated with human activities. Some contaminants can cause toxic effects on exposed organisms such as green turtles (Chelonia mydas). This exposure causes biological responses, which can potentially serve as a biomarker. The uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGT) enzyme belongs to phase II of the xenobiotic biotransformation system, and its activity can be explored as a biomarker. In this context, this study aimed to investigate the activity of the UGT enzyme in green turtle liver microsomal samples. Liver tissue samples were taken from specimens found within six hours after death, on the beaches of Bacia de Santos, from Ubatuba, São Paulo, to Laguna, Santa Catarina. Liver, small intestine and kidney samples were also obtained from two specimens of green turtles which, after veterinary treatment, had to be euthanized. The UGT activity was quantified by the adapted method of Collier et al. (2000) and Ladd, Fitzsimmons and Nichols (2016), applying 4-methylumbeliferone (4-MU) as substrate. Among the permeabilizers tested, the enzymatic activity was significantly higher with alamethicin and Brij®58, while the application of Triton®X-100 generated inhibition and higher standard deviation, which is why it was excluded from the further assays. The application of saccharolactone (5 mM) and UDP-N-acetylglucosamine (1 mM) was not justified in the assay on C. mydas hepatic UGT activity as it caused inhibition and the absence of significant changes, respectively. The addition of magnesium (Mg2+) and bovine serum albumin (BSA) increased the maximum velocity (Vmax) of the enzymatic activity in the presence of alamethicin and Brij®58 separately. However, the contribution of these reagents was only significant in the reaction medium with alamethicin, and not with Brij®58. Two non-mutually exclusive hypotheses are proposed: 1) the possibility of kidnapping some UGT inhibitor present in the reaction medium by the surfactant; 2) the interaction of Brij®58 with UGT hydrophobic amino acids which may have led to conformational change which, in turn, facilitated the binding of the substrate to the active site of the enzyme. Thus, it is suggested that while the addition of BSA and Mg2+ leads to increased function in the reaction medium with alamethicin, it does not occur in the medium with Brij®58. The highest Vmax value was obtained in the presence of alamethicin (12.5 µg / mL), BSA (0.25 %) and Mg2+ (1 mM), a condition that, among the four standardized ones, allows the detection of lower values of UGT activity. The UGT activity detected in C. mydas liver microsome was similar to those of other studies with birds and reptiles that used non-selective substrates, such as 4-MU, and the inhibition generated by different compounds followed a similar pattern to that described in the literature. In conclusion, this research allowed the detection of UGT activity in C. mydas liver, intestinal and renal microsomes for the first time, and developed enzymatic assays that can be applied in environmental biomonitoring programs and contribute to conservation actions of this endangered species.
Keywords: Biomarker. Environmental biomonitoring. Chelonia mydas. Contaminants. Uridine diphosphate glucuronosyltransferases.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1– Representação esquemática do sistema de biotransformação. ... 26
Figura 2 – Representação do sistema de glicuronidação no lúmen do retículo endoplasmático (RE). ... 28
Figura 3 – Esquema da glicuronidação... 29
Figura 4 – Tartaruga-verde (Chelonia mydas). ... 36
Figura 5 – Fluxograma das etapas que compõem o presente estudo. ... 47
Figura 6 – Atividade UGT sob diferentes concentrações (µg/mL) de alameticina. ... 53
Figura 7 – Atividade UGT em diferentes concentrações (%) de Brij®58. ... 54
Figura 8 – Atividade UGT em diferentes concentrações (%) de Triton®X-100. ... 55
Figura 9 – Comparação da atividade UGT na concentração ótima de cada permeabilizador. . 56
Figura 10 – Curva cinética da atividade UGT com concentrações crescentes de UDPGA, na presença de alameticina (12,5 µg/mL). ... 57
Figura 11 – Curva cinética da atividade UGT com concentrações crescentes de 4-MU, na presença de alameticina (12,5 µg/mL). ... 58
Figura 12 – Gráfico linearizado de Eadie-Hofstee da curva cinética do substrato 4-MU com alameticina (12,5 µg/mL). ... 58
Figura 13 – Curva cinética da atividade UGT em concentrações crescentes de UDPGA, na presença de Brij®58 (0,0312 %). ... 60
Figura 14 – Curva cinética da atividade UGT em concentrações crescentes de 4-MU, na presença de Brij®58 (0,0312 %). ... 60
Figura 15 – Comparação da atividade UGT com alameticina, Brij®58 e UDP-GLcNAc em C. mydas. ... 61
Figura 16 – Análise da inclusão de UDP-GLcNAc no ensaio da atividade UGT. ... 62
Figura 17 – Atividade UGT com alameticina em C. mydas, sob diferentes concentrações de BSA. ... 63
Figura 18 – Atividade UGT com alameticina em C. mydas, sob diferentes concentrações de Mg2+. ... 63
Figura 19 – Efeito da sacarolactona (5 mM) na atividade UGT de C. mydas. ... 64
Figura 20 – Atividade UGT com Brij®58 em C. mydas, sob diferentes concentrações de BSA. ... 65
Figura 21 – Atividade UGT com Brij®58 em C. mydas, sob diferentes concentrações de Mg2+. ... 65 Figura 22 – Efeito do BSA (0,25 %) e do Mg2+ (1 mM) no ensaio da atividade UGT com alameticina (12,5 µg/mL). ... 66 Figura 23 – Efeito do BSA (0,25 %) e do Mg2+ (1 mM) no ensaio da atividade UGT com Brij®58 (0,0312 %). ... 67 Figura 24 – Curva cinética da atividade UGT em concentrações crescentes de UDPGA, na presença de alameticina (12,5 µg/mL), BSA (0,25 %) e Mg2+ (1 mM). ... 68 Figura 25 – Curva cinética da atividade UGT em concentrações crescentes de 4-MU, na presença de alameticina (12,5 µg/mL), BSA (0,25 %) e Mg2+ (1 mM). ... 69 Figura 26 – Gráfico linearizado de Eadie-Hofstee da curva cinética do substrato 4-MU com alameticina (12,5 µg/mL). ... 70 Figura 27 – Curva cinética da atividade UGT em concentrações crescentes de UDPGA, na presença de Brij®58 (0,0312 %), BSA (0,25 %) e Mg2+ (1 mM). ... 71 Figura 28 – Curva cinética da atividade UGT em concentrações crescentes de 4-MU, na presença de Brij®58 (0,0312 %), BSA (0,25 %) e Mg2+ (1 mM). ... 72 Figura 29 – Curvas cinéticas da atividade UGT sob diferentes condições de ensaio, em concentrações crescentes de UDPGA... 73 Figura 30 – Curvas cinéticas da atividade UGT sob diferentes condições de ensaio, em concentrações crescentes de 4-MU... 74 Figura 31 – Atividade UGT em diferentes tecidos (fígado, intestino delgado e rim) de C. mydas ao longo de um intervalo post mortem de 24 horas. ... 75 Figura 32 – Intervalo ótimo de quantificação da atividade UGT com alameticina (12,5 µg/mL). ... 78 Figura 33 – Intervalo ótimo de quantificação da atividade UGT com Brij®58 (0,0312 %). .... 80 Figura 34 – Intervalo ótimo de quantificação da atividade UGT com alameticina, BSA e Mg2+. ... 81 Figura 35 – Intervalo ótimo de quantificação da atividade UGT com Brij®58, BSA e Mg2+. . 82 Figura 36 – Intervalo de quantificação da atividade UGT em microssoma renal com alameticina, BSA e Mg2+. ... 83 Figura 37 – Atividade UGT com alameticina em C. mydas, sob efeito de diferentes inibidores. ... 84
Figura 38 – IC50 relativo do ácido litocólico na atividade UGT em C. mydas. ... 85 Figura 39 – IC50 relativo do diclofenaco de sódio na atividade UGT em C. mydas. 85
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características das amostras de tecido hepático de C. mydas aplicadas na padronização. ... 42 Tabela 2 – Atividade UGT (média ± desvio padrão, em pmol.min-1 mg. proteína-1) no intervalo post mortem de 24 h em diferentes tecidos de dois espécimes de C. mydas. ... 77
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS AhR – Receptor de hidrocarboneto aromático ou de arila
AINES – Drogas anti-inflamatórias não esteroidais ATP – Trifosfato de adenosina
BSA – Albumina sérica bovina
CAR – Receptor constitutivo de androstano CC – Coeficiente de calibração
CCL – Comprimento curvilíneo de carapaça (do inglês: curved carapace length) CEUA-UFSC – Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC
cm – Centímetro(s) COOH – Carboxila CYP – Citocromo P450
DNA – Ácido desoxirribonucleico DTT – DL-ditiotreitol
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
g – Unidade de força centrífuga aplicada
GST – Enzima glutationa S-transferase h – Hora(s)
HPA – Hidrocarboneto policíclico aromático
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis IC50 – Metade da concentração inibitória máxima
ICMBio – Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade KCl – Cloreto de potássio kDa – Quilodalton(s) kg – Quilograma(s) Ki– Constante de inibição km – Quilômetro(s) Km– Constante de Michaelis-Menten Kmapp– Km aparente
LABCAI – Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica Log – Logaritmo
M – Molar
mAMf – Média de fluorescência emitida por reações de amostras mBRf – Média de fluorescência emitida por reações de brancos MMA – Ministério do Meio Ambiente
Mg2+ – Cátion bivalente magnésio mg – Miligrama(s) min – Minuto(s) mL – Mililitro(s) mM – Milimolar n – Número amostral NH2– Amino nm – Nanômetro(s)
Nrf2 – Fator nuclear eritróide
Nrf2 – Gene fator nuclear eritróide
OH – Hidroxila
OCP – Pesticida organoclorado
p – Probabilidade de significância
PCB – Bifenilo policlorado PCDD – Dibenzo-p-dioxinas pH – Potencial hidrogeniônico pmol – picomol (10-12 mol)
PMP-BS – Projeto de Monitoramento de Praias - Bacia de Santos PMSF – Fluoreto de fenilmetano sulfonilo
PPAR – Receptor ativado por proliferador de peroxissomo PXR – Receptor pregnano X
r2– coeficiente de correlação linear RFU – Unidade de fluorescência relativa RNAm – Ácido ribonucleico mensageiro
R-O-GA – Exemplo representativo de conjugado de glicuronídeo
R-OH – Exemplo representativo de substrato da UGT com grupo funcional hidroxila S – Coeficiente angular
SH – Grupo tiol
SISBIO – Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade SULT – Enzima sulfotransferase
TRIS – 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3diol UDP – Uridina difosfato
UDPGA – Ácido uridina difosfato glicurônico / UDP-ácido glicurônico UDP-GLcNAc – Uridina difosfato-N-acetilglicosamina
UGT – Uridina difosfato glicuronosiltransferase UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina Vmax– Velocidade máxima da reação enzimática 4-MU – 4-metilumbeliferona α – Nível de significância µg – Micrograma(s) µM – Micromolar °C – Grau(s) Celsius % – Porcentagem
3.2 CURVAS CINÉTICAS DA ATIVIDADE UGT EM C. mydas COM OS
PERMEABILIZADORES: ALAMETICINA E BRIJ®58 ... 56
3.2.1 Curvas cinéticas da atividade UGT com alameticina ... 56
3.2.2 Curvas cinéticas da atividade UGT com Brij®58 ... 59
3.3 EFEITO DA UDP-GLcNAc ... 61
3.4 CONCENTRAÇÕES ÓTIMAS E EFEITOS DO BSA E DO Mg2+ ... 62
3.4.1 Concentrações ótimas do BSA e do Mg2+ no ensaio com alameticina ... 62
3.4.2 Concentrações ótimas do BSA e do Mg2+ no ensaio com Brij®58 (0,0312 %) .... 64
3.4.3 Efeito do BSA e do Mg2+ no ensaio da atividade UGT com alameticina ... 66
3.4.4 Efeito do BSA e do Mg2+ no ensaio da atividade UGT com Brij®58 ... 67
3.5 CURVAS CINÉTICAS DA ATIVIDADE UGT EM C. mydas COM PERMEABILIZADORES (ALAMETICINA E BRIJ®58), BSA e Mg2+ ... 68
3.5.1 Curvas cinéticas da atividade UGT com alameticina, BSA e Mg2+ ... 68
3.5.2 Curvas cinéticas da atividade UGT com Brij®58, BSA e Mg2+ ... 70
3.5.3 Comparação das curvas cinéticas da atividade UGT de C. mydas sob diferentes condições de ensaio ... 72
3.6 ATIVIDADE UGT DE C. mydas AO LONGO DE UM INTERVALO POST MORTEM DE 24 HORAS NOS TECIDOS: HEPÁTICO, INTESTINAL E RENAL ... 74
3.7 INTERVALOS ÓTIMOS DE QUANTIFICAÇÃO ... 78
3.7.1 Intervalo ótimo de quantificação para atividade UGT no microssoma hepático de C. mydas com alameticina ... 78
3.7.2 Intervalo ótimo de quantificação para atividade UGT no microssoma hepático de C. mydas com Brij®58 ... 79
3.7.3 Intervalo ótimo de quantificação para atividade UGT no microssoma hepático de C. mydas com alameticina, BSA e Mg2+ ... 80
3.7.4 Intervalo ótimo de quantificação para atividade UGT no microssoma hepático de C. mydas com Brij®58, BSA e Mg2+ ... 81
3.7.5 Intervalo ótimo de quantificação para atividade UGT no microssoma renal de C.
mydas com alameticina, BSA e Mg2+ ... 82
3.8 INIBIDORES ... 83
3.8.1 Efeito de potenciais inibidores da atividade UGT em microssomas hepáticos de C. mydas ... 83
3.8.2 IC50 relativo para ácido litocólico e diclofenaco de sódio ... 84
4 DISCUSSÃO ... 87
4.1 LATÊNCIA DA ATIVIDADE UGT HEPÁTICA EM C. mydas ... 87
4.2 EFEITO DE UDP-GLcNAc, BSA, Mg2+ E SACAROLACTONA NA ATIVIDADE UGT HEPÁTICA DE C. mydas ... 88
4.2.1 Efeito da UDP-GLcNAc (1 mM) na atividade UGT de C. mydas ... 88
4.2.2 Efeito da sacarolactona (5 mM) na atividade UGT de C. mydas ... 89
4.2.3 Efeito do BSA na atividade UGT de C. mydas ... 91
4.2.4 Efeito do Mg2+ na atividade UGT de C. mydas ... 93
4.3 PARÂMETROS CINÉTICOS PARA DIFERENTES CONDIÇÕES DE ENSAIO DA ATIVIDADE UGT HEPÁTICA DE C. mydas ... 94
4.4 ATIVIDADE UGT DE C. mydas AO LONGO DE UM INTERVALO POST MORTEM EM AMOSTRAS DE FÍGADO, INTESTINO DELGADO E RIM ... 97
4.4.1 A influência da decomposição na atividade UGT... 98
4.4.2 Variações da atividade UGT nos espécimes Cm A e Cm B ... 100
4.4.3 Atividade UGT nos tecidos hepático, intestinal e renal de C. mydas ... 102
4.4.4 Estudos post mortem e a aplicação de tecidos internos de animais no biomonitoramento ambiental ... 103
4.5 INIBIÇÃO DA ATIVIDADE UGT HEPÁTICA DE C. mydas ... 105
5 CONCLUSÕES ... 107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 109
APÊNDICE A – Efeito de matriz da amostra ... 129
APÊNDICE C – Conjunto de artigos que aplicam a atividade UGT com destaque de aspectos metodológicos ... 131 APÊNDICE D – Análise dos meios na ausência de microssoma (brancos) ... 136 APÊNDICE E – Efeito da sacarolactona ... 138 APÊNDICE F – Análise da atividade UGT em diferentes tecidos (fígado, intestino delgado e rim) durante intervalo post mortem de até 24 horas ... 139 APÊNDICE G – Intervalo ótimo de detecção ... 143 APÊNDICE H – Comparação de dados da atividade UGT oriundos do presente estudo com aqueles relatados na literatura para aves e répteis ... 145 APÊNDICE I - Condições de ensaio para atividade UGT hepática de C. mydas ... 149 ANEXO A – Autorização 67299 do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade ... 150
1 INTRODUÇÃO
1.1 BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA
Os produtos químicos fazem parte da vida cotidiana, estando presentes em fármacos, produtos de higiene pessoal, de limpeza, em plásticos, agrotóxicos, inseticidas, derivados de petróleo, e, até mesmo, na produção das roupas que vestimos. O desenvolvimento desses produtos, que hoje são estimados em cerca de 159 milhões (CAS REGISTRY®, 2020),
está associado, muitas vezes, ao aumento da qualidade de vida, mas ao mesmo tempo, pode ser considerado danoso ao ambiente e à saúde humana.
Após o uso, esses produtos frequentemente acabam em cursos de água por meio de descargas diretas ou em consequência de processos hidrológicos e atmosféricos, sem tratamento prévio ou com tratamento incipiente (UNO; ISHIZUKA; ITAKURA, 2012; NATIONAL INSTITUTE OF WATER AND ATMOSPHERIC RESEARCH, 2016). Dentro desse contexto, os produtos químicos podem ser definidos como contaminantes, que de acordo com Chapman (2007), são substâncias presentes onde não deveriam estar ou em concentrações acima do nível natural. Há contaminantes que podem causar efeitos tóxicos nos organismos expostos e são conhecidos como poluentes (CHAPMAN, 2007). Atualmente milhares de poluentes orgânicos, como bifenilos policlorados (PCBs), pesticidas organoclorados (OCPs), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs) e dibenzo-p-dioxinas (PCDDs) têm sido produzidos e, em parte, lançados no ambiente (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
Considerando que muitos xenobióticos1, químicos que não são produzidos naturalmente pelo organismo (IYANAGI, 2007), são utilizados diariamente por quase toda população humana mundial, que hoje se encaminha aos 8 bilhões, a gestão adequada dos produtos químicos e a avaliação de possíveis danos ambientais devem ser realizados (UNITED NATIONS ENVIRONMENT PROGRAMME, s. d.).
A análise química da água e dos sedimentos é fundamental e comumente empregada para avaliar o estado de contaminação do ambiente aquático, e, caracteriza-se pela comparação dos resultados em relação ao nível dos principais contaminantes com o valor limite definido na legislação ou por padrões de segurança. No entanto, a presença de contaminantes no
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ecossistema aquático não representa, por si só, um risco para os seres vivos. Isso porque uma vez que a exposição tenha ocorrido e as substâncias estejam biodisponíveis, pode ocorrer uma sequência de respostas biológicas nos indivíduos expostos. O efeito da exposição ao xenobiótico dependerá de fatores internos ao organismo, como idade, sexo e estado nutricional, e de fatores externos, como concentração, duração e interação com outros químicos (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
Uma abordagem complementar à química que possibilita a obtenção de informações relativas aos efeitos biológicos dos poluentes, refere-se ao “uso sistemático de organismos vivos, ou suas respostas, para determinar a condição ou alterações do ambiente”, o que corresponde ao biomonitoramento ambiental (PRABHAKARAN et al., 2017; BEIRAS, 2018). Os biomarcadores são ferramentas cada vez mais utilizadas no biomonitoramento ambiental e são definidos, de acordo com Walker e colaboradores (1996), como alterações biológicas que ocorrem em um indivíduo quando exposto a contaminantes químicos, sendo que essas alterações podem ser quantificadas em diferentes níveis (moleculares, bioquímicos e/ou fisiológicos).
Os biomarcadores apresentam a vantagem de representar sinais de alerta precoces à exposição, uma vez que os efeitos tóxicos iniciais de um composto no organismo ocorrem por meio de alterações em nível bioquímico das funções celulares. A identificação desses sinais possibilita que ações imediatas de mitigação e remediação de danos sejam executadas (BREITWIESER et al., 2016). Se não monitorados e controlados, os efeitos em nível bioquímico poderão gerar efeitos fisiológicos e, em seguida, ecológicos, momento em que os prejuízos possivelmente já serão irreversíveis ao ecossistema (HANSEN, 2003). Outra vantagem dos biomarcadores é que as respostas bioquímicas tendem a ser mais semelhantes em uma grande variedade de seres vivos, do que as respostas em níveis mais altos da organização biológica (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
Para que a aplicação dos biomarcadores permita a obtenção de resultados acurados e de maneira eficiente, dentre outros fatores, é essencial que os ensaios de quantificação do biomarcador sejam reprodutíveis, relativamente baratos e de fácil realização (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Nesse sentido, cabe mencionar a importância de pesquisas que busquem padronizar os protocolos de ensaios com biomarcadores, assim como desenvolver novos biomarcadores, inclusive em diferentes espécies (McCARTHY, 1990). Também se tem buscado a realização do biomonitoramento por meio de biomarcadores que, preferencialmente,
são alcançados por métodos não invasivos e não destrutivos, o que também possibilita o estudo em espécies ameaçadas de extinção (FOSSI; MARSILI, 1997).
Os avanços científicos têm contribuído para o desenvolvimento dos biomarcadores, os quais vêm aprimorando suas características científicas e, concomitantemente, tornando-se juridicamente mais defensáveis. Dentre os biomarcadores mais explorados estão as proteínas envolvidas no sistema de biotransformação de xenobióticos (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Assim, costumam ser investigados seus níveis de expressão, detecção em tecidos e as atividades enzimáticas correspondentes, por exemplo.
1.2 SISTEMA DE BIOSTRANSFORMAÇÃO
Muitos xenobióticos absorvidos em sistemas biológicos são substâncias lipofílicas. Logo, a excreção não é favorecida, e essas substâncias acabam sendo reabsorvidas no rim ou no trato gastrointestinal, após secreção biliar. Através da biotransformação essas substâncias lipofílicas tendem a produzir metabólitos mais polares e, consequentemente, mais passíveis de serem eliminadas dos tecidos (TIMBRELL, 2008). O órgão destaque na biotransformação é o fígado, pois contém a maior diversidade de enzimas e em níveis relativamente elevados (CUI; LI, 2018).
Paradoxalmente, a toxicidade do xenobiótico pode ser afetada pela biotransformação, podendo ser benéfico ou prejudicial ao organismo, dependendo se leva a desintoxicação ou bioativação do composto, respectivamente. Isso porque durante a biotransformação é comum a geração de intermediários reativos, mais tóxicos que o composto original, que podem se ligar a biomoléculas (como, proteínas e ácido desoxirribonucleico, DNA), causando citotoxicidade, dano ao DNA e outros efeitos tóxicos (STANLEY, 2017).
As principais reações da biotransformação são classicamente divididas em duas fases, conhecidas como fase I e fase II (BUHLER; WILLIAMS, 1988; OMIECINSKI et al., 2011; Figura 1).
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Figura 1– Representação esquemática do sistema de biotransformação.
O aumento do tom azul no fundo da figura corresponde ao aumento da hidrossolubilidade do xenobiótico. Em ➊ não é exposto um gradiente de azul, em função da ausência da atuação das enzimas do sistema de biotransformação, nesse caso o xenobiótico (lipossolúvel) é capaz de entrar e sair da célula (círculo em azul) por difusão. Como demonstrado pelo caminho ➋ o metabolismo da fase I não precisa preceder o da fase II, desde que os grupos funcionais estejam disponíveis na molécula original. Em ➌ a atuação das enzimas de fase I não é acompanhada pelas de fase II, assim, o metabolito é potencialmente mais reativo que a molécula original podendo aumentar os efeitos tóxicos do xenobiótico no organismo. Por fim, em ➍ há um equilíbrio na atuação das enzimas de fase I e II, e, da mesma maneira que em ➋, ocorre o aumento da polaridade da molécula. Os compostos que passaram pelo sistema de biotransformação, agora hidrossolúveis, necessitam de transportadores (representados pelas barras vermelhas) para se direcionarem ao exterior da célula e, em seguida, serem excretados na urina ou no ácido biliar. Fonte: adaptado de Siebert (2017).
Inicialmente os xenobióticos entram nas células passivamente, por difusão, aproveitando suas propriedades lipofílicas. Em seguida, podem atuar como substratos para as enzimas de fase I que expõem ou adicionam grupos funcionais reativos, como OH, SH, NH2 e COOH, por meio de reações de oxidação, redução ou hidrólise (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003; SANCHEZ; KAUFFMAN, 2010). A principal superfamília de enzimas da fase I compreende o citocromo P450 (CYP), heme proteínas microssomais, mas também compõe essa fase as álcool desidrogenases, amina oxidases, flavinas monooxigenases, dentre outras. Enquanto, nas reações de fase II ocorre a conjugação dos xenobióticos ou de seus metabólitos com ligantes endógenos polares, como: o ácido glicurônico, sulfato ou glutationa
(OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003; TIMBRELL, 2008). As três principais transferases, grupo de enzimas da fase II, são a uridina difosfato glicuronosiltransferase (UGT), a sulfotransferase (SULT) e a glutationa S-transferase (GST), sendo que com exceção da UGT todas as demais são citosólicas (GHOSAL et al., 2005). No final do processo de biotransformação ocorre o transporte ativo dos produtos hidrofílicos para fora da célula (XU; LI; KONG, 2005). Convém destacar que o aumento da hidrossolubilidade do composto é mais marcante apenas após as reações de fase II, momento também caracterizado pelo aumento do peso molecular (CUI; LI, 2018).
1.3 URIDINA DIFOSFATO GLICURONOSILTRANSFERASE (UGT)
As UGTs têm um papel de destaque na fase II da biotransformação tanto de compostos endógenos, como a bilirrubina, ácidos biliares, eicosanoides, hormônios esteroides e tireoidianos, quanto de xenobióticos, como contaminantes químicos, poluentes e fármacos (LIU; COUGHTRIE, 2017). Localizam-se principalmente no retículo endoplasmático liso, apesar de algumas isoformas terem sido identificadas na membrana nuclear (WISHART; FRY, 1977; YANG et al., 2017).
Essas enzimas catalisam a transferência do ácido glicurônico em sua forma ativada, como ácido uridina difosfato glicurônico (UDPGA), para carbonos nucleofílicos e grupos funcionais, como hidroxila (fenol ou álcool alifático), carboxila, sulfidrila e amino (aromático ou alifático), dos substratos (conhecidos como agliconas), por meio de ligação covalente formando conjugados de glicuronídeos (Figura 2 e Figura 3; ODA et al., 2015). Tais conjugados são substratos para inúmeros transportadores de membrana e, assim, podem ser excretados na bile ou na urina (LIU; COUGHTRIE, 2017). Geralmente a glicuronidação resulta em detoxificação, porém um número limitado de glicuronídeos são bioativos (RITTER, 2000), como por exemplo, a morfina-6-glicuronídeo (PENSON et al., 2000).
Quando chegam no intestino delgado, por meio da secreção biliar, os conjugados de glicuronídeos podem ser clivados pela ação de enzimas β-glicuronidases, que também estão presentes no fígado, mas pouco ativas. O produto desta clivagem, costumeiramente o metabólito resultante da fase I (a aglicona), pode ser reabsorvido e transportado de volta para o fígado, podendo causar toxicidade (ZAMEK-GLISZCZYNSKI et al., 2006; TIMBRELL, 2008).
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Figura 2 – Representação do sistema de glicuronidação no lúmen do retículo endoplasmático (RE).
A entrada das agliconas/substratos lipofílicos (R-OH, por exemplo) para o lúmen do RE ocorre por meio de difusão (A), enquanto o cosubstrato UDPGA conta com o transporte antiporte via UDPGA/UDP-GLcNac (B). Após a atividade UGT, os conjugados de glicuronídeo (exemplificados como: R-O-GA) são transportados para fora do lúmen via transportadores (C). GA: ácido glicurônico; UDP: uridina difosfato; UDPGA: ácido uridina difosfato glicurônico; UDP-GLcNAc: UDP-N-acetilglicosamina; UGT: uridina difosfato glicuronosiltransferase. Fonte: adaptado de Liu; Coughtrie (2017).
Em vertebrados, as UGTs têm de 50 kD a 56 kD, cerca de 530 aminoácidos e contam com dois domínios orientados para a superfície luminal do retículo endoplasmático, onde o sítio catalítico está localizado (RACCOR et al., 2014; STANLEY, 2017; HU et al., 2019). A conjugação da aglicona com o UDPGA ocorre, provavelmente, em uma fenda localizada entre os dois domínios, que se encontra próxima ao local de ligação do UDPGA (MEECH et al, 2012). O domínio C-terminal contém uma porção transmembranar, é altamente conservado nas diferentes isoformas e está envolvido na ligação do cosubstrato UDPGA, além de ser essencial para o ancoramento da enzima na bicamada lipídica. Já o domínio N-terminal (aproximadamente a metade N-terminal do peptídeo) possibilita a ligação da aglicona, confere seletividade aos substratos e inibidores, e, conta com um peptídeo sinal que auxilia na inserção da UGT no retículo endoplasmático sendo, subsequentemente, clivado (OUZZINE et al., 1999; BARRÉ et al., 2005; ODA et al., 2015). Sugere-se que a glicuronidação envolve um processo ordenado que conta primeiro com a ligação do UDPGA e depois da aglicona (LUUKKANEN
Figura 3 – Esquema da glicuronidação.
As UGTs facilitam o ataque do grupo nucleofílico (neste caso, OH) da aglicona (substrato lipofílico endógeno ou xenobiótico), especificamente, no carbono anomérico do ácido glicurônico em sua forma ativada (UDPGA) formando uma ligação β-glicosídica, que libera o conjugado de glicuronídeo (como O-glicuronídeo, exemplificado na figura) e UDP. UDP: uridina difosfato; UDPGA: ácido uridina difosfato glicurônico.UGT: uridina difosfato glicuronosiltransferase. Fonte: adaptado de Meech et al. (2018).
Apesar da associação de uma porção significativa das UGTs à membrana do retículo endoplasmático, estima-se que cerca de 95 % da cadeia polipeptídica seja luminal e esteja conectada à cauda C-terminal citosólica (com cerca de 26 aminoácidos) por meio de uma alfa-hélice de 17 resíduos (RACCOR et al., 2014; LIU; COUGHTRIE, 2017). Até o momento não foi gerada uma estrutura cristalina completa, em animais, capaz de demonstrar a íntima associação entre UGT e a membrana do retículo endoplasmático, pois a porção N-terminal é muito flexível (LIU; COUGHTRIE, 2017). Atualmente, aceita-se que são necessárias duas cadeias polipeptídicas UGT (homo ou heterodímeros) para constituir uma unidade funcional, de modo que todas as UGTs ativas se encontram como dímeros, o que possivelmente pode levar
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a uma maior diversidade funcional que ainda é pouco compreendida (MINERS et al., 2004; MEECH et al., 2018).
O tecido que possui maior abundância de UGT é o hepático, mas tecidos extra-hepáticos também contam com sua expressão, como é o caso dos: rins, intestino, brânquias e pulmões (TIMBRELL, 2008; ODA et al., 2015). Inclusive, há isoformas que apenas são expressas em tecidos extra-hepáticos. Esses são os casos de UGT2A1, que ocorre predominantemente no epitélio nasal, e de UGT1A7, UGT1A8 e UGT1A10 que estão presentes no trato gastrointestinal (UCHAIPICHAT et al., 2004).
As UGTs são membros de uma superfamília mais ampla de UDP-glicosiltransferases, as quais compartilham a característica de transferir covalentemente uma variedade de açúcares UDP (como, UDP-ácido glicurônico, UDP-glicose, UDP-galactose e UDP-xilose) para xenobióticos e compostos endógenos lipofílicos (MEECH et al., 2018). Essa superfamília está presente em animais, bactérias e vegetais. Geralmente as UDP-glicosiltransferases dos vertebrados podem ser divididas em quatro famílias, sendo elas: UGT1, UGT2, UGT3 e UGT8. No entanto, apenas as famílias UGT1 e UGT2 estão envolvidas no sistema de biotransformação e realizam reações de glicuronidação (YANG et al., 2017). Cada uma das isoformas dessa superfamília é designada pela sigla UGT seguida de um número arábico que representa a família, de uma letra para a subfamília, e, novamente, um número arábico da isoforma individual dentro da família ou subfamília (MEECH et al., 2018). Portanto, UGT1A1 por exemplo, refere-se a isoforma 1, da subfamília A, família 1, da superfamília das UDP-glicosiltransferases.
As famílias UGT1 e UGT2 são divididas de acordo com a similaridade das sequências de aminoácidos, de modo que cada família compartilha pelo menos 50 % de homologia e cada subfamília 60 %. Isoformas com nomes iguais, mas em espécies diferentes, podem apresentar atividades metabólicas diferentes. Ainda não são totalmente compreendidas as especificidades por substratos e relação com inibidores nas isoformas UGTs (YANG et al., 2017). No entanto, cada UGT pode conjugar muitos substratos lipofílicos (potencialmente milhares), com considerável sobreposição nas seletividades de substrato em diferentes isoformas (TIMBRELL, 2008; HU et al., 2019).
Estudos têm explorado as UGTs em diferentes táxons de animais, dentre eles peixes, mamíferos e aves (HURK et al., 2007; RACCOR et al., 2014; KAWAI et al., 2019; HURK; KERKKAMP, 2019). Essas enzimas, que parecem ter evoluído, primeiramente, por
meio de uma “disputa” entre plantas e herbívoros que precisavam se desintoxicar de substâncias fenólicas tóxicas da dieta, apresentam propriedades funcionais e estruturais semelhantes e, consequentemente, forte conservação evolutiva entre filos distantes (BOCK 2016; HURK, 2019). Estudos recentes têm demonstrado que há atividade UGT em aves e répteis, apesar de ser menor do que a registrada em mamíferos (SAENGTIENCHAI et al., 2018; KAWAI et al., 2019; HURK; KERKKAMP, 2019). Exceções são as cobras, as quais não apresentam atividade UGT, principalmente no que se refere a agliconas fenólicas, bem como os felinos e algumas espécies de peixes (GUPTA, 2016; HURK; KERKKAMP, 2019). Os anfíbios, assim como os invertebrados, por sua vez têm preferência pelo uso de UDP-glicose, em relação ao UDP-ácido glicurônico, de modo que o uso da UDPGA parece ser uma característica derivada (MACKENZIE et al.,1997; UEDA et al., 2011). Por fim, pouco se sabe sobre as transferases em quelônios, os quais ocupam um amplo espectro de nichos ecológicos e apresentam uma variedade de fontes alimentares, de modo que torna-se muito interessante a investigação da atividade UGT em diferentes espécies e, consequentemente, gerar informações que possam ajudar na compreensão da história filogenética das UGTs e do porquê certos táxons não possuírem determinadas isoformas.
Por meio da análise do genoma da espécie Chelonia mydas (Linnaeus, 1758) sabe-se, até o momento, que ela conta com os genes necessários para a expressão de 3 isoformas diferentes, sendo elas: UGT1A1-like, UGT1A6-like e UGT2A1-like (GENBANK, 2020). As UGT1A1 estão envolvidas na glicuronidação da bilirrubina, de fenóis, flavonas, cumarinas e esteroides, por exemplo (BOSMA et al., 1994; LV et al., 2019). As UGT1A6 estão envolvidas principalmente na glicuronidação de fenóis, assim como de cumarinas e aminas. Enquanto as isoformas da família UGT2A são predominantemente expressas em tecidos olfativos e estão envolvidas na percepção de odores (JEDLITSCHKY et al.,1999; MINERS et al., 2004; ZAMEK- GLISZCZYNSKI, 2006).
Numa série de estudos realizados com peixes expostos a HPAs,PCBs,PCDDs e OCPs, a atividade UGT aumentou significativamente (CLARKE; BURCHELL; GEORGE, 1992; CELANDER et al., 1993; OTTO; MOON, 1995; GADAGBUI; GOKSØYR, 1996; OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Tais resultados estão em concordância com experimentos de campo realizados em ambientes aquáticos contaminados, os quais também detectaram um aumento na atividade UGT em peixes (VIGANO et al., 1995; OOST et al., 1996; 1998). Além disso, galinhas expostas a PCB 126 demonstraram maior atividade UGT,
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após 2 semanas de exposição, em comparação aos controles, aumento que deixou de ser registrado após 5 semanas (HURK et al., 2007).
A regulação do aumento ou inibição da atividade UGT pode ocorrer por meio de interações de compostos endógenos e xenobióticos com fatores de transcrição, como o receptor hidrocarboneto aromático (AhR), receptor constitutivo de androstano (CAR), receptor pregnano X (PXR), receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR) e o fator nuclear eritroide (Nrf2) (YANG et al., 2017; CUI; LI, 2018). Sabe-se que os HPAs se ligam ao AhR, aumentando a transcrição de isoformas da família UGT1 (OWENS, 1977; BOCK et al., 1992). Convém mencionar, no entanto, que a regulação de isoformas UGT ainda é pouco compreendida e o que se sabe é referente, em sua maioria, aos fármacos utilizados pelos humanos (YANG et al., 2017). E ainda, apenas alguns poucos inibidores seletivos foram identificados, em humanos, sendo eles: hecogenina para UGT1A4, fluconazol para UGT2B7, ácido niflumico para UGT1A9 e diclofenaco de sódio para UGT1A9 e UGT2B7 (UCHAIPICHAT et al., 2004; ZHOU; MINERS, 2014). Ademais, além de substratos para a atividade enzimática das UGTs, os sais biliares (como, o ácido litocólico e o ácido taurocólico) e as drogas anti-inflamatórias não esteroidais (AINES, como, ibuprofeno, diclofenaco de sódio e paracetamol) são inibidores de várias isoformas de UGTs (SCHNEIDER et al., 1993; KIRKWOOD; NATION; SOMOGYI, 1998; GRANCHAROV et al., 2001; UCHAIPICHAT
et al., 2004; FANG et al., 2013; MANO; USUI; KAMIMURA, 2005, 2006, 2007, 2008; JOO
et al., 2015).
A atividade UGT, assim como os biomarcadores bioquímicos de maneira geral, pode ser influenciada por sexo, idade, pH, temperatura, diferenças genéticas, fase do desenvolvimento, além da exposição a agentes xenobióticos (STEGEMAN et al., 1992). Ainda assim, a atividade dessa transferase, é considerada um válido biomarcador para programas de biomonitoramento ambiental e a continuidade de estudos direcionados ao aumento ou detecção da atividade frente aos contaminantes químicos, tem potencial de fortalecer a sua aplicação (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
Tendo em vista que o sítio ativo da UGT se localiza no lúmen do retículo endoplasmático, um passo limitante na reação de glicuronidação in vitro é o transporte de UDPGA, molécula altamente carregada sintetizada no espaço citoplasmático (OLESON; COURT, 2008; TIMBRELL, 2008). Tal situação conduz o fenômeno de latência da atividade UGT em ensaios in vitro. Esse fenômeno deriva de observações experimentais de que
microssomas nativos geralmente apresentam níveis menores de atividade do que microssomas tratados com agentes permeabilizadores de membrana (DEPIERRE; DALLNER, 1975; LADD; FITZSIMMONS; NICHOLS, 2016). Portanto, para que o ensaio in vitro seja capaz de gerar com precisão estimativas da taxa de atividade UGT in vivo, é necessário interromper de alguma maneira a barreira formada pela membrana. Para tanto, podem ser utilizados diversos detergentes (como Triton®X-100, Brij®58, Lubrol®), a alameticina (um peptídeo formador de canais isolado de fungos, como o Trichoderma viride) e a sonicação(HE et al., 1996; BOASE; MINERS, 2002; ODA et al., 2015; LADD; FITZSIMMONS; NICHOLS, 2016).
Para que os resultados do ensaio UGT reflitam a atividade desta enzima, ao invés de um equilíbrio entre a formação e hidrólise do glicuronídeo, resultando na subestimação da catálise, é possível aplicar sacarolactona às misturas de reação e, assim, inibir as β-glicuronidases (OLESON; COURT, 2008). Nas células hepáticas, um terço das β-glicuronidases se encontram no retículo endoplasmático, enquanto dois terços estão nos lisossomos (SWANG et al., 1986). É justamente esta proximidade entre a enzima que forma e degrada o glicuronídeo que tem potencial de gerar um ciclo fútil, afetando os resultados da taxa de glicuronidação.
Os cátions divalentes são conhecidos por aumentar significativamente a atividade UGT (ZAKIM; GOLDENBERG; VESSEY, 1973; WALSKY et al, 2012). O Mg2+ é rotineiramente adicionado em ensaios in vitro de glicuronidação, em concentrações que variam de 1 mM, correspondente à concentração presente no retículo endoplasmático, a 50 mM (ODA
et al., 2015; LADD; FITZSIMMONS; NICHOLS, 2016). O Mg2+ parece estar envolvido no
aumento da atividade de transportadores que permitem o acesso do UDPGA ao sítio ativo da UGT e a saída do lúmen do conjugado de glicuronídeo, bem como diminui a inibição das UGTs pela UDP (YOKOTA et al., 1998; FUJIWARA et al., 2008; ODA et al., 2015; LIU; COUGHTRIE, 2017).
Outra substância que influencia a atividade UGT in vitro é a albumina sérica bovina (BSA). O BSA sequestra os ácidos graxos insaturados de cadeia longa (como, o ácido linoleico e o araquidônico) liberados durante as incubações microssomais, que inibem determinadas isoformas, como UGT1A9 e UGT2B7 (ROWLAND et al., 2008; LADD; FITZSIMMONS; NICHOLS, 2016). Diversos estudos registraram o aumento da atividade UGT devido a aplicação de BSA (LADD; FITZSIMMONS; NICHOLS, 2016; ROWLAND et al., 2008; WALSKY et al., 2012; KILFORD et al., 2009). Esse aumento se correlaciona principalmente
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à redução no valor da constante de Michaelis-Menten, Km (ROWLAND et al., 2008), enquanto o valor da velocidade máxima nas condições de total saturação da enzima pelo substrato, ou seja de Vmax, tendem a não ser afetados (LADD; FITZSIMMONS; NICHOLS, 2016). Destaca-se que o Km expressa a concentração de substrato na qual a velocidade da reação corresponde à metade da Vmax, sendo consequentemente uma medida da afinidade do substrato pela enzima (BISSWANGER, 2014).
A UDP-N-acetilglicosamina (UDP-GLcNac) também pode ser aplicado nos ensaios da atividade UGT, devido ao transporte antiporte que realiza com o UDPGA (LIU; COUGHTRIE, 2017). Alguns trabalhos indicam que a integridade da membrana precisa ser mantida para estimulação da atividade UGT via UDP-GLcNAc, uma vez que não foi verificado aumento na atividade quando as membranas haviam sido tratadas previamente com detergentes ou sonicação (WINSNES, 1969; LIN; WONG, 2002).
Muitos estudos têm demonstrado que as características do meio de reação influenciam a atividade UGT, embora condições de ensaio universalmente aceitas não tenham sido alcançadas. Além disso, como anteriormente relatado, poucos foram os estudos que aplicaram enzimas de fase II em espécies de répteis (VALDIVIA et al., 2007; RICHARDSON; GOLD-BOUCHOT; SCHLENK, 2009; RICHARDSON et al., 2010; LABRADA-MARTAGÓN et al., 2011; TREMBLAY et al., 2017; HURK; KERKKAMP, 2019), e nenhum explorou a atividade UGT em espécies de tartarugas-marinhas.
Convém mencionar ainda que a padronização de ensaios enzimáticos é essencial para que a atividade enzimática e, consequentemente, a resposta do biomarcador, neste caso a UGT, seja mensurada de maneira acurada. A padronização permite adequar o ensaio enzimático às particularidades da espécie, determinar as concentrações saturantes de cada substrato e identificar casos de cinética atípica (não hiperbólica), por exemplo. Realizar ensaios em condições saturantes é imprescindível para que os substratos não atuem como fator limitante e, consequentemente, a atividade enzimática não seja subestimada (BISSWANGER, 2014). Em condições saturantes a cinética enzimática será de ordem zero, o que significa que a velocidade será proporcional à quantidade da enzima, independentemente das concentrações de substratos e produtos. De acordo com o modelo de Michaelis-Menten, as reações cinéticas conduzidas sob condições experimentais ocorrem no “estado estacionário”, que se refere ao intervalo de tempo no qual o complexo enzima-substrato é mantido em um nível constante e elevado. E, para isso, a concentração do substrato tem que exceder muitas vezes a concentração da enzima, o valor é
definido de acordo com o valor de Km para cada substrato. Dessa maneira, a enzima estará presente em quantidades catalíticas e a variação da concentração de substrato pode ser considerada desprezível (WILKISON, 1971).
1.4 QUELÔNIOS COMO ORGANISMOS SENTINELA
As tartarugas-marinhas pertencem a mais antiga linhagem de répteis vivos, estando presentes desde o Jurássico, há cerca de 110 milhões de anos. Esses répteis compõem a ordem dos Testudines e as famílias Cheloniidae (compreende seis espécies, dentre elas a Chelonia
mydas) e Dermochelyidae (contém apenas uma espécie, a Dermochelys coriacea)
(BAPTISTOTTE, 2004). A identificação do estado de vulnerabilidade ou ameaça de extinção de espécies de tartarugas-marinhas têm estimulado o desenvolvimento de pesquisas científicas numa ampla variedade de temas que envolvem a biologia e ecologia desses animais. Apesar do avanço de conhecimentos sobre essas espécies, ações de manejo e conservação ainda têm passado por dificuldades mediante à falta de informações, inclusive no que se refere aos impactos gerados pela exposição aos poluentes (HAMANN et al., 2010; FINLAYSON; LEUSCH; MERWE, 2019). A medição das respostas de biomarcadores a produtos químicos contaminantes tem grande potencial para contribuir na compreensão desse questionamento (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
A espécie Chelonia mydas (Linnaeus, 1758), conhecida popularmente como tartaruga-verde, está ameaçada de extinção (União Internacional para a Conservação da Natureza, IUCN, 2004). São características importantes da espécie ter um par de escamas pré-frontais e carapaça lisa com 4 escudos laterais (Figura 4). A cor de suas carapaças varia com a idade, sendo preta nos recém-nascidos, passando para marrom nos jovens, e, ganhando tons esverdeados quando adultos (WYNEKEN, 2004).
Nos primeiros anos de vida as tartarugas-verdes têm uma dieta onívora, com tendência à carnívora, mas quando apresentam cerca de 30 cm a 40 cm de comprimento de carapaça, tornam-se herbívoras, alimentando-se principalmente de macroalgas e fanerógamas (MORTIMER, 1982). A carapaça desses espécimes adultos encontrados no Brasil tem medição curvilínea média de 115,6 cm de comprimento (GROSSMAN, 2001; MOREIRA, 2003), e podem atingir até cerca de 230 kg (PRITCHARD; MORTIMER, 1999). Ocorrem nos mares tropicais, geralmente entre as latitudes 40° S e 40° N, e têm distribuição circunglobal (HIRTH,
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1997). Desovam principalmente em ilhas oceânicas e retornam ao local onde nasceram quando atingem a maturidade sexual (entre 26 e 40 anos). Os machos adultos se diferem das fêmeas por apresentarem cauda mais longa e grossa, garras mais longas nos membros anteriores e plastrão côncavo, enquanto o plastrão das fêmeas é plano ou convexo (O'MALLEY, 2005).
Figura 4 – Tartaruga-verde (Chelonia mydas).
Foto de um indivíduo da espécie C. mydas. Em destaque estão características importantes para a identificação da espécie, os quatro escudos laterais na carapaça lisa e um par de escamas pré-frontais. Fonte: adaptado de Paul Asman e Jill Lenoble, 2018.
Segundo o Banco de Dados do TAMAR (SITAMAR) a espécie C. mydas é a que conta com maior número de ocorrências na região costeira brasileira (SANTOS et al., 2011) e apesarde ser uma espécie migratória é, dentre as tartarugas-marinhas que ocorrem no Brasil, a que possui hábito mais costeiro, sendo ainda bastante fiel às suas áreas de alimentação (ALMEIDA, 2011; HIRTH, 1997). Acabam bioacumulando contaminantes químicos (orgânicos e inorgânicos), principalmente por meio da dieta, durante seus longos períodos de vida, já tendo sido identificados diversos contaminantes em seus tecidos e ovos (SILVA; LÓPEZ-BARRERA, 2016).
Tartarugas-verdes, assim como as tartarugas-marinhas em geral, são consideradas sentinelas da contaminação aquática, ou seja, conseguem refletir as perturbações do meio ambiente podendo servir como indicador da conservação do ecossistema onde vivem (AGUIRRE; LUTZ, 2004; FLINT et al., 2019). Assim, alguns estudos têm analisado em tartarugas alguns biomarcadores, tais como parâmetros relacionados com o estresse oxidativo (superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase, acetilcolinesterase, butirilcolinesterase e índices de peroxidação lipídica) e a exposição a contaminantes químicos (CYP e GST) (RICHARDSON et al., 2010; LABRADA-MARTAGÓN et al., 2011; TREMBLAY et al., 2017; CASINI et al.,2018; COCCI et al., 2018; COCCI; MOSCONI; PALERMO, 2019). Essas pesquisas utilizaram amostras hepáticas de tartarugas encontradas mortas, coletaram sangue, realizaram a raspagem da carapaça de espécimes vivas, ou ainda, utilizaram biópsias da pele.
A utilização de tartarugas encontradas mortas, por no máximo 24 horas após a morte, em estudos de ecotoxicologia é recorrente (VALDIVIA et al., 2007; RICHARDSON; GOLD-BOUCHOT; SCHLENK, 2009; RICHARDSON et al., 2010; CASINI et al., 2018) e tem possibilitado o avanço desta área científica, ao mesmo tempo em que assegura a conservação do meio ambiente e respeita o direito à vida dessas espécies (Lei nº 5.197 de Proteção à Fauna Silvestre; BRASIL, 1967).
Dentro deste contexto, a aplicação da espécie ameaçada C. mydas no presente projeto, de maneira não destrutiva e não invasiva, por meio de amostras coletadas após a morte, permitiu uma investigação pioneira da atividade da enzima de fase II UGT. Adicionalmente, num futuro próximo, análises da atividade UGT em C. mydas possivelmente serão utilizadas por agências reguladoras em programas de biomonitoramento da qualidade ambiental marinha da costa brasileira, uma vez que seus resultados podem contribuir na interpretação da qualidade do ecossistema em que a espécie se encontra.
Por fim, as respostas de biomarcadores bioquímicos à contaminantes químicos fornecem resultados mais precisos quando as amostras são coletadas em períodos curtos após a morte. Entretanto, ainda é pouco compreendido como as respostas dos biomarcadores mudam em diferentes intervalos de tempo a partir da morte (POZHITKOV et al., 2016). Tendo em vista que pesquisas de ecotoxicologia e programas de biomonitoramento ambiental aplicam carcaças de organismos selvagens para análise de biomarcadores de contaminação, estudos que avaliem a estabilidade post mortem de enzimas chaves da biotransformação, como a UGT, são
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necessários. Portanto, espera-se que este estudo possa auxiliar na compreensão de quanto o tempo entre a morte e a coleta do material biológico interfere nos resultados encontrados, gerando, por consequência, maior confiabilidade aos estudos que aplicam biomarcadores.
1.5 OBJETIVOS
1.5.1 Objetivo geral
Investigar a atividade da enzima de biotransformação uridina difosfato glicuronosiltransferase (UGT) em amostras hepáticas microssomais de tartarugas-verdes (Chelonia mydas - Linnaeus, 1758).
1.5.2 Objetivos específicos
- Determinar os parâmetros cinéticos Km aparente (Kmapp) e velocidade máxima (Vmax) da atividade uridina difosfato glicuronosiltransferase (UGT) para o substrato 4-metilumbeliferona (4-MU) e para o ácido uridina difosfato glicurônico (UDPGA), sob diferentes condições de ensaio;
- Avaliar os efeitos da alameticina e dos surfactantes Brij®58 e Triton®X-100 na latência da atividade UGT;
- Investigar os efeitos da albumina sérica bovina (BSA), do cátion bivalente magnésio (Mg2+), da sacarolactona e da uridina difosfato-N-acetilglicosamina (UDP-GLcNAc) na atividade UGT;
- Estabelecer concentrações ótimas de proteínas microssomais, alameticina, surfactantes (Brij®58 e Triton®X-100), 4-MU, UDPGA, Mg2+ e BSA para o ensaio da atividade UGT em amostras hepáticas de C. mydas;
- Avaliar a atividade UGT ao longo de um intervalo de tempo post mortem (0 h,1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h, 18 h e 24 h);
- Comparar a atividade UGT na fração microssomal de diferentes tecidos (fígado, intestino delgado e rim) de C. mydas;
- Definir intervalos ótimos de quantificação para ensaios da atividade UGT em condições saturantes na presença de diferentes reagentes (alameticina, Brij®58, Mg2+ e BSA);
- Investigar a atuação de potenciais inibidores (ácido litocólico, ácido taurocólico, diclofenaco de sódio, ibuprofeno e paracetamol) da atividade UGT de C. mydas;
- Estabelecer o IC50 relativo para o ácido litocólico e diclofenaco de sódio na atividade UGT de C. mydas.
2 METODOLOGIA
2.1 COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO
As amostras de tecido hepático de C. mydas aplicadas no presente estudo são provenientes da coleção do Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica (LABCAI),pertencente à Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).Tais amostras foram obtidas por meio da parceria do LABCAI com o Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de Santos (PMP-BS).
O PMP-BS foi estabelecido como uma condicionante pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) para licenciamento ambiental das atividades da Petrobras de produção e escoamento de petróleo e gás natural, no Polo Pré-sal da Bacia de Santos. No âmbito desse projeto mais de 1500 km de costa são monitoradas diariamente, compreendendo o litoral entre a Barra da Lagoa de Santo Antônio dos Anjos, em Laguna (em Santa Catarina), até a praia de Camburi, em Ubatuba (no estado de São Paulo). Durante o monitoramento são prestados atendimentos veterinários às aves, tartarugas e mamíferos marinhos encontrados vivos e é realizada a necropsia nos animais encontrados mortos. Por meio desse processo são avaliadas possíveis interferências das atividades de produção e escoamento de petróleo sobre os animais marinhos (PMP-BS, 2017).
Para o processo de padronização da atividade UGT foram utilizadas amostras de microssoma hepático de um número amostral de 10 tartarugas-verdes (n=10), juvenis e fêmeas, encontradas durante o processo de monitoramento no litoral paulista pelo Instituto Argonauta (integrante do PMP-BS), nos munícipios: Caraguatatuba, Ilhabela, São Sebastião e Ubatuba (Tabela 1). As amostras foram coletadas no máximo até 6 horas após a morte, transferidas para microtubos, armazenadas em nitrogênio líquido ou gelo seco e transportadas para o LABCAI. No laboratório as amostras foram armazenadas em freezer a -80 °C até o momento da utilização. Dentro desse contexto, não houve a necessidade de aprovação do projeto pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC (CEUA-UFSC), uma vez que o presente projeto não envolve experimentos com animais vivos, conforme determina a Lei Arouca (nº 11.794) de 2008 (BRASIL, 2008).
