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R O M P E N D O A S B A R R E I R A S D O E S P E R M O G R A M A

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Academic year: 2021

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(1)

Método para Análise

Computadorizada

de Espermatozoides

ROMPENDO AS BARREIRAS DO ESPERMOGRAMA

MACE SPERM TRACKER

ANDERSON

MACE

(2)

Durante 13 anos de pesquisa, iniciando

os trabalhos primeiramente com

espermatozoides humanos, foi possível

constatar empírica e cientificamente que

os espermatozoides apresentam de uma

maneira "explícita" suas características

reprodutivas, seja pelo comportamento de

movimentação (motilidade) ou agitação

frenética de seu flagelo durante seu

deslocamento e trajetória. Quando

saudáveis, eles se comportam sob uma

regra ou equação perfeita que transpõe

para o outro lado do sinal de igual um

resultado significativo e singular, um valor,

um número. Mensurados por técnicas

complexas, porém expressos em valores

numéricos únicos e simples podemos

registrar e avaliar a característica da

célula perpetuadora de cada espécie. Um

espermatozoide saudável ou viável marca

sua trajetória de vida por meio de uma

espécie de “fórmula padrão” que gera um

traçado característico. Trajetórias

retilíneas, trajetórias curvas,

deslocamentos alternados, traçados que

esboçam as reais características de cada

indivíduo flagelar que povoa o líquido

seminal humano ou animal.

Amostra de Sêmen Humano

Câmara de Makler

Amostra de Sêmen Suíno

Microscópio com Contraste de Fase

Para que possamos compreender

estas microscópicas células ativas,

responsáveis pela reprodução

contínua da espécie humana e animal,

obtendo-se uma análise detalhada

destes agentes reprodutivos,

detentores de uma propulsão motora

exclusiva, primeiro torna-se necessário

conhecer um pouco de sua anatomia

para depois estudar a sua "Mecânica

Reprodutiva".

Os Espermatozoides

e a "Equação da Vida"

Força Motriz do Flagelo do Espermatozoide extraída do comportamento, velocidades e frequência flagelar em meio a viscosidade do fluído seminal

(3)

As funções dedicadas embutidas nos

algoritmos do

MACE SPERM TRACKER

permitem ler estes valores complexos com

metodologia simples, traduzindo-os e

apresentando-os de forma amigável e de fácil

interpretação ao analista, que antes em sua

subjetividade, talvez, não poderia perceber.

Com o trabalho conjunto destas funções

desenvolvidas para mensurar a mecânica do

espermatozoide, nasceu um método ou uma

variante de critérios e sistemas. Um método

inteligente, que transforma a complexidade e a

quantidade, na simplicidade e singularidade,

mostrando através de índices e sinais visuais, a

verdadeira capacidade reprodutiva de cada

espermatozoide classificado em populações e

subpopulações.

A base do estudo, pesquisa e desenvolvimento foi

o critério conhecido como

Computer Assisted

Sperm Analisys (Análise de Espermatozoides

Assistida por Computador) ou CASA

como

difundido no meio andrológico veterinário e

humano. Estudar este critério abriu um prisma de

opções e alternativas de desenvolvimento de

metodologia para ir além do padrão de variáveis e

leituras já usadas e compreendidas. O objetivo

não foi apenas criar, mas recriar, adaptar, para

romper as barreiras dos altos custos e cada vez

mais chegar com exatidão na leitura da "equação

da vida" destas pequenas e vibrantes células

motorizadas.

Velocidades, trajetórias, comportamento de

movimentação, frequência, força de impulsão

(Força motriz) entre outras muitas variáveis que

podem, graças ao resultado de uma pesquisa,

desenvolvimento e recursos da tecnologia

digital de baixo custo e inovação disruptiva,

permitindo assim calcular cada “linha de vida”

dos espermatozoides capturados pelo olhar

digital de um equipamento de fácil manipulação

e acessibilidade.

Barreiras alicerçadas por segredos e reforçadas

por muito pouca divulgação compreensiva de

estudos e artigos científicos acabam por criar uma

parede, tornando restrito o conhecimento da

análise assistida por computador a uma minoria de

pesquisadores e estudantes, mantendo assim

ainda hoje, a análise subjetiva como o recurso

padrão da grande maioria dos estudantes e

profissionais da medicina veterinária

especializados na área de reprodução animal e

inseminação artificial.

Amostra de Sêmen Equino

Microscópio sem Contraste de Fase

Trajetórias dos Espermatozoides

(4)

Nomenclatura usada no

Mace Sperm Tracker

Cada linha de informação digital, de cada espermatozoide, capturado e registrado no vídeo gravado, é convertida em

um registro, em uma linha de dados armazenada que representa as variáveis de uma "equação" que os algoritmos do

método MACE traduzem e expressam em uma única interface gráfica de forma clara e precisa para o analista.

Exemplo: Espermatozoide N° 120 [ 35.14399 29,101086 22,761469 0,7821519 0,828053 5,451613 ]

Leituras

VCL VAP VSL STR ALH BCF

Motilidade Total (%): Representa a porcentagem de espermatozoides que se deslocam de uma maneira adequada dentro dos parâmetros de motilidade logo abaixo descritos. Este valor é calculado classificando os espermatozoides em subpopulações através de suas velocidades e parâmetros VCL, VAP, VSL, STR, ALH, BCF e LIN.

VCL (Velocidade Curvilinear): É a velocidade de deslocamento do espermatozoide durante sua trajetória circular em µm/s (mícrons por segundos). Representa a velocidade da trajetória "real" do espermatozoide. É sempre a maior das três velocidades e serve como elemento de cálculo para a linearidade.

VAP (Velocidade Média): Representa a velocidade ponto a ponto em um caminho construído usando uma média de deslocamento em µm/s. Representa a velocidade da trajetória média dos espermatozoides. Em casos, onde o comportamento da cabeça é muito regular e linear com pouco movimento lateral da cabeça, a VAP é quase a mesma que a VSL, porém com trajetórias irregulares, não lineares ou onde existe um alto grau de movimento lateral (ALH) da cabeça, a VAP será maior que a VSL.

VSL (Velocidade Retilínea): Este valor é mensurado usando-se como referência o ponto de partida, o caminho médio e o ponto mais distante atingido pelo espermatozoide a partir de sua origem (µm/s). É a velocidade medida em função da linha reta estabelecida entre o primeiro e o último ponto da trajetória do espermatozoide. É sempre a mais baixa das três velocidades.

STR (Retilinearidade): É o resultado da divisão entre a VSL e a VAP. Descreve o percentual de “curvatura” da trajetória. É um valor inversamente proporcional, ou seja, quanto maior for o índice percentual, mais reta será a trajetória do espermatozoide (valor expresso em %). Estima a proximidade do percurso da célula reprodutiva com relação a uma linha reta.

· Exemplo sobre os dados acima: 22,761469 / 29,101086 = 0,7821519 – multiplicado por 100 por ser expresso em valores percentuais = 78,21 %.

ALH (Amplitude Lateral da Cabeça): É o resultado da divisão entre a VAP e a VCL. Descreve o movimento lateral (lado a lado) da cabeça do espermatozoide. Expresso (µ mícrons) é o comportamento que gera a “sinuosidade da trajetória”. Esta variável armazena a distância que a cabeça do espermatozoide desloca-se com relação à cauda ou flagelo (valor expresso em µm). Representa a amplitude do deslocamento médio da cabeça do espermatozoide em sua trajetória real. A mensuração desse parâmetro esta relacionada com a capacidade de penetração na zona pelúcida do óvulo, assim, a ALH é um dos parâmetros que tem efeito sobre a fertilização.

· Exemplo sobre os dados acima: 29,101086 / 35,14399 = 0,828053 µm

BCF (Freqüência de Batimento Flagelar em Hz): Este valor é calculado vetorialmente, detectando-se a frequência em Hertz (Hz) com que o VCL cruza a linha de VAP. Representa a característica de progressão dos espermatozoides viáveis. Assim, uma frequência mais baixa indica um espermatozoide de projeção positiva, enquanto uma frequência mais alta indica o deslocamento irregular do espermatozoide, com trajetórias de alta sinuosidade, com VAP abaixo das referências e percentuais de retilinearidade

STR também abaixo dos valores de referência.

LIN (Linearidade): Representa o valor encontrado da divisão entre a VSL e a VCL. Apresenta o percentual de linearidade do espermatozoide, mensura o movimento retilíneo do espermatozoide. Quanto maior for o índice percentual, mais reta é a trajetória do espermatozoide. (Valor expresso em valor %). Quanto mais o espermatozoide se afasta da velocidade em linha reta, menor será sua linearidade.

MACE

- Na mira do melhor

entre os melhores

(5)

Pesquisadores, cientistas, estudiosos,

autodidatas, desenvolvedores de

sistemas e metodologias, têm a

obrigação de levar ao âmago estudantil e

acadêmico e até mesmo profissional,

novas criações, métodos adaptados ao

contexto econômico de cada região,

estado, pais ou continente, tornar o

complexo simples e compartilhar novas

maneiras de ver e interpretar as

“equações matemáticas” destes

microscópicos agentes da vida - os

espermatozoides.

Abrir novos horizontes para as novas

mentes pensantes de nossa época,

cultivar novas ideias e avanços nas

pesquisas de manutenção e preservação

da vida tanto para a espécie humana

como animal.

Através de novos métodos e técnicas de

interpretação, não estamos apenas

reinventando a roda criada pelas

potências do espermograma estamos

redesenhando, melhorando,

simplificando, no sentido mais econômico

da projeção de ideias. Estamos criando

novas formas de interpretação gráfica,

vislumbrando estatísticas de um mundo

microscópico e de suas populações e

subpopulações, traçando novos caminhos

nesta vasta região de pesquisa que

penso ainda engatinhar. Devemos evoluir

nos conceitos e interpretações, gerar

resultados que resumam a análise

computadorizada, apresentar novos

índices, novas maneiras de leitura,

medidas e compreensão.

(6)

FLAGELO ou CAUDA

Movimenta-se freneticamente em círculos

para impulsionar o espermatozoide.

ACROSSOMA - PARTE DA CABEÇA

O acrossoma é uma organela localizada na

região frontal da cabeça do espermatozoide,

contendo enzimas essenciais à sua

penetração no óvulo.

NÚCLEO - PARTE DA CABEÇA

É onde fica o material genético transmitido

pelo pai.

COLO - PEÇA INTERMEDIÁRIA (o Motor de

Propulsão do Flagelo)

Logo atrás da cabeça, vem um reservatório

de mitocôndrias (em forma espiral) que

fornecem energia para a propulsão do

espermatozoide, o motor de propulsão do

flagelo ou cauda.

Poderíamos apresentar

inúmeras outras

descrições e conteúdo

científico relacionado a

cada componente da

estrutura da célula

reprodutiva masculina,

porém para nosso estudo

e apresentação baseado

no método MACE de

análise, precisamos

apenas destas

descrições para

compreender o

comportamento motor e

o deslocamento do

espermatozoide durante

seu registro nas imagens

digitais gravadas.

(7)

O Microscópio

Requisitos do Equipamento Óptico

O

Mace Sperm Tracker

precisa para funcionar

adequadamente de um microscópio óptico com

aumento a partir de 400x até 1000x e com

características ópticas de bom contraste e brilho. De

preferência, equipado com subconjunto de contraste de

fase, embora seja possível utilizar microscópios de

campo claro com bom contraste. Ao utilizar microscopia

de campo claro é necessário o uso de filtros. O filtro

verde e o filtro azul forneceram bons resultados durante

o desenvolvimento e testes do método Mace. As

imagens fornecidas por microscópios com pouco

contraste, predominantemente claras ou muito escuras

podem gerar problemas à qualquer metodologia de

análise assistida por computador. No caso de imagens

com baixo contraste torna-se difícil para os

interpretadores de imagem (algoritmos) à distinção

entre os espermatozoides, plano de fundo ou outras

partículas (corpúsculos) coadjuvantes da amostra

seminal. Por outro lado, o contraste de fase apresenta

uma imagem magnífica para gravação da atividade

motora dos espermatozoides.

Pode-se observar subjetivamente na ocular

de equipamentos com contraste de fase,

que a cabeça do espermatozoide aparece

mais brilhante, envolta em uma espécie de

círculo luminescente contornando e

destacando o espermatozoide do plano de

fundo. Esta particularidade, agregada a

esta tecnologia óptica, resulta em imagens

mais nítidas com alto contraste, boa

definição, exigindo com isso, velocidades

mais baixas do número de quadros por

segundo (Frame Rate) da câmera digital

acoplada ao microscópio.

O método

MACE

necessita de vídeos gravados com

apenas 14 quadros por segundo ( Frame Rate 14

ajustado automaticamente pelo

MacEye

– Módulo

gravador de vídeo da amostra ) na composição do

vídeo que obrigatoriamente deve ter 30 ou 60

segundos de duração, gravado exclusivamente no

formato AVI, o que irá gerar aproximadamente 860

quadros ( em câmeras de 2 MPixels ) para serem

analisados. O vídeo gravado será posteriormente

analisado pelo método e dele serão extraídos os

vetores de motilidade dos espermatozoides.

(8)

Modelo de Utilitário Laboratorial

MACE CHAMBER - Câmara para Análise de Sêmen

Como utilidade de análise o

Mace Sperm

Tracker

fornece a parte para seus

usuários um modelo de utilidade

laboratorial específico para utilização

com o método. Esta câmara de análise

de fluídos biológicos (Fig. ao lado) foi

criada e utilizada durante as pesquisas e

testes do método. O veterinário poderá

utilizar a

Mace Chamber

que pode ser

adquirida separadamente, como uma

lâmina de análise que possui

características específicas para esta

finalidade, isolando e protegendo a área

de preparo da amostra de sêmen e

podendo ser utilizada por inúmeras

vezes.

A câmara Mace foi projetada com

uma espécie de “piscina de

contensão de fluídos biológicos”,

localizada no centro da lâmina de

vidro cristal de quartzo, para

análise direta, com ou sem a

lamínula circular protetora como

nas lâminas laboratoriais

convencionais.

(9)

Mace Chamber – Câmara para Análise Laboratorial de Fluídos Biológicos (esq.)

Lamínula circular 13 mm (opcional) para uso com a Câmara de Análise - Mace Chamber

A piscina de contensão de fluídos biológicos (que pode ser observada no centro da lâmina da foto ao lado) permite analisar uma maior quantidade de sêmen. Ela tem a finalidade de conter o fluído seminal numa área protegida e de superfície de distribuição maior que as similares existentes sem o risco de vazamento na borda da lâmina comum. Numa análise de fluído seminal animal, por exemplo, o observador ou analista permitirá à sua pesquisa uma maior

área de movimentação ou motilidade espermática dos espermatozoides alvos de sua observação. Como a área da “piscina de análise” é maior que a maioria das lâminas ou câmaras de analise de sêmen já existentes no mercado, torna-se fácil à limpeza e esterilização da piscina de contensão da amostra e da lâmina permitindo seu uso por inúmeras vezes sem a necessidade de descartá-la

De fácil manipulação com áreas foscas lixadas, sem risco de escorregões da mão do analista e com

total cristalinidade na área da “piscina de análise”, não foram observadas quaisquer aberrações ópticas

causadas por reflexão de luz ou refrações durante testes realizados com microscópios ópticos, com ou

sem contraste de fase.

Produzida em vidro quartzo cristal, com uma espessura de três milímetros de

base e com dimensões de comprimento de nove centímetros, largura de três

centímetros, difere-se por ser composta por uma câmara de contensão de fluído

biológico chamada de “piscina”, esta com dois centímetros de diâmetro interno

(possibilitando o uso de lamínula circular de 13 mm), profundidade de dois

milímetros e uma borda de três milímetros de largura. Em sua estrutura possui

duas áreas de sua superfície com 1,5 cm em cada extremidade de sua lâmina

base, que recebeu tratamento fosco (áspero) na parte inferior para facilitar a sua

manipulação sem riscos de acidentes.

(10)

A Câmera de Vídeo Digital USB

A câmera digital de captura das imagens a partir da

ocular do microscópio ou tubo trinocular também deve ter

especificações técnicas mínimas para uma boa gravação

das imagens.

Para uso com esta metodologia, a câmera digital deve

ser conectada à uma porta USB livre do PC desktop ou

notebook (não é aconselhado o uso de HUBs). A

configuração mínima do dipositivo de imagem deve ser:

2MP (Mega Pixels) de capacidade gráfica do sensor de

imagem (CMOS) equipada com recurso que possibilite a

gravação de vídeos no formato AVI e com resolução

mínima de 640 x 400 pixels (30 fps até no mínimo 14

quadros ou frames por segundo). A câmera digital

responsável pela gravação das imagens deve possuir

rosca adaptadora ou anel de adaptação tanto para

microscópios binoculares (acoplada através da ocular)

como para trinoculares (acoplada ao tubo de acesso

superior do microscópio).

Os modelos NO294 e NO297 da

ToupTek facilmente encontrados no

Brasil são câmeras CMOS de baixo

custo e excelente qualidade gráfica,

podendo serem usadas com

microscópios binoculares ou

trinoculares

Observações: O PC desktop ou Notebook que irá rodar o

método deve ter uma memória mínima de 2GB de RAM

(recomendado 4GB), um HD (disco rígido) de 500GB

(espaço para a gravação dos vídeos), sistema operacional

Microsoft Windows a partir da versão 7 32 ou 64 bits, com

ao menos uma porta USB 2.0 livre para conectar a câmera

digital e um processador CPU - Dual Core a partir de 2GHZ.

Computadores com recursos inferiores aos indicados

podem ser usados, mas podem resultar em processamento

de imagens e resultados mais demorados com risco de

travamentos.

Com base nas pesquisas e testes a que foi submetido o conjunto Mace

Sperm Tracker testado por mais de 10 anos sob as mais variadas

configurações e condições de hardware, esta documentação foi desenvolvida

com o objetivo de repassar para seus novos usuários a melhor configuração,

criando um ambiente específico e perfeito para sua utilização sem prejudicar

no processo de análise e consequente obtenção de resultados imprecisos.

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