UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
Thatiane Cristina de Moura
Estudo da transmissão glutamatérgica no globo pálido de ratos com exposição subaguda ao manganês
CAMPINAS 2015
Thatiane Cristina de Moura
Estudo da transmissão glutamatérgica no globo pálido de ratos com exposição subaguda ao manganês
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADOR: Dr. Alan Stewart Hazell
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA THATIANE CRISTINA DE MOURA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. ALAN STEWART HAZELL.
CAMPINAS 2015
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
THATIANE CRISTINA DE MOURA
ORIENTADOR: PROF. DR ALAN STEWART HAZELL
MEMBROS:
1. PROF. DR. ALAN STEWART HAZELL
2. PROFA. DRA. CLAUDIA VIANNA MAURER MORELLI
3. PROF. DR. RAÚL BONNE HERNANDÉZ
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
“Dedico este trabalho à minha prima Bruna (in memoriam), uma jovem exemplo de força e superação, que me inspirou a ver a Ciência com os olhos de quem busca esperança.”
AGRADECIMENTOS
À minha família pelo amor, dedicação e suporte. Todo esforço de vocês para garantirem uma boa educação resultou em mais uma grande conquista em minha vida.
Ao meu noivo Felipe pelo carinho, paciência e companheirismo. Obrigada por me apoiar em todas as decisões, por me ajudar a manter o equilíbrio nos momentos difíceis e por compreender minha ausência em todos os dias que me dediquei a esse trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Alan Stewart Hazell por todo conhecimento compartilhado ao longo desses anos e pela oportunidade de fazer parte de um grupo de trabalho tão maravilhoso. Seus ensinamentos não só me fizeram crescer profissionalmente, mas também me prepararam para enfrentar os desafios futuros.
Aos meus amigos e companheiros de laboratório Vinícius, Szeifoul, Ashraf, Shihadeh e Samantha. Compartilhamos momentos difíceis em nossa jornada como alunos, mas os momentos felizes superam tudo. Sou muito grata por todo apoio acadêmico e emocional que vocês me deram; por todas as noites que passaram ao meu lado trabalhando; por todas as discussões científicas que contribuíram para o sucesso desse trabalho.
À minha amiga e bióloga responsável Amanda Almeida. Agradeço por todos os ensinamentos e por todos os conselhos sábios de uma profissional que cresce a cada dia com sua simpatia e prontidão em ajudar o próximo.
Ao Prof. Rodrigo Fabrizzio por todo suporte e prontidão em ajudar e transmitir seus conhecimentos em cultura celular.
À bióloga Dongmei Wang da Universidade de Montreal por ter me acolhido tão bem e por todo conhecimento laboratorial transmitido, que me estruturou para desenvolver os experimentos com clareza e segurança.
À química Karina Lins por toda sua paciência e dedicação em me ajudar com os cálculos, diluições e teoria química. Seu apoio foi muito importante para qualidade do meu trabalho.
Ao Prof. Alexandre Rezende e suas alunas Gabriela e Aline por estarem sempre com as portas do laboratório abertas e por todo conhecimento de análise de imagem.
Aos funcionários do CEMIB por toda atenção e dedicação de vocês aos animais utilizados.
Ao Programa de Pós-graduação em Fisiopatologia Médica, em especial ao Prof. Marcondes e à Regina por toda paciência, atenção e dedicação em garantir a organização dos processos ao longo do Curso.
A todos os meus amigos por compreenderem minha ausência em muitas comemorações e fins de semana. Obrigada por estarem ao meu lado garantindo a alegria que renova minhas energias.
RESUMO
O manganês (Mn) é um metal essencial para funcionamento normal de diversos processos fisiológicos, porém em altas concentrações ocasiona o desenvolvimento de uma síndrome extrapiramidal subcortical conhecida como Manganismo, cujos sintomas assemelham-se aos da Doença de Parkinson. A Neurotoxicidade causada pelo Mn foi caracterizada por uma perda seletiva de neurônios acompanhada de uma proliferação astroglial no globo pálido, assim como alterações morfológicas conhecidas como Astrócitos Alzheimer tipo II. Apesar de os mecanismos envolvidos nesses processos ainda não terem sido completamente elucidados, diversos estudos sugerem que a excitotoxicidade é uma das principais características desse transtorno. Para melhor compreendermos esse processo, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos iniciais do Mn em cultura primária de astrócitos e em modelo subagudo de exposição. Na cultura primária de astrócitos, as células foram expostas por 48h a 1) 100μM de Cloreto de Manganês (II) tetrahidratado (Grupo Mn), 2) MnCl2 e 300 μM de Ceftriaxona (Grupo Mn+CEF), 3) Ceftriaxona (Grupo CEF) ou 4) somente meio de cultura suplementado (Grupo Controle). Para os experimentos in vivo, ratos adultos Sprague-Dawley foram separados em quatro grupos: 1) Grupo Controle, tratados com salina; 2) Grupo Mn: administrados diariamente com Cloreto de Manganês (II) tetrahidratado (50mg/kg, i.p.); 3) Grupo Mn+CEF: administrados diariamente com Cloreto de Manganês (II) tetrahidratado (50mg/kg, i.p.) e com Ceftraixona (200mg/kg, i.p.) após uma hora; 4) Grupo CEF: administrados apenas com Ceftraixona (200mg/kg, i.p.). O exame do número de células neuronais coradas com Cresil Violeta e a imunohistoquímica com NeuN mostrou não haver nenhuma alteração significativa no globo pálido após tratamento subagudo com Mn. As análises de expressão proteica dos transportadores de glutamato astrocitários GLT-1 e GLAST in vivo e in vitro não demonstraram alterações estatisticamente significativas, embora tenham sofrido sutis variações. Os níveis de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em astrócitos do globo pálido mantiveram seus níveis próximos ao controle após o tratamento com Mn, indicando não haver reação de astrogliose. Curiosamente, a coadministração
de Mn com CEF resultou em uma redução da captura de glutamato em cultura primária de astrócitos, sugerindo que essa droga seja capaz de exercer uma influência negativa sobre o transporte de glutamato diante de um metabolismo energético deficiente, uma característica estabelecida na exposição ao Mn. Em conjunto, os resultados indicam que os efeitos de Mn na transmissão glutamatérgica pode ser uma resposta tardia em comparação às alterações iniciais, como redução do metabolismo energético e desenvolvimento de astrócitos Alzheimer tipo II.
Palavras-Chave: Intoxicação por manganês, Síndromes neurotóxicas, Astrócitos, Ceftriaxona.
ABSTRACT
Manganese (Mn) is an essential metal for the normal functioning of many physiological processes, but in high concentrations causes the development of a subcortical extrapyramidal syndrome known as manganism, in which the symptoms are similar to those of Parkinson's disease. Neurotoxicity caused by Mn is characterized by a selective loss of neurons accompanied by an astroglial proliferation in the globus pallidus, and morphological changes known as Alzheimer type II astrocytes. Although the mechanisms involved in these processes have yet not been fully elucidated, several studies suggest that excitotoxicity is a major feature of the disorder. To better understand the process, this study aimed to investigate the initial effects of Mn in primary cultures of astrocytes and in a subacute exposure model. In primary cultures of astrocytes, the cells were exposed for 48h to 1) 100μM of manganese (II) chloride tetrahydrate (Mn group), 2) MnCl2 + 300 mM of Ceftriaxone (Group Mn + CEF), 3) Ceftriaxone (CEF Group), or 4) supplemented culture medium only (Control group). For in vivo experiments, adult Sprague-Dawley rats were divided into four groups: 1) Control group, saline treated; 2) Mn group, administered daily with manganese (II) chloride tetrahydrate (50mg / kg, i.p.); 3) Mn + CEF group: administered daily with manganese (II) chloride tetrahydrate (50mg / kg, i.p.) and ceftriaxone (200mg / kg, ip) after one hour; and 4) CEF: ceftriaxone only administered (200mg / kg, ip). Examination of neuronal cell numbers with cresyl violet staining and NeuN immunohistochemistry showed no significant change in the globus pallidus following sub-acute Mn treatment. Protein expression analysis showed astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST both in vivo and in vitro did not show statistically significant changes, although they underwent subtle variations. Levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in astrocytes of the globus pallidus remained close to control following Mn treatment, indicating no astrogliosis reaction. Interestingly, co-administration with CEF Mn resulted in a reduction of glutamate uptake in astrocytes, suggesting that the drug may be capable of exerting a negative influence on glutamate transport in the presence of impaired energy metabolism, an established feature of Mn exposure. Together, the results
indicate that the effects of Mn on glutamatergic transmission may be a later response compared to earlier changes such as decreased energy metabolism and development of the Alzheimer type II astrocytic change.
Keywords: Manganese poisoning, Neurotoxicity syndromes, Astrocytes Ceftriaxone.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismos de transporte de Manganês através da Barreira Hematoencefálica (BHE). Representação dos transportadores de Manganês segundo seu estado de oxidação. A largura das setas faz alusão à importância relativa de cada um dos transportadores neste processo. O termo vazamento se refere aos capilares fenestrados que formam a BHE dos órgãos circunventriculares. O complexo Mn2+ -Albumina tem a passagem limitada pelo seu tamanho. (Tf) Transferrina; (DMT-1) Transportador de Metais Divaletes tipo-1; (ZIP8) Transportador de zinco 8 (Modificado de Aschner et al., 2007) (10).
Figura 2. Mecanismos de transporte demonstrando as vias de influxo e efluxo de Manganês nas células. Representação dos transportadores de Manganês segundo seu estado de oxidação. (Tf/TfR) Transferrina/ Receptor de Transferrina; (DMT-1) Transportador de Metais Divaletes tipo-1; (ZIP8/ZIP4) Transportadores de zinco 8 e 4; (DAT) Transportador de Dopamina; (SLC30A10) Carreador de solutos- Família 30- Membro 10; (SPCA1) Via Secretora de Ca2 + -ATPase isoforma 1; (ATP13A2) ATPase tipo 13 A2 lisossomal (Chen et al., 2015) (11).
Figura 3: Representação do Ciclo Glutamina-Glutamato. (Gln) glutamina; (Glu)
glutamato; (Gt) transportador de glutamato (n) neuronal e (g) glial. (Modificado de Forman et al., 2009) (52).
Figura 4: Imagem representativa da confirmação da linhagem de astrócitos in vitro por marcação com anti-GFAP, marcador padrão para reconhecimento de astrócitos. Figura 5: Astrócitos em condições in vitro. Em (A) determinação da dosagem de 500μM de dBcAMP para aumento da expressão de GLT-1 através da técnica de Western Blotting; em (B) morfologia com formato estrelado e processos elaborados (setas) compatíveis aos astrócitos maduros após 7 dias de exposição ao dBcAMP; em C imunocitoquimica, avaliando a expressao de GLT-1 nos astrócitos in vitro.
Figura 6: Western Blotting demonstrando ausência de feito do manganês na expressão proteica de GLT-1 em astrócitos tratados com 100µM de Mn por 48 horas, p = 0,76. Os níveis de proteína foram avaliados por densitometria (n=6). Os resultados estão expressos em porcentagem da média ±SEM em comparação ao controle (one-way ANOVA com post-hoc Tukey).
Figura 7: Western Blotting demonstrando ausência de feito do manganês na expressão proteica de GLAST em astrócitos tratados com 100µM de Mn por 48 horas, p = 0,88. Os níveis de proteína foram avaliados por densitometria (n=6). Os resultados estão expressos em porcentagem da média ±SEM em comparação ao controle (one-way ANOVA com post-hoc Tukey).
Figura 8: Representação gráfica do número de núcleos neuronais corados com Cresil Violeta. A análise histológica demonstra não haver alteração quantitativa neuronal entre os grupos, p= 0,33. Os resultados estão expressos em média ±SEM (one-way ANOVA com post-hoc Tukey). (n=5)
Figura 9: Western Blotting demonstrando ausência de feito do manganês na expressão proteica de GLT-1 no globo pálido, p= 0,85. Os níveis de proteína foram avaliados por densitometria (n=4). Os resultados estão expressos em porcentagem da média ±SEM em comparação ao controle (one-way ANOVA com post-hoc Tukey).
Figura 10: Western Blotting demonstrando ausência de feito do manganês na expressão proteica de GLAST no globo pálido, p= 0,97. Os níveis de proteína foram avaliados por densitometria (n=4). Os resultados estão expressos em porcentagem da média ±SEM em comparação ao controle (one-way ANOVA com post-hoc Tukey).
Figura 11: Representação gráfica do número de núcleos neuronais marcados com NeuN no globo pálido. Os dados demonstram não haver alteração quantitativa neuronal entre os grupos, p=0,83. Os resultados estão expressos média±SEM (one-way ANOVA com post-hoc Tukey). (n=5)
Figura 12: Imunofluorescência no globo pálido com marcação do anticorpo NeuN demonstrando núcleos neuronais. Magnificação 40x, Barra de escala: 100µM.
Figura 13: Representação gráfica do número de núcleos neuronais corados com Cresil Violeta. A análise histológica demonstra não haver alteração quantitativa neuronal entre os grupos, p= 0,33. Os resultados estão expressos em média ±SEM (one-way ANOVA com post-hoc Tukey). (n=5)
Figura 14: Fotomicrografias representando a região do globo pálido em cortes de cérebro corados com Cresil Violeta. Magnificação 20x, Barra de escala: 100µM.
Figura 15: Representação gráfica da quantificação de imunorreatividade à GFAP no globo pálido após 4 dias de exposição ao Mn. Observa-se que não houve alteração entre os grupos experimentais, n=5.
Figura 16. Análise imunohistoquímica do globo pálido marcado com anti-GFAP após quatro dias de exposição ao Mn. Não houve alteração significativa entre os grupos. Magnificação 40x, Barra de escala: 100µM.
Figura 17: Determinação da expressão de GFAP no globo pálido através da técnica de Western blotting. Os níveis de proteína foram avaliados por densitometria (n=4). Os resultados estão expressos em porcentagem da média ±SEM em comparação ao controle (one-way ANOVA com post-hoc Tukey).
Figura 18. Representação esquemática (A) da neurotransmissão glutamatérgica em condições normais, (B) em pacientes com Manganismo e (C) no modelo subagudo de exposição ao Mn desenvolvido no presente estudo.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Transportadores de glutamato, expressão e padrão de distribuição. (Modificado de Maragakis & Rothstein, 2004) (56).
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
6-OHDA - 6-hydroxydopamine
AMPA - Alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico ATP - Adenosina trifosfato
ATP13A2 - ATPase tipo 13 A2 lisossomal BIS II - Bisindolylmaleimide II
Ca2+ - Cálcio
cAMP - Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
CEF - Ceftriaxona
DAT - Transportador de Dopamina
dBcAMP - N6,2′-O-Dibutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt
DHK - Dihydrokainate
DMEM - Dulbecco’s modified Eagle Medium DMT-1 - Transportador de Metais Divaletes tipo-1 EAATs - Transportadores de aminoácidos excitatórios EAATs - Ttransportadores de aminoácidos excitatórios ELA - Esclerose Lateral Aminotrófica
FDA - Food and Drug Administration
Fe - Ferro
FoxO - Orkhead winged-helix transcription factor O GABA - Ácido gama-aminobutírico
GFAP - Glial Fibrillary Acidic Protein
GLAST - Transportador de glutamato/aspartato
GLT-1 - Transportador de glutamado 1
Glu - Glutamato
GPe - Globo Pálido externo
GPi - Globo Pálido interno
GSH - Glutamato Sintetase
Gt - Transportador de glutamato HDACs - histona desacetilases
IKKα - Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit alpha
IL - Interleucina
IP3 - Inositol Trifosfato
IκBα - Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha
K+ - Potássio
KMnO4 - Permanganato de Potássio
L-dopa - (S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl) propanoic acid MAPK - Proteína-quinase ativadas por mitógenos
mGluR - Receptores metabotrópicos
MMT - Manganês Tricarbonil Metilciclopentadienil
Mn - Manganês
MN - Manganismo
Mn2+ - Manganês divalente Mn3+ - Manganês trivalente MnO2 - Dióxido de Manganês
Mn-SOD - Superoxido dismutase de manganês mRNA - Ácido Ribonucleico mensageiro MTP - Poros de transição mitocondrial
Na+ - Sódio
NeuN - Neuronal nuclear antigen protein/neuronal marker NF-kB - Factor nuclear kappa B
NMDA - N-metil-D-aspartato PAS - Ácido para-aminosalicílico PKC - Proteína Quinase C
PMA - Activator - phorbol 12- myristate 13-acetate PPAR - Gama coativador-1
ROS - Espécies reativas de oxigênios SEM - Erro Padrão da Média
SLC30A10 - Solute carrier family 30, member 10 SNC - Sistema Nervoso Central
SPCA1 - Via Secretora de Ca2 + -ATPase isoforma 1
Tf - Transferrina
TfR - Receptor de Transferrina
TH - Tirosina Hidroxilase
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral Alfa
YY1 - Yin Yang 1
ZIP4 - Transportador de zinco 4 ZIP8 - Transportador de zinco 8
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 19
1.1 Manganês ... 19
1.1.1 Absorção, excreção e transporte. ... 21
1.1.2 Formas de Intoxicação ... 25
1.3 Globo Pálido ... 26
1.4 Astrócitos e Manganês ... 28
1.5 Transmissão Glutamatérgica ... 30
1.6 Transportadores de Glutamato ... 32
1.7 Tratamentos para intoxicação com Mn ... 35
1.8 Ceftriaxona ... 35
1.9 Modelo animal para Manganismo ... 37
1.10 Justificativa ... 40 2. OBJETIVOS ... 41 2.1 Objetivos gerais ... 41 2.2 Objetivos específicos ... 41 2.2.1 In vitro ... 41 2.2.2 In vivo ... 41 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 42
3.1 Modelo Subagudo de Manganismo em ratos ... 42
3.2 Cultura Primária de Astrócitos ... 43
3.3 Western Blotting ... 44 3.3.1 In vitro ... 44 3.3.2 In vivo ... 44 3.4 Imunofluorescência ... 47 3.5 Imunocitoquímica. ... 48 3.6 Captura de Glutamato ... 48 3.7 Análise Estatística ... 49 4. RESULTADOS ... 50 4.1 In vitro ... 50
4.1.1 Confirmação da linhagem celular de astrócitos e da expressão de GLT-1. ... 50
4.1.2 O efeito do Mn na expressão proteica dos transportadores de glutamato
GLT-1 e GLAST em cultura primária de astrócitos. ... 52
4.1.3 Redução da captura de glutamato no cotratamento de Manganês com Cetriaxona ... 55
4.2 In vivo ... 56
4.2.1 O efeito do Mn na expressão proteica dos transportadores de glutamato GLT1 e GLAST na região do globo pálido ... 56
4.2.2 Sobrevivência neuronal na região do globo pálido ... 59
4.2.3 Imunorreatividade de GFAP na região do globo pálido. ... 63
5. DISCUSSÃO ... 66
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 75
8. ANEXOS ... 88
8.1 Aprovação do comitê de ética CEUA/UNICAMP... 88
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, houve um aumento considerável no número de estudos envolvendo Mn no Brasil. Graças à nossa geologia, favorável à ocorrência de jazidas de minerais ferrosos, o manganês sempre ocupou uma posição de destaque na mineração e na indústria siderúrgica. Além disso, diversos trabalhos nacionais relataram altos níveis de Mn na água, solo, ar e até mesmo alimentos e diferentes regiões do país (1-4).
Segundo o Relatório de Qualidade das águas superficiais do Estado de São Paulo de 2014 (5), os níveis de Mn vêm se apresentando acima do estabelecido pelas normas ambientais ao longo dos últimos anos. Uma das razões apontadas é a constituição do solo, fonte significativa de Mn para os corpos hídricos através do processo erosivo associado à ausência ou má preservação das matas ciliares (5). No sudeste do Brasil, um estudo das águas superficiais e sedimentos do Rio Pardo também revelaram altas concentrações de Mn em ambos os aspectos analisados, o que foi relacionado à incidência de atividade agrícola e às características geológicas da bacia (4). O mesmo foi relatado nas águas do rio Pardinho, localizado no sul do país (3). Utilizando o cabelo como biomarcador não invasivo, um estudo envolvendo pessoas vivendo nos arredores desse rio revelou que, mesmo resultante de causas naturais, houve o aumento das concentrações de manganês na água, solo e em alimentos (3). Dessa forma, a exposição de população a altos níveis de Mn demonstra ser um relevante problema de saúde pública no Brasil.
1.1 Manganês
O manganês é um metal de transição pertencente à família VIIb da tabela periódica. Foi descoberto em 1774 pelo químico sueco Carl Wilhelm
Scheele e isolado pela primeira vez através da redução de MnO2 com carvão por seu colaborador Johan Gottlieb Gahn (6).
Assim como os outros elementos de transição, devido sua configuração eletrônica, o Mn pode assumir 11 estados de oxidação (de -3 até +7), sendo as formas Mn2+ e Mn3+ as mais frequentes em condições fisiológicas (7).
Na natureza aparece em diversas formas físicas e químicas no solo, na água e no ar, ocupando a décima segunda posição entre os elementos mais abundantes da crosta terrestre (8).
As principais reservas mundiais de Mn estão localizadas na África do Sul (26,5%), Ucrânia (24,7%), Austrália (17,1%), Brasil (8,8%) e Índia (8,7%) (9).
No Brasil, o minério de manganês é produzido desde o século XIX, período no qual o Estado de Minas Gerais exportava sua produção para indústrias siderúrgicas norte americanas. Tradicionalmente o manganês ocupou a primeira posição na exportação de bens minerais até 1942, quando foi ultrapassado pelo minério de ferro com a criação da Cia Vale do Rio Doce. Cerca de 90% da produção de manganês no Brasil era exportada até o ano de 1960. Foi somente a partir de 1980 que a parcela exportada tornou-se menor que a demanda interna, consumida principalmente pela indústria siderúrgica nacional (10).
As principais reservas brasileiras de manganês estão distribuídas na região sudeste nos Estados de Minas Gerais, Espírito Santo e São Paulo; na região norte no Pará e no Amapá; no nordeste nos Estados do Ceará e Bahia, e no centro-oeste no Mato Grosso do Sul e Goiás (10)
Atualmente, o Brasil é o quinto maior produtor global de minério de manganês, sendo a liderança da produção nacional pertencente ao Estado do Pará, com participação de 70%, seguido pelos Estados de Minas Gerais (15%) e Mato Grosso do Sul (14,6%) (9).
Graças às suas propriedades naturais, o Mn vem sendo amplamente utilizado em diversos setores industriais, como na fabricação de aço, baterias, cerâmica, cosméticos, couro, fogos de artifício, vidro e produtos têxteis. Além
disso, pode ser encontrado em pesticidas, fungicidas, aditivo antidetonante para gasolina (MMT) e como reagente de contraste em exame de ressonância magnética (8).
1.1.1 Absorção, excreção e transporte.
A absorção de Mn pelo organismo pode ocorrer através das vias de inalação, ingestão, dermal ou injeção intravenosa (11). Apesar da abundância de Mn no ambiente, em condições normais, a principal via de entrada de Mn em humanos é através da dieta (12). Como um metal essencial para nosso desenvolvimento e metabolismo de aminoácidos, lipídios, proteínas e carboidratos, o Mn pode ser encontrado em diversos alimentos que compõem nossa dieta diária, como legumes, nozes, arroz, grãos integrais, vegetais de folhas verdes, chá, chocolate e algumas frutas (12). Essa grande variedade de alimentos como fonte Mn garante a manutenção dos níveis adequados em seres humanos, com 2.3 mg / dia necessários para homens e 1.8 mg / dia para mulheres (13).
Cerca de 1-5% do manganês ingerido é absorvido pelo trato gastrointestinal, podendo variar de acordo com a concentração de Fe, uma vez que compartilham mecanismos de transporte, e com a idade do indivíduo, com uma retenção maior em crianças comparando aos adultos (11). No sangue, o Mn é transportado pela gamaglobulina e albumina na sua forma divalente e pela transferrina na trivalente, espalhando-se rapidamente pelos tecidos e acumulando preferencialmente naqueles ricos em mitocôndrias (11). A principal via de excreção do Mn é pelo sistema biliar, sendo posteriormente eliminado pelas fezes (12). Apenas uma pequena quantidade de Mn é eliminada pela urina (14).
Em geral, órgãos e tecidos não acumulam grandes concentrações de Mn, podendo variar entre 0,1 e 1 μg/g em humanos e animais. O cérebro,
apesar de possuir uma pequena quantidade de Mn, possui o maior tempo de retenção desse metal (11).
A manutenção da homeostase do Mn envolve uma complexa rede de proteínas capaz de mediar sua importação e exportação. Em concentrações plasmáticas normais o Mn entra no SNC principalmente pelo endotélio capilar, enquanto que em altas concentrações o transporte é predominante através do plexo coroide. (15). Diversos mecanismos envolvidos no transporte do Mn através da Barreira Hematoencefálica já foram descritos na literatura, incluindo difusão facilitada, transportador de metal divalente 1 (DMT-1), transportador de zinco ZIP 8, transportador de citrato e o receptor de transferrina (TfR) (15) (Figura 1).
Figura 1. Mecanismos de transporte de Manganês através da Barreira Hematoencefálica (BHE). Representação dos transportadores de Manganês segundo seu estado de oxidação. A largura das setas faz alusão à importância relativa de cada um dos transportadores neste processo. O termo vazamento se refere aos capilares fenestrados que formam a BHE dos órgãos circunventriculares. O complexo Mn2+ -Albumina tem a passagem limitada pelo seu tamanho. (Tf) Transferrina; (DMT-1)
Transportador de Metais Divaletes tipo-1; (ZIP8) Transportador de zinco 8 (Modificado de Aschner et al., 2007) (15).
Nas células, a concentração intracelular de Mn é regulada pelos transportadores de superfície e pelos transportadores intracelulares localizados na membrana interna das organelas. Na superfície celular, DMT-1, DAT (Transportador de Dopamina), ZIP8/ZIP4, transportadores de Citrato e Canais de Ca+ facilitam o influxo de Mn2+ para o citosol. Em contrapartida, o SLC30A10 (solute carrier family 30, member 10) e a ferroportina são os principais responsáveis pelo efluxo de Mn2+. Já o Mn3+ entra na célula mediado pela Tf/TfR e endocitose. Uma vez nos endossomos acidificados, o Mn3+ é liberado do complexo Tf/TfR e reduzido a Mn2 + por ferrireductase, evitando que o Mn3+ cause danos de estresse oxidativo no citosol. O Mn2+ é então transportado para o citosol pelo DMT-1 endossomal. Quando o nível de Mn citosólico atinge um limiar, as proteínas SPCA1 e a ATP13A2 presentes na membrana de Golgi e lisossomal, respectivamente, aumentam o transporte de Mn para o interior dessas organelas, o que facilita o efluxo de Mn2 + para a matriz extracelular (16) (Figura 2).
Dentre os transportadores citados, o DMT-1 é o transportador primário para o Mn em sua forma divalente e o TfR é para sua forma trivalente (16).
Figura 2. Mecanismos de transporte demonstrando as vias de influxo e efluxo de Manganês nas células. Representação dos transportadores de Manganês segundo seu estado de oxidação. (Tf/TfR) Transferrina/ Receptor de Transferrina; (DMT-1) Transportador de Metais Divaletes tipo-1; (ZIP8/ZIP4) Transportadores de zinco 8 e 4; (DAT) Transportador de Dopamina; (SLC30A10) Carreador de solutos- Família 30- Membro 10; (SPCA1) Via Secretora de Ca2 + -ATPase isoforma 1; (ATP13A2) ATPase tipo 13 A2 lisossomal (Chen et al., 2015) (16).
A necessidade de absorção diária de Mn é um reflexo de seu papel como cofator de várias enzimas importantes, incluindo glutamina sintetase, arginase, piruvato carboxilase e superóxido-dismutase de Mn (Mn-SOD). Estas metaloproteínas são fundamentais para processos enzimáticos que ajudam a regular o desenvolvimento, a síntese de neurotransmissores, a digestão, o metabolismo energético, a função imunológica, reprodução e defesas antioxidantes (16).
1.1.2 Formas de Intoxicação
A deficiência de Mn já foi relacionada a diversos problemas, incluindo déficit de crescimento, defeitos ósseos, redução de fertilidade, tolerância anormal à glicose, dermatites e alteração do metabolismo de lipídios e carboidratos, sendo raros os relatos clínicos em humanos (17)
No entanto, a exposição prolongada e excessiva ao Mn leva a um acúmulo desde metal no Sistema Nervoso Central, que ocasiona um distúrbio neurológico com ações semelhantes à Doença de Parkinson, conhecido como Manganismo (MN) (15). Uma das principais vias de intoxicação por manganês é a exposição ocupacional. A neurotoxicidade desencadeada pela inalação de material particulado contendo dióxido de manganês já foi descrita em mineradores e trabalhadores da indústria de aço, baterias, fundição e soldagem (18).
Além desses, outros grupos estão sujeitos à elevada exposição ao Mn, como pacientes que receberam nutrição parenteral (19); usuários da droga Metcatinona ou Efedrona, que utiliza Permanganato de Potássio (KMnO4) no processo de oxidação (20); pacientes que sofrem de doença hepáticas (21); pessoas que vivem em áreas de grande tráfego de automóveis, onde o MMT é utilizado como aditivo de gasolina (22); e famílias que moram nas imediações de indústrias que utilizam Mn na produção de ligas metálicas (1) ou que consomem água e alimentos com altos níveis de Mn (3).
1.2 Manganismo
Apesar de sua essencialidade, o Mn tem sido descrito como neurotóxico há mais de 170 anos (8). Em 1837, Jhon Couper relatou pela primeira vez na literatura os sintomas de uma síndrome neurológica extrapiramidal com características de “parkinsonismo” em mineradores que trabalhavam em condições precárias com exposição a altas doses de Mn (23). Esse Parkinsonismo induzido por Mn, também conhecido como Manganismo,
assemelha-se à Doença de Parkinson em diversos aspectos, incluindo os sintomas de bradicinesia, rigidez muscular, falta de expressão facial (aparência de máscara), micrografia e perda de reflexo postural (24). Contudo, enquanto a DP é uma disfunção motora resultante da perda de neurônios dopaminérgicos da substância negra(25), o Manganismo está associado à alteração funcional e perda de neurônios principalmente do globo pálido (26).
Além disso, pacientes com Manganismo apresentam um quadro de distonia mais acentuado e menos tremores do que pacientes com Doença de Parkinson idiopática; assim como uma resposta pouco eficaz nos sintomas clínicos diante do tratamento com L-dopa e uma flexão plantar do pé, que ocasiona uma marcha característica conhecida como “cock walk” (caminhada do galo) (15, 24).
Dentre os sintomas psiquiátricos do Manganismo podemos incluir irritabilidade, atos compulsivos, insônia e alucinações (27). Do ponto de vista neuropatológico, há um número limitado de estudos em seres humanos em que as amostras de autópsia de cérebros de pacientes expostos ao Mn foram examinadas. Porém, mesmo diante desta limitação, há evidências claras que os núcleos basais são alvo primário da neurotoxicidade causada pelo Mn. Estudos iniciais descreveram alterações neuropatológicas significativas de perda de células neurais e gliose no globo pálido, caudado, putâmen e núcleo subtalâmico (28).
1.3 Globo Pálido
O globo pálido, junto ao corpo estriado, núcleo subtalâmico e substância negra, fazem parte de um grupo de estruturas subcorticais do encéfalo conhecidas como núcleos basais. Apesar de não possuir conexão direta com os motoneurônios da medula espinhal, tais núcleos estão estreitamente ligados ao córtex cerebral, recebendo e enviando informações que irão modular a atividade motora (29). Essas informações enviadas pelo córtex cerebral
transitam através dos núcleos basais e são transmitidas ao tálamo, que as reenvia ao córtex cerebral formando uma alça fundamental para o funcionamento normal do sistema motor (29).
O globo pálido é atravessado por vários axônios mielinizados, o que lhe confere uma tonalidade mais clara que os núcleos vizinhos. Anatomicamente, essa estrutura é dividida pela lâmina interna em duas porções: globo pálido interno (GPi) e globo pálido externo (GPe), que, embora sejam parecidas, possuem conexões distintas (29). O GPi participa da via direta reduzindo a ação inibitória sobre o tálamo que, consequentemente, aumenta os estímulos nas áreas corticais e facilita o movimento. Já o GPe atua na via indireta, enviando estímulos inibitórios para o núcleo subtalâmico. Este por sua vez, projeta neurônios excitatórios para os núcleos de saída do GPi, que aumentam a ação inibitória sobre o tálamo e reduzem o movimento (29).
Distúrbios no globo pálido já foram descritos em doenças nas quais os pacientes apresentam movimentos corporais anormais e falha na coordenação, como Doença de Parkinson (30), Doença de Huntington (31) e Manganismo (28).
Graças às propriedades paramagnéticas do Mn, foi possível a visualização de um aumento bilateral e simétrico nos sinais de intensidades da Ressonância Magnética na área do globo pálido. Este efeito já foi observado em pacientes com neurointoxicação por Mn (32), em macacos experimentalmente intoxicados com Mn (33, 34) e mesmo em trabalhadores assintomáticos expostos a Mn (35). Mais recentemente, Robson e colaboradores (2012) utilizaram imagens de Raio-X de fluorescência como ferramenta de análise com alta resolução espacial e confirmaram o acúmulo de Mn no globo pálido de ratos (36).
Pacientes com encefalopatia hepática decorrente de cirrose tipicamente apresentam hiperintensidade de sinal no globo pálido semelhante aos descritos (37). Uma vez que a principal via excretora do Mn é o fígado, o acometimento
deste órgão resulta em um aumento das concentrações de Mn na área palidal, como descrito emautópsia de pacientes cirróticos (38).
A degeneração neuronal bilateral no globo pálido, juntamente com uma diminuição acentuada de fibras mielinizadas e uma proliferação moderada de astrócitos, foram características comuns observadas em tecido neural post mortem com exposição crônica ao Mn (28). Além dessas alterações, também foi descrito o desenvolvimento dos Astrócitos Alzheimer tipo II, células caracterizadas por edema celular, palidez nuclear e marginalização da cromatina (39). Essas células tornaram-se o marcador patológico para o acúmulo de Mn no sistema nervoso, colocando os astrócitos em uma posição importante na investigação da fisiopatologia do Manganismo.
1.4 Astrócitos e Manganês
Os astrócitos são células da glia especializada que desempenham um papel essencial na regulação e manutenção do ambiente extracelular do SNC (40). Dentre suas principais funções podemos incluir a formação da cicatriz glial, participação da transmissão sináptica pela captura e reciclagem de glutamato e formação de uma barreira de permeabilidade seletiva entre o sangue e o tecido nervoso, que garante suporte trófico, energético e metabólico aos neurônios (41).
Os astrócitos possuem uma grande afinidade por Mn, o que lhes tornam alvo de acúmulo deste metal, com concentrações que podem ser até 50 vezes maior do que em neurônios (42).
Uma vez dentro dos astrócitos, cerca de 60-70% do Mn2+ é sequestrado pela mitocôndria através de canais uniporte de Ca2+, resultando em um comprometimento do metabolismo energético (43). Diversos estudos associaram o acúmulo de Mn a um déficit na produção energética, demonstrando haver inibição na produção de ATP pela fosforilação oxidativa (43, 44).
Em 2003, Zwingmann e colaboradores demonstraram por experimentos de comparação de metabolismo energético que os astrócitos capturam mais Mn do que neurônios, além de aumentarem sua taxa de glicólise. Este fornecimento adicional de ATP, que não é dependente da fosforilação oxidativa, foi associado a uma forma de proteção dos astrócitos (44).
Diante da complexibilidade dos processos metabólicos que conduzem à produção de ATP pela fosforilação oxidativa, dois locais são preferencialmente inibidos pelo Mn2+ na mitocôndria do cérebro: o complexo II (succinato-desidrogenase) da cadeia respiratória e o transportador de glutamato e aspartato (45). Além disso, a concentração de Mn também demonstrou influenciar no local de inibição. Estudos sugerem que em baixas concentrações o Mn interfere na fosforilação oxidativa pela inibição do complexo ATPase, enquanto a inibição do complexo I ocorre apenas em altas concentrações de Mn (43).
Em associação aos defeitos energéticos mitocondriais está o estresse oxidativo induzido pelo Mn. Quando as proteínas que participam da transferência de elétrons da cadeia respiratória são danificadas, passam a doar elétrons diretamente para as moléculas de oxigênio, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) (46). Em geral, o dano oxidativo causado por ROS conduz a uma redução nos níveis de ATP e ao colapso do potencial de membrana mitocondrial pela abertura dos poros de transição mitocondrial (MTP), possíveis mecanismos subjacentes à neurotoxicidade por Mn (47). O estresse oxidativo causado pela exposição ao manganês também foi relacionado ao edema de astrócitos, efeito significativamente bloqueado pela ação antioxidante N-acetilcisteina (48). Recentemente, um estudo demonstrou a elevação de marcadores específicos de estresse oxidativo em astrócitos tratados com Mn. Suas descobertas sugerem que FoxO, MAPK e PPAR sejam moléculas chave intermediárias na resposta biológica protetora do estresse oxidativo induzido por Mn (49).
Além do estresse oxidativo, a neurotoxicidade por Mn também demonstrou ser capaz de estimular a libertação de várias citocinas a partir de células gliais, incluindo o TNF-α, IL-6, IL-1β (50).
As interações astrócitos-neurônios são cruciais para o funcionamento adequado do sistema nervoso, principalmente na síntese de neurotransmissores. Uma vez que o glutamato não é transportado eficientemente através da barreira hematoencefálica, os astrócitos tem a função de fornecer a glicose que será precursora para sua biossíntese, assim como de outros neurotransmissores como Aspartato e GABA (27).
Além disso, os astrócitos são responsáveis pela reciclagem do neurotransmissor glutamato pelo Ciclo de Gln / Glu-GABA, cuja interrupção tem sido associada à toxicidade por manganês (27).
1.5 Transmissão Glutamatérgica
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do sistema nervoso central dos mamíferos (51). Em condições fisiológicas normais de transmissão sináptica excitatória, o glutamato estocado em vesículas é liberado por exocitose a partir de terminal nervoso pré-sináptico por um processo dependente de cálcio (52).
No terminal pós-sináptico, o glutamato pode ativar dois tipos de receptores: metabotrópicos e ionotrópicos. Os receptores metabotrópicos (mGluR) são constituídos por um domínio transmembrana acoplado às proteínas G, que regulam mecanismos de sinalização de pela ativação da fosfolipase C e da adenilil ciclase, com geração de IP3 e cAMP, respectivamente. Por outro lado, os receptores ionotrópicos, como AMPA (Alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico ), Cainato e NMDA (N-metil-D-aspartato), promovem um influxo de íons de Na+, K+ e Ca2+, com subsequente despolarização e excitação neuronal (53).
Após o término da ativação dos receptores de glutamato, ocorre a recaptação do transmissor da fenda sináptica por transportadores localizados nos neurônios pré-sinápticos e nas membranas plasmáticas das células gliais. Uma vez dentro dos astrócitos, a enzima Glutamina Sintetase converte o glutamato em glutamina, que é transferida para os neurônios adjacentes e convertida novamente em glutamato pela ação da enzima glutaminase associada às mitocôndrias, completando o Ciclo Glutamina-Glutamato (Figura 3) (54).
Figura 3: Representação do Ciclo Glutamina-Glutamato. (Gln) glutamina; (Glu) glutamato; (Gt) transportador de glutamato (n) neuronal e (g) glial. (Modificado de Forman et al., 2009) (55).
O glutamato funciona não apenas como um transmissor de informações unidirecinal, mas também gera um crosstalk sináptico entre neurônios vizinhos em que o volume de glutamato liberado cria uma sinalização extrassináptica. Assim, a concentração de glutamato em torno do fluido extracelular determina a extensão do estímulo do receptor (56).
Qualquer distúrbio na homeostasia do glutamato pode ocasionar o aumento da liberação ou a diminuição da recaptação deste transmissor, com consequências patológicas severas e a ocorrência de excitotoxicidade, caracterizada pela ocorrência de morte neuronal por excitação celular excessiva (57). Nesse processo, a ativação excessiva dos receptores de glutamato ocasiona a sobrecarga de Ca2+ na célula, seguida pela produção de radicais livres, insuficiência bioenergética e ativação de enzimas de pró-apoptótica, que podem causar danos ou morte celular (58). Dessa maneira, podemos associar a vulnerabilidade cerebral ao processo de excitotoxicidade a um aumento seletivo das concentrações extracelulares de glutamato.
1.6 Transportadores de Glutamato
O glutamato é constantemente liberado das células e removido do espaço extracelular pela ação de transportadores de glutamato com alta afinidade por Na+ ou transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs). Cinco subtipos de transportadores de aminoácidos excitatórios já foram clonados a partir de tecido humano e animal. Os principais transportadores de glutamato expressos em astrócitos são GLAST e GLT-1, cujos homólogos em humanos são EAAT1 e EAAT2, respectivamente; enquanto EAAT3,
EAAT4 e EAAT5 são encontrados primariamente em neurônios (Quadro 1) (59).
Quadro 1. Transportadores de glutamato, expressão e padrão de distribuição. (Modificado de Maragakis & Rothstein, 2004) (59).
Transportadores de Glutamato
Homólogos em humanos
Tipo de célula Localização
anatômica
GLAST EAAT1 Astrócitos/ Células de
Bergmann
cérebro e medula espinhal. Adultos: maior expressão no cerebelo.
GLT-1 EAAT2 Astrócitos No cérebro e medula
espinhal
GLT-1b EAAT2b Astrócitos e neurônios No cérebro e medula
espinhal
EAAC1 EAAT3 Neurônios Hipocampo, cerebelo e
Gânglios Basais
EAAT4 EAAT4 Células de Purkinje Cerebelo
EAAT5 EAAT5 Células fotoreceptoras
e bipolares Retina
O transporte de glutamato pelos transportadores astrocitários é um processo dependente de energia, no qual ocorre um cotransporte de três íons de Na+ e um íon de H+ e um contratansporte de um íon de K+ (60).
Graças ao papel fundamental dos transportadores de glutamato na manutenção dos níveis abaixo do limiar tóxico, distúrbios em sua função ou expressão levam a uma lesão neuronal excitotóxica e estão associados a diversas doenças neurológicas, como Esclerose Lateral Amiotrófica, Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson e Manganismo (60).
Diversos trabalhos tem demonstrado o comprometimento da função dos transportadores de glutamato pelo Mn, diminuindo os níveis proteicos e de mRNA de GLT-1 e GLAST, bem como a captação de glutamato pelos astrócitos (61-64). Células de ovário de hamster Chinês transfectadas com os genes de GLAST e GLT-1 também tiveram uma redução expressiva no
transporte de glutamato após exposição ao Mn, indicando que ambos os transportadores estão envolvidos nos mecanismos de toxicidade (65).
Embora os efeitos negativos do Mn na expressão e função dos transportadores de glutamato GLAST e GLT-1 sejam reconhecidos, seus mecanismos de ação ainda não foram completamente compreendidos.
Estudos recentes revelaram uma participação importante do fator de transcrição Yin Yang 1 (YY1) na desregulação de GLT-1 mediada por Mn. Os resultados deste trabalho sugerem que o aumento da liberação de TNF-α em resposta aos efeitos citotóxicos do Mn ativa a via de NF-kB, que promove um aumento da expressão de YY1. Esse estímulo de YY1 reprime GLT-1 por interação com a NF-kB e reguladores epigenéticos HDACs (histona desacetilases) (66).
O aumento da expressão de YY1 também promoveu a redução da expressão de GLAST e da captura de glutamato em células da glia de Bergmann (67). Juntos esses resultados indicam que o YY-1é um importante regulador da homeostasia do glutamato nos astrócitos.
A ativação da proteína quinase C (PKC) sob exposição de Mn também foi relacionada à disfunção dos transportadores de glutamato astrocitários (68). O estímulo da via PKC por PMA (activator - phorbol 12- myristate 13-acetate) reduziu significativamente a captura de glutamato, enquanto o tratamento com seu inibidor BIS II foi capaz de prevenir a redução dos transportadores de glutamato induzida por Mn (62). Também foi demonstrada a existência de uma associação entre GLT-1 e as isoformas PKCδ e PKCα, com um aumento específico na interação PKCδ-GLT-1 induzida pelo Mn. Porém, não foi observada interação entre PKCδ e PKCα com GLAST, demonstrando que, apesar de ambos os transportadores serem regulados por mecanismos dependentes de PKC, a contribuição de suas isoformas α e δ é desigual (62).
Assim, essas informações reforçam a importância dos astrócitos e dos transportadores de glutamato na fisiopatologia da neurotoxicidade por manganês.
1.7 Tratamentos para intoxicação com Mn
Apesar dos avanços na pesquisa da toxicidade causada pelo Mn, os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo ainda não foram completamente compreendidos. Um dos desafios no aspecto clínico é a falta de uma estratégia terapêutica eficaz para casos de comprometimento neurológico induzido pelo Mn.
A similaridade do Manganismo com a Doença de Parkinson fez com que uma das primeiras tentativas de tratamento fosse com a utilização de L-dopa, estratégia terapêutica eficaz na redução dos sintomas extrapiramidais em casos de Doença de Parkinson (15). Porém, a maioria dos estudos demonstrou que pacientes com Manganismo tiveram uma melhora limitada nos sintomas clínicos em comparação aos pacientes com Doença de Parkinson idiopática (25).
Em casos de intoxicação aguda com Mn, a terapia de quelação com EDTA tem sido muito utilizada para redução dos níveis de Mn no sangue, embora não alivie os sintomas clínicos entre esses pacientes (15). Por outro lado, o tratamento com Ácido para-aminosalicílico (PAS) demonstrou ser eficaz não apenas na mobilização e remoção tecidual do Mn (69), mas também no alívio das manifestações clínicas induzidas por manganês em casos graves de exposição crônica (70).
1.8 Ceftriaxona
A capacidade de remoção do glutamato da fenda sináptica pelos transportadores de glutamato é essencial para manutenção do funcionamento neuronal. A disfunção ou perda do GLT-1 tem sido associada a diversas doenças neurodegenerativas, como Esclerose Lateral Aminotrófica (ELA), Doença de Alzheimer, Doença de Huntington e Manganismo, cujo quadro de excitotoxicidade por glutamato ocasiona a morte neuronal (71).
Diante da importância do transporte do glutamato pelos astrócitos na manutenção da homeostasia do cérebro, pesquisadores começaram a focar em técnicas que aumentassem a expressão de GLT-1 como forma de aliviar os sintomas ou a degeneração potencialmente causada pelo aumento da concentração de glutamato e/ou redução de GLT-1.
Em 2005, 1.040 drogas e agentes nutricionais aprovados pela FDA (Food and Drug Administration) foram testados quanto a sua bioatividade na expressão dos transportadores de glutamato (72). Nesse trabalho, Rothstein e colaboradores observaram que os antibióticos β-lactâmicos se destacaram por estimular a expressão de GLT-1, porém não de GLAST (72).
Embora diversos antibióticos β-lactâmicos tenham demonstrado esse efeito, a Ceftriaxona (CEF) foi considerada a mais apropriada para o uso clínico, uma vez que pode facilmente cruzar a barreira hematoencefálica e apresenta poucos efeitos colaterais (73). Além disso, a concentração de Ceftriaxona necessária para aumentar a expressão de GLT-1 está dentro da gama aprovada pela FDA para o tratamento de meningite, o que a torna uma candidata promissora para ensaios clínicos (72).
A Ceftriaxona é um antibiótico classificado como cefalosporina de terceira geração em função do seu amplo espectro de ação contra a maioria das bactérias gram-negativas(74). Seu mecanismo de ação antibacteriano, assim como para os demais β-lactâmicos, consiste na inibição da síntese da parede celular bacteriana (74). Originalmente, esse antibiótico demonstrou aumentar a expressão de GLT-1 em experimentos in vitro, conferindo proteção neuronal em modelo de privação de oxigênio-glicose, e in vivo, no qual modelo de ratos para ELA injetados diariamente com 200mg/kg de CEF tiveram a perda de força de massa corporal retardados (72).
A partir de então, diversos estudos relataram o uso da CEF como uma droga neuroprotetora capaz de aumentar a expressão de GLT-1 e aliviar os sintomas de modelos animais com doenças excitotóxicas (75).
O pré-tratamento por cinco dias com 100 ou 200mg/kg de CEF demonstrou ter um efeito neuroprotetor em modelo de acidente vascular cerebral isquêmico em ratos, com redução significativa da área infartada após
24 horas da oclusão (76). Esse efeito foi bloqueado pela administração de um bloqueador específico de GLT-1 (DHK), sugerindo que a neuroproteção resultou do aumento da captação de glutamato por esse transportador (76).
A administração de CEF por cinco dias também foi eficiente na redução das disfunções motoras observadas em camundongos transgênicos com fenótipo da doença de Huntington, efeito associado ao aumento da expressão de GLT-1 e captura de glutamato no estriado (77). Em modelo animal da Doença de Parkinson, induzido por 6-OHDA, a CEF atenuou aproximadamente 28% da perda de tirosina hidroxilase (TH) (78).
Apesar de os mecanismos envolvidos no processo de aumento da expressão induzida pela CEF ainda não terem sido completamente elucidados, evidencias apontam para participação da via de sinalização NF-κB. Em 2008, Lee e colaboradores demonstraram evidências que esse processo pode ser consequência do aumento da ligação de NF-κB na região promotora de GLT-1, resultante da degradação de sua proteína inibidora IκBα (79). Mais recentemente, foi demonstrado que a CEF é capaz de induzir a ativação da NF-κB através da fosforilação de IKKα, responsável pela degradação de IκBα (80).
Embora seja evidente que um dos mecanismos de excitotoxicidade ocasionada pelo excesso de Mn esteja relacionado à redução da expressão e função dos transportadores de glutamato GLT-1 e GLAST (81), ainda não se tem relatos na literatura do uso de CEF em modelos animais com acúmulo de Mn no SNC. Além da sua capacidade de estimular a expressão proteica e a transcrição de GLT-1, a CEF é capaz de interagir com íons metálicos, podendo agir como quelante e reduzir seus efeitos tóxicos sobre GLT-1 (82). Tais propriedades ofereceriam assim uma dupla proteção em casos de Manganismo.
Estudos epidemiológicos realizados com humanos certamente tem a vantagem de apresentarem resultados baseados na população de interesse, porém os diferentes protocolos, rotas de exposição e a falta de controle experimental não permitem a consolidação de uma associação dose-efeito uniforme (83).
Dessa maneira, a utilização de modelos animais no estudo dos efeitos neurotóxicos do manganês permitiu o desenvolvimento de investigações em ambientes mais controlados e entre indivíduos semelhantes entre si.
Dentre as espécies utilizadas nos estudos de toxicidade por manganês estão os roedores e os primatas não humanos (macacos), porém o aparecimento dos sinais da neurotoxicidade depende da dose administrada, da dose cumulativa, via de exposição e dos parâmetros examinados (83).
Em roedores, o acúmulo de manganês foi descrito em diferentes áreas do cérebro por diversos autores (36, 39, 84), mas apenas alguns trabalhos identificaram alterações motoras e comportamentais (85, 86). A análise da marcha de ratos com exposição subaguda ao Mn (50mg/kg – 4 dias) utilizando sistema de Catwalk demonstrou uma redução do comprimento da passada e da base de suporte das patas posteriores em comparação ao grupo controle, revelando de forma específica os efeitos da intoxicação do Mn na marcha e equilíbrio do animal (87).
Em 2003, Hazell e colaboradores estabeleceram um modelo subagudo com 4 dias de exposição ao Mn em ratos, que resultou em aumentos significativos desse metal na região do globo pálido, área de acúmulo característica em humanos (26). Em estudos seguintes, esse mesmo modelo subagudo revelou que o acúmulo previamente relatado foi acompanhado por alterações na morfologia glial, originando os Astrócito Alzheimer tipo II, caracterizado como marco patológico da neurotoxicidade manganês (39).
Até então, o desenvolvimento desse marcador patológico era consequência apenas de uma exposição crônica ao Mn em primatas e casos de Manganismo em humanos(39). Dessa forma, o estabelecimento do modelo
subagudo em roedores abriu novos caminhos e oportunidades de se estudar a fisiopatologia de diversas doenças relacionadas ao acúmulo de Mn no SNC.
Em macacos, os sintomas causados pela exposição a altas doses de manganês ocasionaram sintomas semelhantes àqueles apresentados por humanos, como postura distônica, distúrbios da marcha, tremor, instabilidade emocional e hipoatividade (33, 34, 88). Além disso, o aumento da concentração de manganês foi observado em diferentes órgãos e tecidos de macacos com exposição subcrônica (1.5 mg MnSO4/m3 ≥ 15 dias) (89).
Por muito tempo modelos experimentais utilizando espécies não mamíferas foram considerados inviáveis na ciência biomédica devido à sua distância filogenética em relação aos humanos. Porém, nos últimos anos tornou-se evidente que algumas espécies não mamíferas possuem propriedades farmacológicas e fisiológicas comuns com os seres humanos (90).
O peixe-zebra tem sido utilizado em estudos de diversas condições neurológicas humanas, como Doença de Alzheimer e Doença de Parkinson, contribuindo com a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nessas doenças (91). Em modelo de intoxicação por manganês, as larvas do peixe-zebra apresentaram defeitos posturais, locomotores e sensoriais quando expostas ao metal, evidências que nos motivam a sugerir que tal espécie possui relevância e promissora importância como modelo experimental para estudos da neurotoxicidade causada pelo manganês (92).
Outro modelo experimental utilizou larvas do nematoide Caenorhabditis elegans expostas ao manganês para caracterização da expressão gênica transcricional e pós-transcricionais. A especificidade da técnica citada tem se revelado importante aliada no sentido de se compreender como o manganês influi no maquinário gênico e, consequentemente, nas respostas biomoleculares aos estudos propostos (93).
1.10 Justificativa
Diante das considerações acima, fica evidente a importância do desenvolvimento trabalhos que auxiliem na compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos nos processos patológicos da neurotoxicidade induzida pelo Mn.
Segundo Rodier (1955), a reconstrução do histórico de pessoas com Manganismo demonstra que trabalhadores, mesmo expostos a altas concentrações de manganês pelas vias inalatórias (poeira), demoram em média um ano para desenvolverem a doença, e que cerca de 2% não apresentam nenhum sintoma até 10 anos depois da exposição ocupacional (94). Por isso, desenvolver modelos animais que reproduzam as condições fisiológicas de anos de exposição ao Mn tornou-se um grande desafio para a ciência.
A melhor compreensão dos efeitos iniciais do Mn no modelo subagudo pode ampliar sua gama de uso experimental. Assim, o estudo da transmissão glutamatérgica através dos transportadores de glutamato GLT-1 e GLAST (in vitro e in vivo) e das características histológicas na área do globo pálido podem contribuir com informações que complementarão a caracterização do modelo subagudo previamente estabelecido pelo nosso grupo de estudo (26).
A falta de terapias eficazes em casos de neurotoxicidade por Mn, também nos levou a buscar por fontes alternativas de tratamento. A Ceftriaxona tem sido relatada como uma ferramenta de neuroproteção
promissora no aumento da expressão de GLT-1 em doenças
neurodegenerativas (75). Porém, em nossos experimentos optamos por utilizar a CEF diariamente após a administração de Mn, o que seria mais próximo da realidade de pacientes que são intoxicados por Mn e posteriormente procuram auxílio médico.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
• Estudar a transmissão glutamatérgica da região do globo pálido em modelo subagudo de exposição ao manganês.
• Estudar o efeito do Mn em cultura primária de astrócitos.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1 In vitro
Avaliar os efeitos da exposição astrócitos ao manganês quanto:
• à expressão proteica dos transportadores de glutamato GLT-1 e GLAST; • à função de captação de glutamato dos transportadores de glutamato; • ao cotratamento com Ceftriaxona.
2.2.2 In vivo
Analisar os efeitos do Manganês na região do globo pálido em relação:
• à expressão proteica dos transportadores de glutamato GLT-1 e GLAST pela técnica de WB.
• à resposta astrocitária por meio das técnicas de imunohistoquímica e Western Blotting
• à sobrevivência neuronal, através da contagem nuclear com as técnicas de coloração com Cresil Violeta imunohistoquímica (NeuN)
• aos efeitos do Ceftriaxona no pós-tratamento da exposição ao manganês.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Modelo Subagudo de Manganismo em ratos
Para desenvolver os estudos in vivo foram utilizados ratos machos adultos da linhagem Sprague-Dawley com 5 semanas de idade pesando aproximadamente 170-200g. Os animais foram fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP e pelo Centro de Pesquisa do Hospital da Universidade de Montreal. Os animais foram mantidos em sala fechada com temperatura controlada, iluminação artificial com ciclo claro e escuro de 12 horas e ração e água ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo os princípios éticos na experimentação animal, com aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animais – CEUA/UNICAMP, protocolo nº 2505/(A) (Anexo 8.1) e do Comitê institucional de Proteção Animal – CIPA/UdeM, protocolo N14062AHr (Anexo 8.2).
Para os experimentos in vivo os animais foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos experimentais:
1. Grupo Controle (n=9), administrados apenas com o veículo (solução salina 0,9% NaCl, i.p.);
2. Grupo Mn (n=9), administrados com Cloreto de Manganês (II) Tetra-hidratado (MnCl2-4H2O, Sigma-Aldrich, M5005) (50 mg/kg de peso corporal, i.p.) (26);
3. Grupo Mn+CEF (n=9), administrados com MnCl2-4H2O (50 mg/kg de peso corporal, i.p.) e, após uma hora, com Ceftriaxona (200mg/kg de peso corporal, i.p.) (26, 72);
4. Grupo CEF (n=9), administrados apenas com (200mg/kg de peso corporal, i.p.) (72).
As doses foram injetadas diariamente por 4 dias consecutivos e, após 24 horas da última dose injetada, os animais foram sacrificados e os cérebros coletados para posterior análise.
3.2 Cultura Primária de Astrócitos
A cultura primária de astrócitos foi realizada como previamente descrita por Hazell et al.(1997) (61). Neonatos de Sprague-Dawley com 1-3 dias de vida tiveram seus córtex removidos e dissociados. O macerado foi filtrado através de membranas de nylon esterilizado com 80μm e 10µm de porosidade. As células foram então resuspendidas em DMEM (Dulbecco’s modified Eagle Medium – high glucose Sigma-Aldrich, D1152) suplementado com 20% de SBF (Soro Fetal Bovino, Life Technologies - Invitrogen – Gibco, Canadá, 12484-028) e 1% de antibiótico-antimicótico (Gibco, 15240-062)
A suspensão celular foi distribuída em placas de 35 mm (Falcon, 353001), com uma taxa de densidade de sedimentação de 12 animais/ 90ml de meio, totalizando 45 placas por experimento. As células foram mantidas em incubadora a 37ºC e atmosfera contendo 5% CO2.
Após uma semana, as células atingiram confluência e a confirmação da linhagem isolada foi determinada baseada na marcação de GFAP (Glial fibrillary acidic protein) detectada por imunocitoquímica. Neste momento a suplementação do DMEM foi trocada para 10% de Soro de Cavalo (Life Technologies - Invitrogen - Gibco, Nova Zelândia, 26050-088), 1% de antibiótico-antimicótico e 0,5mM de dBcAMP (N6,2′-O-Dibutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt, Sigma-Aldrich, D0627).
Após uma semana de exposição à nova suplementação, houve a confirmação da expressão de GLT-1 nos astrócitos pela técnica de
imunocitoquímica. Durante todo o processo inicial de preparo das células, o meio de cultura foi trocado em intervalos de 2 ou 3 dias.
O experimento teve uma duração de 48 horas, em que as células foram expostas a quatro diferentes condições:
1- Grupo Controle: Células que foram mantidas com o meio de cultura; 2- Grupo Mn: Células tratadas com 100μM de MnCl2-4H2O (61);
3- Grupo Mn+CEF: Células cotratadas com 100μM de MnCl2-4H2O e 300μM de Ceftriaxona (61,95);
4- Grupo CEF: Células tratadas com 300μM Ceftriaxona (95).
Durante as 48 hora do experimento foi realizada uma troca de meio, na qual a suplementação foi mantida de acordo com os grupos de tratamento.
3.3 Western Blotting
3.3.1 In vitro
Após 48h de tratamento, o meio das culturas foi removido e as células lavadas com PBS gelado. Adicionou-se 80µl de tampão de lise proteica, composto por As células foram removidas das placas de cultura por raspagem com suporte de plástico (Cell Scraper – Corning Gass Working, USA) e transferidas para tubos eppendorf. Os tubos foram então vortexados e centrifugados a 12.000 RPM por 10 minutos, a 4°C.
Estudos prévios demonstram que a proteína GLT-1 encontra-se solubilizada no sobrenadante sob as condições descritas acima (96). Assim, para desenvolver este estudo, coletamos o sobrenadante e estocamos em freezer a -80°C.
Após completar 24 horas da última dose de manganês administrada, os animais foram eutanasiados por decapitação, os cérebros rapidamente removidos, congelados em nitrogênio líquido e estocados em freezer a -80°C. A região do globo pálido foi dissecada, seguindo as coordenadas do atlas de cérebro de rato de Paxinos e Watson (1998) (97), e homogeneizada em solução de tampão de lise proteica (50 mM Tris Base (pH 8); 150 mM NaCl; 1% Triton-X 100; 5% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS e Coquetel inibidor de protease (Roche,11 836 153 001) com o auxílio de um sonicador (Q-Sonica) (26). As amostras foram estocadas em freezer a -80°C.
A quantificação de proteína total foi realizada com o kit de detecção proteica da Bio-Rad (DCTM Protein Assay), seguindo as instruções do fabricante. A leitura da absorbância foi realizada a 750 nm em leitor de microplaca (BioTek Synergy 4). O teor de proteína das amostras foi determinado usando albumina de soro bovino (BSA, Sigma-Aldrich, A4503) como padrão.
Após determinação da concentração proteica, o volume necessário para obtenção total de 30 μg de proteína de cada amostra foi diluído (1:1) em tampão de loading (Tris-HCl 100mM pH 6,8, SDS 4%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0,2% e 1/5 do volume final DTT). As amostras foram fervidas a 100 ºC por 5 minutos e aplicadas no gel. No mesmo gel foi aplicado um marcador padrão para determinação do peso molecular (Precision Plus Protein™ Dual Color Standards, 1610374).
A eletroforese foi realizada em cuba de mini gel da BioRad (Mini-Protean),com solução tampão para eletroforese, previamente diluída. O SDS-PAGE foi submetido a 60 volts, inicialmente, até a passagem da linha demarcada pela fase de empilhamento (stacking) e 100 volts até o final do gel de resolução (resolving). As proteínas separadas no SDS-PAGE foram então transferidas para a membrana de PVDF (Bio-Rad) utilizando o equipamento de
