Neurogênese e estrutura dendrítica hipocampais em ratos submetidos à restrição proteica durante a ontogênese encefálica : estudo comportamental e influências do ambiente enriquecido

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GABRIEL BOER GRIGOLETTI LIMA

NEUROGÊNESE E ESTRUTURA DENDRÍTICA HIPOCAMPAIS EM RATOS SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTEICA DURANTE A ONTOGÊNESE ENCEFÁLICA: ESTUDO COMPORTAMENTAL E INFLUÊNCIAS DO AMBIENTE

ENRIQUECIDO

Campinas 2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas

GABRIEL BOER GRIGOLETTI LIMA

NEUROGÊNESE E ESTRUTURA DENDRÍTICA HIPOCAMPAIS EM RATOS SUBMETIDOS À RESTRIÇÃO PROTEICA DURANTE A ONTOGÊNESE ENCEFÁLICA: ESTUDO COMPORTAMENTAL E INFLUÊNCIAS DO AMBIENTE

ENRIQUECIDO

Orientador: Prof.Dr. José Antonio Rocha Gontijo

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE A VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO GABRIEL BOER GRIGOLETTI LIMA E ORIENTADO PELO PROF. DR. JOSE ANTONIO ROCHA GONTIJO

Assinatura do Orientador

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Campinas 2015

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em

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Em primeiro lugar agradeço meus pais, Patrícia Aline Boer e Ricardo Grigoletti Pereira Lima, pela eterna confiança e amor ao longo dos meus 27 anos de idade. Vocês são a parte mais importante de mim. Muito obrigado pela dedicação e carinho. Sem vocês, nada disso seria possível. Vocês são o maior amor da minha vida!

Agradeço meu orientador, José Antônio Rocha Gontijo, pela paciência, carinho e imensurável conhecimento durante este processo de formação. Muito mais que um orientador, você foi um amigo durante esta jornada. Espero, um dia, poder contribuir com a ciência da mesma forma que você tem feito e, ter a mesma simplicidade e humildade para formar muito mais que cientistas, mas pessoas éticas e de bom coração. Tenho muito orgulho de ser seu aluno!

Agradeço a professora Patrícia pela imensa ajuda e contribuição a este trabalho. Por direcionar os meus passos ao longo deste caminho. Você me ajudou a entender todos os assuntos e temáticas que o curso de psicologia não me proporcionou, como as especificidades das ciências biológicas. O entendimento e a técnica que adquiri durante o mestrado passam pelo teu crivo. Obrigado por me ajudar em todos os atos deste trabalho!

Agradeço meus amigos que, durante toda minha vida foram a melodia para esta canção um tanto desafinada. Vocês trouxeram alegria quando eu menos suspeitava ser possível. Em especial, agradeço Leandro Doblas e Henoch Pedro Rodrigues Junior. Nossa amizade será eterna!

Agradeço toda a minha família pelos pilares que sempre me sustentaram ao longo dos anos. Em especial, meus avós, Oswaldo Boer, Mara Boer, Antônio Carlos Pereira Lima e Sirlei Barbosa, pelo carinho que me deram desde sempre. Eu amo muito vocês!

Agradeço minha namorada, Mell Rossi Veloso, pelo apoio nessa reta final. Suas palavras fizeram com que eu ganhasse mais força. Quando um sonho é compartilhado com alguém, acaba por se tornar mais forte. Este sonhar tornou-se sustentável com você ao meu lado. Muito obrigado. Eu amo você!

Agradeço meus professores da graduação, Abrahão dos Santos e Marcos Peres, pelos ensinamentos que levarei comigo em todos os caminhos e conjunturas. Vocês foram fonte de grande inspiração para minha formação crítica e meus devaneios. Obrigado por tirarem os meus pés do chão!

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Agradeço meus colegas de laboratório, em especial, Agnes e Daniel, pela importante ajuda nos experimentos e fundamental descontração, respectivamente. Todos vocês fazem parte desta conquista.

Agradeço ao Prof. Eduardo Scabora pela disposição em nos ajudar com a técnica do fracionamento. Muito obrigado!

Agradeço a UNICAMP pela oportunidade e estrutura para que este trabalho fosse realizado.

Agradeço a CAPES pelo apoio financeiro ao longo desses dois anos.

Agradeço, enfim, a todos que de alguma maneira fizeram parte da minha vida e, com demasiada certeza, contribuíram para minha formação enquanto pessoa, cidadão e cientista. Muito Obrigado!

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Dedico este trabalho aos meus pais. Meus maiores amores!

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RESUMO

O estresse gestacional afeta diversas regiões neurais incluindo hipocampo, amígdala, corpo caloso, neocortéx, cerebelo e hipotálamo e frequentemente resulta em redução no volume dos tecidos que compõem estas estruturas. A formação hipocampal tem sido alvo de diversos estudos devido a sua importância na plasticidade neural, na neurogênese e na regulação de processos cognitivos. Dessa forma, este estudo buscou avaliar os efeitos da restrição proteica, durante a gestação e amamentação, sobre a estrutura do hipocampo e o comportamento relacionado à memória e emoções (ansiedade/medo) bem como sobre a composição celular desta estrutura cerebral e, a influência sobre estes parâmetros morfológicos e comportamentais, da exposição da prole de ratos machos ao ambiente enriquecido. Os achados deste estudo representam o impacto pré e perinatal da desnutrição proteica correspondente à situação de estresse nutricional, no hipocampo que está envolvido no comportamento emocional bem como na memória e no aprendizado. O estudo revelou dissociação entre a resposta do teste comportamental e alterações no número de neurônios hipocampais, como consequência da programação fetal. A ausência de alterações basais no desempenho destes testes, ocorreram a despeito de redução no número de neurônios no giro denteado do hipocampo. Vários autores têm sugerido que a atrofia observada no hipocampo pode ser uma resposta compensatória para proteger o hipocampo de danos adicionais. Nós demonstramos, pela primeira vez, que a exposição materna a restrição proteica durante o desenvolvimento neural da prole causa importantes mudanças morfológicas no hipocampo podendo tornar estes animais vulneráveis a distúrbios neurais na idade adulta. O presente estudo pelo menos sob aspecto morfológico ponderal confirma a teoria do "cérebro egoísta", um paradigma recente que postula que, para manter estável seu próprio fornecimento de energia, o cérebro modula o metabolismo da energia na periferia regulando tanto a alocação quanto a ingestão de nutrientes. Neste trabalho, a ausência de alterações ponderais encefálicas não está associada às intensas modificações na composição citológica, particularmente hipocampal, nos diferentes grupos experimentais. Embora pareça que as alterações nutricionais promovam alterações irreversíveis ponderais na massa corporal, mas não no encéfalo e algumas de suas

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estruturas fundamentais, a composição e estrutura neuronal e sua recuperação a partir de células primordiais, são profundamente modificadas pela restrição dietética materna e, surpreendentemente, pela exposição ao ambiente enriquecido. Assim, podemos afirmar que a teoria do cérebro egoísta explica a manutenção da massa encefálica entretanto, a proporção dos diferentes tipos celulares é profundamente alterada o que pode expandir nosso entendimento sobre a adaptação ao estresse e a neuro-regeneração em estados neuro-comportamentais tidos como anormais. Além disso, devemos ressaltar que, embora tenhamos observado redução significativa no número de neurônios após o período de amamentação, demonstramos pela primeira vez que este parâmetro é revertido pelo estimulo em ambiente enriquecido.

Palavras-chave: Hipocampo; fracionamento; Neurogênese; Desenvolvimento Fetal;

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ABSTRACT

The stress affects neural regions including gestational hippocampus, amygdala, corpus callosum, neocortex, cerebellum and hypothalamus and often results in a reduction in the volume of the tissues that make up these structures. The hippocampal gyrus training has been the subject of several studies due to its importance in neural plasticity in neurogenesis and regulation of cognitive processes. Thus, this study sought to assess the effects of protein restriction, during pregnancy and breastfeeding, on the structure of hippocampus, their duties on the memory and emotions (anxiety/fear) as well as on the cellular composition of this brain structure and influence over these morphological and behavioral parameters, the exposure of the offspring of male rats to the enriched environment. The findings of this study represent the pre and perinatal impact of malnutrition protein corresponding to situation of nutritional stress in the hippocampus, which is involved in emotional behavior as well as in memory and learning. The study revealed decoupling the behavioral test response and changes in the number of hipocampais neurons, as a consequence of fetal programming. The absence of basal changes in performance of these tests, occurred in spite of reduction in the number of neurons in the dentate gyrus of the hippocampus. Several authors have suggested that the observed atrophy in the hippocampus may be a compensatory response to protect the hippocampus of additional damage. We have demonstrated, for the first time, that maternal exposure to protein restriction during neural development of offspring cause important morphological changes in hippocampus may make these animals vulnerable to neural disorders in adulthood. The present study at least under morphological aspect by confirming the "selfish brain" theory, a recent paradigm that posits that in order to keep stable its own energy supply, the brain modulates the energy metabolism in the periphery by regulating both the allocation as the intake of nutrients. In this work, the unmodified brain mass, do not match with the intensity of cytological composition changes, particularly of the hippocampal nucleus, in different experimental groups. Although it seems that the nutritional changes promote irreversible changes in body mass, but not in the brain and some of its fundamental structures, composition and neuronal structure and its recovery from primordial cells, are deeply modified by the maternal dietary restriction and, surprisingly, by exposure to oxygen-enriched environment. Thus, we can affirm that the selfish brain theory explains the maintenance of brain matter however, the proportion of the different cell types is profoundly changed what can expand our understanding of the adaptation to stress and neuro-regeneration in neuro-behavioral States regarded as abnormal. Moreover, we must emphasize that, while we have observed a significant reduction in the number of neurons after the period of breastfeeding, we demonstrate for the first time this parameter is reversed by stimulus in enriched

Keywords: neural ontogenesis, Cell Fractionation, gestational protein-restriction, rats offspring, fetal development

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Lista de Abreviaturas 11-HSD2 - 11--hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2

ACTH - Adrenocorticotrofina AE - Ambiente Enriquecido

CEMIB - Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas CEUA - Comissão de Ética na Experimentação Animal

COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal DCX - Doublecortina

DG - Giro Denteado GC - Glicocorticoides GR - Receptores Glico- HD - Hipocampo Dorsal

HHPA - Eixo Hipocampo-Hipotálamo-Pituitária-Adrenal HPA - Eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal

HV - Hipocampo Ventral

LCE - Labirinto em Cruz Elevado LP - Low Protein (ração hipoproteica) LPP - LP Submetidos ao Ambiente Padrão MR - Mineralocorticoide

NP - Normal Protein (ração normoproteica) NPCs - Células Progenitoras Neuronais

NPE - NP Submetidos ao Ambiente Enriquecido NPV – Núcleos paraventriculares

SGZ - Zona Subgranular

SNC - Sistema Nervoso Central SVZ - Zona Subventricular

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Lista de Figuras Figura 1.a – Anatomia do Hipocampo

Figura 1.b – Histologia Hipocampal

Figura 2 – Curvas de Crescimento Neural Figura 3 – Desenho Experimental

Figura 4.a – Primeiro Modelo de Ambiente Enriquecido Figura 4.b – Segundo Modelo de Ambiente Enriquecido Figura 5 – Monitor de Atividades

Figura 6 – Labirinto em Cruz Elevado Figura 7 – Discriminação de Objetos Figura 8 – Massa dos Animais Figura 9 – Massa do Encéfalo Figura 10 – Massa do hipocampo Figura 11 – Número de núcleos

Figura 12 – Porcentagem de Neurônios e Células da Glia Figura 13 – Gráfico Representativo do Giro Denteado Figura 14 – Imunoistoquímica no Giro Denteado

Figura 15 – Imunoistoquímica nas Regiões Subventriculares Figura 16 – Resultados Monitor de Atividade

Figura 17 – Taxa de Variação

Figura 18 – Movimentos Estereotipados Figura 19 – Deslocamento

Figura 20 – Resultados Labirinto em Cruz Elevado Figura 21 – Bolos Fecais

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Lista de Tabelas Tabela 1 – Ingredientes da Ração

xxi Sumário Resumo... xi Abstract... xiii 1. Introdução... 1 1.1 Hipocampo... 5

1.2. Neurogênese no Hipocampo de Roedores Adultos... 7

1.3 Eixo Hipocampo-Hipotalamo-Pituitaria-Adrenal (HHPA)... 9

1.4. Ambiente Enriquecido... 10

2. Justicativa e Objetivos... 13

2.1 Objetivos Específicos... 14

3. Materiais e Métodos... 15

3.1 Animais... 15

3.2 Composição dos Grupos... 15

3.3 Ambiente Enriquecido...16

3.4 Teste do Monitor de Atividades... 18

3.5 Teste do Labirinto em Cruz Elevado... 19

3.6 Teste de Discriminação de Objetos... 20

3.7 Fracionamento... 21

3.8 Imunoistoquímica... 22

3.9 Análise estatística... 23

4. Resultados... 25

4.1 Imunoistoquímica... 28

4.2 Teste do Monitor de Atividades... 33

4.3 Teste do Labirinto em Cruz Elevado... 36

4.4 Bolos Fecais... 37

4.5 Teste de Discriminação de Objetos... 38

5. Discussão... 39

6. Conclusão... 59

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1. INTRODUÇÃO

A desnutrição em todas as suas formas (subnutrição, deficiências de micronutrientes e excesso de peso e obesidade) impõe custos econômicos e sociais inaceitavelmente elevados para os países, independentemente dos níveis de renda e regimes de governo. Estimativas mais recentes da FAO indicam que 12,5% da população mundial (868 milhões de pessoas) apresentam subnutrição calórica, no entanto, estes números representam apenas uma fração dos níveis globais de desnutrição em populações humanas. Estima-se que 26% das crianças do mundo apresentam raquitismo, 2 bilhões de pessoas sofrem deficiência de um ou mais micronutrientes e 1,4 bilhão de pessoas apresentam excesso de peso, dos quais 500 milhões são obesas (FAO, 2013). Além dos efeitos diretos às pessoas que sofrem desnutrição, no caso de gestantes, efeitos dramáticos sobre a prole alteram o desenvolvimento embrionário e fetal, determinando a suscetibilidade de doenças na idade adulta. Este fenômeno, denominado programação fetal, é o processo pelo qual modificações ambientais intrauterinas ou durante a tenra infância, molda, em longo prazo, a fisiologia de órgãos e tecidos e, a homeostase corporal (LANGLEY-EVANS, 2004). Assim, tem sido proposto a associação entre o baixo peso ao nascer, o crescimento infantil e manifestações subsequentes de doenças principalmente, na idade adulta, como processo pelo qual um estímulo ou injúria durante períodos críticos do crescimento e desenvolvimento afetam permanentemente, estruturas e funções teciduais (LUCAS, 1991).

As primeiras evidências de programação datam de 1964, quando Rose descreveu alto risco de isquemia cardíaca em indivíduos cujos irmãos foram abortados ou morreram na infância. Fordshal, em 1967 observou que em regiões da Noruega com alto índice de mortalidade infantil os índices de morte por doenças cardiovasculares eram também elevados. A década de 1980 é rica em estudos associando mortalidade por doenças cardiovasculares e eventos adversos ocorridos na primeira fase da infância. No entanto, o termo “programação fetal” foi usado pela primeira vez em 1991, por Alan Lucas, que define programação como “resposta permanente de um organismo a um estímulo ou insulto durante um período crítico do desenvolvimento”.

Observações feitas a partir do período histórico conhecido como Fome Holandesa permitiram examinar a relação entre a exposição pré-natal à restrição alimentar e sua associação com doenças psiquiátricas, incluindo transtornos afetivos. Provocada pelo

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bloqueio nazista no último ano da Segunda Guerra Mundial, a fome grassou a partir de outubro de 1944, se agravando gradativamente ao longo dos meses seguintes, afetando principalmente, cidades da Holanda ocidental. De fevereiro à abril de 1945, a fome atingiu o seu pico causando elevada mortalidade, e estando associada a futura baixa fertilidade e comprometimento de nascimentos viáveis (STEIN et al., 1975). A disponibilidade de extensa documentação sobre os hábitos alimentares e uma excelente base de dados médicos sobre desordens psiquiátricas, tem permitido uma avaliação epidemiológica inédita da subnutrição associada a transtornos psiquiátricos (BROWN et al., 2000). Brown et al (2000) relacionou a exposição pré-natal à fome com transtornos afetivos na idade adulta. Susser e Lin, 1992, deste mesmo grupo, apresentaram um relatório sobre transtornos psiquiátricos estabelecendo um risco duas vezes maior de desenvolvimento de esquizofrenia na população exposta a fome severa no início da gestação.

O desequilíbrio nutricional materno leva a alterações que permitem a sobrevivência da prole, embora seus efeitos, em longo prazo, promovam alterações na função cardiovascular, renal, respiratória, endócrina e em componentes do sistema nervoso central (BARKER, 1995; FOWDEN et al., 2006). Assim, evidências demonstram que algumas doenças no adulto podem ser induzidas pela manipulação do ambiente fetal (BARKER, 1998; NYIRENDA et al., 1998) e ainda comprovam que, quando um feto ou neonato é exposto a um ambiente não usual durante rápida fase de crescimento, as respostas adaptativas podem se tornar permanentes. Desta forma, tem sido estabelecido que não somente fatores genéticos, mas também mecanismos epigenéticos orquestrados pelo ambiente moldam desde a fase intrauterina, o perfil de saúde e a propensão às doenças ao longo da vida. Estudos apontam ainda que as implicações da manipulação do ambiente fetal podem não estar limitadas à primeira geração, prolongando os efeitos da programação pelas gerações subsequentes (DRAKE et al., 2004).

Embora alguns efeitos nutricionais sejam consequência direta da alteração na disponibilidade de substrato, parte desses resultados se deve à mediação hormonal, que pode alterar o desenvolvimento de tecidos fetais específicos em períodos críticos do desenvolvimento, levar a mudanças permanentes na secreção hormonal ou à sensibilidade tecidual a hormônios (BARKER, 1998).

Os glicocorticoides são os principais hormônios relacionados à homeostase em condições de estresse físico, psicológico ou nutricional. Muitas características da exposição excessiva a glicocorticoides sugerem seu possível papel na programação de

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desordens metabólicas e cardiovasculares. Os receptores de glicocorticoides são altamente expressos em quase todos – senão todos – os tecidos fetais a partir do segundo trimestre gestacional (DIAZ et al., 1998; COLE et al., 1995), assim como na placenta e nas membranas fetais. O tratamento de ratas prenhas com baixas doses de dexametasona, glicocorticoide sintético usado na prática da obstetrícia, reduz o peso ao nascer e eleva a pressão arterial sanguínea na prole adulta (BENEDIKTSSON et al., 1993).

Embora os glicocorticoides sejam em sua maioria lipofílicos e rapidamente atravessem a placenta, normalmente o feto tem níveis fisiológicos muito menores de glicocorticoides do que sua progenitora (CAMPBELL e MURPHY, 1977). Essa diferença é garantida pela enzima 11--hidroxiesteróide desidrogenase do tipo 2 (11-HSD2) placentária, que catalisa o rápido metabolismo do cortisol e da corticosterona para inativá-las nas formas 11-ceto cortisona e 11-desidroxicorticosterona, respectivamente (MURPHY et al., 1974; LOPEZ-BERNAL et al., 1980). Essa barreira enzimática placentária garante que a maioria, mas nem todos os glicocorticoides maternos sejam inativados, de forma que o cortisol fetal circulante seja, em teoria, apenas aquele derivado das adrenais do feto (BENEDIKTSSON et al., 1997). No entanto, a eficiência da 11-HSD2 placentária varia consideravelmente tanto em humanos quanto em ratos (BENEDIKTSSON et al., 1993; STEWART et al., 1995). Sugere-se que em diferentes modelos de programação fetal ocorra deficiência relativa de 11-HSD2 placentária, permitindo o acesso ao feto aos glicocorticoides maternos, promovendo assim retardo no crescimento da prole e, uma possível resposta de programação relacionada a doenças cardiovasculares, metabólicas e psiquiátricas futuras (EDWARDS et al., 2005). De fato, experimentos em ratos, tem confirmado que uma menor atividade da 11-HSD2 placentária, e presumivelmente, a maior exposição fetal a glicocorticoides resulta em fetos menores com placentas maiores.

A associação entre o peso ao nascer e a 11-HSD2 placentária foi verificada em humanos (STEWART et al., 1995), embora nem todos os estudos tenham confirmado essa observação (ROGERSONET al., 1997). No entanto, mutações deletérias do gene da 11-HSD2, em humanos, estão associadas com baixo peso ao nascer (DAVE-SHARMAET al., 1998). Além disso, marcadores bioquímicos de exposição fetal a glicocorticoides estão relacionados com a redução da função da 11-HSD2 placentária próximo ao nascimento (BENEDIKTSSONET al., 1995).

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Em mamíferos, a organização morfológica e funcional do sistema nervoso central (SNC) é estabelecida durante os períodos pré e pós-natais, envolvendo síntese de componentes celulares, neurogênese, gliogênese, diferenciação e migração celular. Estes processos são afetados por diversos fatores ambientais, tais como a nutrição materna e aspectos comportamentais, podendo acarretar, em longo prazo, alterações na função cerebral da prole (MATOS et al., 2011). Crianças expostas a má nutrição em períodos perinatais apresentam déficits cognitivos (GALLER AND RAMSEY, 1989; WALKER et al., 2000) e elevado risco de desenvolverem desordens psiquiátricas, tais como depressão (BROWN et al., 2000; COSTELLO et al., 2007) e esquizofrenia (WAHLBECK et al., 2001; BROWN AND SUSSER, 2008).

A grande plasticidade da população neuronal durante o desenvolvimento pós-natal sugere que os mecanismos de regulação que geram as diversas populações neuronais adultas em evolução não estão restritos ao período embrionário (BANDEIRA et al., 2009). No homem, a ontogênese encefálica cessa após o nascimento, entretanto, no rato, ela continua até o 14° dia de vida. (AVISHAI-ELINER et al, 2002; ROMIJN et al, 1991) Segundo a literatura vem mostrando, uma dieta adequada e equilibrada é um dos principais fatores para a maturação do sistema nervoso central (SNC), e por conseguinte, do estabelecimento de padrões comportamentais (MORGANE et al., 1993; WAINWRIGHT, 2001). Muitos estudos têm sido realizados para compreender os efeitos da desnutrição materna durante a gestação e, durante a lactação, sobre o desenvolvimento físico, neuroquímico, neurofisiológico e comportamental da prole na idade adulta. Esse estudos afirmam que quanto mais cedo o insulto dietético, mais grave e permanente serão os seus efeitos (MORGANE et al., 1992).

Estudos mostram que o stress materno durante o desenvolvimento do cérebro fetal humano provoca profundos efeitos neurobiológicos sobre o desenvolvimento pós-natal, levando ao atraso do crescimento fetal (CLIVER et al., 1992) e do desenvolvimento motor (HUIZINK et al., 2003), aumentando a susceptibilidade de perturbações afetivas em crianças e adolescentes (WADHWA et al, 2001; WALKER et al, 2008)

Estudos em modelos animais submetidos a má nutrição gestacional, têm demonstrado que a prole adulta apresenta significativo déficit de aprendizado e memória (TONKISS AND GALLER, 1990; FUKUDA et al., 2002). Adicionalmente, estes animais apresentam excessiva resposta a fatores estressantes (TRZCTNSKA et al., 1999; LEVAY et al., 2008) e predisposição à adição de drogas psicotrópicas (LAINO et al., 1993;

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ALMEIDA et al., 1996). Ainda não são conhecidos os mecanismos celulares e moleculares envolvidos nestes distúrbios neuro-comportamentais.

Sabemos que a desnutrição proteica no início da vida acarreta mudanças duradouras na estrutura e na neuroquímica no sistema nervoso central, assim como anomalias comportamentais (DOBBING, 1987: WIGGINS et al., 1984; MORGANE et al., 1978). Estudos em ratos indicam que, quando a desnutrição é imposta durante o período embrionário, esta pode alterar o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), especialmente a plasticidade do hipocampo (CINTRA et al., 1997; KEHOE et al., 2001; DURAN et al., 2006). Sabemos também, que a desnutrição proteica pode causar um decréscimo no número de receptores de glicocorticoides no hipocampo, alterar a sensibilidade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e, consequentemente, a resposta do organismo ao estresse (KEHOE et al., 2001; MESQUITA et al., 2002; LISTER et al., 2005; SAMPAIO et al., 2008).

1.1 Hipocampo

A formação hipocampal é funcional e anatomicamente dividida em porção dorsal, cuja função está relacionada à memória, e porção ventral relacionada com as emoções (BANNERMAN et al., 2004, figura 1a). Recentemente, Bannerman e colaboradores (2014) demonstraram que a porção ventral está relacionada com a manifestação de ansiedade (figura 2). Histologicamente o hipocampo é dividido nos subcampos CA1, CA3 e giro denteado (SCHARFMAN, 2007, figura 1b)

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Figura 1: Em A, temos um esquema representativo da divisão funcional do hipocampo. Em B, uma fotomicrografia de um corte histológico mostrando os diferentes subcampos histológicos hipocampais (BANNERMAN et al., 2014 figura 1a; Neal Melvin 2007, figura 1b).

Em roedores o desenvolvimento do hipocampo persiste após nascimento até a terceira semana de vida (MORGANE et al., 1993, figura 2) embora, a diferenciação e organização de seus neurônios ocorra entre o 17º e o 22º. De gestação (BAYER, 1980). No giro denteado a neurogênese continua até a vida adulta (ALTMAN e DAS, 1965).

Figura 2. Curvas de crescimento representando o aparecimento dos diversos tipos celulares neurais em ratos (adaptado de Morgane et al, 2002).

CA1

CA3

Giro

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1.2 Neurogênese no hipocampo de roedores adultos

A formação hipocampal e a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais são regiões onde grandes números de novos neurônios continuam a ser produzidos na vida adulta. As células que originam no SVZ migram para o bulbo olfatório e se diferenciam em interneurônios locais, enquanto que no hipocampo, novos neurônios tem origem na zona subgranular (SGZ) do giro denteado (DG) a partir de uma população local de células radiais que, atuam como células progenitoras neuronais (NPCs). Através de processos de proliferação, diferenciação neuronal, migração, crescimento dos dendritos e do axônio e formação de sinapses, em três semanas as NPCs se apresentam integradas à rede neuronal do DG como células granulares e estendem projeções axonais ao longo das fibras de Mossy para a região CA3 hipocampal (STANFIELD AND TRICE, 1988; HASTINGS AND GOULD, 1999). Embora a importância da neurogênese hipocampal no adulto não seja totalmente compreendida, várias linhas de evidência indicam que ela contribui para a formação da memória e pode estar envolvida no desenvolvimento de desordens psiquiátricas (DAVID et al., 2010; DENG et al., 2010).

A neurogênese é a formação de novos neurônios e pode ser dividida em diversos processos independentes. Estes processos incluem a proliferação de células progenitoras, a diferenciação destas progenitoras em neurônios, a maturação dos neurônios recém-nascidos e a integração desses neurônios à circuitos neurais pré-existente (CHRISTIE e CAMERON, 2006; KEMPPERMANN, 1997). Em todas estas etapas pode ocorrer morte celular (PETREANU e ALVAREZ-BUYLLA, 2002). A proliferação e a morte celular são dois processos regulados de forma independente, porém o balanço entre estes dois eventos determinam a taxa de geração dos novos neurônios e da renovação de circuitos neurais (CHRISTIE e CAMERON, 2006).

O hipocampo é uma estrutura cerebral relacionada com: a emoção, memória e aprendizado espacial. Sua estrutura é dividida em duas porções: o hipocampo ventral (HV) e o hipocampo dorsal (HD). Esta separação é feita de acordo com sua funcionalidade descrita na literatura (FANSELOW e DONG, 2010). No processamento de informações, o HD seria responsável pela memória espacial, enquanto o HV seria responsável pelas respostas ao estresse e emoções (FANSELOW e DONG, 2010). O hipocampo consiste no corno de Ammon (CA, de 1 a 4) e no GD (CAMPBELL e MACQUEEN, 2004). O GD encontra-se ao longo de

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todo o hipocampo e a neurogênese ocorre em todo GD, portanto, qualquer parte do hipocampo pode ser utilizada para avaliação da neurogênese (AIMONE et al., 2010).

A proliferação é a divisão celular de células progenitoras pode dar origem a células-filhas idênticas às progenitoras (para revisão ver ALVAREZ-BUYLLA et al., 2002). A diferenciação é o comprometimento da célula-filha com o fenótipo ao qual dará origem, glia ou neurônio. Cada uma dessas células diferencia-se, passando a expressar proteínas específicas e, nesta fase, os neurônios expressam a doublecortina (DCX). A DCX é uma proteína associada a microtúbulos, que é expressa em precursores neuronais e neurônios imaturos, tanto no cérebro em desenvolvimento quanto no adulto (BROWN et al., 2003). Depois das células já estarem comprometidas com o fenótipo neuronal, elas migram para a região alvo onde irão amadurecer e integrar-se à circuitos neurais já existentes (PETREANU e ALVAREZ-BUYLA, 2002). Assim, as células formadas na ZSV migram para camada granular do bulbo olfatório, enquanto as células formadas na ZSG do GD migram para camada granular do GD do hipocampo. A maturação é o amadurecimento dessas células. Nesta fase, o neurônio recém-formado desenvolve a árvore dendrítica e inicia as conexões sinápticas com os neurônios já existentes.

Geralmente esta fase se dá dos 20 aos 30 dias após o nascimento desses neurônios (BOHLEN AND HALBACH, 2007). Para que os neurônios possam integrar-se à circuitos neurais existentes, é necessário sua sobrevivência em todas estas etapas. PETREANU e ALVAREZ-BUYLLA (2002) verificaram um declínio na contagem desses neurônios entre 15 e 45 dias após o nascimento, e que após 1 ano, apenas um terço destes são encontrados na camada granular. Para estudar cada uma das fases da divisão a diferenciação celular foram desenvolvidos vários marcadores celulares para identificação dessas etapas (para revisão ver BOHLEN AND HALBACH, 2007). Com o desenvolvimento destas técnicas para detecção de marcadores foi possível acompanhar as diferentes etapas da neurogênese. As diversas fases da neurogênese no GD do hipocampo de ratos e camundongos adultos são afetadas por eventos externos ao organismo, tais como, o enriquecimento ou empobrecimento ambiental (KEMPERMANN et al., 1998; MESHI et al., 2006, LLORENS-MARTÍN et al., 2007).

A exposição a um ambiente enriquecido (AE) estimula (induz) a neurogênese hipocampal em camundongos adultos (KEMPERMANN et al., 1998; MESHI et al.,

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2006, LLORENS-MARTÍN et al., 2007) e produz efeitos comportamentais semelhantes ao de fármacos antidepressivos (MESHI et al., 2006). Desta forma, parece que a neurogênese hipocampal é um importante fenômeno associado a modificações do comportamento em camundongos adultos expostos a estímulos aversivos (SANTARELLI et al., 2003; SURGET et al., 2008). No entanto, não está bem determinado se a exposição a ambiente enriquecido modifica a resposta depressiva e/ou afeta a neurogênese que ocorre no GD do hipocampo de camundongos adultos. Ou ainda se, este processo, é importante para os efeitos comportamentais em ratos originários de mães submetidas à desnutrição proteica durante a gestação.

1.3 Eixo Hipocampo-Hipotalamo-Pituitaria-Adrenal (HHPA)

Em ratos, existem evidências de que a função pós-natal do eixo hipocampo-hipotalamo-pituitaria-adrenal (HHPA) pode ser alterada por eventos intrauterinos. Tais alterações podem ocasionar, no adulto, exposição cronicamente aumentada a elevados níveis de glicocorticoides (GC) ou exacerbação na resposta ao estresse. Essas alterações são geralmente atribuídas à modificações na taxa de realimentação de esteroides, condicionado pelo nível de expressão de genes para receptores de GC, incluindo receptores glico- (GR) e mineralocorticoide (MR) hipocampais. Paralelamente, ocorrem alterações em outros neurotransmissores em várias outras partes do cérebro (para revisão ver WELBERG, 2001).

O hipocampo contém grande quantidade de receptores corticosteroides que são importantes reguladores de seu processo de realimentação negativa (DE KLOET et al, 1998; JACOBSON e SAPOLSKY, 1991). Alterações na expressão destes receptores podem causar, em longo prazo, modificações dos níveis centrais de CRH causando elevação dos níveis plasmáticos de adrenocorticotrofina (ACTH) e de GC.

Estudos têm demonstrado que a exposição de animais ao estresse crônico pode promover alterações permanentes na formação hipocampal, como atrofia de corpos neuronais e remodelamento dendrítico, morte neuronal e gliose, especialmente na região C3. Estes efeitos observados no hipocampo são dependentes da ação de glicocorticoides e expressão de seus receptores, o que desencadeará efeito em

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cascata alterando a expressão de neuroaminoácidos que atuam como mediadores a jusante do remodelamento dendrítico (RADLEY et al., 2005).

Os corticosteroides, atuando através de dois receptores distintos, influenciam não somente a proliferação e morte celular, mas também, provavelmente, a diferenciação celular. A ocupação dos MR parece ser essencial para a sobrevivência dos neurônios granulares gerados. Em contrapartida, enquanto os GR podem induzir perda de neurônios na ausência de ativação de MR, parece que a ação de mineralocorticoides ligados a seus receptores normalmente, promove menos efeitos drásticos sobre a estrutura hipocampal envolvendo apenas atrofia dendrítica e perda de contatos sinápticos (Revisto em SOUSA E ALMEIDA 2002).

Recentemente, estudos em nosso laboratório demonstraram que ratos machos adultos, cujas mães foram submetidas à restrição proteica durante toda a gestação, apresentam alterações na expressão hipocampal de GR e MR paralelamente ao aumento na concentração sérica de corticosterona nos levando a supor que estes estão envolvidos na resposta exacerbada do eixo HHPA observada neste modelo. Adicionalmente, este estudo mostrou uma redução no hipocampo da expressão de receptores AT1 o que nos leva a supor que ocorra uma adaptação contrarregulatória no sentido de atenuar a resposta exacerbada ao estresse. Recentemente, observamos ainda redução na expressão de 5HT1A e aumento de 5HT2A no hipocampo e aumento do comportamento de ansiedade (dados não publicados). Estas alterações neuroquímicas podem induzir consequências importantes na gênese de distúrbios de ansiedade e de humor bem como da depressão. Matos et al. (2011) examinaram o processo de neurogênese no hipocampo de ratos adultos expostos a restrição de nutrientes (50% da quantidade de ração consumida pelos animais controle) nos períodos pré-natal e/ou neonatal e encontraram redução na proliferação celular mas não na diferenciação das novas células geradas.

1.4 Ambiente enriquecido

O ambiente enriquecido (AE) é composto por uma combinação de estímulos inanimados e sociais complexos. Animais em ambientes enriquecidos são criados em grandes grupos e mantidos em grandes espaços com uma variedade de

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objetos ofertados (por exemplo, brinquedos, túneis, material de nidificação e escadas) e que são frequentemente modificados na sua disposição. Um componente importante do ambiente enriquecido é a oportunidade de alcançar altos níveis de atividade física voluntária em rampas ou rodas giratórias (HOSSEINY et al., 2014)

Muitos estudos mostram que o AE provoca mudanças no cérebro em nível molecular, anatômico e funcional (Sale et al. 2009). A exposição ao AE promove aparecimento de efeitos benéficos em modelos animais de desordens do sistema nervoso, incluindo as doenças neurodegenerativas, lesão cerebral e mutações que comprometem a plasticidade sináptica e ao aprendizagem. (Young et al. 1999; Ilin e Richter-Levin 2009; Nithianantharajah e Hannan 2006; Baroncelli et al. 2010).

O AE vem demonstrando ter um efeito benéfico sobre uma variedade de processos fisiológicos, como a melhora da aprendizagem e da memória, assim como a redução do declínio cognitivo, tipicamente associado com o envelhecimento (Sale et al., 2009).O ambiente enriquecido também contribui para o aumento da sinaptogênese no hipocampo, o aumento do número de espinhas dendríticas e de sinapses em algumas populações neuronais (Moser et al 1994;. Rampon et al 2000).

Estudos mostram que perturbações da 4ª a 6ª semana de vida, em ratos, são cruciais para determinar a função do hipocampo na idade adulta (Guo et al. 2013). O AE promove uma série de mudanças no hipocampo que, por ser uma estrutura cerebral altamente adaptável, desempenha um papel crucial no aprendizado. Foi visto também, no giro denteado do hipocampo, que a exposição ao AE aumenta a neurogênese e reduz a morte celular por apoptose (Nithianantharajah e Hannan 2006;. Kempermann et al 1997, 2002).

Assim, no presente trabalho estamos interessados em investigar se a prole de ratas submetidas à restrição proteica gestacional apresenta alterações comportamentais e se estas estão associadas a modificações da neurogênese do hipocampo de ratos adultos in vivo. Além disso, queremos investigar se o enriquecimento ambiental, outro estímulo indutor de neurogênese hipocampal, modificaria estas possíveis alterações comportamentais e a própria neurogênese

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2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Tendo em vista a fundamentação apresentada acima o desenvolvimento do presente projeto se JUSTIFICA pela:

 Prevalente desnutrição materno-infantil, com evidentes repercussões sobre a saúde de populações e, a merecida preocupação para o desenvolvimento de políticas de saúde publica que minimizem os efeitos desta em países desenvolvidos e em desenvolvimento;

 Conhecida repercussão fetal da desnutrição materno-infantil em períodos críticos do desenvolvimento ontogênico, vinculada à manifestação programada de alterações no desenvolvimento morfológico e funcional de órgãos e sistemas;

 A programação fetal por desnutrição altera a função pós-natal do eixo HHPA podendo ocasionar, no adulto, exposição aumentada cronicamente a glicocorticoides (GC) ou exacerbação na resposta ao estresse;

 Essas alterações são geralmente atribuídas a modificações na taxa de realimentação de esteroides, condicionado pelo nível de expressão de genes para receptores de GC;

 O hipocampo e contêm MR e GR que são ativadas por estresse e contribuem para o controle neural da resposta endócrina e comportamental de adaptação ao estresse

 Os corticosteroides modulam alterações estruturais tanto no volume quanto na estrutura fina (por ex: número de sinapses e morfologia dendrítica) hipocampais e do MPFC;

 Evidências que tais alterações estão relacionadas a modificações definitivas da modulação do sistema nervoso central.

Assim, são OBJETIVOS GERAIS do presente projeto estudar, em ratos submetidos in útero a desnutrição comparativamente aos seus controles:

Os efeitos da restrição proteica gestacional sobre a neurogênese constitutiva e induzida e no número de neurônios e gliócitos no hipocampo relacionando estes achados ao comportamento da prole de ratos machos. Adicionalmente

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observaremos se estes parâmetros são modificados pela exposição dos animais ao ambiente enriquecido.

2.1. Objetivos Específicos

1. Avaliar os efeitos da desnutrição proteica materna sobre:

- O comportamento dos animais estudado por testes específicos;

- O número de células em proliferação e dos neurônios novos no giro denteado do hipocampo;

2. Avaliar os efeitos do tipo de ambiente sobre:

- O comportamento dos animais estudado por testes específicos;

- O número de células em proliferação e dos neurônios novos no giro denteado do hipocampo.

3. Correlacionar os resultados dos testes comportamentais com o número de células em proliferação celular e o número de neurônios.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar HanUnib machos e fêmeas (250-300 g) provenientes do Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas, SP (CEMIB). Os experimentos estavam de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEUA #3634-1) da Universidade Estadual de Campinas.

Os animais foram mantidos no biotério com temperatura e umidade controlada com ciclo de luz 12h/12h, com água e ração padrão para roedores ad libitum até completarem onze semanas de idade, quando teve início o período de acasalamento. Os mesmos foram acasalados em sistema de harém (dois ou três fêmeas para cada macho) por 12 horas em ambiente escuro. A presença de espermatozoide no lavado vaginal foi utilizada como indicativo de prenhez.

3.2. Composição dos grupos experimentais

Após a confirmação da prenhez as fêmeas foram divididas em dois grupos. Um grupo recebeu ração normoproteica (NP – Normal protein), contendo 17% de caseína (n=40) e outro grupo recebeu ração hipoproteica (LP – Low protein) contendo 6% de caseína (n=40) (veja Tabela 1 para composição da Dieta). As fêmeas foram alocadas em caixas individuais. As dietas normoproteica e hipoproteíca foram produzidas pela Pragsoluções Biociências, Jaú, SP. Após o nascimento a ninhada foi reduzida mantendo oito filhotes por rata e somente os machos foram utilizados. Durante a amamentação as ratas continuaram a ser alimentadas com as rações NP e LP. Após o desmame, após a terceira semana do nascimento, os animais passaram a ser alimentados com dieta padrão do biotério e foram formados os seguintes grupos: (1) animais do grupo NP submetidos ao ambiente padrão (NPP, n=20); (2) animais do grupo NP submetidos ao ambiente enriquecido (NPE, n=20); (3) animais do grupo LP submetidos ao ambiente padrão (LPP, n=20) e, (4) animais do grupo LP submetidos ao ambiente enriquecido (LPE, n=20, figura 4). Após 21 dias no ambiente padrão ou enriquecido os animais foram submetidos aos testes comportamentais como descrito abaixo.

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3.3. Ambiente enriquecido

Nos primeiros 41 dias de vida, após amamentação, os animais permaneceram em gaiolas para “pets” coloridas e compostas por diversos tubos, rampas e rodas para exercício de animais. Objetos de madeira coloridos eram ofertados para exploração (Figura 4A). Aos 53 dias de vida os ratos já haviam crescido e, por este motivo foram transferidos para gaiolas com tubos e brinquedos maiores, nas quais permaneceram por mais dez dias (Figura 4).

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Figura. 4 Ambientes enriquecidos utilizados nos primeiros 11 dias (A) e nos próximos 10 dias (B).

Tabela 1: Quantidade para 1 kg de dieta.

INGREDIENTES NORMAL PROTEIN 17% BAIXA PROTEÍNA 6%

Amido de milho 410,10 484,80 Caseína 188,90 66,70 Amido dextrinizado 130,50 159,00 Sacarose 100,00 121,00 Óleo de soja 70,00 70,00 Celulose microcristalina 50,00 50,00

Mix mineral AIN 93 35,00 35,00

Mix vit AIN 93 10,00 10,00

L cistina 3,0 3,0

Bitartarato de colina 2,5 2,5

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Testes Comportamentais

3.4. Teste de Monitoramento de Atividade

Como no teste do campo aberto esse equipamento é apropriado para demonstrar possíveis diferenças entre animais normais e animais com alterações no sistema nervoso central (SNC), em termos de suas habilidades para adquirir e utilizar informação espacial, bem como para habituação a um novo ambiente que impõe situação de medo e estímulo à emoções. As caixas de atividade (INSIGHT®) são dotadas de seis barras com 16 sensores infravermelhos que detectam e monitoram a posição relativa do animal nestas caixas (Figura 5). Durante o experimento o registro e posição dos animais ponto a ponto e registrado e armazenado por software especifico, permitindo análise detalhada do comportamento destes animais. As principais análises efetuadas foram: distância percorrida pelo animal, velocidade média, tempo de repouso, movimentos ambulatórios, movimentos instáveis (ou estereotipados), movimentos rotacionais e o número de pulos e de permanência em posição ortostática.

Para a adequada observação comportamental, os animais foram colocados em ambiente com completo silêncio e baixa luminosidade, no centro do monitor durante 5 minutos e seus movimentos foram registrados por 5 minutos. Ao final de cada sessão experimental, foi também verificado o número de bolos fecais (também definido como evidência de ansiedade ou medo) (HILL, 2006; LAUND, 2005) e, em seguida o equipamento foi higienizado com álcool etílico 5% v/v, para retirar o cheiro do animal anterior.

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FIGURA 5. Monitor de atividades

3.5. Teste em Labirinto em cruz elevado

O estado de ansiedade dos animais foi avaliado no labirinto em cruz elevado (LCE) em ambiente com completo silêncio e baixa luminosidade. Este teste comportamental foi descrito por Pellow & Chopin (1985), e convalidado por Pellow & File (1986), para o estudo de drogas ansiolíticas e ansiogênicas em ratos. Este teste fundamenta-se na aversão dos roedores a espaços abertos e altos, o que acarreta estimulação tanto dos centros do medo como da exploração, sendo interpretado como indutor da ansiedade. Os animais foram colocados na arena central do labirinto (Figura 6) com a cabeça voltada para o espaço fechado e sensores localizados nos diferentes seguimentos dos braços, detectam o número de vezes e o tempo em segundos que o animal entrava e permanecia nos braços abertos e fechados e na arena central durante período de 5 minutos de observação. O índice de ansiedade é definido e corresponde à razão entre o número de entradas e tempo de permanência nos braços abertos e o número total de entradas e tempo de permanência nos dois braços (Pellow, 1985). Os resultados obtidos foram armazenados e analisados por software específico para o experimento. Ao final de cada sessão, o aparelho era higienizado com álcool etílico 5% v/v, para retirar o cheiro do animal anterior.

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Figura 6. Labirinto em Cruz Elevado

3.6. Teste de discriminação de objeto novo:

No primeiro dia foi executada a ambientação dos animais que permaneceram em uma caixa acrílica durante 3 minutos no período da manhã e mais 3 minutos no período da tarde. No dia seguinte, pela manhã, os animais foram colocados na mesma caixa contendo dois objetos iguais (fase de familiarização, figura 7 A) durante 5 minutos. Para testar a memória de curto prazo, após um período de 3 horas um dos objetos foi trocado por um novo objeto (de cor e formato diferentes) (Figura 7 B) e, durante 5 minutos, a exploração dos objetos foi filmada. Após 24 horas testamos a memória de longo prazo mantivemos um dos objetos familiar e adicionamos outro objeto novo, também distinto em relação àqueles do teste anterior (Figura 7 C), sendo a exploração filmada durante 5 minutos. Ao final de cada sessão, o aparelho era higienizado com álcool etílico 5% v/v, para retirar o cheiro do animal anterior. Consideramos que o animal estava explorando o objeto quando este se aproximava com o focinho a uma distância de cerca de 1 centímetro do objeto. O tempo (t) de exploração de cada objeto foi registrado e a razão de discriminação (D) foi calculada como: a razão entre o tempo de exploração do objeto novo subtraído do tempo de exploração do objeto familiar em relação ao

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tempo total de exploração dos dois objetos e expressado percentualmente, (Stuart et al., 2013), de acordo com a seguinte fórmula:

D= (t [novo]-t [familiar]) / (t [novo] +t [familiar]) *100

Figura 7. Teste de discriminação de objeto novo. As figuras A, B e C

representam os objetos utilizados nos períodos de familiarização, memória de curto e longo prazo, respectivamente.

3.7. Fracionamento Isotrópico

Para avaliar o número de células do hipocampo, especificamente a quantidade de neurônios, utilizamos a técnica denominada fracionamento isotrópico (HERCULANO-HOUZEL, S e LENT, R. 2005).

Três filhotes machos de cada grupo, com idade de 42 dias de vida, foram perfundidos com salina heparinizada e, em seguida, com solução de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7.4. Os hipocampos foram dissecados, pesados e submetidos ao fracionamento em um vidro homogeinizador com 3mL de solução de dissociação (40mM de citrato de sódio e 1% de triton X-100). Assim que o tecido apresentou-se perfeitamente homogeneizado na solução de dissociação, com auxilio de uma pipeta Pasteur foi transferido para tubos de centrifugação graduados e o volume final (vf) foi precisamente ajustado com PBS 0,1M para 14mL.

Para determinar o número total de núcleos e de núcleos de neurônios, homogeneizamos, manualmente, 20 vezes a solução por tombamento, imediatamente uma alíquota de 1mL foi retirada e centrifugada por 5’ a

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6000rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi suspendido para 1mL com PBS. Este procedimento foi repetido três vezes.

Após a última lavagem o pellet foi suspendido e encubado à temperatura ambiente por 24hr com anti-NeuN mouse lgG (1:200 em PBS; Chermicon, Temecula, CA). No dia seguinte a alíquota foi lavada três vezes e os núcleos foram encubados com anticorpo secundário, Alexa Fluor® 488 goat Anti-Mouse lgG 3 (y3) (1:200 em 40% PBS, 10 NGS (normal Goat Sorum) e 50% DAPI) por 2 horas. Novamente, os núcleos foram lavados e suspendidos em 200µl de PBS para contagem dos núcleos de neurônios em microscópio de fluorescência.

Após a homogeneização mecânica, uma alíquota de 10µl foi aplicada à câmera de Neubauer. Após 5’ de espera, foi feita a leitura, contando primeiramente os núcleos marcados com DAPI, tendo em vista que este reagente marca todos os núcleos indiscriminadamente (endotélio, células da glia, neurônios). Em seguida, trocou-se o filtro azul do microscópio pelo filtro verde, realizando a contagem dos núcleos marcados com Alexa 488 (marcador de núcleos de neurônios).

A contagem do núcleo de neurônios só foi considerada válida para marcações (DAPI e Alexa 488) que se sobrepunham. Para cada animal, todos os núcleos, bem como os núcleos marcados por NeuN, foram contados em 176 quadrantes. Cada quadrante contém 4nL, desta forma, o volume final foi de 704nL. O número total de células e neurônios por grama de hipocampo foi calculado da seguinte forma: Número total de núcleos * 1000000/704 = núcleos em 2 ml. Dividindo por 2, teremos o total de núcleos por ml. Em seguida, dividimos o número de células por ml pela massa do hipocampo, obtendo assim, o número de células por grama.

3.8. Imunoistoquímica

Os animais (n = 3 por grupo) de cada grupo (NPP, NPE, LPP, LPE) foram anestesiados com ketamina (75mg/kg) e xilasina (10mg/kg), através de aplicação intraperitoneal. Os níveis de anestesia foram controlados pelo monitoramento do reflexo corneal. A perfusão foi realizada com o auxílio de uma bomba peristáltica de perfusão, mantendo-se a pressão média de 120mmHg. Cada animal foi perfundido por 15 minutos com solução salina

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heparinizada a 5% em temperatura ambiente e 20 minutos com solução de paraformoldeído a 4%.

Após a perfusão, os encéfalos foram fixados por imersão em paraformoldeído a 4% por 2 horas. Após a fixação, o material foi incluído em paraplast e, através de um micrótomo rotativo, cortes de 5 µm foram coletados em lâminas silanizadas. Os cortes histológicos, aderidos em lâminas silanizadas foram desparafinizados e posteriormente submetidos a recuperação antigênica no vapor, em tampão citrato, pH 6,0 por 30 min. Após as lâminas esfriarem, foram realizadas lavagens em PBS (0,1M, pH 7,4) por três vezes (5 minutos cada).

Findado este processo, os cortes foram incubados com anticorpos primários SOX 2 Mouse (Sta. Cruz) com diluição de 1:200 e Ki-67 rabbit (Abcam) com diluição de 1:200, diluídos em BSA 1%, overnight, sob refrigeração. Após lavagem com PBS (4 vezes com intervalos de 5 minutos), os cortes foram expostos ao anticorpo secundário específico, conjugado com fluorocromos (Alexa 555 e 488) em temperatura ambiente, durante 2 horas. Após lavagens sucessivas com PBS, a lâmina foi montada com vectashield contendo DAPI. A análise das imagens foi realizada em microscópio confocal a laser.

3.9. Análise Estatística dos Resultados

Os resultados experimentais foram expressos como média ± EPM. Estabelecida à distribuição gaussiana dos resultados obtidos, procedeu-se a analise estatística dos resultados utilizamos teste t de Student, teste de rank ou ANOVA com post-hoc de Bonferroni quando apropriado para as comparações, respectivamente de dois grupos ou mais de dois grupos analisados simultaneamente. Em todos os testes o nível de significância adotado foi de 5% (P < 0,05).

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4. RESULTADOS

A prole de animais oriundos de mães submetidas à restrição proteica gestacional, grupo LP, apresentou menor massa corporal no dia do nascimento comparativamente aos animais NP (6.28 ± 0.57 g, n=76 vs. 6.19 ± 0.5 g, n=70) , no entanto, esta diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 8). A partir do sétimo dia de vida a diferença de peso entre os grupos foi significativa, sendo que em LP o ganho de peso foi menor, comparativamente a NP, como mostra os resultados de massa corporal no 7º (17.36 ± 2.06 g, n=34 vs. 10.84±1.9g, n=32), 14º (28.64 ± 4.5 g, n=67 vs. 16.06 ± 1.9 g, n=62) e 21º (49.58 ± 7.58 g, n=71 vs.22.27 ± 3.19 g, n=63) dia de vida (Figura 8). No 42º dia a diferença de peso foi mantida, sendo que os animais NP submetidos ao ambiente enriquecido apresentaram redução significativa da massa corporal comparativamente àqueles mantidos no ambiente padrão (181.8 ± 5.5 g vs. 158.5 ± 7.3 g). Entre LPP e LPE não houve diferença significativa (118.5 ± 2.4 g vs. 112.7 ± 3.9 g).

Quanto à massa encefálica, quando ponderada pela massa corporal dos animais as diferenças relativas são significativas, já que o peso dos animais LP é significativamente menor (NPP: 0.53 ± 0.04g; NPE: 0.63 ± 0,04g; LPP: 0.76 ± 0.06g; LPE: 0.79 ± 0.07g). Entretanto, quando comparamos somente os valores absolutos da massa encefálica não são observadas diferenças estatísticas significativas (NPP: 0.86 ± 0.07g; NPE: 0.93 ± 0.06 g; LPP: 0.93 ± 0.06 g; LPE: 0.93 ± 0.07 g, Figura 9) entre todos os grupos estudados.

Não houve diferença na massa hipocampal ponderada pela massa encefálica (NPP: 0.039 ± 0.008g; NPE: 0.035 ± 0.006g; LPP: 0.038 ± 0.01g; LPE: 0.039 ± 0.008g). Também na massa hipocampal absoluta não observamos diferença entre os grupos (NPP: 0.05 ± 0.01g; NPE: 0.04 ± 0.008 g; LPP: 0.046 ± 0.016 g; LPE: 0.046 ± 0.01 g, Figura 10).

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Figura 8. Massa dos animais NP e LP do dia do nascimento até o final do período de amamentação (A). Repare nas fotos, a diferença de tamanho entre os animais no período de amamentação (C-E). Após exposição aos diferentes ambientes durante 21 dias esta diferença ainda foi mantida (B).*P<0.05; *** P<0.0005.

Figura 9. Massa do encéfalo no 42º dia de vida, dividida pela massa dos animais e massa absoluta do encéfalo dos animas dos quatro grupos . *P<0.05; ** P<0.005.

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Figura 10. Massa do hipocampo esquerdo no 42º dia de vida, dividida pela massa do encéfalo e massa hipocampal absoluta.

Pela técnica de fracionamento isotrópico observamos que não houve diferença significativa no número de células totais nos hipocampos dos animais estudados (NPP: 9269.409 x 103 ± 3055.642 x 103; NPE: 12033.14 x 103 ± 3730.842 x 103; LPP: 10399.97 x 103 ± 843.5232 x 103; LPE: 11563.06 x 103 ± 1172.047 x 103, N=3, Figura 11). Já o número de neurônios foi significativamente reduzido nos animais do grupo LPP quando comparado aos outros três grupos, entretanto, a permanência no ambiente enriquecido durante 3 semanas (LPE) levou ao reestabelecimento do número de neurônios (NPP: 6253.068 x 103 ± 2198.868 x 103; NPE: 6521.314 x 103 ± 732,4741 x 103; LPP: 3324.018 x 103 ± 763.3779 x 103; LPE: 5344.112 x 103 ± 551.5624 x 103, N=3, Figura 11).

Figura 11. Número de núcleos totais e de núcleos de neurônios em relação à massa do hipocampo. *P<0.05; ** P<0.005.

Assim, observamos que a restrição proteica durante a gestação e a amamentação acarretou em alteração a proporção entre neurônios e outros tipos celulares presentes no hipocampo (células da glia e endoteliais) e esta foi

NP P NP E LPP LPE 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 Ma s s a h ip o c a m p o (g ) NP P NP E LPP LPE 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 M a s s a h ip o c a m p o /e n c é fa lo (g )

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parcialmente reestabelecida àquela observada nos animais controle após permanência no ambiente enriquecido (Figura 12).

Figura 12. Porcentagem de neurônios e células da glia e endoteliais em relação à massa do hipocampo.

4.1 Imunoistoquímica

A formação hipocampal e a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais são regiões onde grandes números de novos neurônios continuam a ser produzidos na vida adulta. As células que originam na SVZ migram para o bulbo olfatório e se diferenciam em interneurônios locais, enquanto que no hipocampo, novos neurônios tem origem na zona subgranular (SGZ) do giro denteado (DG) a partir de uma população local de células radiais que atuam como células progenitoras neuronais (NPCs).

A figura 13 apresenta o número de mitoses, de células tronco (stem cells) e de mitoses de células tronco observadas na zona subgranular (SGZ) e na camada granular (GL) do giro denteado hipocampal (GD) na prole de animais dos

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grupos NPP, NPE, LPP e LPE avaliados. Os resultados mostram inicialmente, uma expressiva e significante redução de células em mitose, de células tronco e de mitoses de células tronco na prole de animais cujas mães foram submetidas à restrição proteica gestacional (LP), seja na camada granular bem como subgranular do giro denteado.

Os estudos evidenciam claramente, que a exposição dos animais ao ambiente enriquecido promove expressiva recuperação do processo de proliferação celular, particularmente de células tronco. Estas observações podem ser evidenciadas, por imunoistoquimica do giro denteado (Figura 14) e da zona subventricular (Figura 15) próximo aos ventrículos laterais e, pelas representações gráficas da Figura 13.

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Figura 13. O gráfico representa o número de mitoses, de células tronco (stem cells) e de mitoses de células tronco observadas nas camadas subgranular (SGL) e granular (GL) do giro denteado hipocampal (GD) na prole de animais NP. NPE, LP e LPE avaliados. *P< 0.05; ** P<0.005.

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Figura 14. Imagens representativas obtidas pela técnica de imunoistoquimica de regiões do hipocampo avaliando o número de mitoses e de células tronco, nas regiões subgranular e granular do giro denteado. A esquerda dos painéis são apresentados os grupos das proles estudadas cujas mães foram submetidas (LPP) ou não (NPP) a restrição proteica na gestação e amamentação e expostas a ambiente enriquecido após amamentação (LPE e NPE).

Sox 2 DAPI Sox 2 Sox 2 Sox 2 Ki67 DAPI DAPI DAPI Ki67 Ki67 Ki67 merge merge merge merge

N

P

P

N

P

E

L

P

E

L

P

P

GIRO DENTEADO

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Figura 15. Imagens representativas obtidas pela técnica de imunoistoquimica de regiões subventriculares próximas aos ventrículos laterais, avaliando o número de mitoses e de células tronco. A esquerda dos painéis são apresentados os grupos das proles estudadas cujas mães foram submetidas (LPP) ou não (NPP) a restrição proteica na gestação e amamentação e expostas a ambiente enriquecido após amamentação (LPE e NPE).

Sox 2 DAPI Sox 2 Sox 2 Sox 2 Ki67 DAPI DAPI DAPI Ki67 Ki67 Ki67 merge merge merge merge

N

P

P

N

P

E

L

P

E

L

P

P

SUBVENTRICULAR

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TESTES COMPORTAMENTAIS

4.2 Teste de Monitoramento de Atividade: A distância percorrida pelos

animais foi considerada como a somatória dos diversos deslocamentos de posições monitoradas pelo equipamento. Os resultados demonstraram que nos animais NP o ambiente enriquecido aumentou significativamente a atividade locomotora dos animais. Já no grupo LP, embora tenhamos observado um discreto aumento em LPE, a diferença não foi significativa comparativamente, a LPP (Figura 16, tabela 2).

A velocidade média dos animais foi calculada como a distância percorrida de um determinado ponto a outro, dividida pelo tempo gasto pelo animal para percorrer esta distância. Também com relação à velocidade, houve aumento significativo nos animais NPE comparativamente aos NPP e não foi significativa entre LPP e LPE (Figura 16, tabela 2).

Figura 16. Resultados obtidos pelo monitor de atividades. Nas imagens superiores temos representados exemplos dos deslocamentos de animais NP e LP da mesma prole um mantido em ambiente padrão e outro em enriquecido. Nos gráficos temos os valores da distância e velocidade de deslocamento de cada grupo. *P<0.05; ** P<0.005.

Quanto à atividade, pulos, movimentos ambulatórios e vezes que ficou em pé, em posição exploratória ortostática, o padrão de diferenças observadas foram as mesmas encontradas nos resultados anteriores, ou seja, maior na prole NP submetida ao EA, comparada a animais controles e a LPE. Assim, observa-se aumento significativo destes parâmetros somente nos NP submetidos ao

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ambiente enriquecido (Figura 17, tabela 2). Somente a quantidade de vezes que o animal ficou em posição ortostática apresentou um decréscimo significativamente menor no LPP quando comparado ao NPP (Figura 17, tabela 2).

O software considera movimentos estereotipados sempre que ocorre detecção de movimentos repetitivos em leituras seguidas, sem que o centro de massa do animal seja alterado. Estes movimentos representam atitudes dos animais quando estes estão se coçando, ou com movimentos repetitivamente mastigatórios ou da cauda. Os animais LP apresentaram redução significativa dos movimentos estereotipados e o ambiente enriquecido não promoveu qualquer alteração significativa neste parâmetro (Figura 18, tabela 2).

A diferença entre o tempo que os animais permaneceram no centro ou nas bordas da arena foi significativamente diferente. Desta forma, a prole LP apresentou tendência em permanecer maior tempo nas a bordas e evitar o centro da arena (Figura 19, tabela 2). O ambiente enriquecido aumentou significativamente os movimentos de rotação dos animais NP e LP (Figura 19, tabela 2).

Tabela 2. Valores obtidos no monitor de atividades

NPP NPE LPP LPE Distância 7608±839 11000±732 6944±736 8050±953 Velocidade 25.36±2.8 36.67±2.4 23.15±2.4 26.83±3.2 Atividade 67.5±6.9 89.9±5.7 61.22±6.5 65.16±7.3 Movimentos ambulatórios 52±5.7 73.31±4.7 46.94±4.9 53.58±6.3 Em pé 25.2±2.9 34.5±2.9 16.9±1.7 20.3±2.2 Pulos 3.9±0.8 7.3±0.6 3.3±0.4 5.2±0.6 Movimentos estereotipados 713±33 721±17 626±27 610±35 Movimentos rotacionais 7.2±1.2 14.2±1.4 7.9±1 11.3±1.5

Tempo nas bordas 294±1.4 293±1 296±0.9 295±0.9

Tempo no centro 5.5±1.4 6.4±1 2.9±0.9 4.4±0.9