Análise transcritômica de linfócitos T humanos tratados com anticorpos anti-CD3

(1)

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR

Análise transcritômica de linfócitos T humanos tratados

com anticorpos anti-CD3

Kelly Cristina Rodrigues Simi

Orientador: Prof Dr. Marcelo de Macedo Brígido

Co-orientadora: Profª Dra. Andréa Queiroz Maranhão

Brasília – DF

2014

(2)

ii

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR

Análise transcritômica de linfócitos T humanos tratados

com anticorpos anti-CD3

Kelly Cristina Rodrigues Simi

Tese apresentada ao Departamento

de Biologia Celular do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade

de Brasília como requisito parcial à

obtenção do grau de Doutor em

Biologia Molecular

Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido

Co-orientadora: Profª Dra. Andréa Queiroz Maranhão

Brasília – DF

2014

(3)

iii

Banca Examinadora:

Prof. Niels Olsen Saraiva Camara (USP – Banca Externa)

Dra. Priscila Grynberg (Embrapa – Banca Externa)

Prof. Dra. Ildinete Silva-Pereira (UnB – Banca Interna)

Prof. Dra. Kelly Grace Magalhães (UnB – Banca Interna)

Dra. Galina Gulis (UnB – Suplente)

Prof Dr. Marcelo de Macedo Brígido (UnB – Orientador)

Prof

a

_{Dra. Andréa Queiroz Maranhão (UnB – Co-orientadora)}

Trabalho desenvolvido no Laboratório

de Biologia Molecular da Universidade

de Brasília, sob a orientação do Prof.

Dr. Marcelo de Macedo Brigido.

(4)

iv

Dedico este trabalho ao meu marido, Gideone Nobre Bandeira e aos meus

pais, que sempre me apoiaram e acreditaram nos meus sonhos. E a minha

pequena, que está prestes a chegar e me concederá o maior título de todos!

(5)

v

“Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima”

(Louis Pasteur)

(6)

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela força concedida em todos os momentos difíceis,

determinação nos momentos de dúvidas e serenidade nos momentos de conflitos.

Agradeço de coração aos meus orientadores Marcelo e Andrea pela oportunidade

que me deram. Por terem acreditado em mim. Devo à vocês o meu crescimento

científico e profissional.

A todos da minha família por acreditar nos meus sonhos. Ao meu

marido, que sempre foi paciente e tanto me ajudou. Sem você, eu não teria

conseguido. Aos meus pais que sempre me apoiaram nos momentos difíceis. A

minha querida Melissa, que tem me dado uma gestação tranquila que permitiu a

finalização desse doutorado. Saiba que você pequena, me concederá o mais

nobre título, o de mãe!

Aos meus grandes amigos do grupo de Imunologia Molecular, pelos

momentos de alegrias e os de desesperos.

A Maryani e Isabel, minhas companheiras de experimentos. Sempre foi

fácil trabalhar com vocês. Agradeço pela paciência, amizade, carinho. Amo vocês!

A Manu, que embarcou em parte desse projeto. Sempre à disposição, com seu

jeitinho meigo.

Ao meu querido amigo Rafa, de longa data. Que sempre esteve

disposto a ajudar. Saiba que te amo como um irmão! A Galina, essa pessoa

simplesmente sensacional e atenciosa. Ao Thompson, que sempre foi prestativo

e gentil.

A querida professora Ildinete, que acompanhou minha evolução desde

o início. Saiba que tenho um carinho muito especial por você, conterrânea!

A todos os que participam desse grupo ou já participaram. A Bárbara,

Fernanda, Isabella, Luana, Janaína, Izabel, Flávia, Mariana, Victor e Yuri. Com

cada um, aprendi um pouquinho. Mesmo não estando mais no grupo,

tornaram-se pessoas especiais.

Agradeço a Fátima e Ivonildes, sem vocês, o laboratório pararia.

Obrigada pelo carinho!

(7)

vii

SUMÁRIO

Índice de Figuras

x

Índice de Tabelas

xi

Lista de Abreviaturas

xii

Resumo

xiv

Abstract

xv

Introdução

1 1. Sistema imune e tolerância imunológica

2 2. Diferenciação e funções dos Linfócitos T CD4+

4 2.1 Linfócitos Th1

5 2.2 Linfócitos Th2

6 2.3 Linfócitos Th17

7 2.4 Família de Linfócitos T com fenótipo supressor

9 2.4.1 Linfócitos T reguladores de ocorrência natural (nTregs)

10 2.4.2 Linfócitos T reguladores induzidos (iTregs)

12 2.5 Mecanismos de supressão

13 2.5.1 Supressão por meio de citocinas

13 2.5.2 Supressão pela modulação das células dendríticas (DCs)

14 3. Anticorpos recombinantes

15 4. Anticorpos anti-CD3

23 5. Tecnologia de RNA-Seq

27 Justificativa e Objetivos

30 Material e Métodos

33 Material

34 1. Células

34 2. Soluções, meios e regentes

34 3. Soluções e material para ensaios imunológicos

38 4. Soluções e material para citometria de fluxo

39 5. Anticorpos utilizados nos imunoensaios

40 6. Reagentes e Kits de isolamento de PBMC e linfócitos T

42

(8)

viii

8. Kits e placas para validação de genes por PCR Array

42 Métodos

43 1. Cultura de células de mamíferos

43 2. Congelamento de células de mamíferos

43 3. Descongelamento de células de mamíferos

43 4. Tripsinização, passagem das células e formação de monocamada celular

44 5. Estimativa do número de células

44 6. Acúmulo de sobrenadante de cultura

45 7. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

45 8. Purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade

46 9. Análise de proteínas por Dot Blot

47 10. Análise de proteínas em gel de SDS-PAGE

47 11. Coloração de gel de SDS-PAGE

48 12. Análise de proteínas por Western Blot

48 13. Ensaio de ligação direta utilizando citometria de fluxo

48 14. Separação de PBMC por gradiente de Ficoll

50 15. Estimulação de PBMC com os anticorpos anti-CD3

50 16. Isolamento dos Linfócitos T por meio de beads magnéticas

50 17. Extração de RNA total de Linfócitos T

51 18. Tratamento de RNA total com DNAse

51 19. Quantificação de RNA e análise de qualidade por Bioanalyzer

51 20. Preparo das amostras de RNA e sequencimaneto

52 21. Análises por bioinformática

52 22. Ferramentas de bioinformática

53 22.1 FastQC

54 22.2 Segemehl.x

54 22.3 HTSeq-count

55 22.4 DESeq2

56 22.5 g:GOSt

56 23. Validação por PCR Array

57 Desenho Experimental

59 Resultados e Discussão

61 1. Produção e purificação dos FvFc anti-CD3

62

(9)

ix

3. Estimulação de PBMC humano e isolamento de Linfócitos T

66 4. Análise da qualidade do RNA total

67 5. Análise da qualidade dos dados de RNA-Seq

69 6. Análise da expressão gênica global de Linfócitos T após estimulação

70 7. Expressão diferencial de genes envolvidos com a regulação do sistema imune 78

7.1 Expressão de genes envolvidos com anergia ou morte celular

78 7.2 Regulação de genes codificadores de citocinas e fatores de transcrição

81 7.3 Expressão de genes envolvidos com imunorregulação

85 7.4. Regulação da expressão do VDR e da enzima CYP27B1

94 7.4 Dualidade das respostas induzidas pelos anti-CD3

97 Conclusões e perspectivas

101 Referências Bibliográficas

104 Anexos

119 Anexo I

120

(10)

x

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Diferenciação de Linfócitos T CD4+

8 Figura 2 – Desenvolvimento de Tregs

9 Figura 3 – Estrutura de anticorpo inteiro e seus fragmentos

17 Figura 4 – Mecanismos efetores mediados por anticorpos

18 Figura 5 – Representação esquemática das diferentes versões de anticorpos 20

Figura 6 – Desenho esquemático das diferentes versões dos anti-CD3 26

Figura 7 – Experimento típico de RNA-Seq

28 Figura 8 – Pipeline de análise empregado para os dados de RNA-Seq

53 Figura 9 – Gráfico comparativo de eficiência de purificação

63 Figura 10 – Análise dos anticorpos anti-CD3 por SDS-PAGE

64 Figura 11 – Análise da separação de Linfócitos T da cultura de PBMC

67 Figura 12 – Análise da pureza do RNA por Bioanalyzer

68 Figura 13 – Representação gráfica da qualidade dos dados Illumina

70 Figura 14 – Análise da expressão gênica global

73 Figura 15 – Diagrama de Venn

74 Figura 16 – Representação gráfica das ontologias gênicas (GO)

77 Figura 17 – Regulação dos genes envolvidos com anergia e morte celular 81

Figura 18 – Expressão de Foxp3 e seus alvos

87 Figura 19 – Expressão de IRF4 e seus alvos

88 Figura 20 – Regulação de Foxp3 e IRF4

88 Figura 21 – Expressão de MIR155HG

89 Figura 22 – Comparação de genes obtidos por RNA-Seq e dados de Birzele et al

(2011)

92 Figura 23 – Expressão do gene codificador de granzima B (GZMB)

94 Figura 24 – Expressão dos genes codificadores de Vitamina D (VDR) e a enzima

1-alfa-hidroxilase (CYP27B1)

86 Figura 25 – Sequencimento do tipo paired-end

120

(11)

xi

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1

– Citocinas e fatores de transcrição que regulam o programa de

diferenciação de Linfócitos T CD4+

5 Tabela 2 – Principais marcadores de Tregs

10 Tabela 3 – Anticorpos monoclonais aprovados pelo FDA até 2013

21 Tabela 4 – Produtividade específica dos anticorpos anti-CD3

62 Tabela 5 – Concentração dos FvFc após purificação e diálise em PBC 64

Tabela 6

– Medianas de intensidade de fluorescência (MIF) de FITC e

porcentagem de linfócitos T marcados com os FvFc recombinantes

66 Tabela 7 – Estatística do mapeamento

71 Tabela 8 – Genes diferencialmente expressos em cada tratamento

72 Tabela 9 – Ontologias gênicas (GO)

75 Tabela 10 – Genes envolvidos com anergia e morte celular (RNA-Seq) 80

Tabela 11 – Expressão de fatores de transcrição, citocinas e receptores 84

Tabela 12 – Genes específicos de Tregs ativadas

90

(12)

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

ADCC

Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

AICD

Morte Celular Induzida por Ativação

APC

Allophycocyanin

APS

Persulfato de amônio

BCIP

5-Bromo-4Cloro-indolil fosfato

CD

Cluster of diferentiation (Marcador de diferenciação)

CDR

Região Determinante de Complementariedade

CH

Cadeia constante pesada de anticorpo

CHO

Células de ovário de hamster chinês

Cκ

Porção constante kappa da cadeia leve

CL

Cadeia constante leve de anticorpo

EDTA

Ácido etilenodiaminotetracético

ELISA

Ensaio de ligação imunoenzimático

Fab

Fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo

FACS

Fluorescence Activated Cell Sorter

Fc

Fragmento cristalizável de anticorpo (porção constante)

FDA

Food and Drug Administration (EUA)

FL

Fluorescência

FR

Arcabouço (Framework)

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Fragmento variável de anticorpo

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Interleucina

kDa

Kilodalton

M

Molar

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Anticorpo monoclonal

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Miligrama

MHC

Complexo principal de histocompatibilidade

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Micrograma

mL

Mililitro

μL

Microlitro

mM

Milimolar

μm

Micrômetro

μM

Micromolar

mRNA

Ácido ribonucléico mensageiro

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Nitro Blue Tetrazole

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Nanograma

OKT3

Anticorpo monoclonal anti-CD3 clone OKT3

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Origem de replicação

pb

Par de base

PBMC

Células mononucleares de sangue periférico

PBS

Tampão salina fosfato

PCR

Reação em cadeia de polimerização

FITC

Fluoresceína isotiocianato

pH

Potencial hidrogeniônico

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Picomol

(13)

xiii

rpm

Rotações por minuto

RNA

Ácido ribonucléico

RNAse

Ribonuclease

RNAse Free Livre de Ribonuclease

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Fragmento variável de anticorpo de cadeia única

SDS

Sódio Duodecil Sulfato

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS

SFB

Soro fetal bovino

TCR

Receptor de célula T

TEMED

N,N,N’,N’-tetrametil etilenodimetilamina

VH

Domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo

VL

Domínio variável da cadeia leve de um anticorpo

(14)

xiv

RESUMO

O sistema imune é constituído de uma complexa rede de células, tecidos e órgãos

que trabalham em conjunto para a proteção do organismo. Um importante

componente do sistema imunológico é o linfócito T. Há dois tipos principais de

linfócitos T: T CD4+ (T auxiliares) e T CD8+ (T citotóxicos). Os linfócitos T

auxiliares podem estar envolvidos com a proteção do organismo contra

microorganismos ou no desenvolvimento de algumas doenças. O receptor de

linfócitos T está associado ao complexo da molécula CD3. Estimulação dessa

complexo com anticorpos anti-CD3 induz a ativação dos linfócitos T. Depois da

ativação, o linfócito T pode se diferenciar em subpopulações envolvidas com

respostas inflamatórias para eliminação de patógenos (Th1, Th2 e Th17) ou

anti-inflamatórias (Tregs) para a manutenção da homeostase do organismo.

Anticorpos anti-CD3 pode induzir a diferenciação dos linfócitos T nos subgrupos

de Tregs e pode ser usado como moléculas terapêuticas para tratar doenças

autoimunes e processos de rejeição a transplantes. No presente estudo foi

analisado o efeito imunomodulatório in vitro de versões humanizadas de anti-CD3

(FvFc R, T e M) comparando com o anticorpo murino anti-CD3 (OKT3) usando

sequenciamento de alto desempenho (RNA-Seq). RNA-Seq foi realizado em

linfócitos T não estimulados e estimulados com as diferentes versões de anti-CD3.

Diversos genes envolvidos com imunorregulação foram regulados positivamente

após o tratamento com os anti-CD3. Alguns desses genes codificam marcadores

exclusivos de Tregs, tais como, CD25, FOXP3, CTLA4 e GITR. Outros genes

codificavam importantes proteínas envolvidas com a função supressora das

células Tregs (Ex. GZMB). Por outro lado, alguns marcadores de células Th17

também foram regulados positivamente. Citocinas de perfil Th17, tais como, IL17

e IL17F foram induzidas por todos os tratamentos. Porém, IL21 e IL22 foram

regulados positivamente somente em OKT3. Embora os anticorpos anti-Cd3

humanizados apresentaram um efeito imunomodulatório, mais estudos são

necessários

para

compreender

os

mecanismos

envolvidos

nessa

imunomodulação.

(15)

xv

ABSTRACT

The imune system is made up of network of cells, tissues and organs that work

together to protect the body. An important component of immune system is T cell.

There are two kinds of T cell: T CD4+ (T helper) and T CD8+ (T cytotoxic). T helper

cells can be involved with organism protection against microorganism or in the

development of some diseases. The receptor of T cells is associated with the CD3

molecule complex. Stimulation of this complex with anti-CD3 antibodies induces T

cell activation. After activation antigen-dependent T cell drives the differentiation

into subpopulation involved with inflammatory response to eliminate patogens

(Th1, Th2 and Th17) or antiinflamatory reponse (Tregs) to maintain organism

hemeostasis. Antibodies anti-CD3 can induce differentiation of T cell into Treg

subsets and can be used as terapeutic molecules to treat autoimune diseases and

allograft rejection. We studied immunomodulatory effect in vitro of humanized

version of anti-CD3 (FvFc R, T and M) comparing with comercial murine anti-CD3

antibody (OKT3) using deeping sequencing (RNA-Seq). RNA-Seq was performed

in T cells not stimulated or stimulated with anti-CD3. We found several genes

involved with immunorregulation that were upregulated after treatment with

anti-CD3 antibodies. Some of genes encodes exclusive markers of Tregs, such as,

CD25, FOXP3, CTLA4 and GITR. Some others encodes important proteins

involved with supressive function of Tregs (eg. GZMB). Otherwise, some markers

of Th17 cells were also upregulated. Th17 cytokines profile, such as IL17 and

IL17F were upregulated in all treatment. But, IL21 and IL22 were upregulated only

with OKT3. Despite of the humanized anti-CD3 presented an immunomodulatory

effect further studies are necessary in order to understand the mechanisms of this

effect.

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