PARAMÊTROS MOTORES E DE ESTRESSE OXIDATIVO NO
MUSCULO QUADRÍCEPS DE RATOS
Effect of the Sedentary style of Life in the Quality of Life in Women after - breast Câncer of the Valley of Braço do Norte
... Thiago Nack Feuser*; Aderbal Silva Aguiar Junior, M.Sc.*.
* Departamento de Fisioterapia da Universidade do Sul de Santa Catarina, Tubarão, SC, Brasil.
RESUMO
O objetivo do trabalho foi estudar os efeitos eletroestimulação neuro muscular após a imobilização sobre parâmetros de estresse oxidativo, analisar os níveis de oxidação de proteínas no quadríceps, verificar os níveis de oxidação de lipídios do quadríceps, avaliar a atividade locomotora dos animais. A amostra foi de 15 ratos Winstar machos com idade entre 6 e 8 semanas fornecida pelo biotério da UFSC. Os animais foram divididos em três grupos de cinco, sendo um grupo controle, grupo imobilização e grupo imobilização mais eletro estimulação neuro muscular. Foi avaliado a atividade locomotora dos camundongos, carbonilação de proteínas e lipoperoxidação. A imobilização do membro inferior dos ratos reduziu a atividade locomotora dos mesmos e após a aplicação da EENM foi possível recuperar em parte a atividade perdida. Provavelmente se a EENM fosse por um período maior de tempo alcançaríamos resultados ainda mais satisfatórios. Em relação a carbonilação de proteínas obtivemos respostas semelhantes as da atividade locomotora. Foi visto que a imobilização levou a oxidação de proteínas e que com a EENM conseguimos diminuir essa oxidação. A lipoperoxidação obteve resultados não satisfatórios provavelmente devido ao pouco tempo de EENM.
ABSTRACT
The objective of the work was to study the effects electro stimulation neuromuscular after detention on parameters of oxidative stress, examine the levels of protein oxidation in the quadríceps femoralis , check the levels of lipid oxidation of the quadríceps femoralis, assess the motor activity of the animals. The sample was of 15 rats winstar males aged between 6 and 8 weeks provided by biopterin of UFSC. The animals were divided into three groups of five, with a control group, group detention and detention group more electro stimulation neuromuscular. It was estimated the motor activity of the rats, carbonylation of protein and lipid peroxidation. The immobilization of the lower limb of rats reduced the motor activity of the same and after the application of EENM was able to recover in part the activity lost. Probably the EENM were for a greater period of time to take results even more satisfactory. For carbonylation of proteins obtained similar responses of the motor activity. It has been seen that led to the detention of protein oxidation and that the EENM we reduce the oxidation. The lipid peroxidation received unsatisfactory results probably due to the short time of EENM.
INTRODUÇÃO
Lesões nos desportos, doenças degenerativas articulares, fraturas ósseas, rupturas ligamentares ou desnervação são situações clínicas que podem levar a imobilização do membro, acarretando, atrofia e alterações no metabolismo muscular (DIAS et al., 2005).
Para haver o metabolismo energético das fibras musculares, deve-se ter uma integridade entre as estruturas musculares e a placa motora, além de uma constância do suprimento de substâncias metabólicas (DIAS et al., 2005).
Estudos mostram que, a imobilização, induz prejuízos ao metabolismo mitocondrial do músculo esquelético, comprometendo a síntese de proteínas miofibrilares, afetando a dinâmica contrátil e integridade das vias metabólicas, que juntas precedem o processo de atrofia (DIAS et al., 2005).
O metabolismo mitocondrial é dependente do oxigênio e este representa um paradoxo por ser elemento essencial, e ao mesmo tempo, potencialmente destrutivo para a saúde (CANCELLIERO, 2004). As espécies reativas de oxigênio são também produzidas durante o metabolismo normal e serem envolvidas em reações enzimáticas, transporte mitocondrial do elétron, sinal de transducão, ativação de fatores nucleares da transcrição, expressão do gene, e a ação anti-microbial dos neutrófilos e macrófagos (BAYIR, 2005).
Os radicais livres de oxigênio são formados pela redução incompleta do oxigênio, gerando espécies que apresentam alta reatividade para outras biomoléculas, principalmente lipídios e proteínas das membranas celulares e até mesmo, o DNA (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
Um radical livre é definido como qualquer espécie que contém um ou mais elétrons desemparelhados. Espécie Reativa do oxigênio (EROs) é um termo coletivo que inclui ambos radicais do oxigênio, tais como o anion superóxido, radical hidroxil, e determinados agentes de oxidação não radical, tais como o peróxido de hidrogênio , ácido hipocloroso , e ozônio, que pode ser convertido facilmente nos radicais.
Os radicais livres e a oxidação são tópicos importantes a serem considerados, na EENM para manutenção do equilíbrio químico muscular. No intuito de minimizar os eventos desencadeados pelo desuso muscular, diversas técnicas têm sido utilizadas, buscando melhorar as condições homeostáticas das fibras musculares, com destaque para estimulação elétrica neuromuscular (DURIGAN, 2006). A atrofia do músculo induzida pela imobilização é também acompanhada pelo stress oxidativo; substância reativa ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e glutationa oxidado (GSSG) foram aumentados e o glutationa total (GSH) foi diminuído no músculo atrofiado (KONDO et al., 1993).
[...] Estimulação eletro neuro muscular (EENM) a longo prazo da panturrilha com as freqüências do impulso que eliciam contrações tetânicas mostram a sessão transversa do músculo e o aumento da área e força, melhorando também resistência a fadiga (NUHR et al., 2003).
Sendo assim o objetivo geral foi estudar os efeitos eletroestimulação neuro muscular após a imobilização sobre parâmetros de estresse oxidativo, e teve por objetivos específicos, analisar os níveis de oxidação de proteínas do quadríceps, analisar os níveis de oxidação de lipídios do quadríceps e avaliar a atividade locomotora dos animais.
MATERIAIS E MÉTODO
A pesquisa trata-se de um estudo experimental. A pesquisa experimental, segundo Rudio (1998) “[...] está interessada em verificar a relação de casualidade que se estabelece entra as variáveis, isto é, em saber se a variável X (independente) determina a variável Y (dependente)”. Para isso, cria-se uma situação de controle rigoroso neutralizando todas influências alheias que Y pode sofrer.
A amostra foi de 15 ratos Winstar machos com idade entre 6 e 8 semanas pesando 200-250g fornecidos pelo biotério da UFSC. Os animais foram divididos em três grupos de cinco, sendo um grupo controle, grupo imobilização e grupo imobilização mais eletro estimulação neuro muscular.
Figura 1 Eletroestimulador Nemesys 941 Figura 2 Caneta estimuladora, jacaré e eletrodo
Os animais foram divididos em três grupos (n=5) grupo controle, grupo imobilização e grupo imobilização mais eletro estimulação neuro muscular.
Os animais foram anestesiados com quetamina, 3 µl, via sub-cutânea para poder se realizar a imobilização.
Foi imobilizado todo membro inferior durante 1 semana, sendo utilizado para imobilização uma tala confeccionada pelo autor, utilizando tala gessada. (figura 3 e 4).
Figura 3 membro inferior imobilizado
Após 1 semana de imobilização os animais foram submetidos a EENM durante 2 dias. O local a ser colocado os eletrodos foi tricotomizado para garantir um melhor posicionamento dos eletrodos. No eletrodo metálico foi colocado gaze umidificada em soro fisiológico para melhor condução, prendendo o eletrodo na pata. Com a caneta foi estimulado o quadríceps. Na ponta da caneta foi colocado um algodão umidificado em soro fisiológico.
Após 2 dias de EENM os animais foram sacrificados, dissecado o quadríceps e retirado amostra de tecidos.
A avaliação da atividade locomotora dos ratos foi realizada em uma caixa de madeira com dimensões 40 x 25 x 20 cm. Esta apresenta três células fotoelétricas instaladas a 3 cm de altura do assoalho em grade, espaçadas igualmente ao longo de sua extensão e acopladas a um contador digital. Este registra o número de vezes que o animal interrompe os feixes de luz (cada interrupção do feixe de luz constituiu em uma medida de atividade). Desta forma, somente os movimentos horizontais dos animais são detectados pelas fotocélulas.
Os níveis de Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) foram mensurados pelo método de Draper e Hadley (1990) e expressos em equivalentes de malonaldeído (MDA). 1ml de ácido tricloroacético 10% e 1ml de ácido tiobarbitúrico 0,67% será acrescido às amostras, e posteriormente aquecidos em banho maria por 15 min. Os níveis de TBARS serão determinados pela leitura da absorbância a 535nm e os resultados em nmol MDA/mg proteína.
O conteúdo de carbonilação de proteínas foi determinado de acordo com o método de Levine et al (1990), pela formação de derivados da proteína hidrazona utilizando 2,4-dinitrofenilhidrazida (DNPH). Estes derivados serão extraídos sequencialmente com ácido tricloroacético 10% seguido de tratamento com etanol/etilacetato (volume 1:1) e re-extração com ácido tricloroacético 10%. O precipitado resultante será dissolvido em uréia 6M. A diferença entre as leituras do espectro a 370nm de 2,4-DNPH (branco) será utilizado para calcular o nmol de 2,4-DNPH incorporado por mg de proteína.
A concentração de proteínas foi estimada com a albumina sérica bovina (BSA) como padrão (Lowry et al, 1951). Nos ensaios de imunodetecção, as proteínas serão determinadas pelo método de Petersen (1952) (Lowry modified) e BSA também como padrão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A figura 4 apresenta a atividade locomotora dos camundongos, comparando o grupo controle, imobilização e imobilização mais EENM, demonstrando que os resultados obtiveram significância estatística (P<0,05). A figura 4 demonstra que a imobilização diminuiu a atividade locomotora dos camundongos, e que com a aplicação da EENM, após a retirada da imobilização melhorou a atividade locomotora.
Figura 4 demonstrando resultados da caixa de atividade * P<0,05 do grupo controle# P<0,05 do grupo imobilização. Fonte: Pesquisa realizado pelo autor.
No intuito de minimizar os eventos desencadeados pelo desuso muscular, diversas técnicas tem sido utilizadas, buscando melhorar as condições homeostáticas das fibras musculares, com destaque para estimulação elétrica neuro muscular (DURIGAN et al, 2005).
Fuchs, cita ainda que a EENM é efetiva em músculos anormais ou imobilizados. Durigan et al, 2005 fala que dentre os estudos com animais a estimulação elétrica com freqüência de 10 Hz aplicada 8 horas por 21 dias diariamente promove redução da atrofia muscular induzida por suspensão em ratos. Isso comprova os achados da figura acima e ainda nos mostra que os resultados poderiam ser ainda mais significantes. Se o período de eletroestimulação fosse maior e durante mais dias, os resultados obtidos seriam ainda mais significantes, aumentaria também a atividade locomotora dos ratos.
Autores como Durigan, Cancelliero, demonstram ótimos resultados com a EENM utilizando períodos maiores de aplicação da estimulação.
A figura 5 apresenta a oxidação das proteínas, mostrando que a imobilização aumenta a oxidação das proteínas e que com a EENM foi possível reverter um certo grau de oxidação com significância estatística (P<0,05).
Figura 5 demonstra carbonilação de proteínas * P<0,05 do grupo controle# P<0,05 do grupo imobilização. Fonte: Pesquisa realizada pelo autor.
Há tempos vem se observando que a imobilização promove fraqueza e atrofia muscular, e só nos anos 90 foi verificado o comprometimento nas vias sinalizadoras de insulina e no transporte de glicose. Estudos mostram que, de forma concomitante com a imobilização, existe modificação na homeostasia do músculo esquelético, comprometendo ou não a síntese de proteínas miofibrilares, afetando a dinâmica contrátil e integridade das vias metabólicas, que juntas precedem o processo de atrofia (DIAS et al, 2004).
muscular é o resultado do decréscimo da síntese de proteínas musculares, seguido da quebra de proteínas e, essa atrofia resulta em diminuição do conteúdo de proteínas musculares.
Ficou claro que a imobilização causa diminuição da atividade motora, com isso aumentando a oxidação de proteínas, levando a mais diminuição da atividade motora, e que com a EENM foi possível aumentar a atividade motora, aumentando a força e diminuindo a oxidação. Esses resultados poderiam ser ainda mais significantes se houvesse um período maior de estimulação e também se houvesse a administração de um antioxidante como cita Zarzhevsky e Reznick, 1998 que o pré-treinamento associado a vitamina E pode melhorar o nível de oxidação de proteínas durante a atividade do músculo.
Zarzhevsky e Reznick, 1998 citam que a oxidação protéica mensurada pela dosagem da proteína carbonil é aumentada nos músculos de ratos submetidos a exaustão, tanto quanto exercícios de longa duração. Usando ratos como modelo para a imobilização muscular pode-se obpode-servar maiores efeitos deletérios, incluindo lesão oxidativa medida por oxidação protéica e peroxidação lípidica. A administração da vitamina E o aumento do hormônio pode retardar os efeitos deletérios em animais.
A figura 6 demonstra oxidação de lipídios que teve um aumento com a imobilização e que a EENM não teve melhora significativa (P<0,05).
Figura 6 demonstra lipoperoxidação * P<0,05 do grupo controle# P<0,05 do grupo imobilização Fonte: Pesquisa realizada pelo autor.
decorrência da peroxidação lipídica, que acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas celulares (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
A lipoperoxidação também pode estar associada aos mecanismos de envelhecimento, de câncer e à exacerbação da toxidade de xenobióticos. Assim como na formação das ERMO, nem sempre os processos de lipoperoxidação são prejudiciais, pois seus produtos são importantes na reação em cascata a partir do ácido aracdônico (formação de prostaglandinas) e, portanto, na resposta inflamatória (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Segundo Ferreira e Matsubara a lipoperoxidação pode ser catalisada por íons ferro, por conversão de hidroperóxidos lipídicos em radicais altamente reativos e peroxila, que, por sua vez iniciam nova cadeia de reações, denominada ramificação. Essas reações, que podem ser rápidas ou lentas, dependem da valência do ferro. Aqui entra a importância da deferoxamina onde Kondo et al, 1993 diz que alguns metais de transição, como o ferro e o cobre, estão relacionados a produção de radicais livres. Foi encontrado o nível de ferro aumentado no músculo esquelético atrofiado pela imobilização, e sugeriram a possibilidade que o aumento de ferro pode ser responsável para o estresse oxidativo realçado no músculo atrofiado. O papel da deferoxamina, que é um agente quelante de ferro, é de ser utilizado para suprimir o estresse oxidativo aumentado.
Talvez se fosse administrado algum antioxidante associado a EENM nos animais testados, teríamos conseguido um resultado mais significante, o qual não foi alcançado com a EENM.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A imobilização do membro inferior dos ratos reduziu a atividade locomotora dos mesmos e após a aplicação da EENM foi possível recuperar em parte a atividade perdida. Provavelmente se a EENM fosse por um período maior de tempo alcançaríamos resultados ainda mais satisfatórios. Em relação a carbonilação de proteínas obtivemos respostas semelhantes as da atividade locomotora. Foi visto que a imobilização levou a oxidação de proteínas e com a EENM conseguimos diminuir essa oxidação. A lipoperoxidação obteve resultados não satisfatórios provavelmente devido ao pouco tempo de EENM. Fica aqui uma sugestão para novos estudos traçando objetivos semelhantes, e que o período de EENM seja maior, alcançando melhores resultados.
Durante a realização do trabalho foi observado em alguns estudos que o tipo de fibra muscular também interfere nos efeitos do tratamento, como também a posição do membro imobilizado influi nos resultados. Sendo esses parâmetros não traçados nesse trabalho mas fica como sugestão para novas pesquisas.
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