REVIEWS
Вза
и
мо
де
йствие
ба
ку
ло
ви
ру
сов
с
клет
ка
ми
по
зво
ноч
ных
в
сис
те
ме
in vitro
А
.
П
.
Со
лом
ко
,
Е
.
А
.
За
ха
рук
,
Л
.
И
.
Ча
щи
на
,
Л
.
И
.
Стро
ков
ская
Инсти тут мо ле ку ляр ной би о ло гии и ге не ти ки НАН Укра и ны Ул. Академика За бо лот но го, 150, Киев, Укра и на, 03680
solomko@imbg.org.ua
Про а на ли зи ро ва ны дан ные ли те ра ту ры от но си тель но из уче ния но вой век тор ной сис те мы для кле -ток по зво ноч ных, осно ван ной на ви ру сах на се ко мых – ба ку ло ви ру сах. Рас смот ре ны пути и ме ха низ -мы про ник но ве ния ре ком би нан тных ба ку ло ви ру сов в клет ки, фак то ры, вли я ю щие на эф фектив-ность транс дук ции, при нци пы мо ди фи ка ции ви рус но го дис плея, ре ак ция раз ных ти пов кле ток на внед ре ние ви ру са. Обсуж да ют ся пер спек ти вы ис поль зо ва ния ре ком би нан тных ба ку ло ви ру сов в кле -точ ной ин же не рии.
Клю че вые сло ва: ба ку ло ви рус, по зво ноч ные, вза и мо де йствие, транс дук ция, дис плей, кле точ ный от вет.
Введение. Впоследниегоды бурное развитиепо
-лучили исследования, посвященные разработке
векторныхсистемдляцелевойдоставкитерапевти
-ческиважныхгеноввклеткиитканивысшихорга
-низмов. Срединихвыделяютвирусныевекторные
системынаосновеаденовирусов, вирусовгерпеса,
лентивирусов иретровирусов [1]. Каждая из этих
системимеетсвоидостоинстваинедостатки. Кпо
-следнимследуетотнестималуюклонирующуюем
-кость генома аденоассоциированного вируса (до 4 тыс. н.) иналичиесильногоиммунногоответана
вирусныебелки.
Широкоиспользуемыевисследовательскихце
-ляхвекторы наосноверетровирусовилентивиру
-сов интегрируюттрансген в геномтрансдуцируе
-мойклетки, чточреватовозникновениеминсерци
-онныхмутаций. Поискальтернативыэтомупривел
кразработке многочисленныхневирусныхсистем
доставки, основнымограничениемпримененияко
-торыхявляетсянизкаяэффективностьтрансдукции
[2].
Обнаружение всередине 90-х годовпрошлого
столетияспособностибакуловирусов (вирусов, ин
-фицирующихболее 500 видовнасекомых), аимен
-но – вируса Autographa californica, наиболее изу
-ченногоизнихисодержащегокольцевуюковален
-тно замкнутую двуспиральную геномную ДНК
(модифицированную за счет встраивания специ
-фичной для клеток млекопитающих экспрессион
-ной кассеты), обеспечивать синтез репортерного
белка в клетках млекопитающих создало предпо
-сылкидляразработкиещеоднойвекторнойсисте
-мы [3]. Особенностью бакуловирусовявляетсяна
-личие двух сильных промоторов поздних генов –
полиэдрина ир10, обусловливающих суперсинтез
кодируемыхимибелков. Этосвойствоиспользова
-липриконструировании наосновебакуловирусов и культивируемых клеток насекомых высокоэф
-фективныхэкспрессионныхсистем, спомощьюко
-торых синтезировано большое количество реком
-бинантныхбелков [4].
Преимуществобакуловирусноговекторапоот
-ношению к другим вирусным векторам состоит в том, чтооннереплицируетсявклеткахмлекопита
ющих, приэтомслаботранскрибируетсячастьран
-нихгеновинетранскрибируютсяосновныерегуля
-торныегены. Размерегогенома (около 130 тыс. п.
н.) позволяетделатькрупныевставки. Вирусмало
-токсичен для клеток и организмов позвоночных из-заотсутствиявнихпродуктивнойбакуловирус
-ной инфекциииблагодаряэтомупредсуществую
-щих антител к нему. Учитывая вышеперечислен
-ныесвойства, бакуловирусA. californica впослед
-ние годы стал полифункциональным инструмен
-томмолекулярнойбиологии.
Дальнейшеесовершенствованиеновойбакуло
-вируснойвекторнойсистемышловнесколькихна
-правлениях: исследование спектра клеточных ли
-ний млекопитающих, трансдуцируемых рекомби
-нантным бакуловирусом, модификация вирусного
дисплеядля повышенияэффективноститрансдук
-цииin vitroи in vivo, обеспечения специфичности
ткане- иорганотропизмаприрешениипроблемдо
-ставки иммуногенных вакцин, тканевой инжене
-рииитерапиирака.
Механизмы проникновения бакуловирусов
в клетки млекопитающих. Для большинстваис
-следованныхвирусовописанонесколькомеханиз
-мовихпроникновениявклетки: посредствомклат
-рин- или динамин-опосредованного эндоцитоза,
вследствиеобразованиякавеолилокальноголизи
-самембраныклеток, атакжемакропиноцитоза. Для
больших ДНК-содержащих вирусов характерно
внедрение за счет слияния вирусной и клеточной оболочексиспользованиемнабораспецифических белков. Процесс проникновения бакуловируса в
клеткинасекомыхимеханизмыегоосуществления детальнопроанализированывобзоре [5].
Бакуловируснымбелкомслияния, характерным
длятакназываемого budded-вируса, образующего
-сяпослепервичногоинфицированияклетокэпите
-лиякишечноготрактанасекомогоифункциональ
-но предназначенного для инфицирования клеток различных его тканей и органов, является gp64.
Этотбелокимеетвсвоемсоставесигнальныйпеп
-тид, вовлеченный в процесс слияния. В дальней
-шем речь пойдет именно об этойфракции вирус
-ныхчастиц, используемыхприработескультиви
-руемыми клетками насекомых имлекопитающих.
Детальныймеханизмэндоцитозаиучаствующиев неммолекулы, способствующиефункциональному
внедрениюбакуловирусавклетки – мишени мле
-копитающих, всеещенеполностьюохарактеризо
-ваны. Отражая общие черты с клетками
насекомого, бакуловирусное внедрение в клетки
млекопитающих осуществляется, по одним дан
-ным, через low-pH-dependent-путь эндоцитоза,
по-видимомувключающийклатрин-зависимыйэн
-доцитози/илимакропиноцитоз [6]. (Клатрин – кле
-точныйконсервативныйфибриллярныйбелок, об
-разующий вместе с другим полипептидом специ
-фическиймногогранныйчехолнаповерхноститак называемых «окаймленныхпузырьков», возникаю
-щихприрецепторномэндоцитозе.)
Однако есть и другие результаты эксперимен
-тальных исследований [7], свидетельствующие о
существованииклатрин-независимого пути встра
-иваниябакуловируса, покрайнеймере, дляизучен
-ныхавторамилинийклетокчеловека. Приэтомдо
-статочноубедительнопродемонстрированоотсут
-ствие ассоциатов бакуловируса с тяжелой цепью клатринапритрансдукции. Болеетого, установле
-но, что внедрение бакуловирусаусиливаетпогло
-щение неспециализированными эпителиальными клетками бактериальных частиц Escherichia coli путем, напоминающимфагоцитозитакжерегули
-руемым динамином. Вышеприведенные данные
двухразных групписследователейсвидетельству
-ют о существовании различных функциональных путей встраиваниябакуловирусоввклеткимлеко
-питающих.
Показано также, что последующие этапыпро
-цессатрансдукции – выходизраннихэндосом, эн
-доплазматическийтранспорти ядерный импорт –
являютсякритическимистадиямивпроцессепопа
-даниябакуловирусавклеткимлекопитающих [8].
Изучениемеханизмавнедренияиядерногоим
-портабакуловирусногогеномавклеткахмлекопи
-тающихсиспользованиемметодаэлектроннойми
-кроскопиинамоделинеделящихсяклеток, облада
-ющихядерноймембранойвотличиеотклеток, на
-ходящихся в митозе, выявило наличие вирусного
капсидавядерныхпорахипоследующуюеголока
-лизациювядре [9], чтосвидетельствуетобобщнос
-ти путей транспортаи локализациибакуловируса каквклеткахнасекомых, такивклеткахмлекопи
-тающих. Однакодлянекоторыхлинийклеток этот
процессимеетсвоиособенности.
Так, дляклеток YAC-1 характерноингибирова
-тиц [10], вполневероятнопроисходящееприучас
-тиимикротубулиновойсети, деполимеризацияко
-торой нокодазолом или винбластином в гепато
-цитахчеловекаусиливаеттранспортировку вирус
-ного капсида в ядра клеток и повышает уровень экспрессиитрансгена [11]. Втожевремя для ли
-ниимакрофагальныхиммунокомпетентныхклеток
RAW264.7 показано внедрение бакуловируса пу
-тем фагоцитоза с последующей транслокацией и
деградацией нуклеокапсида во внутриклеточных компартментах [12].
Трансдукция рекомбинантными бакулови
-русамиклетокпозвоночных. Многочисленными
исследованиями различных лабораторий опреде
-лен широкий спектр клеточных линий высших и низших позвоночных, пермиссивных для бакуло
-вируснойтрансдукции. Срединихклеткичеловека,
втомчислераковые, стволовыемезенхимальныеи
эмбриональные, клетки приматов, бычьи, свиные,
овечьи, клетки кроликов, рыб и птиц, грызунов и
кошек [13, 14]. Приведенный авторами обзоров
списоктрансдуцируемыхрекомбинантнымибаку
-ловирусамиклетокэукариотов являетсядалеко не полным, однакодаетпредставлениеотом, чтовпо-
давляющембольшинствеиспользовалилиниикле
-ток человека. Этообъясняется, впервуюочередь,
генотерапевтическойнаправленностьюисследова
-ний. Эффективность трансдукции варьирует от 5–10 до 90 % взависимостиотпроисхождениякле
-точнойлинии, протоколатрансдукции (используе
-мыесреды, температураивремяинкубациисвиру
-сом, множественностьинфицирования) ирядадру
-гих факторов [15]. Например, добавление неспе
-цифическогоингибиторадеацетилазыгистоновбу
-тирата натрия повышает уровень экспрессии трансдуцированных генов во многих клеточных линиях [16].
Весьмасущественной составляющейрекомби
-нантногобакуловирусноговектораявляетсянали
-чие сильного промотора, активного вклетках по
-звоночныхи, видеале, обладающегооргано- итка
-неспецифичностью. Какправило, используютпро
-моторывирусов млекопитающих, такие как CMV (цитомегаловирус), RSV (вирус саркомы Рауса ), SV40 (обезьяний вирус) и гибридный промотор CAG [17].
Во многих случаях применяют сильный гиб
-ридныйпромотор CAG, содержащийпромоторную
последовательность куриного гена b-актина и эн
-хансерную последовательность промотора немед
-ленно-раннего гена CMV, а также сигнал
полиаденилирования кроличьего гена b-глобина
[18]. Кроме вышеперечисленных вирусных, в от
-дельных работах использованы тканеспецифичес
-киеклеточныепромоторы: генаглиальногокисло
-го фибриллярного белка астроцитов [19], нейрон
-специфического белка синапсина-1 и фактора
ростаbизтромбоцитов [20], клеточныепромоторы
геначеловеческогоубиквитинаС [21] игенабелка EF-1a [22].
Для большинства рекомбинантных бакулови
-русов отмечена незначительная длительностьэкс
-прессиитрансгена – от 7 до 14 дней, чтодалеконе
всегда устраивает исследователей. Это связано,
скореевсего, сдеградациейвирусногогеномаиот
-сутствием интеграции трансгена в геном клетки
-хозяина [23].
Внекоторыхслучаяхвсежепроисходитинтег
-рациямаркерноготрансгенавгеномклетокпозво
-ночных [24, 25]. Последняяработаинтереснатем,
что трансдуцировали стволовые клетки низшего позвоночного – рыбы. Эффективность трансдук
-циидостигала 100 % итрансген обнаруживался в
ряде хромосом. Однако эти результаты требуют
уточненияидетализациивотношениитого, какие
фрагментыименнобакуловирусногогеномавстра
-иваютсявгеномтрансдуцированныхклеток, свой
-ственноли этопреимущественноклеткамнизших позвоночныхилиявляетсяобщимсобытием?
Необходимость пролонгированной экспрессии трансгена для проведения экспериментаи генной терапии сталапричиной появления работ, связан
-ныхс модификациейгеномарекомбинантногоба
-куловирусазасчетсоздания гибридныхбакулови
-русов. Наиболее привлекательной, с нашей точки
зрения, являетсямодификациявведениемвконст
-рукцию последовательностей ориджина реплика
-ции (OriP) вируса Эпштейн-Барра (EBV) и гена
ядерного антигена этого вируса (EBNA-1). Такая
конструкцияобеспечиваетэкспрессиюмаркерного гена EGFP на протяжении двух месяцев за счет поддержаниявэписомномсостояниирекомбинан
-тного трансгена, чемуспособствуетсинтезвирус
-ногоядерногоантигена, отвечающегозаэписомное
состояние генома EBV в латентно инфицирован
Другой вариант обеспечения пролонгирован
-нойэкспрессиицелевогогеназаключаетсявконст
-руированиигибридногобакуловирусного/аденоас
-социированного вирусного вектора, содержащего
геннуюкассету, наобеихконцахкоторойнаходят
-ся последовательности инвертированных терми
-нальных повтороваденоассоциированного вируса
(AAV ITR). Врезультатеинтеграциимодифициро
-ванной генной кассеты в геном клетки получена длительная экспрессия маркерного гена [27, 28].
Необходимо отметить, что в работе [28] экспери
-менты выполнены на эмбриональных стволовых клетках человека и достоверно установлено, что
трансдукция бакуловирусом не влияетна их нор
-мальныйростиплюрипотентность. Этосвидетель
-ствуето безопасности генетических манипуляций нетолькосэмбриональнымистволовымиклетками при использовании трансдуцирующих рекомби
-нантныхбакуловирусов.
Бакуловирусныйдисплей. Однимизважных
направлений развития бакуловирусной векторной системы, как ужеупоминалось, являетсяповыше
-ние эффективности трансдукции клеток и тканей позвоночных, впервуюочередь, млекопитающих,
атакжемодификациятропизмабакуловируса. Для
этого производят определенные генно-инженер
-ные манипуляции, связанные с мажорным глико
-протеином gp64, экспонированнымнаповерхности
вируснойчастицыинеобходимымдлявзаимодей
-ствия вирусной частицы с поверхностью клеток насекомыхимлекопитающих, иликапсиднымбел
-ком vp39, атакжеиспользуютхимическиеспособы
модификациидисплеявируснойчастицы.
В первом случае модификации осуществляют конструированием слитного гена, включающего
последовательностьвирусногогенаgp64игетеро
-логичногобелкаилипептидаподконтролемсиль
-ных промоторов одного из поздних бакуловирус
-ныхгенов – полиэдринаилир10. Показано, чтодо
-бавлениекконструкцииещеоднойкопиигенаgp64 повышает эффективность трансдукцииразличных типовклетокмлекопитающих [29]. Дляувеличения
уровнясвязыванияипроникновениярекомбинант
-ногобакуловирусаиспользуютвесьмаразнообраз
-ные имногочисленные варианты генно-инженер
-ногослияния сgp64, включаяавидин-биотиновую
технологию [30], основанную на метаболическом
биотинилировании в живых клетках. Этареакция
катализируетсябиотиновойлигазойE. coli, присое
-диняющей биотин к специфическим белкамчерез амиднуюсвязьмеждукарбоксильнойгруппойбио
-тина и аминогруппой лизина. Принцип метаболи
-ческого биотинилирования ранееуспешно приме
-ненпримодификацииаденовирусадляповышения степени его очистки ииспользования вопытахin vitro [31] и in vivo [32].
Методметаболическогобиотинилированияба
-куловируса совершенствуется в направленииуве
-личенияэффективноститрансдукции, атакжеспо
-собаочисткииконцентрациимодифицированного вируса. Установлено, чтовставканебольшогобио
-тин-акцепторногопептида (ВАР) вразличныесай
-тывирусногогликопротеина gp64 позволяетварьи
-роватьстепеньсвязываниябиотинанаповерхности вирусной частицы и оптимизировать эффектив
-ностьтрансдукциираковыхклеток, атакжеупрос
-титьспособконцентрированиявируса [33].
Альтернативныйподходдля модификацииви
-русногодисплеянаосновеиспользованияякорного мембранногодоменавирусавезикулярногостома
-тита позволил экспонировать на поверхности ви
-русной частицы ряд гетерогенных мембранных белковипептидов, средикоторыхрецепторывиру
-сакори [34], нейраминидазы [35], G-белоквируса
везикулярного стоматита, что дало возможность
повысить степень трансдукции модифицирован
-ным бакуловирусом в условиях in vitro и in vivo
[36].
Применениегена G-белкавирусавезикулярно
-гостоматитавкачестве партнерадля конструиро
-ванияслитногобелкапозволилоэкспонироватьна вируснойповерхностиопухолеспецифические ли
-ганды, такиекак LyP-1, F3 CGKRK, чтопривелок
усилениюсвязываниясклеточнымирецепторамии возрастаниюуровня трансдукцииклетоккарцино
-мычеловека [37].
Гетерогенныебелкиипептидымогутбытьэкс
-понированынавируснойчастицетакжеблагодаря слиянию с мажорным вирусным капсидным бел
-ком vp39 [8], ассоциированнымспроцессомполи
-меризацииактинавовремявхождениявирусавци
-топлазму и ядра инфицированных клеток насеко
-мых [38].
Воснове принципиально отличного подходак модификации дисплея бакуловирусов лежит спо
-зывании поверхностных вирусных белков с целе
-вымилигандамиилипептидами. Конъюгатыбаку
-ловирусасполиэтиленгликолем (ПЭГ) илисПЭГи
фолатом в отдельных случаях дают возможность повыситьэффективностьтрансдукции, однакопо
-добная модификация существенно снижает титр вирусавинфицированныхмодифицированнымви
-русомклеткахнасекомых [39, 40].
Тем не менее, далеко не всегда увеличение
уровнясвязываниярекомбинантногобакуловируса с клеточной поверхностью приводит к возраста
-ниюэффективноститрансдукции [41].
В то время как рекомбинантный бакуловирус
-ный вектор демонстрирует достаточно высокую эффективностьвтрансдукцииклетокмлекопитаю
-щихin vitro, всистемеin vivoонасущественносни
-жаетсяиз-за комплемент-опосредованной инакти
-вациивируса. Системакомплементавключаетвсе
-бясывороточныеимембраносвязанныебелки, уча-
ствующие в различных специфичных и неспеци
-фичныхиммунныхреакциях. Привзаимодействии
с вирусом система комплемента активирует ряд ферментативныхреакций, чтоприводитлибокмо
-дификациивирусаиегоинактивации, либоклизи
-суинфицированныхтакимвирусомклеток.
Необходимостьмодификациивирусноговекто
-расиспользованиемсинтетическихполимероввы
-званапотребностьюпредохранения егоотинакти
-вациисистемойкомплементавопытахin vivo.При
-меняемыедляэтогоранеегенетическиемодифика
-ции с помощью генов комплемент-регуляторного
белка человека DAF [42], G-белка вируса везику
-лярного стоматита и растворимого ингибитора комплемента 1 (sCR1) хотя ипозволялизащитить
вирус от влияния системы комплемента, однако
приэтомсущественноснижаласьлибовообщеот
-сутствовалаэкспрессиятрансгена [43, 44].
На этом фоне повышенный интерес вызывает создание новых гибридных векторных систем на основе вирусов икатионных синтетических поли
-меров, вчастности, полиэтилениминаиегопроиз
-водных, используемыхвкачествекомпонентовне
-вирусныхвекторов [45, 46]. Гибридная векторная
система формируется благодаря электростатичес
-кому взаимодействию между положительно заря
-женнымполимерным комплексомиотрицательно заряженной вирусной частицей. Перспективность
подобных гибридных векторных систем для ис
-пользования в экспериментах in vitro и in vivo за
-ключается в сочетаниивысокой внутриклеточной эффективности рекомбинантныхвирусовинизкой
иммуногенности, обеспечиваемой значительным
системным потенциалом полиэтилениминных эк
-ранирующих невирусных векторов. Аналогичные
гибридные системыразработаны и для бакулови
-русов [47, 48].
Оптимизацияусловийприсозданиикомплекса полиэтиленимина и бакуловируса позволила су
-щественно уменьшить цитотоксичность модифи
-цированного бакуловируса в системе in vitro на клеткахглиобластомычеловекалинии U87 иобес
-печитьдостаточновысокуюэкспрессиюмаркерно
-готрансгенавэтихклеткахиклеткахгепатокарци
-номы HepG2.
Клеточныйответнавнедрение бакуловиру
-савсистемеin vitro. Весьмаважнымаспектомпро
-цессавзаимодействия трансдуцирующего бакуло
-вирусасклеткамипозвоночныхявляетсяструктур
-но-функциональное состояние вирусного и кле
-точногогеномовивероятностьучастиятранскрип
-ционногокомплекса клетки в экспрессиивектор
-ногогенома.
Установлено, что взаимодействие бакуловиру
-са с клетками млекопитающих ведет к активации транскрипции целого ряда вирусных генов, при
этом существуют значительные различия в коли
-честве экспрессируемых генов в зависимости от линииклеток. Так, вклетках HeLa14 (человек) сис
-пользованиемтехникиДНК-микроарреевпоказана
транскрипция 43 вирусныхгенов, авклетках BHK (хомячок) – лишь 14 бакуловирусных генов, при
этомэкспрессия 12 раннихбакуловирусныхгенов
является общей для обоих типов клеток. В этом
случаеотмеченаиклеточнаяреакциянавстраива
-ние вируса в виде временного увеличения транс
-крипцииклеточногоb-актиновогогена [49], какив
клеткахнасекомых, гденаблюдаетсясуперэкспрес
-сия клеточного актина. Среди транскрибируемых
бакуловирусныхгеновзафиксированытриранних гена: ie-0,ie-1,pe-38, продукты которыхучаствуют
втрансактивациипромоторовдругихвирусныхге
-нов.
Трансдукция клеток млекопитающих еще од
-нимчленомсемействабакуловирусов, Bombyx mori NPV, также приводит к транскрипции ранних ви
Болеетого, врезультатеисследованияпричаст
-ностидвухосновных бакуловирусныхтрансрегу
-ляторовтранскрипции IE1 и IE2 кактивациивирус
-ногогеномавклетках VeroE6 (клетки почекзеле
-ноймартышки) установлено, чтокомбинацияобо
-их факторов вызываетстимуляциюэкспрессии 59
бакуловирусных генов (около трети бакуловирус
-ногогенома).
Наличиевпромоторахвирусныхгенов, взаимо
-действующих с трансактиваторами, бакуловирус
-ногораннеготранскрипционного cайта CAGT (яв
-ляющегосяифрагментомэукариотногосайтаини
-циации транскрипции) и мотива TATA вызывает
формированиепромоторнойструктуры, аналогич
-ной таковой эукариотной РНК-полимеразы II,
следствиемчегоявляетсяучастиехозяйскойполи
-меразы в транскрипции бакуловирусных генов
[51], какиприинфицированиибакуловирусомкле
-токнасекомых.
Транскрипция немедленно-ранних трансакти
-ваторныхбакуловирусныхгеновie-1, ie-2продемо
-нстрирована в человеческих клетках почек линии
293 ипечени HepG2. Однимизпоследствийвстраи
-вания бакуловируса в клетку и дальнейшего его транспортавядроявляетсясущественнаямодифи
-кацияядернойархитектоники трансдуцированных
клеток [52], чтохарактерноидлярядавирусовмле
-копитающих. При этом достоверно установлена
экспрессиябелка IE-2, который в клеткахнасеко
-могонакапливаетсяводномсайтесполифункцио
-нальной ядерной субструктурой – PML NBs (pro-myeolocytic leukemia nuclear bodies), находящейсяв
непосредственной близости от зоны репликации вируса [53].
Весьма интересны результаты авторов работы
[54] относительно функциональной активности
ранне-позднегобакуловирусногопромотора ETL в
клетках млекопитающих, продукт гена которого
необходим для экспрессии ряда бакуловирусных генов. Активностьэтогопромоторанеодинаковав
исследуемыхклеточных линиях, наиболее низкой
она оказалась в клетках COS1 (почечные фибро
-бластоподобныеклеткизеленойафриканскоймар
-тышки) вотличиеотвысокойактивностивчелове
-ческих клетках эмбриональных остеобластов
hFob1.19. Авторыделаютвыводонедостаточности
либоотсутствиивклетках COS1, HeLa ихомячко
-выхклеткахСНО-К1 транскрипционныхфакторов,
необходимыхдляпроявленияполноценнойактив
-ности бакуловирусного ETL-промотора.
Всвязисэтимдовольнозначительнырезульта
-тыизучениятранскрипционнойактивноститранс
-дуцированного с помощью бакуловирусамодель
-ного трансгена вряде производных мезенхималь
-ныхстволовыхклеток – предшественниковостео
-цитов, адипоцитов ихондроцитов. Припрактичес
-киодинаковойэффективноститранспортатрансге
-навядраисследованныхтиповклетоктранскрип
-циямаркерногогенаоказаласьсущественнонижев предшественниках хондроцитов. Использование
при этом в конструкциях различных промоторов генов CMV, CAG и EF-1a выявило несуществен
-ные промоторзависимые отличия в уровне транс
-крипции трансгена. Следовательно, неодинаковый
уровень эффективности транскрипции связан со степенью и направлением дифференциации пред
-шественников, атакже возможнойразницей вко
-личестве и наборе транскрипционных факторов,
соответствующихспециализациичастичнодиффе
-ренцированныхпредшественников [22].
Реакцияклеточногогеноманавнедрениебаку
-ловируса проявляется в большинстве случаев в
частичной дерегуляции экспрессии ряда клеточ
-ныхгеноввзависимостиотихфункциональной и видовой специфичности. Прежде всего важно от
-метить активацию клеточного иммунного ответа,
что индуцирует синтез некоторых цитокинов – TNF-a, IL1-a, IL1-bвгепатоцитахкрысы [55], хе
-мокиновиинтерфероновпервоготипа [56].
Так, трансдукциявирусомтутовогошелкопря
-да (BmNPV) приводит кизменению профиляэкс
-прессии 22 генов клеток НЕК293 [50]. Еще более
драматической оказываетсяреакциямезенхималь
-ныхстволовыхклетокчеловекана введение баку
-ловируса AcNPV – около 816 генов, связанных с
функционированиемпятисигнальныхпутей, демо
-нстрируютсущественныеотклонениявтранскрип
-ционнойактивности каквсторону ееувеличения,
так и снижения. При этом наблюдается суще
-ственноевозрастаниесинтезадвухцитокинов – IL6
и IL8, втожевремяобщийпрофильэкспрессиици
-токиновых генов весьма отличается от такового для специализированных иммунных клеток [57].
Авторыотмечаютактивацию Toll-like 3-рецептор
-ногосигнальногопутиДНК-содержащимвирусом
что весьма необычно для активируемого двуспи
-ральнымивирусными исинтетическимиРНК кас
-када генов. Важным результатом этих исследова
-нийявляетсявыводотом, чтобакуловирусиндуци
-руетвмезенхимальныхстволовыхклеткахумерен-
ныйикраткосрочныйответ. Этопозволяетрассчи
-тывать на эффективнуюи безопасную модифика
-циюихдлягеннойтерапии.
Активациябакуловирусомрецепторовдругого сигнальногопути – Toll-like 9, обычнораспознаю
-щих неметилированные CpG-динуклеотидымоле
-кулы бактериальной ДНК, стимулирует синтез
провоспалительныхцитокиноввклеткахперитоне
-альных макрофагов и спленических дендритных
клеткахмыши [12]. Учитывая, чтобакуловирусная
ДНК содержитзначительное количество потенци
-ально активных CpG-динуклеотидов, этот вывод
можнобылобыпризнатьлогичным. Однако даль
-нейшееисследованиеэтихжеавторов [58] показы
-вает, чтонарядусучастием Toll-like 9-рецепторно
-госигнальногопутивактивациисинтезаинтерфе
-ронаbистимулируемыхим хемокиноввиммуно
-компетентных клетках эмбриональных фибробла
-стовмыши его индукция происходитнезависимо
отэтогосигнальногопути – спривлечениеминтер
-ферон-регуляторных факторов IRF7/IRF3. Следо
-вательно, вэтом случаеимеетместозависимаяот
функциональной специализации клеток сигналь
-ная система индукции клеточного адаптивного и иммунногоответов. Покачтоокончательноэтоне
установлено.
Вышеизложенныерезультатысвидетельствуют отом, чтотакиедалекоотстоящиевэволюционном
планесистемы, какклеткинасекомых, атакжевыс
-шихинизшихпозвоночных, имеютвесьмасхожие
механизмывзаимодействиясбакуловирусамииих геномами. Следует подчеркнуть, что эффектив
-ность трансдукции клеток позвоночных демонст
-рирует выраженную зависимость от типа клеток,
их тканевой принадлежности и функционального состояния. Этоттезисподтверждаетсяидифферен
-цированнымнаборомэкспрессируемыхраннихба
-куловирусных генов, обусловленным типом кле
-ток. Такиерезультатыважныдляопределениясте
-пени безопасности использования рекомбинант
-ных бакуловирусов дляклеточной инженерии, со
-здания клеточных векторов на базе рекомбинан
-тных бакуловирусов и трансдуцированных ими различныхтиповклеток, использованияихвсисте
-меin vivoдлягеннойтерапии, созданияидоставки
рекомбинантныхвакцин.
Совершенствованиетехнологииработысбаку
-ловирусами, возможностьдостаточнолегкоизако
-роткийсрок (отсемидодесятидней) конструиро
-ватьрекомбинантныйвирус, делаявставки разме
-ромдо 38 тыс. п. н., получениевысокихтитровви
-руса с использованием клеток насекомых делает весьмапривлекательнойидею примененияреком
-бинантныхбакуловирусов всовременноймолеку
-лярной медицине. Отмеченная выше экспрессия
ранних генов при трансдукции клеток позвоноч
-ныхявляетсякратковременной, исинтезвирусных
белковявляетсяследовым. Низкаятоксичностьба
-куловирусов для эмбриональных и мезенхималь
-ных стволовых клеток, отсутствиеинтеграции ба
-куловирусныхпоследовательностейвгеномыэтих клеток, атакжедостаточнобыстраядеградацияви
-русаоткрываютбольшиевозможностидлянаправ
-ленноймодификации стволовых клетоки исполь
-зования их для локального продуцирования целе
-вых белков при восстановительной сочетанной клеточнойигенотерапии. Впоследниегодыинтен
-сивнопроводятизучениепотенциаларекомбинан
-тныхбакуловирусовнаживотныхмоделях, гдепо
-лучены весьма интересные результаты. Обзор и
анализподобныхданных являются предметом на
-шейпоследующейработы.
A. P. Solomko, O. A. Zaharuk, L. I. Chashchina, L. I. Strokovskaya
Baculovirus integration with the vertebrate cells in system in vitro
Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine 150, Akademika Zabolotnoho Str., Kyiv, Ukraine, 03680
Summary
In this review the literature data are analyzed relative to the study of a new vector system for the cells of vertebrates, based on the in-sect viruses – baculoviruses. The ways and mechanisms of recom-binant baculoviruses penetration into cells, the factors, which in-fluence the effectiveness of transduction, the principles of the mo-dification of virus display, and the reaction of the different types of cells on virus introduction are examined. The prospects of using recombinant baculoviruses in cellular engineering are discussed.
Keywords: baculovirus, vertebrates, interaction, transduction, display, cell response.
О. П. Со лом ко, О. А. За ха рук, Л. І. Ча щи на, Л. І. Стро ко вська
Взаємодія ба ку ловi русів з кліти на ми хре бет них у сис темі in vitro
Ре зю ме
ко мах – ба ку ловіру сах. Роз гля да ють ся шля хи та ме ханізми про ник нен ня ре комбіна нтних ба ку ло ви русів у клітини, фак то -ри, що впли ва ють на ефек тивність транс дукції, при нци пи мо -дифікації вірус но го дис плея, ре акція різних типів клітин на вбу до ву ван ня вірусу. Обго во рю ють ся пер спек ти ви ви ко рис -тан ня ре комбіна нтних ба ку ловірусів у клітинній інже нерії.
Клю чові сло ва: ба ку ловірус, хре бетні, взаємодія, транс -дукція, дис плей, клітин на відповідь.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zhang X., Godbey W. T. Viral vectors for gene delivery in tis-sue engineering // Adv. Drug Deliv. Rev.–2006.–58, N 4.– P. 515–534.
2. Camradt S. C., Lieberman J. R. Genetic modification of stem cells to enhance bone repair // Ann. Biomed. Eng.–2004.–32, N 2.–P. 136–147.
3. Boyce F. M., Bucher N. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.–1996.–
93, N 6.–P. 2348–2352.
4. Summers M. D. Milestones leading to the genetic engineering of baculovirus as expression vector systems and viral pestici-des // Adv. Virus Res.– 2006.–68, N 1.–P. 3–73.
5. Kikhno I. M. Penetration of baculoviruses into cell: universal mechanism and intriguing details // Mol. Gen. Microbiol. Vi-rus.–2009.–24, N 2.–P. 47–55.
6. Long G., Pan X., Kormelink R., Vlak J. M. Functional entry of baculovirus into insect and mammalian cells is dependent on clathrin-mediated endocytosis // J. Virol.–2006.–80, N 17.– P. 8830–8833.
7. Laakkonen J. P., Makela A. R., Kakkonen E., Turkki P., Kuk-konen S., Peranen J., Yla-Herttuala S., Airenne K. J., Oker-Blom C., Vihinen-Ranta M., Marjomaki V. Clathrin-in-dependent entry of baculovirus triggers uptake of E. coli in non-phagocytic human cells // PLoS One.–2009.–4, N 1.– P. 1–12.
8. Kukkonen S. P., Airenne K. J., Marjomaki V., Laitinen O., Lehtolainen P., Kankaanpaa P., Mahonen A. J., Raty J. K., Nordlund H. R. Baculovirus capsid display; a novel tool for transduction imaging // Mol. Ther.–2003.–8, N 5.–P. 853– 862.
9. Van Loo N.-D., Fortunati E., Ehlert E., Rabelink M., Gros-veld F., Scholte B. J. Baculovirus infection of nondividing mammalian cells: mechanisms of entry and nuclear transport of capsids // J. Virol.–2001.–75, N 2.–P. 961–970.
10. Kitajima M., Hamazaki H., Miyano-Kurosaki N., Nakaku H.
Characterisation of baculovirus Autographa californica mul-tiple nuclear polyhedrosis virus infection in mammalian cells // Biochem. Biophys. Res. Communs.–2006.–343, N 2.– P. 378–384.
11. Salminen M., Airenne K. J., Rinnankoski R., Reimari J., Vali-lehto O., Rinne J., Suikkanen S., Kukkonen S., Yla-Herttuala S., Kulomaa M. S., Vihinen-Ranta M. Improvement in nuclear entry and transgene expression of baculoviruses by disinteg-ration of microtubules in human hepatocytes // J. Virol.– 2005.–79, N 5.–P. 2720–2728.
12. Abe T., Hemmi H., Miyamoto H., Moriishi K., Tamura S., Ta-kaku H., Akira S., Matsuura Y. Involvement of the Toll-Like receptor 9 signaling pathway in the induction of innate immu- nity by baculovirus // J. Virol.–2005.–79, N 5.–P. 2847– 2858.
13. Kost T. A., Condreay J. P. Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors // TRENDS Biotech.– 2002.–20, N 4.–P. 173–180.
14. Hu Y.-C. Baculoviral vectors for gene delivery // Curr. Gene Ther.–2008.–8, N 1.–P. 54–65.
15. Hsu C. S., Ho Y. C., Wang K. S., Hu Y. C. Investigation of op-timal transduction conditions for baculovirus-mediated gene delivery into mammalian cells // Biotechnol. Bioeng.–2004.–
88, N 1.–P. 42–51.
16. Condreay J. P., Witherspoon S. M., Clay W. C., Kost T. A.
Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.–1999.– 96, N 1.–P. 127–132. 17. Hu Y.-K. Baculovirus vectors for gene therapy // Adv. Virus
Res.–2006.–68, N 2.–P. 287–320.
18. Shoji I., Aizaki H., Tani H., Ishii K., Chiba T., Saito I., Miya-mura T., Matsuura Y. Efficient gene transfer into various mammalian cells, including non-hepatic cells, by baculovirus vectors // J. Gen. Virol.–1997.–78, N 10.–P. 2657–2664. 19. Wang C. Y., Wang S. Astrocytic expression of transgene in
the rat brain mediated by baculovirus vectors containing an astrocyte-specific promoter // Gene Ther.–2006.–13, N 20.– P. 1447–1456.
20. Lu B. H., Yang Y., Paton J. F. R. GAL4-NF-kappa B fusion protein augments transgene expression from neuronal pro-moters in the rat brain // Mol. Ther.–2006.–14, N 6.–P. 872– 882.
21. Spenger A., Ernst W., Condreay J. P., Kost T. A., Grabherr R. Influence of promoter choice and trichostatin A treatment on expression of baculovirus delivered genes in mammalian cells // Protein Exp. Purif.–2004.–38, N 1.– P. 17–23. 22. Lee H. P., Ho Y. C., Hwang S. M.,Sung L.-Y., Shen H.-C., Liu
H.-J., Hu Y.-C. Variation of baculovirus-harbored transgene transcription among mesenchymal stem cell-derived proge-nitors leads to varied expression // Biotechnol. Bioeng.– 2007.–97, N 3.–P. 649–655.
23. Wang K. C., Wu J. C., Chung Y. C., Ho Y. C., Chang M. D., Hu Y. C. Baculovirus as a highly efficient gene delivery vec-tor for the expression of hepatitis delta virus antigens in mam- malian cells // Biotechnol. Bioeng.–2005.–89, N 4.–P. 464– 473.
24. Merrihew R. V., Clay W. C., Condrey J. P., Witherspoon S. M., Dallas W. S., Kost T. A. Chromosomal integration of transduced recombinant baculovirus DNA in mammalian cells // J. Virol.–2001.–75, N 2.–P. 903–909.
25. Yan Y., Du J., Chen T., Yi M., Li M., Wang S., Li C. M., Hong Y.. Establishtment of medakafish as a model for stem cell-based gene therapy: Efficient gene delivery and potential chromosomal integration by baculoviral vectors // Exp. Cell Res.–2009.–315, N 13.– P. 2322–2331.
26. Shan L., Wang L. Y., Yin J., Zhong P. An OriP/EBNA-1-based baculovirus vector with prolonged and enhanced trans-gene expression // J. Gen. Med.–2006.–8, N 12.–P. 1400– 1406.
27. Wang C. Y., Wang S. Adeno-associated virus inverted termi-nal repeats improve neurotermi-nal transgene expression mediated by baculoviral vectors in rat brain // Hum. Gen. Ther.–2005.–
16, N 10.–P. 1219–1226.
28. Zeng J., Du J., Zhao Y., Palanisamy N., Wang S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells // Stem Cells.–2007.–25, N 4.– P. 1055–1061.
29. Tani H., Nishijima M., Ushijima H., Miyamura T., Matsuura Y. Characterisation of cell-surface determinants important for baculovirus infection // Virology.–2001.–279, N 1.–P. 343– 353.
avi-din-displaing baculovirus // Mol. Ther.–2004.–9, N 2.– P. 282–291.
31. Parrott M. B., Mok H., Campos S. K., Adams K. E., Mercier G. T., Barry M. A. Metabolically biotinylated adenovirus for cell targeting, ligand screening and vector purification // Mol. Ther.–2003.–8, N 4.–P. 688–700.
32. Pereboeva L., Komarova S., Roth J., Ponnazhagan S., Curiel D. T. Targeting EGFR with metabolically biotinylated fiber-mosaic adenovirus // Gene Ther.–2007.–14, N 8.–P. 627– 637.
33. Kaikkonen M. U., Viholainen J. I., Narvanen A., Yia-Hert-tuala S., Airenne K. J. Targeting and purification of metabo-lically biotinylated baculovirus // Hum. Gen. Ther.–2008.–
19, N 6.–P. 589–600.
34. Kitagawa Y., Tani H., Kwang C., Matsunaga L. T. M., Mori-ishi K., Matsuura Y. Ligand-directed gene targeting to mam-malian cells by pseudotype baculoviruses // J. Virol.–2005.–
79, N 6.–P. 3639–3652.
35. Borg J., Nevsten P., Wallenberg R.,Stenstrom M., Cardell S., Falkenberg C., Holm C. Amino-terminal anchored surface display in insect cells and budded baculovirus using the ami-no-terminal end of neuraminidase // J. Biotechnol.–2004.–
114, N 1–2.–P. 21–30.
36. Kaikkonen M. U., Raty J. K., Airenne K. J., Wirth T., Heikura T., Yla-Herttuala S. Truncated vesicular stomatitis virus G protein improves baculovirus transduction efficiency in vitro
and in vivo // Gene Ther.–2006.–13, N 4.–P. 304–312. 37. Makela A. R., Matilainen H., White D. J., Ruoslahti E.,
Oker-Blom C.J. Enhanced baculovirus-mediated transduction of human cancer cells by tumor-homing peptides // Virology.– 2006.–80, N 13.–P. 6603–6611.
38. Ohkawa T., Rowe A. R., Volkman L. E. Identification of six
Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus early genes that mediate nuclear localization of G-actin // J. Virol.–2002.–76, N 23.–P. 12281–12289.
39. KimY.-K., Park I. K., Jiang H. L., Choi J. Y., Je Y. H., Jin H., Kim H. W., Cho M. H., Cho C. S., Regulation of transduction efficiency by pegylation of baculovirus vector in vitro and in vivo // J. Biotechnol.–2006.–125, N 1.–P. 104–109. 40. Kim Y.-K., Choi J. V., Yoo M.-K., Jiang H. L., Arote R., Je Y.
H., Cho M. H., Cho C. S. Receptor-mediated gene delivery by folate-PEG-baculovirus in vitro // J. Biotechnol.–2007.–131, N 3.–P. 353–361.
41. Ojala K., Koski J., Ernst W., Grabbher R., Jones I., Oker-Blom C. Improved display of synthetic IgG-binding domains on the baculovirus surface // Technol. Cancer Res.Treat.– 2004.–3, N 1.–P. 77–84.
42. Huser A., Rudolph M., Hofmann C. Incorporation of decay-accelerating factor into the baculovirus envelope generates complement-resistant gene transfer vectors // Nat. Biotech-nol.–2001.–19, N 5.–P. 451–455.
43. Tani H., Limn C. K., Yap C. C., Onishi M., Nozaki M., Nishi-mune Y.,Nishimune Y., Okahashi N., Kitagawa Y., Watanabe R., Mochizuki R., Moriishi K., Matsuura Y.In vitro and in vivo gene delivery by recombinant baculoviruses // J. Virol.– 2003.–77, N 18.–P. 9799–9808.
44. Hoare J., Waddington S., Thomas H. C., Coutelle C., McGarvey M. J. Complement inhibition rescued mice allow-ing observation of transgene expression followallow-ing intraportal delivery of baculovirus in mice // J. Gen. Med.–2005.–7, N 1.–P. 325–333.
45. Hsu P. Y., Yang Y. W. Effect polyethylenimine on recombi-nant adeno-associated virus mediated insulin gene therapy // J. Gene. Med.–2005.–7, N 10.–P. 1311–1321.
46. Russ V., Gunther M., Halama A., Orgis M., Wagner E. Oligo-ethylenimine-grafted polypropylenimine dendrimers as degradable and biocompatible synthetic vectors for gene deli- very // J. Contr. Release.–2008.–132, N 1.–P. 131–140. 47. Kim Y.-K., Choi J. Y., Jiang H.-L., Arote R., Jere D., Cho
M.-H., Je Y. M.-H., Cho C.-S. Hybrid of baculovirus and galactosy-lated PEI for efficient gene carrier // Virology.–2009.–387, N 1.–P. 89–97.
48. Yang Y., Lo S.-L., Yang J., Yang J., Goh S. S. L., Wu C., Feng S.-S., Wang S. Polyethylenimine coating to produce serum-resistant baculoviral vectors for in vivo gene delivery // Biomaterials.–2009.–30, N 29.–P. 5767–5774.
49. Fujita R., Matsuyama T., Yamagishi J., Sahara K., Asano S., Bando H. Expression of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus genes in mammalian cells and upre-gulation of the host b-actin gene // J. Virol.–2006.–80, N 5.– P. 2390–2395.
50. Kenoutis C., Efrose R. C., Swevers L., Lavadas A. A., Gaita-nou M., Matsas R., Latrou K. Baculovirus-mediated gene de-livery into mammalian cells does not alter their trans-criptional and differentiating potential but is accompanied by early viral gene expression // J. Virol.–2006.–80, N 7.– P. 4135–4146.
51. Liu C. Y. Y., Wang C. H., Wang J. C., Chao Y. C. Stimulation of baculovirus transcriptome expression in mammalian cells by baculoviral transcriptional activators // J. Gen. Virol.– 2007.–88, N 8.–P. 2176–2184.
52. Laakkonen J. P., Kalkkonen M. U., Ronkainen P. H. A., Iha-lainen T. O., Niskanen E. A., Hakkinen M., Salminen M., Ku-lomaa M. S., Yla-Herttuala S., Airenne K. J., Vihinen-Ranta M. Baculovirus-mediated immediate-early gene expression and nuclear reorganization in human cells // Cell. Micro-biol.–2008.–10, N 3.–P. 667–681.
53. Mainz D., Quadt I., Knebel-Morsdorf D. Nuclear IE2 struc-tures are related to viral DNA replication sites during baculo-virus infection // J. Virol.–2002.–76, N 9.–P. 5198–5207. 54. Liu Y.-K., Chu C.-C., Wu T.-Y. Baculovirus ETL promoter
acts as a shuttle promoter between insect cells and mamma-lian cells // Acta Pharm. Sinica.–2006.–27, N 3.–P. 321–327. 55. Beck N. B., Sidhu J. S., Omiecinski C. J. Baculovirus vectors
repress Phenobarbital-mediated gene induction and stimulate cytokine expression in primary cultures of rat hepatocytes // Gene Ther.–2000.–7, N 4.–P. 1274–1283.
56. Hervas-Stubbs S., Rueda P., Lopes L., Leclerc C. Insect bacu- loviruses strongly potentiate adaptive immune responses by inducing type I IFN // J. Immunol.–2007.–178, N 4.– P. 2361–2369.
57. Chen G.-Yu., Shian H.-C., Su H.-J., Chen C.-Yu., Chuang Y.-J., Lo W.-H., Huang J.-L., Chuang C.-K., Hwang S.-M., Hu Yu.-C. Baculovirus transduction of mesenchimal stem cells triggers the Toll-Like receptor 3 pathway // J. Virol.–2009.–
83, N 20.–P. 10548–10556.
58. Abe T., Kaname Y., Wen X., Tani H., Moriishi K., Uematsu S., Takeuchi O., Ishii K. J., Kawai T., Akira S., Matsuura Y. Ba-culovirus induces type I interferon production through Toll-Like receptor-dependent and -independent pathways in a cell-type-specific manner // J. Virol.–2009.–83, N 15.– P. 7629–7640.
