FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA – UNICAMP
Título em inglês: Isolation, characterization and chromosomal localization of repetitive DNA
sequences in Physalaemus ephippifer.
Palavras-chave em inglês: Sexual chromosomes; Physalaemus; Heterochromatin; Satellite DNA. Área de concentração: Biologia Celular.
Titulação: Mestre em Biologia Celular e Estrutural.
Banca examinadora: Luciana Bolsoni Lourenço, Ana Paula Zampieri da Silva de Pietri, Patrícia
Pasquali Parisi Maltempi.
Data da defesa: 17/03/2010.
Programa de Pós-Graduação: Biologia Celular e Estrutural.
Nascimento, Juliana
N17i Isolamento, caracterização e localização cromossômica
de seqüências de DNA repetitivo em Physalaemus
ephippifer / Juliana Nascimento. – Campinas, SP: [s.n.],
2010.
Orientadora: Luciana Bolsoni Lourenço.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
1. Cromossomos sexuais. 2. Physalaemus. 3. Heterocromatina. 4. DNA satélite. I. Lourenço, Luciana Bolsoni, 1972-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Dedico minha tese aos meus pais José e Dedico minha tese aos meus pais José e Dedico minha tese aos meus pais José e Dedico minha tese aos meus pais José e Theresa, aos
Theresa, aos Theresa, aos
Theresa, aos meus irmãos Jonatam e meus irmãos Jonatam e meus irmãos Jonatam e meus irmãos Jonatam e Natália,
Natália, Natália,
Natália, a minha vó Ilda e a Dea minha vó Ilda e a Dea minha vó Ilda e a Dea minha vó Ilda e a Deus por us por us por us por nunca me deixar desistir.
nunca me deixar desistir. nunca me deixar desistir. nunca me deixar desistir.
Agradecimentos
Agradeço imensamente à Profa. Dra. Luciana Bolsoni Lourenço, por ter me dado a oportunidade que há muito tempo eu buscava de continuar nos estudos abrindo as portas de seu laboratório acreditando na minha capacidade me aceitando como sua aluna. Agradeço a todo conhecimento passado, aos conselhos valiosos e a atenção de maneira tão cuidadosa que com certeza me fizeram crescer como pessoa e profissional. Por ter sempre me apoiado, dando força positiva acreditando que tudo daria certo. Tudo o que fez por mim só me fez querer ainda mais da vida.
À Profa. Dra. Shirlei Maria Recco-Pimentel por ter me aceitado em seu laboratório e no seu grupo de pesquisas que há tanto tempo contribui valorosamente nessa linha. Sou grata à professora pelos valiosos conselhos profissionais dados no início das disciplinas, ao apoio durante os experimentos e a sugestões da análise prévia desta dissertação.
Ao Conselho de Aperfeiçoamento Profissional de Nível Superior (CAPES-PROEX), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Casadinho-620163/2008-9) e Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro.
À Profa. Dra. Gilda Vasconcellos de Andrade e Profa. Ms. Janaina Reis Ferreira Lima por contribuirem em meu trabalho pela coleta das espécies.
Agradeço também a colaboração do Prof. Diego Baldo.
Agradeço à Profa. Dra. Ana Paula Zampieri de Pietri e Silva pela análise prévia da banca e que juntamente com o Prof. Dr. Fernando Ananias plantou em mim desde iniciação cientifica, a vontade de continuar os estudos nessa área apoiando imensamente durante toda essa fase.
À Profa. Dra. Patricia Pasquali Parise Maltempi por também ter aceitado participar da banca examinadora contribuindo com sugestões valiosas para o enriquecimento deste trabalho com análise prévia dos resultados.
À Profa. Dra Ana Cristina Veiga-Menoncello pela amizade, apoio, ajuda nos experimentos iniciais na minha iniciação em molecular.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural Instituto de Biologia da UNICAMP.
A todos os professores do Depto. de Biologia Celular que durante todo o período das disciplinas contribuíram de grande forma a minha formação.
À todos os funcionários e alunos do Depto. de Biologia Celular, especialmente à secretária Liliam Panagio por tamanha eficiência dedicada a todo departamento.
Agradeço a técnica do laboratório Alessandra Ferreira da Costa por todo apoio nos experimentos principalmente pelos contatos feitos para conclusão dos resultados e também pela amizade e os momentos de descontração.
Agradeço imensamente a amiga Cíntia que ajudou nos primeiros passos na molecular e me apoiou nas horas que mais necessitava.
Amigo Stenio, pois iniciamos juntos em nossa caminhada. Agradeço o apoio em todos os momentos.
Ao amigo Daniel por todo carinho, amizade, ajuda obrigada à todos os momentos de descontração e que foi muito bom te conhecer nesse momento de conclusão da tese.
A amiga Débora pela amizade, ajuda e apoio em todas as horas. Dizer que me diverti muito nesses dois anos.
Aos estagiários do laboratório Mateus e Maria por toda a ajuda e companheirismo.
Aos meus pais José e Theresa que me apoiaram imensamente na concretização deste sonho pois realmente acreditar em mim foi importante para prosseguir. È em vocês que me espelho todos os dias de minha vida. Sou imensamente feliz por ter vocês ao meu lado.
Aos meus irmãos Jonatam e Natália por serem meus verdadeiros amigos desta vida. Eu realmente amo nossa grande amizade.
A Deus que em nenhum momento me deixou desistir...
Sumário
RESUMO ... 8
ABSTRACT ... 10
I. INTRODUÇÃO ... 12
1.ESTUDOS CITOGENÉTICOS NO GRUPO PHYSALAEMUS CUVIERI ... 14
2.HETEROCROMATINA ... 16
2.1. DNA repetitivo ... 18
2.1.1. DNA satélite, microssatélite e minissatélite ... 18
2.1.2. Elementos transponíveis ... 19
Retrotransposons com LTR ... 20
LINEs e SINEs ... 21
PLE e DIRS ... 22
Transposons (“Corta e cola”, Helitrons e Politrons) ... 22
3.ELEMENTOS REPETITIVOS COMO FERRAMENTA APLICADA À CITOGENÉTICA EM ANUROS ... 24
II. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO ... 26
III. OBJETIVO ... 28
IV. MATERIAIS E MÉTODOS... 30
1. ESPÉCIMES ... 31
2.ISOLAMENTO DE DNA GENÔMICO ... 31
3.ISOLAMENTO DE DNA REPETITIVO ... 32
4.ISOLAMENTO DE FRAGMENTO DO RETROTRANSPOSON REX1 ... 33
5.CLONAGEM DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO PEP194,PEP165,PEP320 E DO ELEMENTO REX1 ... 34
6.HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE (FISH) ... 35
7.AMPLIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS REPETITIVAS PEP194 ... 36
8. ANÁLISE CITOGENÉTICA CLÁSSICA ... 37
V. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38
CAPÍTULO 1. ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E MAPEAMENTO DE SEQUÊNCIAS REPETITIVAS ... 39
RESULTADOS ... 39
DISCUSSÃO ... 46
CAPÍTULO 2. ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E MAPEAMENTO DAS SEQUÊNCIAS CORRESPONDENTES AO ELEMENTO RETROTRANSPONÍVEL REX1... 49
RESULTADOS ... 49
DISCUSSÃO ... 54
VI. CONCLUSÕES ... 56
Resumo
Os primeiros resultados citogenéticos obtidos para a espécie Physalaemus ephippifer, atualmente alocada no grupo P. cuvieri, mostraram um interessante heteromorfismo cromossômico ligado ao sexo. As 14 fêmeas analisadas apresentaram um par cromossômico 8 heteromórfico, enquanto nos 7 machos analisados esse par era homomórfico. A diferença entre os cromossomos das fêmeas era devida à presença de um segmento adicional, composto por uma NOR e uma banda heterocromática a ela adjacente, localizado na região terminal do braço curto de apenas um desses homólogos, denominado de morfo 8b. Apesar desse importante achado, o uso de técnicas citogenéticas convencionais nessa e em outras espécies do grupo P. cuvieri não foram suficientes para esclarecer os mecanismos envolvidos na evolução cromossômica, já que poucos caracteres citogenéticos informativos foram evidenciados e também uma grande variação em relação às NORs foi encontrada. Com a intenção de buscar novos marcadores citogenéticos que auxiliem no estudo dos cromossomos sexuais de P. ephippifer e que colaborem na análise citogenética desse grupo de Physalaemus, foram estudadas sequências de DNA repetitivo isoladas desta espécie. Para tanto, o DNA genômico extraído de duas fêmeas de P. ephippifer, provenientes de Belém (Pará), foi digerido com a enzima de restrição BamHI e os fragmentos gerados foram separados por eletroforese em gel de agarose. Fragmentos posteriormente denominados de Pep194, Pep165 e Pep320 isolados a partir desse gel, foram clonados, sequenciados e localizados in situ no cariótipo de P. ephippifer. A seqüência Pep320 mostrou correspondência parcial com o fragmento EU343727.1 isolado de P. cuvieri, cuja sequência está disponível no GenBank. Apesar desses fragmentos não apresentarem similaridade entre si, as sequências Pep165 e Pep320 foram mapeadas no mesmo sítio cromossômico, correspondente à banda pericentromérica do braço curto do cromossomo 3. Esse resultado levanta um questionamento, ainda não respondido, acerca da organização molecular dessas sequências, que podem estar arranjadas em clusters independentes ou representar partes de uma mesma unidade repetitiva. A sequência Pep194 foi mapeada em regiões coincidentes com as NORs, localizadas no braço longo dos cromossomos identificados como Z e W, e no braço curto do cromossomo W. Apesar deste resultado, a análise da sequência Pep194 não apresentou nenhuma similaridade com regiões codificadoras do DNAr nucleolar, nem mesmo com regiões intergênicas associadas a elas já descritas. Tal sequência apresentou interessante arranjo interno, sendo composta de duas repetições diretas terminais, cada uma com 63 pb, sendo ambas flanqueadoras de uma região interna de 68 pb. Para melhor investigar a organização desta sequência no genoma de P. ephippifer, foram analisados produtos resultantes da amplificação por PCR de segmentos do DNA genômico, efetuada com o auxílio de primers construídos especificamente para se anelarem em regiões
internas do segmento isolado. Os resultados obtidos por essa análise evidenciaram a presença de uma unidade repetitiva de 131 pb, que representa parte do fragmento Pep194, diferindo desse por não apresentar uma das regiões de 63 pb. No entanto, não é possível descartar a co-existência de uma unidade repetitiva de 194 pb, não detectada nessas análises. Em paralelo a esses experimentos, sequências pertencentes a elementos retrotransponíveis Rex1 foram isoladas do genoma de P. ephippifer por PCR, clonadas, sequenciadas e mapeadas por FISH em uma região heterocromática pericentromérica do braço curto do cromossomo 3. A análise das sequências desses fragmentos comprovou serem correspondentes a parte da sequência codificadora da enzima transcriptase reversa do elemento Rex1. A fim de verificar a presença desse elemento em outras espécies de Physalaemus, os mesmos primers utilizados nos experimentos com P. ephippifer, foram usados para a amplificação de sequências a partir de amostras do DNA genômico de P. albifrons, P. albonotatus, P. henselli e P. spiniger. A sequência isolada de P. albonotatus apresentou uma deleção interna de cerca de 220 pb quando comparada com as sequências correspondentes, aqui descritas ou disponíveis no GenBank. Isso permite sugerir que, embora derivado de um elemento Rex1, esse segmento provavelmente deixou de ser um elemento de transposição ativo. Embora esse seja o primeiro trabalho que descreve a ocorrência de Rex1 em anuros, a presença desse elemento parece comum, pelo menos no gênero Physalaemus. Além de apresentar similaridade com o segmento de Rex1 e com os fragmentos Pep165 e Pep320, a banda heterocromática pericentromérica de 3p é também o sítio de ocorrência de DNAr 5S. Tal região, reconhecida como DAPI-positiva na presente análise, permite clara distinção entre os cromossomos 3 e 4 de P. ephippifer, frequentemente confundidos se analisados apenas em relação à sua morfologia. As quatro sequências repetitivas aqui isoladas apresentaram-se eficientes marcadores citogenéticos e poderão ser utilizadas para futuros estudos comparativos entre espécies do gênero Physalaemus.
Abstract
Previous cytogenetic studies of Physalaemus ephippifer, a species currently allocated to the group
P. cuvieri, showed an interesting female-specific chromosome heteromorphism. In 14 females of P. ephippifer, chromosome pair 8 was heteromorphic with regard to the occurrence of an NOR and
a terminal C-band. Such heteromorphism was not found in the seven analyzed male specimens. These findings suggest that the chromosomes of pair 8 may be sex chromosomes in P. ephippifer, characterizing a ZZ ♂/ ZW ♀ sex-determination system in this species. Despite these important data, conventional cytogenetic techniques performed in this and other species of the Physalaemus group were not sufficient to clarify the processes involved in the karyological divergence in this anuran group. Aiming to look for new cytogenetic markers that may help in the study of P.
ephippifer sex chromosomes and in the cytogenetic analysis of this group of Physalaemus, we
studied repetitive DNA sequences isolated from P. ephippifer. Genomic DNA extracted from two females of P. ephippifer from Belém (Pará) was digested with the restriction enzyme BamHI. The restriction fragments were separated by electrophoresis in agarose gel. DNA fragments, which were ultimately named Pep194, Pep165, and Pep320, were isolated from the gel, cloned, sequenced, and localized in situ in the karyotype of P. ephippifer. The sequence Pep320 was very similar to the fragment EU343727.1 isolated from P. cuvieri. Although Pep320 and Pep165 were totally different in nucleotide sequence, they were mapped on the same chromosome site, which corresponded to the pericentromeric C-band in the short arm of chromosome 3. This raises doubts about the molecular organization of these sequences, which can be arranged in independent clusters, but can also represent partial regions of the same repeat unit. The sequence Pep194 was mapped in regions that coincided with the NORs, located in the long arm of Z and W chromosomes and in the short arm of the W chromosome. However, the Pep194 sequence had no similarity with the coding regions of the nucleolar rDNA or with intergenic spacers associated to them. The restriction fragment Pep194 had an interesting internal arrangement, being composed of two terminal direct repeats, each with 63 bp, flanking an internal region of 68 bp. To further investigate the organization of this sequence in the genome of P. ephippifer, we amplified some Pep194 segments from genomic DNA by PCR using specific primers designed to anneal in inner
regions of the Pep194 segment. The results of this analysis showed the presence of a repeat unit of 131 bp, which represents part of the fragment Pep194, differing from that by the absence of one set of 63 bp. However, the possible co-existence of a repeat unit of 194 bp not detected by PCR analysis cannot be ruled out. Besides the study of restriction fragments, sequences of the retrotranspon Rex1 were isolated from the genome of P. ephippifer by PCR, cloned, sequenced, and mapped by FISH in the heterochromatic pericentromeric band in the short arm of chromosome 3. The sequence analysis of the isolated segment showed that it corresponds to the coding region of the enzyme reverse transcriptase of the Rex1 element. In order to verify the presence of this element in other species of Physalaemus, the same primers used to isolate the Rex1 element from
P. ephippifer were used to amplify genomic DNA sequences of P. albifrons, P. henselli, and P. spiniger. The sequence obtained from P. albonotatus showed a deletion of 220 bp when compared
with the corresponding sequences described herein or available in GenBank. This allows us to suggest that, although derived from a Rex1 element, this segment probably is no longer an active transposition element. Although this is the first study that describes the occurrence of Rex1 in anurans, the presence of this element seems to be common, at least in Physalaemus. Besides being homologous to the segment of Rex1, Pep165, and Pep320 fragments, the pericentromeric heterochromatic band of 3p was also the site of ocorrence of 5S rDNA. This region, coincident with a DAPI-positive C-band, allowed a clear distinction between chromosomes 3 and 4 of the P.
ephippifer, which have similar size and morphology and can be easily misidentified in
Giemsa-stained karyotypes. In conclusion, the four repetitive sequences isolated here proved to be efficient cytogenetic markers and may be used for future comparative studies between species of the genus
A classe Amphibia é composta por três subclasses: Labyrinthodonthia, Lepospondyli (já extintas) e Lissamphia, sendo nesta última encontradas as ordens Anura, Caudata e Gymnophiona (Duellman & Trueb, 1986). A ordem Anura é a mais diversificada de todas, com espécies distribuídas em 29 famílias, enquanto a ordem Caudata inclui 10 famílias e a ordem Gymnophiona, apenas 5 famílias (Frost, 2009).
Os anuros ocupam diferentes habitats e apresentam ampla distribuição geográfica, sendo grande parte desta ocupação observada em regiões neotropicais. A ampla distribuição dos anuros caracteriza-os como um grupo extremamente cosmopolita. A família Leiuperidae apresenta-se amplamente distribuída no México e na América do Sul e compreende 77 espécies agrupadas em sete gêneros, Edalorhina, Engystomops, Eupemphix, Pleurodema, Pseudopaludicola, Somuncuria e Physalaemus. Dentre eles, o gênero Physalaemus é o maior, com 42 espécies descritas atualmente (Grant et al., 2006; Frost, 2009). Grande quantidade de polimorfismos e notória abundância de espécies crípticas têm caracterizado esse gênero (Barrio, 1965; para outras referências, ver Frost, 2009), o que dificulta a identificação taxonômica de algumas populações com base apenas em critérios morfológicos. A revisão taxonômica de exemplares depositados em coleções científicas como representantes de Physalaemus fucomaculatus, conduzida por Nascimento et al. (2006), é um claro exemplo da dificuldade observada na identificação desses exemplares. Em sua revisão, Nascimento et al. (2006) reportaram a presença de duas espécies no material analisado e propuseram a identificação taxonômica de parte desse material como
Pleurodema fuscomaculatus e dos demais como Physalaemus marmoratus. Esses autores
esclareceram, ainda, que Physalaemus marmoratus trata-se de uma nova combinação, que resultou da revalidação do nome Gomphobates marmoratus, que era sinônimo júnior de Physalaemus
fuscomaculatus.
As relações filogenéticas entre as espécies de Physalaemus continuam pouco elucidadas. Até 2005, as espécies desses gêneros eram distribuídas em quatro grupos, P. biligonigerus, P.
pustulosus, P. signifer e P. cuvieri, seguindo a proposta de Lynch (1970) elaborada a partir de
caracteres morfológicos. Nascimento et al. (2005), com base na análise fenética de caracteres morfométricos, propuseram um novo arranjo para essas espécies. Esses autores revalidaram o gênero Engystomops, para alocar todas as espécies antes reunidas no grupo P. pustulosus, e o
gênero Eupemphix, composto por uma única espécie, E. nattereri. As demais espécies de
Physalaemus foram realocadas em 7 grupos: grupo P. cuvieri (nove espécies), grupo P. signifer
(dez espécies), grupo P. albifrons (quatro espécies), grupo P. deimaticus (três espécies), grupo P.
gracilis (cinco espécies), grupo P. henselii (três espécies) e grupo P. olfersii (quatro espécies).
O grande impacto da proposta de Nascimento et al. (2005) no arranjo das espécies é facilmente notado quando analisamos as alterações em relação ao grupo Physalaemus cuvieri. Segundo tal proposta, esse grupo deixa de alocar 20 espécies antes atribuídas a ele e passa a ser o segundo maior grupo do gênero. No entanto, até o momento não há na literatura nenhuma análise filogenética que permita testar a hipótese de Nascimento et al. (2005) e, portanto, os agrupamentos propostos ainda necessitam de confirmação. Nas análises filogenéticas de anuros cada vez mais o uso de diferentes conjuntos de caracteres tem sido empregado (exemplo em Grant et al., 2006 e Frost et al., 2006). Dentre os caracteres potencialmente informativos, encontram-se os citogenéticos, que podem representar valiosa ferramenta no estudo dos Physalaemus, já que análises preliminares mostram alguns caracteres espécie-específicos e outros que permitem diferenciar grupos de espécies ou de populações, como no caso da espécie P. cuvieri (exemplos em Amaral et al., 2000; Silva et al., 1999; Quinderé, 2007; Quinderé et al., 2009; Tomatis et al., 2009).
1. Estudos citogenéticos no grupo Physalaemus cuvieri
As espécies do grupo P. cuvieri apresentam ampla distribuição geográfica, fazendo com que esse grupo esteja representado do Norte ao Sul da América do Sul a leste dos Andes, ocorrendo da Venezuela à Argentina, em formações abertas do Cerrado, Caatinga, Chacos e em regiões de domínios planos (Nascimento et al., 2005). Os cariótipos de P. cuvieri (Beçak et al., 1970; Silva et
al., 1999; Quinderé et al., 2007), P. centralis (Denaro, 1972; Quinderé et al., 2007), P. albonotatus, P. ephippifer e P. cuqui (Quinderé, 2007, Quinderé et al., 2009) já foram descritos
com base em colorações convencionais com Giemsa, bandamento C e impregnação por prata para detecção de NORs. Informações relativas ao número e à morfologia dos cromossomos do complemento diplóide de P. cicada e P. kroyeri (De Lucca et al., 1974) também estão disponíveis
na literatura. Apenas as espécies P. erikae e P. fischeri do grupo P. cuvieri não apresentam nenhuma informação acerca de seu cariótipo.
Comparações dos cariótipos disponíveis para o grupo, que possui número constante de cromossomos (2n=22), permitiram identificar grande semelhança em relação à morfologia dos sete primeiros pares cromossômicos. Apenas em P. albonotatus parece haver uma diferença na ordenação dos pares 3-5 em relação às demais espécies. Importantes homeologias são consideradas em relação à distribuição da heterocromatina no genoma de algumas espécies desse grupo como as bandas observadas nos pares 2, 3, 10 e principalmente a banda no par 5 que foi encontrada em todas as espécies do grupo P. cuvieri (Quinderé, 2007).
Já os pares cromossômicos 8-11 apresentam-se mais variáveis, o que dificulta o reconhecimento inequívoco de homeologias entre os cariótipos. E justamente nesses menores pares estão localizadas as NORs principais desses cariótipos (Quinderé, 2007). Dessa forma, os dados disponíveis até momento não permitem o reconhecimento dos possíveis rearranjos responsáveis pelas diferenças interespecíficas em relação aos cromossomos portadores de NORs, apesar de permitirem o reconhecimento de interessantes fenômenos especialmente nas espécies P.
cuvieri e P. ephippifer. No primeiro caso, por exemplo, a interessante variação interpopulacional
observada em relação ao padrão de distribuição de NORs (Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009) permitiu identificar alguns agrupamentos populacionais (Quinderé et al., 2009).
Em relação a P. ephippifer um interessante heteromorfismo referente a NORs e à distribuição de heterocromatina foi observado entre os homólogos do par 8 de todas as fêmeas (Quinderé, 2007). Nessas fêmeas, enquanto um dos homólogos desse par (morfo 8a) apresentou uma NOR terminal no braço longo, o outro (morfo 8b) apresentou uma NOR no braço longo e outra no braço curto, ambas adjacentes a regiões detectadas pelo bandamento C (Fig. 1). Todas essas NORs foram evidenciadas tanto pelo método Ag-NOR como também pela técnica de FISH com sonda de DNAr. Segundo Quinderé (2007), essas observações sugerem que o par 8 possa consistir no par cromossômico sexual do cariótipo de P. ephippifer, caracterizando o sistema de determinação sexual ZZ/ZW nessa espécie. No entanto, Quinderé (2007) ressalta a necessidade de novos estudos para que essa hipótese possa ser mais bem avaliada.
Figura 1. Pares cromossômicos 8 encontrados em machos (A) e em fêmeas (B) de P. ephippifer
submetidos à coloração convencional com Giemsa, ao bandamento C, ao método Ag-NOR e à
hibridação in situ com sonda de DNAr nucleolar, da esquerda para a direita. As setas apontam uma pequena banda C intersticial do braço curto do cromossomo Z, em geral, de difícil visualização.
2. Heterocromatina
A heterocromatina foi descrita por Emil Heitz em meados de 1928 com base em experimentos que consistiam na coloração da cromatina em distintos estágios da divisão celular. Ele observou que porções da cromatina permaneciam visivelmente mais compactadas durante a intérfase e, portanto, mais escuras que as outras regiões da cromatina. Denominou a região mais compactada de heterocromatina (transcricionalmente menos ativa) e a região menos compactada de eucromatina (transcricionalmente ativa). Posteriormente, estudos em Drosophila melanogaster mostraram que rearranjos de genes normalmente ativos em porções heterocromáticas poderiam resultar no seu silenciamento (ver revisão de Pardue & Henning, 1990), fenômeno que foi denominado de efeito de posição por Muller (1930). Após diversos estudos, muito foi discutido sobre a função da heterocromatina no genoma de eucariotos. Regiões transcricionalmente inativas presentes no genoma eram consideradas DNA lixo por muitos pesquisadores (ver revisão de Pardue & Henning, 1990). Hoje se sabe que estas regiões podem ter importância fundamental no genoma, podendo atuar não apenas no silenciamento de genes, como também na proteção contra elementos transponíveis, na regulação de sequências repetitivas, no centrômero para a organização dos cromossomos durante a fase de mitose do ciclo celular, na proteção e regulação do tamanho dos telômeros (revisão de Bühler & Moazed, 2007). Atualmente o termo heterocromatina se refere à região do genoma com uma estrutura formada por proteínas específicas para compactação diferencial do restante da cromatina, replicação tardia durante o ciclo celular e, portanto,
transcricionalmente menos ativa, localizada na periferia nuclear e portadora de sequências repetidas constituídas de DNA satélite e elementos transponíveis (ver item 2.1) (Richards & Elgin, 2002). Para a formação da heterocromatina, modificações nas proteínas histônicas (principal constituinte para a formação da fibra cromatínica) são necessárias e incluem: acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinação e isomerização (Jenuwein & Allis, 2001). Dentre as variantes de histonas, a CENP-A, uma das mais estudadas, é encontrada no centrômero e sua modificação é sinal para início da formação de heterocromatina (Folco et al., 2008). Diferentes modificações que acontecem com as proteínas histônicas podem levar ou não à atividade gênica. Por exemplo, a acetilação de histonas está associada à atividade gênica (Kurdistani & Grunstein, 2003). Já a metilação de histonas pode estar tanto relacionada com ativação transcricional quanto com a repressão da atividade gênica (Bannister et al., 2001).
Um constituinte característico da heterocromatina, a proteína HP1 (proteína 1 da heterocromatina), é responsável por reconhecer as modificações nas histonas e iniciar a formação da heterocromatina (Nakayama et al., 2001). Para tanto, um grande grupo proteico age especificamente e por vias complexas. São os chamados fatores de iniciação da heterocromatina e que atuam no cenário para o silenciamento de genes (Craig, 2004). Os alvos principais desses fatores são clusters de sequências satélites exclusivamente encontrados em centrômeros e telômeros além de elementos transponíveis (Jenuwein & Allis, 2001). Um dos fatores de iniciação para a formação da heterocromatina que melhor representa esta função, além dos complexos proteicos envolvidos (metilases e acetilases), são os chamados RNAi (RNA de interferência). Sua origem depende da transcrição de sequências repetitivas centroméricas, evento que, além de abrir o caminho para a formação da heterocromatina, constitui prova de que essa região da cromatina pode tornar-se transcricionalmente ativa (revisão de Bühler & Moazed, 2007).
Algumas regiões do genoma permanecem compactadas durante todo o ciclo celular e são chamadas de heterocromatina constitutiva, como é o caso dos centrômeros e dos telômeros. No entanto, algumas regiões da heterocromatina têm a capacidade de se compactar e descompactar periodicamente, em resposta a sinais celulares específicos, e são chamadas, por alguns autores, de heterocromatina facultativa (Grewal & Jia, 2007; Trojer & Reinberg, 2007).
2.1. DNA repetitivo
Nos genomas de eucariotos podem ser observadas sequências de cópia simples (ou única), e as sequências repetitivas, também denominadas de DNA repetitivo. O DNA repetitivo consiste em sequências nucleotídicas de vários tamanhos e composições que ocorrem em tandem ou estão dispersas ao longo do genoma (Guy-Franck et al., 2008). Estudos baseados em cinética de renaturação de DNA classificaram os DNA repetitivos em dois grupos: as sequências moderadamente repetitivas e as sequências altamente repetitivas (Britten & Kohne, 1968). Após a descoberta, muitos estudos baseados nesses componentes repetitivos de eucariotos foram realizados e puderam revelar que o DNA repetitivo pode variar não penas com relação ao número mas também em relação ao tamanho das repetições (Guy-Franck et al., 2008).
Para justificar a grande variação do número das unidades repetidas que compõem as sequências do DNA repetitivo, muitos eventos relacionados à replicação do DNA foram elencados, como o de slippage da DNA polimerase, a replicação em rolling circle, assim como o evento de crossing over desigual (para referências ver Charlesworth et al., 1994).
Segundo a classificação adotada por Guy-Franck et al. (2008), dentre outros pesquisadores, o DNA altamente repetitivo compreende os chamados DNA satélites, com repetições em tandem. Na classe dos moderadamente repetitivos encontram-se os micro e minissatélites, com repetições em tandem, e os elementos transponíveis dispersos no genoma, além dos RNAt e dos genes parálogos. Breve descrição de cada classe de DNA repetitivo é apresentada a seguir.
2.1.1. DNA satélite, microssatélite e minissatélite
Experimentos de centrifugação em gradiente de densidade realizados com fragmentos de DNA genômico revelaram pequenas bandas ao lado de uma banda principal, que compreendia a maior parte do DNA presente na amostra. Tais bandas menores, denominadas de bandas satélites, eram formadas por sequências repetitivas de DNA, que passaram a ser chamadas de DNA satélite (Szybalski,1968). Logo após, muitos estudos vieram e revelaram que esse DNA satélite, com repetições de aproximadamente 1kb, era comumente presente em eucariotos (Henikoff, 2001). Além da natureza repetitiva que favorece a renaturação das fitas, outros perfis físicos e químicos deste tipo de DNA podem ser observados e incluem o número de repetições, a composição de
bases, a metilação e a ligação com cátions divalentes (Plohl et al., 2008). O DNA satélite pode ser definido como uma região de DNA não-codificadora composta por unidades repetidas em tandem, geralmente não idênticas, localizada em porções da heterocromatina constitutiva de centrômeros e telômeros (Bloom, 2007). Esses fragmentos altamente repetitivos diferem das outras duas classes de satélite pelo tamanho de suas unidades repetitivas, já que são maiores que os chamados microssatélites, cujas unidades repetitivas apresentam 2-6 pb, e os minissatélites, com unidades repetitivas de 15-60 pb. Atualmente muitas funções vêm sendo atribuídas para o DNA satélite (para revisão, ver Grewall & Jia, 2007, e Bloom, 2007). Além de seu essencial papel na produção de moléculas de RNAi envolvidas no recrutamento de complexos que acarretam a formação de heterocromatina centromérica e pericentromérica, discutido no item anterior, sequências de DNA satélite estão envolvidas na organização e emparelhamento dos cromossomos durante o processo de divisão celular. De acordo com Schueller et al. (2005) unidades de DNA satélite de regiões centroméricas são reconhecidas por proteínas específicas (CENP-B) que auxiliam na formação do cinetocoro. Apesar dessa função ser muito conservada entre eucariotos, existe uma variação na sequência nucleotídica dessas unidades entre diferentes espécies (Henikoff et al., 2001). Segundo Charlesworth et al. (1994), essa variação pode estar relacionada com efeitos de mecanismos de
slippage da DNA polimerase, rolling circle, conversão gênica e outros ainda não explicados. Esses
eventos de recombinação não-recíproca conduzem a uma homogeneização dessas sequências repetitivas no genoma e, como consequência desse fenômeno, as cópias resultantes possuem maior similaridade entre as cópias dentro de uma espécie do que entre espécies diferentes (Eikebush, 2007). Esse mecanismo de evolução não independente desses DNA satélites é conhecido como
concerted evolution (evolução combinada) (Dover,1982).
2.1.2. Elementos transponíveis
O genoma de eucariotos possui uma grande quantidade de DNA repetitivo oriundo de elementos transponíveis (Jurka et al., 2007). Barbara McClintock descobriu a presença dessas sequências no genoma de milho antes mesmo da estrutura da dupla hélice de DNA ser definida (McClintock, 1950). Um elemento transponível pode ser definido como uma unidade genética capaz de se mover pelo genoma através de complexos estruturais e mecanismos de transposição
muito variáveis. A capacidade de transposição, acúmulo e ocupação de uma grande porção dos genomas eucarióticos tornam essas sequências o fator de maior força para a mudança dos genes e do genoma da maioria dos organismos (Feschotte & Pritham, 2007).
Essas sequências podem ser encontradas tanto em procariotos quanto eucariotos (Guy-Franck et al., 2008). Após a descoberta da presença dessas sequências nos organismos, muitas informações sobre origem, diversidade e seu impacto no genoma desmentiram a ideia de que esse DNA era somente lixo do genoma (Jurka et al., 2007). Ao longo do tempo estas sequências foram distribuídas em duas grandes famílias: classe I (retrotransposon) e a classe II (transposon) (ver revisão de Guy-Franck et al., 2008). As duas classes são distinguidas pela molécula intermediária usada no processo de transposição. Os elementos da classe I possuem uma molécula de RNA como intermediário de transposição e os da classe II usam intermediários de DNA (Kidwell, 2002).
Porém, com o aparecimento de novas famílias de retrotransposons, a mais recente e sofisticada classificação baseada no mecanismo de transposição e inserção dessas sequências distribui as famílias de elementos da classe I em cinco ordens que incluem os retrotransposon com LTR (longas repetições terminais), os LINEs (long interspersed nucleotide elements), os SINEs (short interspersed nucleotide elements), os elementos DIRS (Dictyostelium intermediate repeat
sequence) e os PLE (Penelope-like elements) (Wicker et al., 2007). Tais elementos da classe I são
encontrados em todos os reinos eucarióticos, com exceção do PLE, que apenas pode ser observado em vegetais. Os elementos transponíveis eucarióticos (classe II) são divididos em três subclasses: a dos transposons “corta e cola”, a dos Helitrons e a dos Politrons (Jurka et al., 2007). A seguir, informações mais detalhadas são fornecidas acerca de cada um desses elementos.
Retrotransposons com LTR
Esses retrotransposons, assim como os retrovírus, são caracterizados por possuírem longas repetições terminais (LTR) que flanqueiam três ORFs (Open Reading Frames) responsáveis pela codificação das proteínas gag, env e pol. O gene pol é necessário para a inserção e transposição do retrotransposon, e codifica um complexo proteico constituído dos domínios RT (transcriptase reversa), EN (endonuclease/integrase) e aspartil protease. Os genes gag e env nos retrovírus
codificam as estruturas virais como a matriz, o capsídeo, o nucleocapsídeo e o envelope viral respectivamente (para revisão, ver Jurka et al., 2007; Capy et al., 1998).
O RNAm, que é expresso a partir de uma região desses elementos transponíveis, sofre uma transcrição reversa, originando um cDNA que é integrado novamente no genoma pela ação de integrases, também codificadas pelo próprio retrotransposon. Pode acontecer a transposição horizontal desses elementos, porém esse mecanismo ainda é pouco estudado (para referências ver Jurka et al., 2007).
LINEs e SINEs
Representam os retroelementos que não possuem as longas repetições terminais flanqueadoras das ORFs e, portanto, diferem dos retrotransposons descritos acima. Duas ORFs são encontradas nesses elementos: a ORF1 e a ORF2, codificadoras de endonucleases e transcriptase reversa (Jurka et al., 2007). Muitos autores denominam os LINEs e os SINEs de retroposons (Ohshima et al., 1993; Moran et al., 1996; Smit, 1996).
Os LINEs (long interspersed nucleotide element) são formados por uma ou duas ORFs (dependendo do elemento), e um promotor interno na extremidade 5' que governa a transcrição do retrotransposon que vai inserir-se no genoma. Esse mecanismo de transposição é chamado de TPRT (target-primed reverse transcription) e envolve três etapas: i) clivagem na fita de DNA em região rica em A-T mediada pela endonuclease codificada pela ORF-2; ii) anelamento do RNA transcrito a partir do LINE na sequência poli-T adjacente à quebra, seguido de síntese de cDNA pela RT codificada pela ORF-2; e iii) degradação do RNA somado a uma síntese de uma segunda fita de DNA, seguida de sua inserção no genoma (Jurka , 1997; Ostertag & Kazazian, 2001; Jurka et al., 2007).
Os LINEs são divididos em cinco grupos, chamados de L1, RTE, I, R2 e jockey, que se subdividem em 15 grupos. Os LINEs do tipo L1, RTE, I estão amplamente distribuídos em eucariotos, enquanto os LINEs R2 e jockey encontram-se restritos a vertebrados (ver Malik et al., 1999; Kojima & Fujiwara, 2004). A presença de uma variedade de elementos pode ter um papel na evolução dos genomas, podendo os LINEs, inclusive, estar envolvidos na explicação da natureza repetitiva encontrada principalmente em genomas de humanos (Han et al., 2004).
Os SINEs (short interspersed nucleotide element) têm tamanho variando entre 80-400 pbs e eles ocorrem na ordem de 105 cópias por genoma (Okada, 1991). No genoma humano, os SINEs constituem um dos mais abundantes grupos de retroelementos (Guy-Frank et al., 2008). De acordo com Kojima & Fujiwara (2004), os SINEs representam mosaicos estruturais derivados de RNAt, RNA 7SL ou RNAr 5S, contendo promotores internos para a RNA polimerase III, que estão intimamente envolvidos na transposição. Os SINEs não transcrevem as proteínas necessárias para sua transposição e utilizam para isso uma transcriptase reversa e endonucleases produzidas por outros retrotransposons, ditos autônomos. Dentre os SINES de roedores encontram-se os elementos B1, B2 e ID e, em humanos, são comuns os SINEs chamados de elementos Alu e MIR. As sequências Alu são formadas por dois monômeros de 130 pb cada, separados por uma região rica em A-T. A origem dessas sequências talvez seja consequência da duplicação de um gene ancestral codificador de RNA 7SL no processo de radiação dos mamíferos ao longo do tempo (Ullu & Tschudii, 1984).
PLE e DIRS
Os retrotransposons do tipo Penelope constituem uma classe de elementos que possuem apenas uma ORF, codificadora de transcriptase reversa e endonuclease. Esses elementos possuem sequências repetidas invertidas, ausentes nos SINEs e LINEs (Arkhipova et al., 2003). Essas características separam esses elementos dos retrotransposons descritos anteriormente e, por isso, essa classe é considerada extremamente divergente (Jurka et al., 2007). Os DIRS codificam a transcriptase reversa mais relacionada com a codificada pelos retrotransposons portadores de LTR do que com a dos LINEs. Sua estrutura terminal é diferente daquela dos outros retrotransposons, porém esses elementos podem ser considerados ancestrais dos retrotransposons com LTR (Capello
et al., 1985)
Transposons (“Corta e cola”, Helitrons e Politrons)
São os elementos da classe II e utilizam para a transposição um intermediário de DNA (Charlesworth et al., 1994). Nos elementos do grupo “corta e cola”, o mecanismo de transposição
envolve a excisão (corta) do transposon de DNA e consequente inserção (cola) em outra região do genoma. A transposase catalisa ambas as reações, ligando as extremidades do transposon no sitio alvo (Craig, 1995). Nesses elementos encontram-se presentes longas repetições terminais de 10400 pb chamados TIRs (terminal inverted repeats) (Kapitov & Jurka, 2003). É uma subclasse muito grande, que inclui 13 subfamílias diferenciadas umas das outras pelas transposases, que são específicas em cada caso (Jurka et al., 2007)
Para os elementos Helitrons o mecanismo de transposição é feito via replicação do tipo
rolling circle (Kapitov & Jurka, 2003). Esse tipo de replicação ocorre pela introdução de uma
quebra em uma das fitas de um DNA circular que resulta na formação de uma extremidade 3´ OH livre usada como um primer para a síntese de DNA. A replicação termina pela clivagem da fita nascente pelo domínio nuclease da enzima Rep. O domínio ligase da Rep liga as extremidades e forma o DNA circular. Esse processo é contínuo formando muitas cópias de DNA circular (Gros et
al., 1987). Os elementos Helitrons são encontrados em vegetais, fungos, insetos, nematodes e
vertebrados. Eles não possuem repetições terminais, mas possuem as extremidades bastante conservadas e um hairpin de aproximadamente 18 pb próximo à uma das extremidades, que auxilia na terminação da replicação rolling circle (Jurka et al., 2007).
Diferente dos Helitrons, os Politrons possuem repetições terminais e são capazes de codificar múltiplas proteínas (como por exemplo, a DNA polimerase B e uma integrase semelhante ao retrovírus) e estão relacionados com DNA de vírus. São conhecidos também como
Mavericks e foram observados em protistas, fungos e no reino animal (Kapitov & Jurka,2006). Seu
mecanismo de transposição envolve uma excisão feita pela integrase, seguida da migração do segmento gerado para regiões extracromossomais, onde se forma uma estrutura semelhante a uma raquete. Nessa estrutura ocorre a replicação do fragmento de DNA pela ação da DNA polimerase B. A integrase é, então, responsável pela re-integração do fragmento resultante novamente no genoma (Jurka et al., 2007). A atuação dos transposons no cenário evolutivo não é diferente em relação aos outros elementos transponíveis. Com sua inserção, os transposons podem alterar a função de um gene, podem induzir rearranjos cromossômicos, e consequentemente podem permitir a formação de novos genes e sequências regulatórias (Jurka et al., 2007).
3. Elementos repetitivos como ferramenta aplicada à citogenética em anuros
A localização cromossômica de sequências repetitivas pode revelar valiosos marcadores para estudos citogenéticos. A digestão de DNA genômico com enzimas de restrição seguida da clonagem e análise de fragmentos de restrição consistem em uma boa estratégia para esse tipo de estudo (Martins & Galleti, 2001; Feliciello et al., 2006 e Martins, 2006). A utilização dessa ferramenta em estudos citogenéticos tem auxiliado grandemente os estudos cromossômicos tanto de plantas (Fominaya et al., 1995; Bauchan et al., 2005) como de animais, especialmente de mamíferos e peixes (Marchal et al., 2006; Saito et al., 2007). Em peixes, o uso de seqüências repetitivas vem mostrando bons resultados mesmo quando técnicas citogenéticas clássicas não forneciam dados informativos para estudos sobre evolução cariotípica (para revisão, ver Martins, 2006). Muitas vezes, a análise de sequências repetitivas tem auxiliado no estudo de cromossomos sexuais, como no caso de Oncorhynchus tschawytscha (Devlin et al., 1991; Stein et al., 2001) e de
Parodon hilarii (Vicente et al., 2003).
Em anuros, os estudos com DNA satélite ainda são escassos, porém têm fornecido bons resultados. Em Rana italica, duas sequências repetitivas de DNA satélite foram encontradas (S1a e S1b) e uma grande diferença na organização dessas unidades foi observada na mesma população (Cardone et al., 1997). Já em Rana graeca, esses dois satélites foram amplificados por PCR e na análise das sequências foi possível notar uma mistura das duas sequências (Picariello et al., 2002). Em Rana temporaria apenas uma dessas unidades repetitivas (S1) foi encontrada e uma grande variabilidade intra-específica desses fragmentos foi observada nas populações analisadas por Feliciello et al. (2005). Variação na distribuição e na composição nucleotídica dessas duas unidades repetitivas também foram relatadas para diferentes populações de Rana dalmatina (Feliciello et al., 2006).
Odierna et al. (2004) notaram que uma sequência de DNA satélite isolada de um espécime diplóide de Pseudepidalea viridis (pBv) está também presente no genoma de outras populações dessa espécie, inclusive em algumas poliplóides, e também em Bufo bufo, “Bufo” mauritanicus,
Amietophrynus maculatus, Werneria mertensiana e Wolterstorffina sp.. Tal resultado evidenciou
cariotípica nesses bufonídeos. Mas os autores não descartaram a hipótese de que outros fragmentos repetitivos, quando isolados, possam ser utilizados como marcadores citogenéticos informativos.
Recentemente, Amor et al. (2010) isolaram três fragmentos de DNA repetitivo em
Discoglossus pictus. Nesse trabalho, os sequenciamento revelou que os três fragmentos eram
referentes a uma única sequência de DNA satélite, com 0,51 kb, denominada Dp-sat. Esse DNA satélite foi detectado por Southern Blotting em outras espécies do gênero Discoglossus, o que não ocorreu em relação a espécies que pertenciam a outros gêneros. Em experimentos de hibridação in
situ, esse DNA satélite foi localizado em regiões próximas ao centrômero de apenas alguns dos
pares cromossômicos do cariótipo de Discoglossus pictus. Esse estudo, assim como os mencionados anteriormente, tornam promissor o uso de fragmento repetitivos como uma nova ferramenta para os estudos da evolução cromossômica nos anfíbios.
A análise de sequências de elementos transponíveis também tem sido usada como estratégia para identificar elementos repetitivos em eucariotos (Devine et al., 1997). De acordo com Galleti & Martins (2005), estudos de elementos transponíveis realizados em muitas espécies de peixes puderam identificar diferentes LINEs e SINEs. Um exemplo foi o estudo realizado na espécie
Oreochromis niloticus, que identificou um elemento LINE amplamente distribuído no genoma,
embora estivesse mais concentrado no braço longo do par 1 (Oliveira et al., 1999), que é considerado por Foresti et al. (1993) o par de cromossomos sexuais X e Y.
A investigação de elementos transponíveis pode também auxiliar no estudo de algumas variações cromossômicas específicas, como a de NORs associadas a regiões de heterocromatina (Hartl, 1996). Resultado interessante, que corrobora essa ideia, foi observado na espécie de peixe
Tetraodon fluviatilis, em que foram encontrados elementos transponíveis do tipo Mariner em
regiões de NORs (Mandrioli & Manicardi, 2001). Em anuros, no entanto, o mapeamento cromossômico de elementos transponíveis ainda não tem sido realizado.
O estudo de cariótipos de populações do grupo P. cuvieri com as técnicas de coloração convencional com Giemsa, de bandamento C, de impregnação por prata e de FISH com sonda de DNAr nucleolar não foi suficiente para esclarecer os mecanismos envolvidos na evolução cromossômica desses anuros (Quinderé, 2007). Isso decorreu da limitada quantidade de caracteres citogenéticos informativos evidenciados por essas técnicas e também da grande variação encontrada em relação às NORs, o que dificultou o reconhecimento de homeologias cromossômicas. Assim, a utilização de outros marcadores citogenéticos torna-se importante forma de obtenção de novos caracteres que ajudem nessa análise. Especial interesse existe em aprofundar a descrição cariotípica de P. ephippifer, pois, neste caso, além de possibilitar comparações interespecíficas, a descrição de novos marcadores citogenéticos poderá permitir melhor análise do heteromorfismo do par 8, supostamente relacionado ao sexo nessa espécie. Já que esse par cromossômico apresentou um interessante heteromorfismo com relação à heterocromatina, a identificação e o mapeamento de diferentes sequências de DNA repetitivas representam uma interessante estratégia para a obtenção de novos marcadores citogenéticos para o estudo desses cromossomos.
O presente trabalho teve como objetivo (1) isolar, clonar e determinar a localização cromossômica de sequências repetitivas DNA (satélite e elementos transponíveis) da espécie P.
ephippifer, caracterizando novos marcadores cromossômicos para seu estudo citogenético; (2)
localizar regiões de DNAr 5S no cariótipo dessa espécie; e (3) aumentar a amostra de exemplares machos e fêmeas de P. ephippifer analisados citogeneticamente, com o intuito de verificar se a hipótese de heteromorfismo sexual cromossômico previamente sugerida por Quinderé (2007) pode ser corroborada.
1. Espécimes
Foram utilizadas preparações cromossômicas obtidas a partir de suspensões celulares intestinais e testiculares de três machos (ZUEC 13699, ZUEC 13727 e ZUEC 13734) e de doze fêmeas (ZUEC 13726, ZUEC 13728, ZUEC 13700, ZUEC13705, ZUEC13706, ZUEC13707ZUEC 13712, ZUEC13729, ZUEC13730, ZUEC13734, ZUEC 13735 e ZUEC13740) de P. ephippifer, já disponíveis no banco de amostras depositado no Laboratório de Estudos Cromossômicos do Departamento ABCFB do Instituto de Biologia da UNICAMP.
Para o isolamento de segmentos de DNA repetitivo e de retrotransposons foram utilizadas amostras de fígado e de músculo disponíveis no banco de tecidos mantido no mesmo laboratório supracitado, referentes a três fêmeas de P. ephippifer (ZUEC 13735, ZUEC 13737, ZUEC 13705). Todos os espécimes citados foram provenientes de Belém (PA) e são aqui identificados pelo seu número de registro na coleção de anfíbios do Museu de Zoologia do Instituto de Biologia da UNICAMP (ZUEC).
2. Isolamento de DNA genômico
Para a extração de DNA genômico, em um eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foram adicionados 50 µL de TNES (250 mM de tampão Tris pH 7,5, 2 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 2,5% de SDS) e um pequeno fragmento de tecido foi macerado com o auxilio de um pistilo autoclavado. Logo após, foram acrescentados 550 µL de TNES e 6 µL de proteinase K a 10mg/mL. Depois de mantidas por 3-4 horas a 55°C, as amostras foram tratadas com 3 µL de RNAse A (4mg/mL) a 37°C por 30 minutos. Após as amostras retornarem à temperatura ambiente, foram adicionados 200 µL de NaCl 5M e as amostras foram agitadas em vórtex e, em seguida, centrifugadas a 15000g por 5 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente transferido para novos tubos contendo 600 µL de isopropanol 100%. Os tubos foram invertidos algumas vezes e as amostras foram centrifugadas novamente a 15000g por 5 minutos. O precipitado foi lavado com 600 µL de etanol 70%. Para a remoção do etanol 70%, uma nova centrifugação de 5 minutos foi realizada e o sobrenadante descartado. Os tubos foram mantidos em papel absorvente até secarem. Logo após, o DNA de cada amostra foi ressuspendido em TE pH 8 e analisado após eletroforese em gel de agarose 1%.
3. Isolamento de DNA repetitivo
Cerca de 3µg do DNA genômico das fêmeas ZUEC 13735 e ZUEC 13737 foram digeridos a 37ºC por 16 horas pelas enzimas de restrição Bam HI, Eco RI, Pst I, Hind III, Bcu I e Xba I, separadamente. Em cada caso, 30 unidades de enzima foram utilizadas para o início da digestão e 30 unidades foram acrescentadas depois das primeiras 7 horas, em um volume total de reação de 100 µL. Os produtos resultantes foram precipitados com a adição de 2 µL de NaCl 5M e 250 µL de etanol 100%. Depois de lavados com etanol 70% gelado, os produtos foram ressuspendidos em 25 µL de água milli-Q autoclavada. Os fragmentos de restrição foram, então, separados por eletroforese em gel de agarose a 1,2% e corados com brometo de etídeo. Apenas a digestão com
Bam HI propiciou a visualização de bandas após a eletroforese. Bandas evidentes correspondentes
ao acúmulo de fragmentos com cerca de 200 pb, 450 pb e 650 pb foram identificadas e recortadas do gel com o auxílio de lâminas esterilizadas (Fig. 2). Os fragmentos de DNA presentes nas bandas foram purificados com o kit GFX PCR and Gel Band DNA Purification (GE Healthcare). Após esta etapa foi realizada uma extensão dos fragmentos obtidos utilizando a enzima Taq polimerase a 70°C por duas horas, conforme descrito por Sánchez et al. (1996), para o preenchimento das extremidades coesivas.
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose 1,2% do produto da digestão de DNA genômico das fêmeas ZUEC 13735 (1 e 3) e ZUEC 13737 (2 e 4) com a enzima Bam
HI, antes (1 e 2) e depois (3 e 4) da
remoção das bandas referentes ao acúmulo de fragmentos com cerca de aproximadamente 200 pb, 450 pb e 600 pb. L: Marcador de peso molecular 1kb plus da Fermentas. 400 _ 300 _ 200 _ 75 _ L 1 2 3 4
4. Isolamento de fragmento do retrotransposon Rex1
Com amostras do material genômico da fêmea ZUEC13705 foram realizadas reações de PCR usando os primers RTX1-F1 (TTCTCCAGTGCCTTCAACACC) e RTX1-R3 (TCCCTCAGCAG AAAGAGTCTGCTC) (Volff et al., 2000), específicos para o isolamento de uma
região do gene codificador da trancriptase reversa (ORF 2) do elemento transponível Rex1, nas
temperaturas de anelamento de 50°C, 51,5°C, 52°C e 55,4°C. Amostras dos produtos dessas reações foram analisadas após eletroforese em gel de agarose a 1% e coloração com brometo de etídeo (Fig. 3) e apenas uma banda, correspondente ao acúmulo de fragmentos com cerca de 550 pb, foi observada em cada caso. Os produtos restantes das reações de PCR foram unidos em uma única amostra e submetidos a eletroforese em gel de agarose. A banda correspondente aos fragmentos com cerca de 550 pb foi recortada do gel com lâminas esterilizadas e o DNA nela presente foi purificado com o auxílio do kit GFX PCR and Gel Band DNA Purification (GE
Healthcare).
A fim de verificar a presença do retrotransposon Rex1 em outras espécies do grupo P. cuvieri
proximamente relacionadas a P. ephippifer, amostras de DNA genômico de espécimes de P. albonotatus (DB2519), P. henselli, (BKT857), P. spiniger (ZUEC14516), P. albifrons
Figura 3. Gel de agarose a 1% corado com brometo de etideo mostrando as bandas (seta) resultantes de reações de PCR com os
primers RTX1-F1 e TRX1-R3, nas
temperaturas de anelamento de 50°C (1), 51,5°C (2), 52°C (3) e 55,4°C (4). L: Marcador de peso molecular 1kb plus da Fermentas.
1000 700 500
(ZUEC12361), disponíveis no Laboratório de Estudos Cromossômicos do Depto. ABCFB do IB-UNICAMP, também foram submetidas a reações de PCR com os primers RTX1-F1 e RTX1-R3 (Fig. 4). Os produtos amplificados foram purificados com o auxílio do kit GFX PCR and Gel Band DNA Purification (GE Healthcare).
5. Clonagem dos fragmentos de restrição Pep194, Pep165, Pep320 e do elemento Rex1
Os fragmentos obtidos por digestão enzimática foram denominados de Pep194, Pep165 e Pep320. Cada um desses fragmentos e daqueles referentes ao retrotransposon Rex1, obtidos
conforme descrito nos itens anteriores, foi inserido no plamídeo pGEM-T (Promega), seguindo instruções do fabricante. Os vetores recombinantes portadores de retrotransposons Rex1 e de
fragmentos de restrição foram utilizados para a transformação de bactérias E. coli da linhagem JM
109. Para tanto, foi utilizado o kit de clonagem Transformaid Bacterial Transformation
(Fermentas) seguindo orientações do fabricante. As colônias brancas de bactérias, portadoras de vetor recombinante, foram selecionadas e cultivadas em meio LB líquido contendo ampicilina. Após o crescimento das culturas, alíquotas foram congeladas em meio LB contendo ampicilina e 30% de glicerol e outras foram colhidas para a extração dos plasmídeos, segundo o método de mini-prep descrito por Sambrook et al. (1989). Amostras dos plasmídeos isolados foram usadas
em reações de PCR com os primers T7 e SP6, que se anelam a regiões específicas dos vetores,
para a amplificação dos insertos neles contidos. Para verificar o tamanho dos insertos clonados, amostras dos produtos dos PCRs foram aplicadas em gel de agarose 1% e coradas com brometo de etídeo. Depois de purificados com o kit GFX PCR and Gel Band DNA Purification (GE
Figura 4. Gel de agarose a 1% corado com
brometo de etideo mostrando as bandas resultantes de reações de PCR com os primers RTX1-F1 e TRX1-R3, na temperatura de anelamento de 55,4°C. 1: P. albonotatus, 2: P. spiniger, 3: P.henselii, 4: P. albifrons, L: Marcador de peso molecular 1kb plus da Fermentas. A seta aponta a banda correspondente a cerca de 550 pb. Note a presença de uma banda com menos de 550 pb (cabeça de seta) em P. albonotatus.
700 500 300
Healthcare), amostras dos insertos amplificados foram sequenciadas. Para isso, tais amostras foram submetidas a reações de sequenciamento com os primers T7 e SP6, separadamente, com o
auxílio dos componentes do kit BigDye Terminator (Applyed Biosystems), conforme instruções
do fabricante. Os produtos das reações de sequenciamento foram purificados por precipitação de DNA com etanol 80%, seguido de centrifugação a 15000g por 5 min. Em seguida, os produtos precipitados foram lavados com etanol 70% e novamente submetidos à centrifugação. Após secos, os precipitados obtidos foram ressuspensos em Loading Dye (Blue-Dextran-EDTA/Formamida (1:5), desnaturados por 3 minutos a 94ºC e aplicados em um sequenciador automático. As sequências obtidas foram editadas com o auxílio do software BioEdit (http://www.jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) e comparadas com sequências já depositadas no GenBank.
6. Hibridação in situ fluorescente (FISH)
Para a localização dos sítios cromossômicos de DNAr 5S, foram utilizados como sondas em experimentos de FISH, fragmentos com cerca de 700 pb isolados por PCR do genoma de
Physalaemus cuvieri (Vittorazzi et al., manuscrito em preparação), marcados com digoxigenina
por PCR.
Os fragmentos de restrição clonados conforme descrito nos itens anteriores foram também utilizados como sondas e localizados in situ. Para tanto, sondas correspondentes aos referidos
fragmentos foram produzidas por PCR, na presença de biotina ou digoxigenina. As condições em que tais reações foram realizadas estão mostradas na Tabela 1.
Tabela 1. Condições das reações de PCR utilizadas para a marcação de sondas pela incorporação de biotina e de digoxigenina (dig).
Marcação com biotina Marcação com dig
Tampão 5µL 5µL MgCl2 4µL 4µ L Mix de nucleotídeos1 3µL 3µL d-UTP-biotina (Roche) 2µL − d-UTP-dig (Roche) - 2µL
1 Mix de nucleotídeos: 1µL de dATP 100mM, 1µL de dGTP 100mM, 1µLde dCTP 100mM, 0,75µL de dTTP 100mM e 21,25µL de H2O milli-Q autoclavada.
Primer T7 4µL 4µL
Primer SP6 4µL 4µL
H2O milli-Qautoclavada 26µL 26µL
DNA 2µL 2µL
Volume total 50 µL 50 µL
Ao produto de cada reação de PCR foram acrescentados 50 µL de água milli-Q autoclavada, 10 µL de DNA de esperma de salmão 10 mg/mL, 11 µL de acetato de sódio 3M, pH 5,4 e 121 µL de etanol 100%. O DNA precipitado nessa etapa foi recuperado após centrifugação por 5 minutos a 12000g, lavado em etanol 70% e ressuspendido em 30 µL de meio de hibridação2
. Preparações cromossômicas de boa qualidade foram selecionadas e hibridadas com as sondas, conforme o método descrito por Viegas-Péquignot (1992). Para a detecção das sondas marcadas com biotina, foi utilizado o sistema da Vector composto por anticorpo secundário anti-biotina acoplado ao composto fluorescente FITC (fluoresceína). Para a detecção das sondas marcadas com digoxigenina foi utilizado um anticorpo anti-digoxigenina acoplado a rodamina. A hibridação simultânea de duas sondas foi realizada em alguns casos.
7. Amplificação das sequências repetitivas Pep194
Para analisar a organização da sequência repetitiva Pep194 no genoma de P. ephippifer, foi
desenhado um par de primers (Pep194-F: 5´-CCGCGGCCACCTGGTATCTC-3´; Pep194-R: 5´- TGGGAG ACCCGCTTTTGCCG-3´) que pudesse se anelar em regiões internas de segmentos homólogos ao fragmento em questão, podendo acarretar a amplificação de possíveis regiões compreendidas entre duas dessas unidades. As sequências desses primers foram desenhadas com o auxílio do programa NCBI primer, ferramenta disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast.
Uma reação de PCR foi montada com o par de primers descrito acima utilizando o DNA
genômico extraído de uma amostra de fígado da fêmea ZUEC 13707. Os fragmentos obtidos foram observados após eletroforese em gel de agarose 1%, recortados do gel com o uso de lâminas
2
As sondas foram ressuspendidas em 6 µL de H2O milli-Q autoclavada, 15µL de formamida, 6µL de sulfato de dextrano 50% e 3µL de SSC 20X.
esterilizadas e purificados com o kit GFX PCR and Gel Band DNA Purification (GE Healthcare).
Após esta etapa, os fragmentos foram sequenciados usando os mesmos primers, conforme descrito
no item 5.
8. Análise citogenética clássica
Com o intuito de aumentar a amostra de machos e fêmeas de P. ephippifer analisados
citogeneticamente, preparações cromossômicas de três machos (ZUEC 13699, ZUEC 13727 e ZUEC 13734) e de três fêmeas (ZUEC 13726, ZUEC 13700 e ZUEC 13712) não utilizados por Quinderé (2007) foram submetidas à impregnação por prata pelo método Ag-NOR (Howell & Black, 1980) para a detecção das NORs.
Adicionalmente, preparações cromossômicas dos espécimes ZUEC 13708, ZUEC 13709, ZUEC 13733, ZUEC13734 e ZUEC 13735 foram submetidas ao bandamento C (King, 1980). Depois de fotografadas, foram lavadas em etanol para a remoção do Giemsa e coradas com DAPI (0,5 µg/mL) para melhor caracterização das regiões heterocromáticas.
Capítulo 1. Isolamento, caracterização e mapeamento de sequências repetitivas
Resultados
A análise citogenética dos três machos e das três fêmeas não incluídos no trabalho de Quinderé (2007) mostrou exclusivamente nas fêmeas o heteromorfismo do par cromossômico 8 relativo à localização de NOR e heterocromatina (Figs. 5A , 5B e 5C), já descrito por aquele autor. O sítio de DNAr 5S foi mapeado na região pericentromérica do braço curto do cromossomo 3 (Fig. 5D). A coloração com DAPI evidenciou todas as bandas heterocromáticas também observadas em metáfases submetidas ao bandamento C e coradas com Giemsa (Figs. 5B e 5C). A presença de uma banda pericentromérica no braço longo do cromossomo W, facilmente visualizada em metáfases coradas com DAPI (Fig. 5C), permite diferenciar claramente os dois braços desse cromossomo metacêntrico, já que ambos também possuem bandas heterocromáticas distais adjacentes a NORs. Tal banda pericentromérica está também presente no braço longo do cromossomo Z e permite reconhecê-lo como braço homólogo ao Wq. É ainda interessante ressaltar que a banda distal presente em Wp é mais evidente do que aquela presente em Wq e Zq, apresentando-se fortemente brilhante em metáfases coradas com DAPI (Fig. 5C).
A clonagem de fragmentos de restrição da Bam HI resultou em dois clones recombinantes
idênticos com inserto de 140 pb (Pep140), um clone com inserto de 165 pb (Pep165), um com inserto de 194 pb (Pep194) e outro com inserto de 320 pb (Pep320) (Fig. 6). Não foi possível obter nenhum clone recombinante portador de fragmento com cerca de 650 pb, embora experimentos de clonagem tenham sido realizados a partir de fragmentos de restrição com tamanho estimado nesse valor.
Os clones sequenciados não apresentaram similaridade entre si (Fig. 6). A sequência Pep194, composta de 52,58% de GC, não teve similaridade considerável com as sequências do GenBank assim como as sequências Pep140 (37,86% de GC) e Pep165(47,56% de GC). A sequência Pep320, que tem 47,83% de CG, mostrou 94% de similaridade com a região terminal da sequência EU343727.1, isolada por Conte et al. (2009) do genoma de Physalaemus cuvieri (Fig. 6D).
O fragmento Pep194 apresenta uma sequência composta de duas repetições diretas terminais, cada uma composta de 63 pb, sendo ambas flanqueadoras de uma região interna de 68 pb. Tal
