Efeito agudo do exercício resistido nas ações vasculares da insulina

Texto

(1)0. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. MILENE TAVARES FONTES. EFEITO AGUDO DO EXERCÍCIO RESISTIDO NAS AÇÕES VASCULARES DA INSULINA. ARACAJU 2013.

(2) 1. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. Fontes, Milene Tavares F683e. Efeito agudo do exercício resistido nas ações vasculares da insulina / Milene Tavares Fontes; orientador Márcio Roberto V. Santos. – Aracaju, 2013. 55 f.. Dissertação (mestrado em Ciências da Saúde) –Universidade Federal de Sergipe, 2013.. 1. Exercícios isométricos. 2. Insulina. 3. Óxido nítrico. 4. Reatividade vascular. I. Santos, Márcio Roberto, orient. II. Título.. CDU 613.65:796.894:615.224.

(3) 2. MILENE TAVARES FONTES. EFEITO AGUDO DO EXERCÍCIO RESISTIDO NAS AÇÕES VASCULARES DA INSULINA. Dissertação apresentada ao Programa de Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito final à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto V. Santos Coorientador: Prof. Dr. Anderson Carlos Marçal. ARACAJU 2013.

(4) 3. MILENE TAVARES FONTES EFEITO AGUDO DO EXERCÍCIO RESISTIDO NAS AÇÕES VASCULARES DA INSULINA. Aprovada em ____/___/____. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.. __________________________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Leonardo Rigoldi Bonjardim. Universidade Federal de Sergipe – DFS/UFS __________________________________________________________ 2º Examinador: Profª. Dra. Luciana Venturini Rossoni Universidade de São Paulo – ICB/USP __________________________________________________________ 3º Examinador: Prof. Dr. Márcio Roberto Viana dos Santos Universidade Federal de Sergipe – DFS/UFS. PARECER ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________.

(5) 4. "Sejam quais forem os resultados com êxito ou não, o importante é que no final cada um possa dizer: fiz o que pude." Louis Pasteur.

(6) 5. AGRADECIMENTOS. Agradeço a Deus por ter me dado força, coragem, sabedoria e por ter colocado pessoas especiais durante esta minha jornada. A meus pais por todo o esforço ao longo de tantos anos, lutando para que eu pudesse chegar cada vez mais longe alcançando todos os meus sonhos. Aos meus irmãos, por todo o aprendizado da convivência. Dani obrigada pela companhia fiel. A todos os meus amigos que sempre deram força, souberam entender a ausência e ajudaram de alguma forma sempre que foi preciso. Não posso de deixar de agradecer aos meus eternos amigos: Suzi, Ana Flávia, Nattaly, Daniela Silva, Anderson, Thiago S., Thiago N., Sebastião. Ao meu orientador, prof Márcio Roberto Viana Santos, pela oportunidade, ensinamentos, dedicação, paciência e por ser um grande exemplo a ser seguido. Obrigada por estes cinco anos de ciência. Ao meu coorientador Anderson Carlos Marçal, pela paciência e ensinamentos. A professora Drª Luciana Venturini Rossoni pelo exemplo de pesquisadora e pela disponibilidade sempre em contribuir com o meu aprendizado e andamento do meu mestrado. Aos colegas do LAFAC pelo aprendizado e companheirismo, foi maravilhoso conviver e aprender com vocês. Agradeço de forma especial a Marcelo e Tharciano que me mostraram que eu posso ir sempre além, que eu preciso ser diferente e que sou capaz. Obrigada por terem sido meus pais científicos. Ao meu namorado Piter que sempre me incentivou e mostrou orgulho pela pessoa que quero me tornar. Aos professores do DFS por serem excelentes exemplos de docentes. Aos meus alunos, por terem acreditado no meu trabalho e no poder que o exercício físico tem de melhorar a saúde e a qualidade de vida..

(7) 6. FONTES M.T. EFEITO AGUDO DO EXERCÍCIO RESISTIDO NAS AÇÕES VASCULARES DA INSULINA. 2013. 55p. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju. RESUMO O objetivo do nosso estudo foi avaliar o efeito agudo de uma sessão de exercício resistido na ação vascular da insulina em artéria mesentérica superior de ratos. Ratos Wistar (250-300g) foram divididos em 3 grupos: controle (CT, n = 20), eletroestimulado (EE, n = 5) e exercício resistido (ER, n = 20). O exercício foi realizado no aparelho de agachamento, onde os animais foram submetidos a 15 séries de 10 repetições, com 3 minutos de intervalo entre as séries. A intensidade foi fixada em 70% da carga máxima estabelecida pelo teste de repetição máxima, realizado 48 h antes da sessão de exercício. Os animais EE foram mantidos suspensos no aparelho de agachamento e receberam a mesma intensidade de estímulo elétrico aplicadas aos animais exercitados. Imediatamente após a única sessão de exercício resistido, os animais foram anestesiados e mortos por dessangramento, a artéria mesentérica superior foi removida e seccionada em anéis (1-2 mm), os quais foram montados em cubas para órgão isolado. O relaxamento dependente de endotélio foi obtido a de curvas concentração-resposta para a insulina, em anéis pré-contraídos com fenilefrina. Após isto, foram obtidas curvas concentração-respostas para os grupos CT e ER, na ausência e/ou na presença dos seguintes inibidores: L-NAME (inibidor da NOS); TEA (inibidor não seletivo dos canais para K+), LY294002 (inibidor da PI3K); BQ123 (antagonista do receptor ETA); e Ouabaína (inibidor da Na+/K+-ATPase); curvas concentração-resposta para KCl na ausência e/ou presença de ouabaína. De acordo com os dados obtidos, constatamos que não houve diferença significativa no relaxamento induzido por insulina entre os grupos CT e EE, entretanto, os animais do grupo ER apresentaram um aumento significativo do relaxamento quando comparado ao grupo CT (p<0,001). Após a utilização do L-NAME, foi observada redução do relaxamento em ambos os grupos (p<0,001). Quando avaliamos a participação dos canais para K+, utilizando TEA foi observado inibição do relaxamento apenas no ER (p<0,001). Na presença de LNAME+TEA o relaxamento no grupo CT foi reduzido e no grupo ER houve uma contração (p<0,001). A presença do LY294002 interessantemente estes anéis responderam de formas similares quando na presença de L-NAME+TEA, promovendo uma inibição no grupo CT e uma contração da curva no grupo ER (p<0,001). O BQ123 foi capaz de amplificar o relaxamento em ambos os grupos (p<0,001). Utilizando ambos os inibidores (LY294002+BQ123) foi observada uma inibição tanto dos efeitos contráteis quanto dos efeitos relaxantes em ambos os grupos (p<0,001). Para avaliar a atividade funcional da Na+/K+-ATPase foram feitas curvas para insulina e KCl na ausência e na presença de ouabaína. Foi observado que a ouabaína promoveu uma redução do relaxamento induzido pela insulina apenas no grupo ER (p<0,001) e reduziu o relaxamento promovidos pelo KCl em ambos os grupos, sendo esta redução maior no grupo ER (p<0,001). Estes dados demonstram que uma sessão de exercício resistido promove ajustes no relaxamento induzido por insulina, que é mediado pelo NO, pelos canais para K+ e pela atividade da Na+/K+-ATPase. Além disso, houve um efeito mediado pela ET-1 (via receptores ETA), necessária para o controle do tônus vascular, durante o exercício. Palavras-Chave: Exercício resistido; insulina; oxido nítrico; fosfatidilinositol 3quinase; reatividade vascular..

(8) 7. FONTES M.T. ACUTE EFFECT OF RESISTANCE EXERCISE ON THE VASCULAR ACTIONS OF INSULIN. 2013. 52p. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju. ABSTRACT The aim of our study was to evaluate the effects of a resistance exercise session on the vascular action of insulin in superior mesenteric artery of rats. Wistar rats (250-300g) were divided into 3 groups: control (CT, n = 20), electrically stimulated (ES, n = 5) and resistance exercise (RE, n = 20). The exercise was conducted in the apparatus of the squat, where the animals were subjected to 15 sets of 10 repetitions with 3 minutes rest between sets. The intensity was set at 70% of maximum load established by repetition maximum test performed 48h before the exercise session. The animals were kept suspended in EE squat machine and received the same intensity of electrical stimuli applied to the exercised animals. Immediately after the single resistance exercise session, the animals were anesthetized and killed by exsanguination, the superior mesenteric artery was removed and sectioned into rings (1-2 mm) which were mounted on tanks for isolated organ. The endothelium-dependent relaxation was obtained from concentration-response curves for insulin on rings precontracted with phenylephrine. After that, concentration response curves were obtained for groups CT response and ER, in the absence and/or presence of the following inhibitors: L-NAME (NOS inhibitor), TEA (inhibitor nonselective channel for K+), LY294002 (PI3K inhibitor), BQ123 ( ETA receptor antagonist), and Ouabain (inhibitor of Na+/K+-ATPase), concentrationresponse curves to KCl in the absence and/or presence of ouabain. According to the data obtained, we found that there was no significant difference in the relaxation induced by insulin between groups EE and CT, however, the animals in the ER showed a significant increase in relaxation when compared to CT group (p<0.001). After use of L-NAME reducing the relaxation was observed in both groups (p<0.001). When evaluating the involvement of K + channels, using TEA, relaxation was inhibited only in the RE group (p <0.001). In the presence of L-NAME+TEA relaxation in the CT group was reduced and there was a group ER contraction (p<0.001). The presence of these rings LY294002 interestingly responded in similar ways in the presence of LNAME+TEA, promoting and inhibiting the group CT contraction curve ER group (p<0.001). The BQ123 were able to amplify the relaxation in both groups (p<0.001). Using both inhibitors (LY294002+BQ123) was observed an inhibition of contractile and relaxing effects in both groups (p<0.001). To assess the functional activity of the Na+/K+-ATPase curves were made for insulin and KCl in the absence and presence of ouabain. It was observed that ouabain was a decrease of insulin-induced relaxation only in the ER (p<0.001) and reduced the relaxation promoted by KCl in both groups, this reduction being higher in the ER (p<0.001). These data demonstrate that a single session of resistance exercise promotes adjustments in insulin-induced relaxation, which is mediated by NO, the channels for K+ and the activity of Na+/K+-ATPase. In addition, there was an effect mediated by ET-1 (via ETA receptors), necessary for the control of vascular tone. Keywords: Resistance exercise, insulin, nitric oxide; phosphatidylinositol-3-kinase, vascular reactivity..

(9) 8. LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Diferentes vias de sinalização do relaxamento vascular, a partir do qual um estímulo/substância promove o aumento da produção de NO, por vias de ativação dependente e independente do aumento da [Ca2+]i. (Fonte: RATTMANN, 2009) ........ 18 Figura 2: Balanço entre a ação da insulina sobre a via da MAPK e via da PI3K. (Fonte: MUNIYAPPA et al, 2007). ......................................................................................... 20 Figura 3: Sequência de atividades do protocolo de exercício resistido. ....................... 25 Figura 4: Curvas concentração-resposta para insulina (10 -13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do Grupo Controle (CT) Eletroestimulado (EE) e Exercício Resistido (ER). Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos em cada grupo. As análises estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma ou duas vias e pós-teste de Bonferroni. ++p<0,01; +++p<0,001 – CT e EE vs ER. ................................................................................................................................... 28 Figura 5: Curvas concentração-resposta para insulina (10 -13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do L-NAME (100µM) (figura 5A). A figura 5B mostra a variação da área sob a curva (dASC) entre a presença e a ausência do LNAME. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pósteste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. **p<0,01 ou ***p<0,001 - CT vs CT LNAME; ++p<0,001 – ER vs ER L-NAME; dASC: ***p<0,001 – CT L-NAME vs ER LNAME. ....................................................................................................................... 29 Figura 6: Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do TEA (10 µM) (figura 6A). A figura 6B mostra a variação da área sobre a curva (dASC) entre a presença e a ausência dos LNAME+TEA. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. ***p<0,001 - CT vs CT TEA +++p<0,001 – ER vs ER TEA; dASC: ***p<0,001 – CT TEA vs ER TEA. ...................................... 30 Figura 7: Curvas concentração-resposta para insulina (10 -13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do L-NAME+TEA (100µM e 10 µM.

(10) 9. respectivamente) (figura 7A). A figura 7B mostra a variação da área sobre a curva (dASC) entre a presença e a ausência dos L-NAME+TEA. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de ASC e o teste t de student para diferenças entre a dASC. *p<0,05 ou ***p<0,001 - CT vs CT L-NAME+TEA; +p<0,05 ou +++ p<0,001 – ER vs ER L-NAME+TEA; dASC: **p<0,01 – CT L-NAME+TEA vs ER L-NAME +TEA. ......................................................................................................... 31 Figura 8: Curvas concentração-resposta para insulina (10 -13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do LY294002 (50µM) (figura 8A).A figura 8B mostra a variação da área sob a curva (dASC) entre a presença e a ausência do LY294002. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pósteste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. **p<0,01 ou ***p<0,001 – CT vs CT LY294002; +++p<0,001 – ER vs ER LY294002; dASC: ***p<0,001 - CT LY294002 vs ER LY294002. ............................................................................................................ 32 Figura 9: Curvas concentração-resposta para insulina (10 -13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do BQ123 (10 µM) (figura 9A). A figura 9B mostra a variação da área sobre a curva (dASC) entre a presença e a ausência dos BQ123. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pósteste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de ASC e o teste t de student para diferenças entre a dASC. dASC: *p<0,01 – CT BQ123 vs ER BQ123. ................................................................................................................................... 33 Figura 10: Curvas concentração-resposta para insulina (10 -13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e précontraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do LY294002 mais BQ123 (50µM e 10 µM respectivamente) (figura 10A). A figura 10B mostra a variação da área sob a curva (dASC) entre a presença e a ausência do LY294002 mais BQ123. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. *p<0,05 ou ***p<0,001 – CT vc CT LY294002+BQ123; + p<0,05 ou +++p<0,001 – ER vs ER LY294002 +BQ123; dASC: ***p<0,001 – CT LY294002+BQ123 vs ER LY294002+BQ123. ........................................................... 34.

(11) 10. LISTA DE TABELAS Tabela 1: Resposta máxima (Rmax) dos relaxamentos promovidos por INS, em anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistidos (ER). Na presença e ausência do L-NAME, L-NAME+TEA, LY294002, LY294002+BQ123 ou Ouabaína. Os dados representam a média ± E.P.M. para 8 – 10 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via e pósteste de Bonferroni. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os diferentes grupos (p<0,05)...............................................................................................................38.

(12) 11. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. ACh- Acetilcolina Akt- Proteína quinase B (PKB) BKCa- Canais para potássio ativados por cálcio [Ca2+]i- Concentração de cálcio intracelular CGs- Ciclase da guanilil solúvel FCDE- Fator contrátil derivado do endotélio FEN - Fenilefrina FHDE- Fator hiperpolarizante derivado do endotélio FRDE- Fator relaxante derivado do endotélio EF- Exercício físico eNOS- Óxido nítrico sintase endotelial ER- Exercício resistido ERa- Exercício resistido agudo ET-1- Endotelina-1 GMPc- Guanosina monofosfato cíclica INS- Insulina IR- Receptor de insulina IRS- Substrato do receptor de insulina MAPK- Proteína quinase ativada por mitógeno NO- Óxido nítrico PDK- Proteína quinase dependente de fosfoinositídeo PGI2- Prostaciclina PGH2- Prostaglandina H2 PI3K- Fosfatidilinositol 3-quinase PKC- Proteína quinase C RM- Repetição máxima.

(13) 12. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO..................................................................... 13 2. REVISÃO DA LITERATURA ............................................ 15 2.1. Exercício Físico .............................................................................................. 15 2.2. Fisiologia do endotélio vascular ...................................................................... 17 2.4. Exercício resistido e endotélio vascular .......................................................... 21. 3. OBJETIVOS ......................................................................... 23 4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................. 24 4.1 Animais............................................................................................................. 24 4.2 Protocolo de exercício resistido agudo ............................................................ 24 4.3 Avaliação do relaxamento induzido pela insulina........................................... 25 4.4 Drogas............................................................................................................... 26 4.5 Análises estatísticas .......................................................................................... 26. 5. RESULTADOS ..................................................................... 28 5.1 Relaxamentos induzidos pela insulina ............................................................ 28 5.2 Participação da NOS nos relaxamentos induzidos pela insulina .................... 29 5.3 Participação dos canais para K + no relaxamento induzido pela insulina ...... 29 5.4 Participação dos canais para K + e do NOS no relaxamento induzido pela insulina ................................................................................................................... 30 5.5 Participação da PI3K nos relaxamentos induzidos pela insulina ................... 31 5.6 Participação da ET-1 nos relaxamentos induzidos pela insulina ................... 32 5.7 Participação das vias PI3k e dos receptores ETA nos relaxamentos induzidos pela insulina ........................................................................................................... 33 5.8 Efeito da Na+/K+-ATPase no relaxamento induzido pela insulina ............... 34 5.9 Resposta máxima do relaxamento na presença e ausência dos inibidores ..... 36. 6. DISCUSSÃO ......................................................................... 38 7. CONCLUSÕES ..................................................................... 43 REFERÊNCIAS........................................................................ 44 ANEXO A .................................................................................. 54 ANEXO B .................................................................................. 55.

(14) 13. 1. INTRODUÇÃO. O exercício físico é recomendado como uma das principais formas de prevenção e. auxílio. no. tratamento. das. doenças. cardiovasculares. (HASKELL,. 2007;. CARNETHON, 2009; LI; SIEGRIST, 2012), de uma forma geral, a prática de exercício físico regular é capaz de reduzir os riscos de doenças cardiovasculares (WARBURTON; NICOL; BREDIN, 2006; LI; SIEGRIST, 2012). Estes efeitos benéficos se devem em parte, a vários fatores como, por exemplo: atenuação da disfunção endotelial em condições de insuficiência cardíaca crônica, redução do quadro de hipercolesterolemia e atenuação da hipertensão arterial (HAMBRECHT, 1998; LEWIS et al, 1999; CARVALHO et al, 2005; LIZARDO et al, 2008; WANG, 2010; FARIA, 2010; MCCOMMIS, 2011; HEFFERNAN et al, 2012). As duas principais modalidades de exercício físico são os aeróbios e anaeróbios. Os aeróbios são caracterizados por atividades cíclicas e contínuas que tem como objetivo principal a melhora da capacidade cardiorrespiratória. Entre as diversas modalidades de exercício aeróbio podemos citar como exemplos: a corrida, natação e ciclismo (FORJAZ, 2010). Já os exercícios anaeróbios, são atividades intermitentes que apresentam como principal objetivo o fortalecimento muscular, onde podemos citar como principal exemplo o exercício resistido, popularmente conhecido como musculação (MONTEIRO, 1996). Recentemente, o exercício resistido foi incluído nas recomendações do Colégio Americano de Medicina do Esporte como parte integrante de um programa de exercício para a promoção da saúde e como ferramenta não farmacológica para o tratamento de diversas patologias (ACSM, 2009; BRAITH; STEWART, 2006). A literatura relata que tanto o exercício aeróbio quanto o exercício resistido são capazes de promover benefícios na captação da glicose que envolve ajustes das vias intracelulares independentes e dependentes da insulina (HENRIKSEN 2002; KRISAN et al. 2004; YASPELKIS, 2006; MAARBJERG; SYLOW; RICHTER, 2011). A maioria dos efeitos promovidos pela insulina no músculo esqueletico e no músculo liso vascular ocorre pela ativação da via de sinalização IR/PI3K/Akt (SALT, 2013). Esta.

(15) 14. mesma via de sinalização está envolvida na ação não-clássica da insulina, por exemplo, em leitos vasculares esta via intracelular quando ativada é capaz de induzir o relaxamento (MUNIYAPPA; SOWERS, 2013). A insulina ao interagir com o seu receptor (via IR/PI3K/AKT), desencadeia eventos intracelulares que culminam no aumento do grau de fosforilação da eNOS em serina 1177, resultando na síntese de NO em células endoteliais. Este efeito ocorre de maneira independente do aumento da concentração. intracelular. de. cálcio. [Ca2+]i. (FLEMING;. BUSSE,. 1999;. MONTAGNANI et al, 2001; MUNIYAPPA et al, 2007). Esse NO, liberado pelas células endoteliais, controla a atividade dos canais para K+, no músculo liso vascular, promovendo assim a hiperpolarização da membrana (BOLOTINA et al, 1994; FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009). A insulina também promove a hiperpolarização da membrana através da sua capacidade de estimular a atividade da Na+/K+-ATPase (CLELAND et al, 1998; SWEENEY; KLIP, 1998). Desta forma, a insulina promove hiperpolarização via canais para K+ e Na+/K+-ATPase, reduzindo as [Ca2+]i promovendo assim o relaxamento, dependente de IR/PI3K/eNOS (YASUI et al, 2008). Dados da literatura demonstram que o exercício aeróbio realizado somente uma vez (exercício agudo) e realizado por um longo período de tempo (exercício crônico), são capazes de modular o relaxamento induzido por insulina. Estes benefícios, se devem em parte, ao aumento da biodisponibilidade de NO e uma maior hiperpolarização do músculo liso vascular por meio da via IR/PI3K/eNOS (YANG et al, 2006; YANG et al, 2010; GHAFOURI; HAJIZADEH; MANI, 2011). A via de sinalização IR/PI3K/eNOS ativada pela insulina promove efeitos vasculares importantes, e a redução da resposta vascular à insulina está diretamente relacionada ao surgimento da disfunção endotelial, hipertensão arterial e resistência a ação da insulina. Dentro deste contexto, buscamos compreender com o nosso estudo se a prática do exercício resistido pode promover ajustes benéficos sobre as ações vasculares da insulina..

(16) 15. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1. Exercício Físico O exercício físico se caracteriza pela prática de uma atividade física de forma regular, orientada e estruturada que visa à obtenção da manutenção ou melhoria da aptidão física e consequentemente da qualidade de vida (NEGRÃO et al, 2005). Desta forma, o exercício físico tem sido constantemente recomendado como uma das principais. ferramentas na prevenção. e no. controle primário. das doenças. cardiovasculares, por conseguinte, os indivíduos adeptos a esta prática de forma contínua apresenta menor propensão a desenvolverem problemas cardíacos (MYERS, 2003; METKUS; BAUGHMAN; THOMPSON, 2010). Além dos aspectos preventivos sobre o sistema cardiovascular, o exercício físico também é considerado essencial ao tratamento de diversas patologias como hipertensão arterial (LIZARDO et al, 2008; FARIA et al, 2010), ateroscleroses (WHAYNE, 2011) e outras alterações relacionadas às doenças cardiovasculares como a disfunção endotelial e a síndrome metabólica (SELIGMAN et al, 2011; TJØNNA et al, 2011; DA SILVA et al, 2012). Devido a estes benefícios, recomendações sobre a importância da prática do exercício físico periodicamente têm sido apresentadas por diversas associações relacionadas à saúde da população (NELSON et al, 2007; WISE, PATRICK, 2011). Podemos citar o Colégio Americano de Medicina do Esporte (ACSM), a Associação Americana de Saúde (AHA) e a Sociedade Brasileira de Medicina do Esporte (SBME). De acordo com a literatura, o exercício físico promove ajustes na homeostase corporal que podem desencadear respostas agudas ou crônicas (BRUM et al, 2004). As respostas agudas são aquelas que ocorrem durante o exercício físico ou imediatamente após. Podemos citar aumento da sudorese, frequência cardíaca e ventilação pulmonar, melhora da sensibilidade à insulina, aumento da secreção de catecolaminas, dentre outros que ocorrem devido ao acréscimo instantâneo da demanda energética (THOMPSON et al, 2001; BRUM et al, 2004; NOBREGA, 2005). As respostas crônicas são ajustes do organismo na tentativa de se adequar ao estresse gerado pelo exercício físico regular, como por exemplo: aumento do consumo máximo de oxigênio.

(17) 16. e débito cardíaco máximo, diminuição da frequência cardíaca de repouso e do esforço submáximo. (BRUM et al, 2004; NOBREGA, 2005). Sobre a função vascular observa-se que o aumento na liberação de NO durante cada sessão de exercício físico, promove benefícios crônicos, como a melhora da função vascular (BECHARA; TANAKA; RAMIRES, 2010). Diversos trabalhos relatam o efeito crônico do exercício físico sobre o sistema cardiovascular, entretanto, apesar dos grandes avanços no estudo dos efeitos agudos do exercício físico, ainda existem questionamentos que precisam ser esclarecidas (BRUM et al, 2004; FARIA et al, 2010). Desta forma, compreender os efeitos agudos do exercício físico se faz necessário, visto que a realização deste, de forma regular ao longo do tempo promoverá mudanças adaptativas decorrentes do estresse contínuo, gerando assim efeitos crônicos mencionados anteriormente (NOBREGA, 2005). O exercício físico é caracterizado em dois tipos principais: o exercício aeróbio e o anaeróbio. Os exercícios aeróbios foram considerados como prioritarios para a prevenção e tratamento das doenças cardiovasculares até a década de 90, neste período o exercício resistido era recomendado apenas para o aumento da massa muscular e da densidade mineral óssea. Posteriormente, o exercício resistido foi reconhecido como um componente importante para um programa de melhora da qualidade de vida, da aptidão física e da reabilitação (CARVALHO et al, 1996; POLLOCK et al, 2000).. Essa. recomendação tardia das diretrizes na prática do exercício resistido ocorreu devido à escassez de estudos anteriores que demonstrassem os benefícios promovidos pela prática desta modalidade (FORJAZ et al, 2010). O exercício resistido caracteriza-se pela contração muscular realizada por um determinado segmento corporal, contra uma força oposta ao movimento, realizada de forma intermitente (FLECK, KRAEMER, 1999). Segundo Westcott (2012), os principais benefícios promovidos pelo exercício resistido são: aumento da densidade mineral óssea, aumento da taxa metabólica basal (controle de peso), aumento da massa magra, prevenção e controle de diabetes tipo 2, aumento da translocação do GLUT4, melhor tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina, além do aumento da biodisponibilidade de NO. A maior parte destes benefícios adquiridos pela prática do exercício resistido acontece principalmente pela capacidade deste tipo de exercício físico em melhorar a força muscular (PINTER et al, 2008). O aumento da força muscular está associado a uma melhoria no estado de saúde global e com baixas taxas de mortalidade, tanto em.

(18) 17. indivíduos saudáveis quanto em hipertensos (FITZGERALD et al, 2004; ARTERO et al, 2011). Estes efeitos foram relatados em idosos, mulheres pós-menopausadas, diabéticos, hipertensos e jovens saudáveis, entretanto, seus efeitos sobre o tônus vascular ainda são pouco compreendidos (RAKOBOWCHUK et al, 2005; BRAITH; STEWART, 2006; HARRIS et al, 2010; WILLIAMS et al, 2013).. 2.2. Fisiologia do endotélio vascular O endotélio vascular é uma camada de células que reveste o lúmen de todos os vasos sanguíneos do organismo e está envolvido em diferentes funções como a modulação do tônus vascular, coagulação, trombólise, remodelação vascular, resposta inflamatória e imune (VAN HINSBERGH, 2001; GALLEY; WEBSTER, 2004). A localização do endotélio é estratégica, uma vez que atua como um sensor de alterações hemodinâmicas além de transmitir sinais que recebe de células e da matriz extracelular (CARVALHO et al, 2001; GALLEY; WEBSTER, 2004). O endotélio, em especial, desempenha papel importante na manutenção do tônus vascular (GALLEY; WEBSTER, 2004). Para manter a homeostase vascular, o endotélio sintetiza e libera substâncias vasoativas em respostas a estímulos humorais, neurais e mecânicos. Estas substâncias são classificadas como Fatores Relaxantes Derivados do Endotélio (FRDE) e Fatores Constritores Derivados do Endotélio (FCDE). Os principais FRDE são: óxido nítrico (NO), prostaciclinas (PGI2) e o fator hiperpolarizante derivado do endotélio. Os principais FCDE são: prostaglandina H2 (PGH2), o tromboxano (TXA2), a angiotensina II (Ang II), a endotelina-1 (ET-1) e os ânions superóxido ou espécies reativas de oxigênio (ROS) (FURCHGOTT et al, 1984; FURCHGOTT; VANHOUTTE, 1989; BAUER; SOTNÍKOVÁ, 2010). O NO é o principal FRDE, sua descoberta datada por volta de 1980, quando Furchgott e Zawadzki realizaram um experimento com aortas de coelho in vitro. Estes pesquisadores perceberam que a Acetilcolina (ACh) promovia um efeito vasorelaxante quando o endotélio estava intacto e um efeito vasocontrátil quando o endotélio era removido. Neste período, estes autores, confirmaram que o endotélio possivelmente liberava alguma substância com propriedades vasorelaxantes (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980)..

(19) 18. Tanto as substâncias vasoativas (bradicinina, substância P, insulina, Acetilcolina) como o mecanismo de shear stress (estresse de cisalhamento) promovem vasodilatação através do seu efeito no endotélio (VINCENT; MONTAGNANI; QUON, 2003; LEVINE; PUNIHAOLE; LEVINE, 2012). A acetilcolina (ACh) e a Insulina (INS), são exemplos de substâncias que promovem vasodilatação endotélio-dependente (TADDEI et al, 1995; ZECCHIN et al, 2007). Essas substâncias promovem aumento na síntese do NO, que pode acontecer de maneira dependente e independente do aumento nas concentrações de cálcio (MULSCH; BASSENGE; BUSSE, 1989). Foi descrito por diversos autores que o endotélio vascular possui receptores transmembrana acoplados a proteína G sensíveis à ACh que quando interagem com este neurotransmissor, ativam a fosfolipase C, resultando na síntese de diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP3). Como consequência, a [Ca2+]i é aumentada, favorecendo a ligação Ca2+calmodulina, estes eventos cursam com a ativação da eNOS e aumento da síntese de NO. Sendo a eNOS desta forma ativada por uma via dependente do aumento da [Ca2+]i. (figura 1A) (CARVALHO et al, 2001; GALLEY; WEBSTER, 2003; CARVALHO et al, 2005).. Figura 1. Diferentes vias de sinalização do relaxamento vascular, a partir do qual um estímulo/substância promove o aumento da produção de NO, por vias de ativação dependente e independente do aumento da [Ca2+]i. (Fonte: RATTMANN, 2009).

(20) 19. 2.3. Ações vasculares da insulina A vasodilatação e consequente aumento do fluxo sanguíneo também são promovidos pela ação da insulina, que ao interagir com seu receptor, localizado no endotélio vascular, promove o aumento da síntese de NO (MUNIYAPPA; QUON, 2007). De forma resumida, a insulina após a interação com o seu receptor (IR), é capaz de promover a transfosforilação dos substratos do receptor de insulina (IRS-1 e IRS-2). Estas moléculas, por sua vez, ativam a PI3K, molécula envolvida na fosforilação e ativação da proteína dependente de fosfatidilinositol-3-quinase (PDK-1) através do aumento da fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3). A PDK-1, por sua vez, promove o aumento do grau de fosforilação e atividade Akt, resultando na fosforilação dos resíduos de serina1177 da eNOS e aumento da síntese de NO independente do aumento da [Ca2+]i (figura 1B) (DUDZINSKI; MICHEL, 2007; MUNIYAPPA et al, 2007; MUNIYAPPA; QUON, 2007; SALT, 2013). Após a síntese do NO, esta molécula difunde-se rapidamente da célula endotelial para as células do músculo liso vascular. No musculo liso, o NO interage com o grupamento heme da guanilato ciclase solúvel (GCs), como consequência, estimula a atividade catalítica da GCs, resultando na formação de monofosfato de guanosina cíclico (GMPc). O aumento do GMPc diminui as [Ca2+]i ocasionando o relaxamento (CARVALHO et al, 2001; SILVA; ZANESCO, 2010). Além do efeito vasorelaxante promovido pelo aumento na liberação do NO, a insulina também promove aumento da liberação da endotelina-1 (ET-1) pelo endotélio. A ET-1 é um vasoconstritor secretado pelas células endoteliais apartir da via de sinalização IR/MAPK/ET-1, que se opõe a ação vasodilatadora do NO (MUNIYAPPA; QUON, 2007). Dados da literatura tem demonstrado que o exercício físico aumenta a liberação de ET-1, sendo esta responsável tanto pela regulação do tônus vascular durante o exercício quanto pela redistribuição do fluxo sanguíneo nos tecidos. Durante o exercício físico há um aumento da vasoconstricção nos órgãos não envolvidos no exercício e uma vasodilatação na musculatura exercitada, aumentando a redistrinuição do fluxo sanguíneo e a nutrição desta musculatura (MAEDA et al, 1994; 2002). De uma forma geral, a manutenção do tônus vascular promovido pela insulina, envolve a modulação entre a produção de substâncias vasodilatadores e vasoconstritores. Todavia, em condições que existam uma diminuição da ação e/ou secreção da insulina, a via IR/PI3K/eNOS ativada por este hormônio são prejudicadas, enquanto que as vias dependentes da MAPK estão intactas (figura 2) (MATHER; ANDERSON; VERMA,.

(21) 20. 2001; MUNIYAPPA et al, 2007; MUNIYAPPA; QUON, 2007). Podendo ocasionar alterações vasculares importantes, em decorrentes deste desequilíbrio (figura 2).. Figura 2. Balanço entre a ação da insulina sobre a via da MAPK e via da PI3K. (Fonte: MUNIYAPPA et al, 2007).. A resistência à ação da insulina é uma alteração metabólica caracterizada pela diminuição da ação e/ou secreção deste hormônio que acarretam efeitos deletérios ao organismo (CERSOSIMO; DEFRONZO, 2006). Leitos vasculares como aortas isoladas de ratos obesos, apresentam uma reduzida ativação das vias de sinalização desencadeadas pela acetilcolina e pela insulina, desta forma, comprometendo os relaxamentos indizidos por estas duas substâncias (ZECCHIN et al, 2007). Além destas evidências, uma possível hiperativação da via IR/MAPK/ET1 neste mesmo modelo experimental não pode ser descartada (MUNIYAPPA et al, 2007; ZECCHIN et al, 2007). Todavia, o exercício aeróbio parece exercer um importante papel na atenuação destes prejuízos vascular provocados por algumas patologias, estes efeitos se devem em parte ao shear stress, que resulta no aumento da fosforilação da eNOS em Serina1177 pela via Akt/eNOS, contribuindo para uma maior biodisponibilidade de NO, que por sua vez, promovem um aumento da resposta vasorelaxante (HAMBRECHT et al, 2003; MUNIYAPPA et al, 2007). Alguns estudos têm demonstrado que a insulina promove relaxamento não apenas pelo aumento na produção de NO, mas que outros fatores estariam envolvidos, promovendo hiperpolarização (TACK et al, 1996; CLELAND et al, 1998; IIDA et al, 2001). Tanto a Na+/K+-ATPase quantos os canais para K+ estão envolvidos neste efeito,.

(22) 21. visto que ambos são ativados pela insulina e promovem a hiperpolarização da membrana, através da redução do [Ca2+]i (TADDEI et al, 1995; TACK et al, 1996; CLELAND et al, 1998; YASUI et al, 2008). Nas células endoteliais a Na+/K+-ATPase assim como os canais para K+ são ativados pelo NO (TACK et al, 1996;. FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2000; CHEN;. CHEN; WU, 2005; YASUI et al, 2008). O NO promove aumento da concentração intracelular de GMPc, resultando na hiperpolarização da membrana da célula através da ativação de canais K+ e da atividade da Na+/K+-ATPase (CHEN; CHEN; WU, 2005; YASUI et al, 2008). A atividade da Na+/K+-ATPase também é controlada pela via de sinalização intracelular da insulina. Com isso, o aumento da atividade da Na+/K+-ATPase estaria relacionada a via IR/PI3K/eNOS, e a redução da sua atividade com a via MAPK/ET-1. Demonstrando assim o papel cardioprotetor da Na+/K+-ATPase (SWEENEY; KLIP, 1998).. 2.4. Exercício resistido e endotélio vascular Estudos têm demonstrado que o exercício físico, quando bem orientado, é capaz de promover ajustes benéficos na função vascular independentes de modificações em fatores de riscos cardiovasculares (GREEN et al, 2003, 2009). Isto acontece porque o exercício físico induz um aumento substancial no fluxo de sangue para suprir o acréscimo da demanda metabólica. Essa ampliação do fluxo sanguíneo exerce efeito direto sobre a vasculatura, aumentando o shear stress e consequentemente à produção de NO vascular (SILVA; ZANESCO, 2010; JENKINS et al, 2012). O shear stress é a força exercida pelo sangue cujo sentido é paralelo ao eixo longitudinal dos vasos sanguíneos, e funciona como um poderoso estímulo para a geração do agente vasodilatador NO no sistema vascular (ZANESCO; ANTUNES, 2007; JENKINS et al, 2012). A prática de EF regular faz com que estas modificações constantes promovam alterações hemodinâmicas (GREEN et al, 2003). O mecanismo pelo qual o shear stress promove aumento na produção de NO, envolve. a. ativação. de. diferentes. proteínas. de. membrana. denominadas. mecanorreceptores (SILVA; ZANESCO, 2010). Os mecanorreceptores podem ser as proteínas Gs, aos canais iônicos, a caveolina e as integrinas, que captam as alterações de.

(23) 22. tensão sobre a parede celular e convertem os estímulos mecânicos em estímulos químicos que culminam na ativação da eNOS (ZHANG et al, 2009; SILVA;ZANESCO, 2010). As vias envolvidas nesse processo estão relacionadas à ativação da PKC, da cSrc e da PI3K/Akt, resultando na fosforilação e ativação da eNOS (ZHANG et al, 2009; PADILLA et al, 2011). A produção de NO induzida pelo shear stress ocorre independente do aumento da [Ca2+]i pois a proteína Akt reduz a sensibilidade da eNOS a esse íon (SILVA; ZANESCO, 2010; JENKINS et al, 2012). Assim, tanto a insulina, na condição de repouso, quanto o shear stress, durante a realização do exercício aeróbio, promovem vasodilatação pela via Akt/eNOS (PADILLA et al, 2011). Durante uma sessão de ER há aumento do débito cardíaco e da redistribuição de sangue para os músculos exercitados (BRUM et al, 2004). O aumento do fluxo sanguíneo induzido pelo ER promove um aumento do shear stress que resulta no aumento da produção de NO (ZHANG et al, 2009; SILVA;ZANESCO, 2010; PADILLA et al, 2011). Desta forma, estudos tem afirmado que o ER é capaz de promover ajustes que podem melhorar a função vascular (RAKOBOWCHUK et al, 2005; BARAUNA et al, 2007; 2005; GÜZEL; HAZAR; ERBAS, 2007). Entretanto, os mecanismos responsáveis por estes benefícios ainda são controversos..

(24) 23. 3. OBJETIVOS. - Avaliar os efeitos agudos de uma sessão de exercício resistido nas ações vasculares da insulina em artéria mesentérica de ratos..

(25) 24. 4. MATERIAL E MÉTODOS. 4.1 Animais Foram utilizados 45 ratos Wistar (Rattus norvegicus) adultos jovens, com idade de 3 meses, pesando entre 250 e 300g, provenientes do Biotério Central da UFS. Os animais foram acomodados em número de 5 animais por caixa retangular grande de polipropileno, mantidos sob condições controladas de temperatura (22 ± 1ºC) e ciclo claro-escuro de 12 horas. Os animais tinham livre acesso a água e ração específica para roedores, Labina (Purina®). Todos os procedimentos descritos no presente trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Sergipe, Brasil (protocolo 80/10). Os animais foram divididos em 3 grupos: 1) Controle (CT, n = 20) – composto por animais saudáveis; 2) Eletroestimulado (EE, n = 5) – composto por animais saudáveis que foram eletricamente estimulados sem executar o exercício; 3) Exercício resistido (ER, n = 20) – composto por animais saudáveis que foram submetidos a uma única sessão de exercício resistido através de estímulos elétricos.. 4.2 Protocolo de exercício resistido agudo O exercício resistido foi realizado em aparelho de agachamento segundo modelo de Tamaki et al., 1992. Os animais do grupo ER, após 3 dias de habituação, foram exercitados através de 15 séries de 10 repetições, com intervalos de recuperação de 3 min, e intensidade de 70% da carga estabelecida através do teste de uma repetição máxima (1RM) (FLECK & KRAMER, 2003; ACSM 2009) realizado 48 antes da sessão de exercício (figura 3). Os animais do grupo EE foram submetidos aos mesmos procedimentos do protocolo de treinamento que os animais do grupo ER, mas sem a realização do movimento de extensão e flexão das patas, visto que estes permaneciam suspensos na posição de repouso..

(26) 25. Figura 3. Sequência de atividades do protocolo de exercício resistido.. Os parâmetros de estimulação elétrica foram realizados conforme descrito em Barauna et al., 2005. Os animais foram estimulados a executar as séries através da aplicação de estímulos elétricos (20 V, 0.3 s de duração, 3 s de intervalo) por eletrodos (ValuTrode, Modelo CF3200, Axelgaard, Fallbrook, CA, EUA) fixados na cauda e conectados a um eletroestimulador (BIOSET, Physiotonus Four, Modelo 3050, Rio Claro, SP, Brasil).. 4.3 Avaliação do relaxamento induzido pela insulina O relaxamento dependente de endotélio foi avaliado utilizando anéis de artéria mesentérica superior de rato preparado conforme descrito em Araújo et al., 2013. Imediatamente após a sessão de exercício os animais foram sacrifícados, anéis do primeiro segmento da artéria mesentérica superior (1 - 2 mm) foram obtidos livres de tecido conjuntivo e adiposo, e foram mantidos em cubas contendo 10 mL de solução de Tyrode (concentração em mM: NaCl 158.3, KCl 4.0, CaCl2 2.0, NaHCO3 10.0, C6H12O6 5.6, MgCl2 1.05 and NaH2PO4 0.42), a 37º C e gaseificada com uma mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2). Os anéis foram suspensos por linhas de algodão fixadas a um transdutor de força (Letíca, Modelo TRI210, Espanha). As tensões isométricas foram registradas por meio de um sistema de aquisição (BD-01, AVS, SP, Brasil). Cada anel foi submetido a uma tensão constante de 0,75 g por um período de no mínimo 60 minutos de estabilização. A funcionalidade do endotélio foi verificada pela. habilidade medida em percentagem (%), de 1 M de ACh em relaxar os anéis pré-. contraídos com 1 M de FEN mais que 75% (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Anéis com percentual de relaxamento inferior a 75% foram descartados. Alterações na reatividade vascular foram avaliadas através da obtenção de curvas concentração-resposta para a Insulina (10-13 - 10-6 M). Posteriormente estas.

(27) 26. mesmas curvas foram obtidas na presença dos seguintes inibidores: LY294002 (inibidor da PI3K - 50 µM), L-NAME (inibidor da NOS - 100 µM), tetraetilamônio (TEA)(inibidor não seletivo dos canais para K+ - 10 µM), BQ123 (antagonista dos receptores ETA - 10 µM) e Ouabaína (inibidor da Na+/K+ ATPase - 100 µM). A atividade funcional da Na+/K+ ATPase foi mensurada indiretamente, utilizando o método descrito por Rossoni et al (2002). Após a estabilização com a solução de Tyrode (4.0 mM de K+), as artérias foram incubadas por 30 minutos com uma solução nutritiva livre de K+. Em seguida os anéis foram pré-contraídos com fenilefrina, e sob o platô da contração foram adicionadas concentrações cumulativas de K+ (1 – 10mM). Estes mesmo experimentos foram realizados após a incubação dos anéis em solução livre de K+ mais ouabaína (100µM).. 4.4 Drogas As drogas utilizadas foram: Fenilefrina (FEN, agonista α1 adrenérgico), NGnitro L-arginina metil éster (L-NAME, inibidor da síntese do óxido nítrico) e tetraetilamônio (TEA, inibidor não seletivo dos canais para K+), BQ123 (antagonista dos receptores ETA) e Ouabaína (inibidor da Na+/K+-ATPase) adquiridas da Sigma (Chemical Co, St Louis, MO, EUA), Insulina Regular Humana Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dinamarca) e LY294002 (inibidor da PI3K) adquirido na Merck (Darmstadt, Alemanha).. 4.5 Análises estatísticas Os valores foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM). O relaxamento induzido pela insulina foi calculado pela análise de regressão não linear para cada curva concentração-resposta. Os resultados foram expressos em área sob a curva (ASC) e variação de área sob a curva (dASC) nas situações controle e experimental. Para avaliar a significância das diferenças entre as médias, foram utilizados os testes t de Student (não-pareado) para dASC, e a análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e os valores de ASC. Os valores foram considerados estatisticamente.

(28) 27. significativos quando p<0,05. Para todos estes procedimentos, foi utilizado o programa estatístico GraphPad Prism versão 3.02 (GraphPad Software, San Diego,CA, E.U.A.)..

(29) 28. 5. RESULTADOS. 5.1 Relaxamentos induzidos pela insulina A insulina foi capaz de induzir relaxamento dependente da concentração em anéis isolados de artéria mesentérica superior com endotélio intacto em todos os grupos (figura 4). Não foi observada diferença entre os relaxamentos à insulina nos grupos CT (Rmax: 7,3 ± 0,4%) e EE (Rmax: 7,8 ± 0,5%). Entretanto, o grupo ER (Rmax: 15,7 ± 0,8%; p<0,001) apresentou um aumento significativo nos relaxamentos comparado aos demais grupos.. % de relaxamento. -10 0 10 ++. 20. ++. +++. +++. CT EE ER. 30 40 13. 12. 11. 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M Figura 4 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do Grupo Controle (CT) Eletroestimulado (EE) e Exercício Resistido (ER). Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos em cada grupo. As análises estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma ou duas vias e pós-teste de Bonferroni. ++p<0,01; +++p<0,001 – CT e EE vs ER..

(30) 29. 5.2 Participação da NOS nos relaxamentos induzidos pela insulina Após a incubação com o inibidor da NOS (L-NAME) os relaxamentos foram reduzidos em ambos os grupos (Rmax: 7,3 ± 0,4% para 2,0 ± 0,3% p<0,001 e ER: Rmax: 15,7 ± 0,8% para -1,2 ± 0,1% p<0,001) (figura 5A). A comparação entre os valores da dASC mostram que os animais do grupo ER apresentaram um aumento de 53% na participação da NOS, quando comparada ao grupo CT (Figura 5B).. T. 20. E AM LN. 10. 0. E. ** ** *** *** *** ***. ER. 0. *** 25. AM. +++ +++ +++ +++ +++ +++. 50. C. % de relaxamento. A -10. 75. LN. dASC (%). B. CT ER CT L-NAME RE L-NAME. 30 40 13. 12. 11. 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M Figura 5 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do L-NAME (100µM) (figura 5A). A figura 5B mostra a variação da área sob a curva (dASC) entre a presença e a ausência do L-NAME. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. **p<0,01 ou ***p<0,001 - CT vs CT L-NAME; ++p<0,001 – ER vs ER L-NAME; dASC: *** p<0,001 – CT L-NAME vs ER L-NAME.. 5.3 Participação dos canais para K+ no relaxamento induzido pela insulina Na presença do inibidor dos canais para K+ o relaxamento foi completamente abolido apenas nos grupo RE (Rmax CT: 7,3 ± 0,4% para 7,6 ± 0,5% e ER: 15,7 ± 0,8%.

(31) 30. para -0,2 ± 0,6%; p<0,001) (figura 6A). A figura 6B evidência essa aumento na participação do K+ nos animais ER em 97% em comparação com os animais do grupo CT.. *** 0 T. TE A. 0. 25. 10 20. B. CT ER CT TEA ER TEA. 30 40 13. 12. 11. TE A. *** *** *** ***. ***. 50. ER. -10. 75. C. % de relaxamento. A. dASC (%). B. 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M. Figura 6 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do TEA (10 µM) (figura 6A). A figura 6B mostra a variação da área sobre a curva (dASC) entre a presença e a ausência dos L-NAME+TEA. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. ***p<0,001 - CT vs CT TEA +++p<0,001 – ER vs ER TEA; dASC: ***p<0,001 – CT TEA vs ER TEA.. 5.4 Participação dos canais para K + e do NOS no relaxamento induzido pela insulina. Na presença do L-NAME+TEA (inibidor não seletivo para os canais para K+), foi observado redução dos relaxamentos em ambos os grupos, entretanto o grupo ER, similarmente aos experimentos na presença do LY294002, apresentou reversão da curva (Rmax CT: 7,3 ± 0,4% para 1,3 ± 0,6% p<0,001 e ER: 15,7 ± 0,8% para -6,1 ± 0,5% p<0,001) (figura 7A). Entretanto, a dASC evidenciou que o exercício resistido.

(32) 31. aumentou em 53% a participação dos canais para K+ nestes relaxamentos, quando comparado com a resposta observada no grupo CT (p<0,001; figura 7B).. E+ TE A. TE A. N AM L-. *** *** *** *** ***. ER. *. 0. AM E+. 0. ** 25. LN. +. +++ +++ +++ +++ +++. 50. C T. % de relaxamento. A -10. dASC (%). B 75. 10 20. CT ER. 30. CT L-NAME+TEA ER L-NAME+TEA. 40 13. 12. 11. 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M Figura 7 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do LNAME+TEA (100µM e 10 µM respectivamente) (figura 7A). A figura 7B mostra a variação da área sobre a curva (dASC) entre a presença e a ausência dos L-NAME+TEA. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de ASC e o teste t de student para diferenças entre a dASC. *p<0,05 ou ***p<0,001 - CT vs CT LNAME+TEA; +p<0,05 ou +++p<0,001 – ER vs ER L-NAME+TEA; dASC: **p<0,01 – CT LNAME+TEA vs ER L-NAME +TEA.. 5.5 Participação da PI3K nos relaxamentos induzidos pela insulina Após a incubação dos anéis com LY294002 (inibidor da PI3K), houve uma inibição do relaxamento á insulina no grupo CT (Rmax: 7,3 ± 0,4% para -0,1 ± 0,3% p<0,001) e no grupo ER (Rmax: 15,7 ± 0,8% para -6,5 ± 0,6% p<0,001) o LY294002 promoveu contração (figura 8A). Os valores da dASC demonstram um aumento de 58% na participação da PI3K nos relaxamentos do grupo ER quando comparado ao CT (Figura 8B, p<0,001)..

(33) 32. ** *** *** ***. T. 10. 0. 40 02. **. LY 29. 0. *** 25. ER. +++ +++. +++ +++ +++. 50. LY 29 40 02. -10. 75. C. % de relaxamento. A. dASC (%). B. 20. CT ER CT LY294002 ER LY294002. 30 40 13. 12. 11. 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M Figura 8 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do LY294002 (50µM) (figura 8A).A figura 8B mostra a variação da área sob a curva (dASC) entre a presença e a ausência do LY294002. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. **p<0,01 ou ***p<0,001 – CT vs CT LY294002; +++p<0,001 – ER vs ER LY294002; dASC: *** p<0,001 - CT LY294002 vs ER LY294002.. 5.6 Participação da ET-1 nos relaxamentos induzidos pela insulina Após a adição de BQ123 (antagonista dos receptores ETA), foi observada uma aplificação do relaxamento apenas no ER (Rmax CT: 7,3 ± 0,4% para 8,3 ± 0,2% e ER: 15,7 ± 0,8% para 20,4 ± 0,6% p<0,001) (figura 8A). A dASC evidenciou 40% de aumento na participação da endotelina no grupo ER, quando comparado com a resposta observada no grupo CT (p<0,05; figura 8B)..

(34) 33. -10 0. 75. 50. *. 25. T. 20. 12 3 BQ. BQ. 10. ER. 12 3. 0. C. % de relaxamento. A. dASC (%). B. CT ER CT BQ123 ER BQ123. 30 40 13. 12. 11. 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M Figura 9 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do BQ123 (10 µM) (figura 9A). A figura 9B mostra a variação da área sobre a curva (dASC) entre a presença e a ausência dos BQ123. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de ASC e o teste t de student para diferenças entre a dASC. dASC: *p<0,01 – CT BQ123 vs ER BQ123.. 5.7 Participação das vias PI3k e dos receptores ETA nos relaxamentos induzidos pela insulina Na presença de LY294002+BQ123 (inibidor da PI3K mais o antagonista dos receptores ETA, simultaneamente) foi observada uma inibição dos relaxamentos em ambos os grupos (Rmax: 7,3 ± 0,4% para 1,8 ± 0,3% p<0,001), já no grupo ER (Rmax: 15,7 ± 0,8% para 2,9 ± 0,4%; p<0,001) (figura 10A). Entretanto o grupo ER apresentou 54% de aumento nos valores de dASC em relação ao grupo CT (figura 10B, p<0,001)..

(35) 34. -10. 75. ***. 50 25. 20 30 40. 12 3+ L. Y2. Y2 94 00 2 BQ ER. 10. 12 3+ L. * *** ***. BQ. 0. +++ +++ +++ +++. 94 00 2. 0. +. C T. % de relaxamento. A. dASC (%). B. CT ER CT LY194002+BQ123 ER LY294002+BQ123 13 12 11 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M Figura 10 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER) na ausência e na presença do LY294002 mais BQ123 (50µM e 10 µM respectivamente) (figura 10A). A figura 10B mostra a variação da área sob a curva (dASC) entre a presença e a ausência do LY294002 mais BQ123. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. *p<0,05 ou ***p<0,001 – CT vc CT LY294002+BQ123; +p<0,05 ou +++p<0,001 – ER vs ER LY294002 +BQ123; dASC: ***p<0,001 – CT LY294002+BQ123 vs ER LY294002+BQ123.. 5.8 Efeito da Na+/K+-ATPase no relaxamento induzido pela insulina Na presença da ouabaína os relaxamentos induzidos pela insulina foram reduzidos apenas no grupo ER (Rmax: 7,3 ± 0,4% para 5,7 ± 0,2%), já no grupo ER (Rmax: 15,7 ± 0,8% para 10,7 ± 0,4%; p<0,001) (figura 11A). Os valores de dASC mostram um aumento de 71% da Na+/K+-ATPase nos relaxamentos do grupo ER quando comparado ao CT (figura 11B, p<0,05). O relaxamento induzidos pelo KCl na presença de uma solução livre de K+ não apresentarou diferenças significativas entre o grupo CT e ER (Rmax CT: 107,5 ± 11,3% e ER: 106,5 ± 68,6%; figura 11C). Após a adição de ouabaína o relaxamento foi reduzido em ambos os grupos (Rmax CT: 79,6 ± 7,2%; p<0,001 e ER: 68,69 ± 7,6%;.

(36) 35. p<0,001; figura 11B). Entretanto na dASC observamos que os animais do grupo ER aumentaram em 36% a atividade funcional da Na+/K+-ATPase, quando comparados ao grupo CT (figura 9D; p<0,001). B dASC (%). A -10. 50 25. 0. * U AB AÍ. ER. T. O. O. 10. N A. U AB AÍ N A. 0. C. % de relaxamento. 75. ++. 20. CT ER CT OUABAÍNA ER OUABAÍNA. 30 40 13. 12. 11. 10. 9. 8. 7. 6. -Log [Insulina] M D. *. *** ***. 300 200 100. +++. 0. 2. 4. 6. AB U O ER. **. CT ER CT OUABAÍNA ER OUABAÍNA. 150. AÍ N. A AÍ AB U T. +++. * 100. A. 0 N. +++. 50. 400. O. 0. d ASC(%). 500. C. % de relaxamento. C. 600. 8. 10. KCl (mM) Figura 11 – Curvas concentração-resposta para insulina (10-13 – 10-6 M; figura 9A) e KCl (1 - 10mM; figura 9B) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de rato com endotélio funcional e pré-.

(37) 36 contraídos com FEN (1µM). Anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistidos (ER) na ausência e na presença de Ouabaína (100µM). As figuras 9B e 9D mostram a variação da área sob a curva (dASC) entre a presença e a ausência da Ouabaína. Os dados representam a média ± EPM para 8 – 10 experimentos para cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni para as diferenças entre as concentrações e valores de Rmax e o teste t de student para diferenças entre a dASC. **p<0,01 e ***p<0,001 - CT vs CT OUABAÍNA; ++p<0,01 ou +++ p<0,001 – ER vs ER OUABAÍNA; dASC: **p<0,01 – CT OUABAÍNA vs ER OUABAÍNA. ***p<0,001 – CT vs CT OUABAÍNA.. 5.9 Resposta máxima do relaxamento na presença e ausência dos inibidores Como observado na tabela 1, as Rmax para insulina no grupo CT não foi reduzida na presença dos inibidores dos receptores ETA (BQ123), dos canais para K+ e da Na+/K+-ATPase, entretanto os demais inibidores obtiveram respostas similares entre eles. No grupo ER as Rmax foram reduzidas na presença de todos os inibidores. Interessantemente, as Rmax obtidas das curvas com LY294002 e L-NAME+TEA não foram significativamente diferente entre si. Tabela 1 Valores de Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para insulina antes e após o pré-tratamento com diferentes inibidores. CT. ER. CONTROLE. 7,34 ± 0,5%a. 15,74 ± 0,8%c. L-NAME. 2,03 ± 0,4%b. -1,26 ± 0,2%e. TEA. 7,62 ± 0,5%a. -0,23 ± 0,6e. L-NAME+TEA. 1,36 ± 0,7%b. -6,16 ± 0,5%d. LY294002. -0,12 ± 0,4%b. -6,56 ± 0,6%d. BQ123. 8,32 ± 0,2%a. 20,40 ± 0,6%g. LY294002+BQ123. 1,81 ± 0,3%b. 2,94 ± 0,4%b. OUABAÍNA. 5,75 ± 0,2%a. 10,74 ± 0,4%h. Resposta máxima (Rmax) dos relaxamentos promovidos por insulina, em anéis obtidos de animais do grupo controle (CT) e grupo exercício resistido (ER). Na presença e ausência do LY294002,.

(38) 37 LY294002+BQ123, L-NAME, L-NAME+TEA, Ouabaína. Os dados representam a média ± E.P.M. para 8 – 10 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de uma via e pós-teste de Bonferroni. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os diferentes grupos. (p<0,005)..