UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS NF-κB E VEGF165 NO LÍQUEN PLANO ORAL
NELMARA SOUSA E SILVA
NATAL- RN 2019
EXPRESSÃO IMUNO- HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS NF-κB E VEGF165 NO LÍQUEN PLANO ORAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa
NATAL- RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos Departamento de Odontologia
Silva, Nelmara Sousa e.
Expressão Imuno-histoquímica das proteínas NF-kB e VEGF165 no líquen plano oral / Nelmara Sousa e Silva. - Natal, 2019. 49 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa.
Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Natal, 2019.
1. Líquen Plano Oral - Dissertação. 2. NF-kappa B - Dissertação. 3. VEGF1 - Dissertação. I. Costa, Antônio de Lisboa Lopes. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D65
Quero agradecer primeiramente a Deus, que é e sempre será minha fonte de tudo: de fé, sabedoria, força, e todas as bênçãos que recebo. É nas mãos dele que entrego minha vida todos os dias ao despertar e é para o Senhor que dedico todas as minhas conquistas, portanto, do fundo do meu coração, muito obrigada meu Deus.
Aos meus pais: Rivaildo da Silva e Cleonice Sousa e Silva, que faltam- me as palavras para descrever o que representam para mim, pois toda minha essência advém deles, tudo que sou se deve ao amor, à dedicação, fé, ética, caráter, bondade, simplicidade e os infinitos ensinamentos que eles me transmitem. Aprendo a cada dia que passa o quanto o amor incondicional deles é alicerce, e também quero agradecer por inúmeras vezes abdicaram de seus sonhos para realizarem os meus e os do meu irmão, com a felicidade estampada no rosto, incentivando-me incansavelmente, mostrando o verdadeiro sentido de ser PAI e de ser MÃE. Obrigada por esse sentimento que cativam em mim e por tanto amor, isso é apenas um pouco de toda alegria que quero proporcioná-los, essa vitória não é só minha, mas nossa! Amo vocês incondicionalmente.
Ao meu irmão: Rivaildo da Silva Filho, pelo simples fato de existir e fazer parte de mim, por ser não só irmão, mas amigo, uma pessoa essencial na minha vida, obrigada por todo amor e carinho que me dedica, essa conquista é sua também!
Aos meus padrinhos: Gilberto Luiz de Sousa e Maria do Socorro Macêdo e Sousa, a Alexandre e Maria do Céu pelo amor e carinho que tem por mim, ao meu primo-irmão Nelson Pereira e sua esposa Islâiny, minha cunhada, por todo amor, incentivo e por sempre acreditar em mim. E agradeço a toda minha família por ser sempre meu maior tesouro e fortaleza.
Agradeço imensamente ao meu orientador enviado por Deus: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa, sem dúvida Deus coloca as pessoas certas em nosso convívio, assim foi com o senhor, sua paciência, humildade, compreensão para com minha situação durante a Pós-Graduação foi crucial para que eu chegasse até onde estou hoje. O senhor é exatamente a resposta
daquela pergunta: Você quer ser igual a quem quando crescer na carreira? Enfim, muito obrigada por tudo, serei eternamente grata, e a maior lição que levo do senhor é como realmente ser PROFESSOR, no real sentido da palavra, de ensinar e aprender, direcionar, mas também compreender.
As ilustres professoras Ana Myrian e Jamile, que compuseram essa banca pela presença e disponibilidade em colaborar com suas ótimas sugestões para abrilhantar a pesquisa e com certeza servirão de exemplos para a minha vida acadêmica.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral: Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas, Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Prof. Dr. Pedro Paulo de Andrade Santos, Profa. Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, e Profa. Dra. Patrícia Teixeira, obrigada por todos os ensinamentos. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, Gracinha, Lourdinha, Idelzuite, Sandrinha, Ricardo, Francine e Hévio pela paciência e disponibilidade em ajudar.
Aos meus guerreiros e colegas de turma (Afonso, Camila, Rani, Patrícia e Rodrigo, não foi nada fácil para nenhum de nós, em meio a inúmeras dificuldades conseguimos construir essa história juntos e ter a certeza de que um sonho quando é sonhado junto, torna-se realidade. Agradeço a Ana Cláudia, Caio e Rodrigo por toda ajuda nessa pesquisa. Agradeço aos demais amigos do programa de patologia como um todo, pela ajuda em todas as horas. Obrigada por tudo!
Aos meus mestres, por terem me passado durante a escola, graduação e pós-graduação, tudo aquilo que foi necessário para minha formação acadêmica e profissional, pois me incentivaram com seu afeto e caráter a seguir com amor à profissão, tendo como principal base, a ética, humanização e a simplicidade.
Agradeço também a minha dupla da universidade pela amizade e companheirismo: Luana Samara Balduino de Sena, pessoa que a vida se encarregou de trazer para UFCG e para o meu convívio. Obrigada pelo carinho de sempre.
Nascimento e sua família, por ter me apoiado nessa caminhada e em todos os momentos, com seu exemplo de dedicação e amor à profissão me incentivou e me deu ainda mais motivos para não desistir. Obrigada pela paciência e amizade. Agradeço também aos colegas de trabalho do município de Parelhas que me incentivaram e acreditaram em mim e também agradeço aos meus pacientes que me ensinam todos os dias que a maior dádiva dessa profissão é ser útil na vida de alguém e ganhar os melhores presentes todos os dias: “os sorrisos” e “muito obrigada”.
Meus agradecimentos a todos os meus amigos de sempre que não vou citar nomes, pois são vários, mais cada um deles sabe o quanto são importantes para mim e se estou realizando esse sonho, devo um pouco a todos, muito obrigada por tanto carinho que recebo.
Muito obrigada especialmente para minhas amigas Bruna Siqueira, Berthiene Medeiros e Thamyres Simões pela amizade e apoio em todos os momentos até aqui. Agradeço também a Hellen Bandeira e família por ter me recebido em Natal e serem sempre uma família que formei a partir do período do mestrado, obrigada por tudo! Agradeço também a Caio César por sempre tirar minhas dúvidas e ser um amigo sempre prestativo. Muito obrigada!
Agradecer em nome de seu Geová (motorista) e Suelen (cobradora), aos funcionários da empresa de transporte Opcional 6, a qual se tornou uma das minhas casas nesses últimos dois anos. Obrigada pela atenção e responsabilidade durante as viagens!
RESUMO
O líquen plano oral (LPO) é uma doença inflamatória crônica relativamente comum cuja etiopatogênese ainda não é totalmente elucidada. Clinicamente o LPO é classificado em seis padrões bem identificados: placa, reticular, bolhoso, atrófico, papular e erosivo. O objetivo dessa pesquisa foi comparar a imunoexpressão do fator nuclear Kappa (NF-κB) e do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF165) no LPO. Esta pesquisa consistiu em um estudo transversal retrospectivo de caráter quantitativo e comparativo da expressão imuno-histoquímica da expressão do NF-κB e descritiva de VEGF165 em espécimes de líquen plano oral reticular (30 casos) e erosivo (10 casos) e ainda 15 casos de hiperplasia fibrosa inflamatória (Controle). Em seguida foi realizada a análise imuno-histoquímica para investigar diferenças na expressão do NF-κB (quantitativo de núcleos positivos) em relação ao número de células com núcleos negativos em regiões particulares do espécime, sendo utilizada a metodologia adaptada de Rich et al. (2018). Na análise estatística foram utilizados os testes (teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, ANOVA one-way e o com correções de Bonferroni, com nível de significância de 5% (p < 0,05). Foi observado que para todos os casos de LPO presentes nesse estudo, houve marcação do VEGF165, tanto em tecido epitelial como nas células do infiltrado inflamatório e vasos sanguíneos. Nos casos de HFI, essa marcação teve menor intensidade quando comparada com a das lesões de LPO. Para o NF-κB não foi encontrada diferença estatisticamente significativa no revestimento epitelial em relação a hiperplasia fibrosa inflamatória (controle), já no tecido conjuntivo (infiltrado inflamatório superficial e profundo) a imunoexpressão dessa proteína foi inferior nos casos de LPO em relação a hiperplasia fibrosa inflamatória. Pode-se concluir que a resposta inflamatória no LPO seria coadjuvante na etiopatogenia, e não seria o fator isolado responsável pelo desenvolvimento e perpetuação do LPO, podendo ser crucial a presença de alterações epigenéticas no sistema imunológico para desencadear a doença.
The oral Lichen Planus (LPO) is a relatively common chronic inflammatory disease whose etiopathogenesis is still not fully understood. Clinically the LPO is classified into six well identified standards: plate, Bullous, reticular, papular and atrophic erosive. The objective of this research was to compare the expression of nuclear factor Kappa (NF-κB) and vascular endothelial growth factor (VEGF165) in the LPO. This research consisted of a retrospective cross-sectional study of quantitative character and comparative immunohistochemical expression of expression of NF-κB and descriptive of VEGF165 in specimens of oral Lichen Planus Reticularis (30 cases) and erosion (10 cases) and 15 cases of inflammatory fibrous hyperplasia (control). Then analysis Immunohistochemistry to investigate differences in the expression of NF-κB (number of cores positive) in relation to the number of cells with nuclei in particular regions of the specimen negative, being used the methodology adapted from Rich et al. (2018). In the statistical analysis we used the tests (non-parametric test of Kruskal-Wallis one-way ANOVA with Bonferroni corrections and, with a significance level of 5% (p < 0.05). It was observed that for every case of LPO present in this study, there were marking the VEGF165, both in epithelial tissue as in inflammatory infiltrate cells and blood vessels. In the case of HFI, this markup had lower intensity when compared to that of LPO. For the NF-κB no statistically significant difference was found in the epithelial lining against inflammatory fibrous hyperplasia (control), already in the connective tissue (superficial and deep inflammatory infiltrate) expression in this protein was lower than in the case of LPO about inflammatory fibrous hyperplasia. It can be concluded that the inflammatory response in the LPO would be in a supporting role in pathogenesis, and it would not be the isolated factor responsible for the development and perpetuation of the LPO, and may be crucial to presence of epigenetic changes in the immune system to trigger the disease.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 : Fotomicrografias LPO Reticular. A) Imunoexpressão do anticorpo NF-κB (LSAB,100X)(PPGPO) ,B)Aumento de 400x(PPGPO) ... PÁG. 25
Figura 2 : Fotomicrografias de HFI ( Controle positivo). A) Imunoexpressão do anticorpo NF-κB (LSAB, 100X), B) Imunoexpressão do anticorpo NF-κB (LSAB, 200X), (PPGPO)... PÁG. 25
Figura 3: Fotomicrografias LPO Reticular. A ) Imunoexpressão do anticorpo anti-VEGF165 (LSAB, 100X) (PPGPO), B) Aumento de 400x (PPGPO)... PÁG. 27
Figura 4: Fotomicrografias HFI (controle positivo). Imunoexpressão do
anticorpo anti-VEGF165 (LSAB, 100X)
Quadro 1. Especificidade, diluição e tratamento prévio dos anticorpos a serem
utilizados de acordo com as recomendações dos
fabricantes... PÁG. 20
Tabela 1. Gênero, idade e localizaçã anatômica segundo a lesão apresentada. ... PÁG. 23
Tabela 2. Parâmetros utilizados no teste de Kruskal-Wallis (KW) para a análise dos percentuais de imunopositividade nuclear do NF-κB no revestimento epitelial de lesões de líquen plano reticular, líquen plano erosivo e hiperplasia fibrosa inflamatória. Natal, RN /2019... PÁG. 24
Tabela 3. Parâmetros utilizados no teste ANOVA one-way, seguido pelo teste post-hoc de Bonferroni, para a análise dos percentuais de imunopositividade nuclear do NF-κB no infiltrado inflamatório superficial de lesões de líquen plano reticular, líquen plano erosivo e hiperplasia fibrosa inflamatória. Natal, RN/ 2019... PÁG. 25
Tabela 4. Parâmetros utilizados no teste ANOVA one-way, seguido pelo teste post-hoc de Bonferroni, para a análise dos percentuais de imunopositividade nuclear do NF-κB no infiltrado inflamatório profundo de lesões de líquen plano reticular, líquen plano erosivo e hiperplasia fibrosa inflamatória. Natal, RN – 2019... PÁG. 26
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
HFI- Hiperplasia Fibrosa inflamatória
ImageJ- Imagem J ( Do inglês: Image Processing and Analysis in Java)
LP- Líquen Plano
LPO - Líquen Plano Oral
NF-κB – Fator Nuclear Kappa B (Do inglês: factor nuclear kappa)
VEGF165 – Fator de crescimento do endotélio vascular (Do inglês: Vascular endothelial growth factor)
1 INTRODUÇÃO ... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 12
2.1 Líquen Plano Oral... 12
2.2 NF-κB... 13 2.3 VEGF165... 14 3 OBJETIVOS... 16 3.1 OBJETIVO GERAL ... 16 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 16 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 17 4.1 Considerações Éticas... 17 4.2 Caracterização do Estudo ... 17 4.3 População ... 17 4.4 Amostra ... 17
4.5 Critérios para Seleção da Amostra ... 18
4.5.1 Critérios de Inclusão ... 18
4.5.2 Critérios de Exclusão ... 18
4.6 Estudo Imuno-histoquímico ... ... 18
4.6.1 Análise do Perfil Imuno-histoquímico ... 20
4.6.2 Análise Estatística ... 21 5 5.1 5.2 6 7 RESULTADOS ... RESULTADOS CLÍNICOS... RESULTADOS IMUNO-HÍSTOQUÍMICOS... DISCUSSÃO... CONCLUSÕES ... 23 23 24 28 31 REFERÊNCIAS ... 32 ANEXO I ... ANEXO II... 36 40
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1 INTRODUÇÃO
O líquen plano é uma doença dermatológica crônica relativamente comum, que frequentemente acomete a pele e por vezes a mucosa oral, quando isto acontece, é denominada de líquen plano oral - LPO (FIRTH et al., 2015). Clinicamente, o LPO é classificado em seis padrões bem identificados: placa, reticular, bolhoso, atrófico, papular e erosivo (SILVERMAN, S., Jr., and BAHL, S., 1997, CHENG, et al., 2016). Sua etioloigia ainda é desconhecida, embora concorda-se ser uma resposta imunomediada (SINON et al., 2016). Essa doença caracteriza-se por uma resposta imune mediada por células- T contra células epiteliais e subepiteliais através da formação de um infiltrado inflamatório em banda de linfócitos T (BACCAGLINI et al., 2013, ROOPASHREE et al., 2010 E FARHJ; DUPIN, 2010).
A angiogênese é o processo que induz à proliferação de novos vasos sanguíneos com origem na vasculatura existente. Este processo desempenha um papel essencial em mecanismos fisiológicos, bem como nos processos patológicos. Os fatores de crescimento endoteliais vasculares (VEGF), particularmente VEGFA, são moduladores importantes da angiogênese e são expressos em vários tipos de células, incluindo células endoteliais, fibroblastos e células inflamatórias. Esses fatores podem agir em sinergismo com outros fatores de crescimento (AL- HASSINY et al., 2018).
Assim mais estudos que verifiquem a associação de cada proteína (NF-κB e VEGF165) com a patogenia das doenças inflamatórias e autoimunes são de extrema importância. Até agora não existem pesquisas publicadas na literatura onde relaciona essas duas proteínas conjuntas e suas funções na patogênese e no desenvolvimento do LPO. Por isso esse estudo busca identificar através de análise imuno-histoquímica a expressão dessas proteínas nas lesões de LPO, avaliando também o comportamento dessas proteínas no tipo reticular e erosivo dessa patologia, almejando colaborar para elucidação da patogênese dessa lesão potencialmente maligna e assim aperfeiçoar as técnicas terapêuticas baseadas no fator etiológico do LPO.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LÍQUEN PLANO ORAL (LPO)
O líquen plano é uma doença dermatológica crônica relativamente comum, que afeta pele, genitália e a mucosa oral (EINSEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al 2007;ANURHADA et al., 2008). O nome peculiar dessa condição foi dado pelo médico britânico Erasmus Wilson, que foi o primeiro a descrevê-la, em 1869 (NEVILLE et al., 2016).
Quando essa lesão acomete a mucosa oral é chamada de Líquen Plano Oral (LPO). , sendo raro na infância (OLSON, et al.,2016). O grau de envolvimento com DO LPO é variável, pacientes com idade entre 30 e 60 anos apresentam maior risco de desenvolver o LPO, com uma forte predileção para o sexo feminino (EBRAHIMI et al., 2011; USATINE et al., 2011). A prevalência mundial do LPO é estimada em cerca de 2%. CHENG et al., 2016)
Clinicamente é classificado em dois tipos: reticular e erosivo O líquen plano reticular é assim chamado por causa de seu padrão específico de linhas brancas entrelaçadas (também denominado como estrias de Wickham), porém, as lesões brancas podem, em alguns casos, caracterizar-se como pápulas (NEVILLE et al., 2016).
O líquen plano erosivo, apesar de não ser tão frequente quanto à forma reticular, é mais considerável para o paciente, pois as lesões são sintomáticas em sua maioria. Clinicamente, identifica-se áreas eritematosas, atróficas, com diversos graus de ulceração central. A periferia das regiões atróficas geralmente é circundada por finas estrias brancas irradiadas. Diferente das lesões cutâneas, as lesões orais são mais resistentes ao tratamento e, com isso, são mais difíceis em se obter a redução da sintomatologia (CASTRO, et al., 2018)
Os achados histopatológicos clássicos do líquen plano incluem: liquefação da camada basal, acompanhada por um intenso infiltrado linfocitário disposto em faixa, imediatamente subjacente ao epitélio; presença de numerosos corpúsculos colóides eosinofílicos na interface epitélio/tecido conjuntivo (corpos de Civatte); cristas interpapilares ausentes, hiperplásicas ou, mais frequentemente, em forma de “dentes de serra”; variações da espessura
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da camada espinhosa e graus variáveis de orto ou paraceratose. Comparada com as lesões cutâneas, as lesões em mucosa oral exibem menos frequentemente as projeções epiteliais em forma de “dentes de serra” e com mais frequência apresentam atrofias epiteliais, ceratinócitos em degeneração podem ser vistos em áreas do epitélio e na interface do tecido conjuntivo e têm sido denominados de corpos coloides, ou de Civatte (GOROUHI et al., 2014; CHENG et al., 2016, CASTRO, 2018).
O principal ponto de destruição nas lesões de LPO são as células basais e o desenvolvimento dessas lesões causadas nos ceratinócitos está associado a um processo imune mediado por células, que são: as células de Langerhans, linfócitos T e macrófagos (ANURADHA et al., 2008).
No que diz respeito à atuação das células do sistema imune na patogênese do LPO, a importante participação das células TCD8+ já é bem evidenciada. Essas células promovem a degradação dos ceratinócitos basais epiteliais nessa lesão (SUGERMAN et al., 2002; FAHRI, DUPIN, 2010).
A maioria dos linfócitos subepiteliais e da lâmina própria no LPO, são linfócitos T CD4 +, estas células T CD4+ podem promover a produção de diferentes subtipos de células TCD4+ + Th, dependendo das citocinas que liberam (RICH et al., 2016; PICCINNI et al., 2014). A ativação das diferentes células resultante das T CD4 + Th, podem desempenhar um papel crucial na iniciação e progressão do LPO (VAN DYKE;SERHAN, 2003; ZHANG et al 2014).
2.2 NF-κB
NF-κB é um fator de transcrição primário que é encontrado em praticamente todos os tipos de células e está envolvido na patogênese de muitas doenças autoimunes (BARNES e KARIN, 1997; LI; VERMA, 2002). Outros estudos descobriram que uma correlação positiva entre a ativação de NFKB nos ceratinócitos e a quantidade de recrutamento e ativação de células T citotóxicas (SANTORO et al., 2003).
O NF-κB participa também patogênese do LPO e desempenha um papel chave no controle da rede de genes envolvidos na inflamação na lesão de LPO. NF-κB é um conjunto heterogeneo de dímeros, a forma mais comum que
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consiste em uma subunidade p65 e uma subunidade p50 (ORLANDO e NICOLINI, 2013).
Após a ativação das células por vários tipos de sinalizações, sejam de citocinas inflamatórias, vírus ou cinases originadas de proteína C, o NF-κB é liberado através de complexos inibitórios e transloca-se para o núcleo, onde liga-se ao promotor de diversas regiões de genes, codificando a resposta imune e os eventos pró-inflamatórios. Os mediadores inflamatórios dessa resposta, tais como TNF α, IL-1 β, leucócitos e moléculas de adesão vascular, que estimulam a síntese do óxido nítrico. Por sua vez, alguns destes produtos podem ativar NF κ B e este tipo de feedback de regulação positiva pode exacerbar e perpetuar local em reações inflamatórias (BARNES, 1997; SANTORO et al., 2003).
Estudos recentes apontam a importante função do NF-κB no processo de formação das células T regulatórias, levando assim este fator de transcrição á desempenhar um papel fundamental para a progressão da inflamação (GRINBERG-BLEYER, 2017).
2.3 VEGF165
Acredita-se que o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) atua como principal constituinte regulatório responsável pela proliferação de células endoteliais, envolvidas na patogênese e desenvolvimento do LPO (MONACO et al., 2004; CHRISTOPOULOS et al., 2011).
VEGFR2 é um dos receptores primários através do qual VEGF leva a ativação da sua atividade pró-angiogênica. A expressão aumentada em tecidos de LPO sugere uma resposta angiogênica e demonstra a importância dos receptores do fator de crescimento na patogênese da doença. Além disso, verificou-se a diminuição de expressão de fatores anti-angiogênicos (RICH et al., 2018). O VEGF165 desempenha um papel pró- angiogênese, o que interfere no surgimento da resposta inflamatória como também na sua manutenção.
Entender completamente a angiogênese no LPO e como isso tem influência na sua patogênese, é crucial para obter uma maior compreensão da sua etiologia e seu desenvolvimento, bem como para auxiliar no tratamento da
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doença. Com as evidências de que a angiogênese contribui para a patogênese de diversas condições inflamatórias crónicas mediadas pelo sistema imunológico, incluindo, doença de Crohn, artrite reumatóide e psoríase pode-se perceber que há indícios de que esse processo também colabore para o desenvolvimento do LPO (POUSA, MATE, GISBERT, 2008; HENNO et al., 2009; ELSHABRAWY et al., 2015).
O infiltrado inflamatório tem função importante na angiogênese através da atuação dos macrófagos e outras células que liberam fatores de crescimento pró-angiogênicos, como por exemplo, o VEGF165, que estimula a proliferação e migração de células endoteliais (SCARDINA et al., 2009).
Vários estudos têm indicado que a angiogênese é significantemente aumentada no LPO em comparação com a mucosa oral normal, e em comparação com LPO nos seus tipos erosivo e reticular. Baseado nisso, juntamente com os com a insuficiência dos fármacos imunossupressores convencionais, preferiu-se utilizar o controle da angiogênese no LPO como um possível alvo terapêutico (MITTAL, SHANKARI, PALASKAR, 2009, SCARDINA et al., 2009, MARDANI et al., 2012; MAHMOUD, AFIFI, 2016 a).
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3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar se a imunoexpressão dessas proteínas (NF-κB e VEGF165) está relacionada a patogênese e a perpetuação da resposta inflamatória no LPO;
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar de forma descritiva e comparativa as expressões imuno-hístoquímicas e os papeis desempenhados pelos NF-κB e VEGF165 no LPO.
Comparar quantitativamente a presença de NF-κB e de VEGF165 no LPO;
Estabelecer uma correlação entre a quantidade de NF-κB e de VEGF165 nos diferentes tipos de líquen plano oral (Reticular e erosivo), descrevendo a imunoexpressão para os tipos clínicos da lesão.
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4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Para a realização do estudo, o mesmo foi cadastrado na plataforma Brasil e submetido à análise do seu conteúdo pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sendo aprovado, através do parecer de número: 2.753.728. Segue em anexo, o parecer emitido pelo CEP.
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Esta pesquisa consistiu em uma análise quantitativa e comparativa da expressão imuno-histoquímica da expressão do NF-κB e uma análise descritiva de VEGF165 em espécimes de LPO.
4.3 POPULAÇÃO
Todos os casos registrados e diagnosticados como LPO que tinham os dados necessários para a pesquisa, contidos nos arquivos do serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte / UFRN constituiram a amostra.
4.4 AMOSTRA
A amostra é do tipo não probabilística, por conveniência, constituída por todos os casos de LPO, tanto os dos tipos reticulares (30 casos), como erosivos (10 casos) e ainda os 15 casos de hiperplasia fibrosa inflamatória (Controle). Esses casos foram selecionados de acordo com a quantidade de material arquivado e as condições de armazenamento dos espécimes.
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4.5 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA
4.5.1 Critérios de inclusão:
Todos os casos diagnosticados como LPO cujas peças estiveram armazenadas no serviço de anatomia patológica do programa de pós-graduação em patologia oral do departamento de odontologia;
Foram incluídos na amostra, os casos de lesões constantes no estudo, cujos blocos continham material suficiente e em boas condições de armazenamento.
4.5.2- Critérios de exclusão
Foram excluídos os casos que não apresentaram quantidade suficiente de material para o estudo.
Foram eliminados os casos que não contiveram os dados clínicos para elucidação do diagnóstico de LPO.
4.6 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 3μm de espessura e estendidos em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA). O material foi posteriormente submetido aos anticorpos policlonais NF-κB e VEGF165. O método empregado foi o HI def HRP (Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA). Na realização do controle positivo foram obedecidas as especificações dos fabricantes para cada anticorpo utilizado na pesquisa. O controle negativo consistiu na substituição do anticorpo primário por albumina de soro bovino a 1% (BSA – Bovine Serum Albumin) em solução tampão. A técnica utilizada foi realizada conforme os passos a seguir:
Coloração pelo método imuno-histoquímico:
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1) Em um recipiente, todas as amostras foram imersas em solução preparada contendo Trilogy®, seguindo, então, as amostras teciduais para panela pascal para desparafinização, reidratação e recuperação dos sítios antigênicos (quadro 1);
2) Lavagem do material em água corrente por 3 minutos e duas passagens por água destilada (1 minuto cada);
3) Duas incubações dos cortes, pelo período de 15 minutos, em solução de peróxido de hidrogênio 10 volumes (3%) para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual;
4) Lavagem em água destilada;
5) Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos cada;
6) Incubação com a proteína Background Block (Cell Marque, Rocklin, Califórnia, EUA) por 10 minutos;
7) Lavagem em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos; 8) Incubação dos cortes com anticorpos primários diluídos (Envision Flex Antibody Diluent – DM830). Para ING1, tempo de incubação de 60 minutos; para ING2, tempo de incubação de 18 horas - overnight;
9) Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos cada;
10) Incubação com anticorpo secundário com Sistema Hi Def Detection (Cell Marque; Rocklin, Califórnia, EUA) com aplicação de solução amplificadora por 20 minutos;
11) Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos;
12) Aplicação do polímero HRP do Sistema Hi Def por 20 minutos
13) Duas passagens em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos cada;
14) Aplicação do agente cromógeno DAB (diaminobenzidina; Scytek Laboratories; Logan, Utah, USA), durante 5 minutos à temperatura ambiente;
15) Duas incubações em TRIS-HCl por 5 minutos cada; 16) Aplicação do agente cromógeno DAB durante 5 minutos;
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17) Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos;
18) Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente, durante 5 minutos;
19) Passagens rápidas em água destilada (3 trocas); 20) Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
Quadro 1. Especificidade, diluição e tratamento prévio dos anticorpos a serem utilizados de acordo com as recomendações dos fabricantes.
Clone Especificidade Diluição Fonte Recuperação
antigênica
Incubação
Policlonal NF-κB 1:400 Dako Trilogy em
Pascal
Overnight
Policlonal VEGF165 1:50 R&D Systems Trilogy em Pascal
Overnight
FONTE: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral /UFRN.
4.6.1 Análise do perfil imuno- histoquímico
A análise da expressão imuno-histoquímica do NF-κB (factor nuclear kappa) nos ceratinócitos e infiltrado inflamatório nas células endoteliais das lesões de LPO. Essa verificação da imunorreatividade foi realizada através de uma adaptação da metodologia proposta por AL-HASSINY et al., (2018). Será realizada uma análise do componente epitelial e do tecido conjuntivo das lesões através da microscopia de luz (Olympus CX31), identificando primeiro as áreas de maior imunoexpressão no aumento de 100x.
Após essa identificação, utilizamos nessas áreas o aumento de 400x para a contagem dos ceratinócitos, células inflamatórias (linfócitos) e células endoteliais com a marcação sendo observada da seguinte forma, o epitélio foi dividido em 3 campos de diferentes profundidades e o tecido conjuntivo, dividido em 9 campos (aleatórios) com diferentes profundidades e localizações. Analisamos a presença de imunorreação do NF-κB em ceratinócitos, linfócitos e do VEGF165 nas células endoteliais (contribuindo para o entendimento da patogênese e progressão da lesão estudada.
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Para investigar potenciais diferenças na expressão dos marcador e do
NF-κB (quantitativo de núcleos positivos) em regiões do espécime, foi utilizada a metodologia adaptada de AL-HASSINY, et al., (2018), dividindo o espécime em três seções, como se segue; Zona 1: superficial (definida como a zona de camada basal do epitélio, como observado quando visto a 400x), zona 2: Média (definida como a zona imediatamente abaixo da 'superficial', definido ao visualizar a 400x e zona 3: profunda (definida como a zona abaixo da zona média e separado dela por uma metade de um campo). Nove imagens foram tiradas por cada bloco de tecido; Três da zona 1, três da Zona 2 e três da Zona 3 (AL-HASSINY et al., 2018).
Para a contagem de células, as imagens das lâminas foram digitalizadas por meio do equipamento Scanner Pannoramic MIDI (3DHISTECH®, Hungria, H-1121) e visualizadas no software Pannoramic Viewer 1.15.2 (DHISTECH®, Hungria, H-1121).
Foram descritos qualitativamente também os vasos sanguíneos com imunopositividade para VEGF165 em todos os casos. Em cada caso, foi avaliada a expressão imuno-histoquímica do NF-κB e analisado quantitativamente, nos campos anteriormente descritos. Foram obtidas fotomicrografias dos campos no aumento de 400x conforme as especificações do software e em cada campo foram contabilizadas as células imunopositividade nuclear para NF-κB, independentemente da intensidade de marcação. Em cada campo analisado foi calculado uma média de células epiteliais (ceratinócitos/ linfócitos) com imunopositividade nuclear para o NF-κB. A contagem de células imunopositivas para estes marcadores foi realizada com auxílio do software image J.
4.6.2 Análise estatística
Os resultados obtidos foram registrados em planilhas eletrônicas Excel (Microsoft Office 2016®) e exportados para o programa Statistical Package for Social Sciences (versão 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) e foram submetidos a análises estatísticas descritiva e inferencial. Os dados clínicos foram expressos na forma de frequências absolutas e relativas.
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teste de Kolmogorov-Smirnov, que indicou ausência de distribuição normal para a imunopositividade no epitélio e distribuição normal para a imunopositividade no infiltrado inflamatório. Portanto, a imunoexpressão do NF-κB no epitélio foi comparada entre as lesões de líquen plano reticular, líquen plano erosivo e hiperplasia fibrosa inflamatória por meio do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Por sua vez, visando a comparação entre os grupos de lesões quanto à imunopositividade no infiltrado inflamatório, foi aplicado o teste ANOVA one-way, seguido do teste post-hoc de Bonferroni.
Em todos os testes estatísticos aplicados no presente estudo, foi estabelecido nível de significância de 5% (p < 0,05).
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5 RESULTADOS
5.1 RESULTADOS CLÍNICOS
De acordo com as fichas clínicas de requisições de biópsias arquivadas no Laboratório de Anatomia Patológica do Departamento de Odontologia da UFRN, foram identificadas as características clínicas dos pacientes como idade, gênero, e ainda, informações sobre as características clínicas das lesões como localização e o tipo das mesmas para que os casos de LPO fossem então classificados como LPO Reticular ou LPO Erosivo.
Dentre todos os casos desta pesquisa, 72,5% pertencem ao gênero feminino 27,5 % ao gênero masculino, enquanto a localização mais frequente foi em mucosa jugal, ocorrendo em 52,5% dos casos. A média de idade observada foi 52,95 anos. As frequências para cada lesão estão apresentadas na tabela 1.
FONTE: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral /UFRN.
LPOR: Líquen Plano Oral Reticular; LPOE: Líquen Plano Erosivo TABELA 1: GÊNERO, IDADE E LOCALIZAÇÃ ANATÔMICA SEGUNDO A LESÃO APRESENTADA.
LPOR LPOE TOTAL
GÊNERO Masculino (n /%) 7/23,3 4/40 11/27,5
Feminino (n /%) 23/76,7 6/60 29/72,5
IDADE Idade (anos) 50,36 60,7 52,95 LOCALIZAÇÃO ANATÔMICA Mucosa Jugal Língua Palato duro Lábio Fundo de vestíbulo Região Retromolar 14 11 2 2 0 1 7 1 1 0 1 0 21/52,5 12/ 30 3/ 7,5 2/ 5 1/ 2,5 1/ 2,5
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5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS
5.2.1 NF-κB
A imunoexpressão do NF-κB no revestimento epitelial (Tabela 2), onde foi observado a variação de 10,65% a 52,99% no líquen plano reticular, de 7,91% a 54,40% no líquen plano erosivo e de 17,81% a 38,71% na hiperplasia fibrosa inflamatória. Demonstrando através do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (KW), que não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de lesões, em relação à imunopositividade epitelial do NF-κB (p = 0,963).
Tabela 2. Parâmetros utilizados no teste de Kruskal-Wallis (KW) para a análise dos percentuais de imunopositividade nuclear do NF-κB no revestimento epitelial de lesões de líquen plano reticular, líquen plano erosivo e hiperplasia fibrosa inflamatória. Natal, RN /2019.
Grupo N Mediana Q25 – Q75 Média dos
postos KW p Líquen plano reticular 30 27,85 23,94 – 33,74 28,50 0,075 0,963 Líquen plano erosivo 10 25,78 23,08 – 39,41 27,80
Hiperplasia fibrosa inflamatória 15 27,78 23,38 – 31,10 27,13 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral / UFRN.
A imunopositividade do NF-κB no líquen plano reticular foi inferior à verificada nas hiperplasia fibrosa inflamatória, considerando o infiltrado inflamatório superficial (p < 0,001), como pode ser observado nas figuras 1 e 2. Contudo, as diferenças entre o líquen plano erosivo e os demais grupos de lesões não apresentaram significância estatística (Tabela 3).
Foi encontrada uma diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos de lesões, onde essas variações foram de :17,04% a 64,68% no LPO reticular, 20,35% a 60,74% no LPO erosivo e 35,77% a 60,62% na hiperplasia fibrosa inflamatória (controle positivo).
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Tabela 3. Parâmetros utilizados no teste ANOVA one-way, seguido pelo teste post-hoc de Bonferroni, para a análise dos percentuais de imunopositividade nuclear do NF-κB no infiltrado inflamatório superficial de lesões de líquen plano reticular, líquen plano erosivo e hiperplasia fibrosa inflamatória. Natal, RN/ 2019.
Grupo n Média ± desvio padrão IC (95%) p
Líquen plano reticular 30 32,89 ± 11,68a 28,53 – 37,25 < 0,001
Líquen plano erosivo 10 39,32 ± 14,80a,b 28,73 – 49,91
Hiperplasia fibrosa inflamatória 15 48,04 ± 6,89b 44,22 – 51,16
a,b Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas na comparação
entre os grupos.
Legenda: IC – intervalo de confiança.
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral /UFRN.
A B
Figura 1 : Fotomicrografias LPO Reticular. A) Imunoexpressão do anticorpo NF-κB
(LSAB, 100X) (PPGPO), B) Aumento de 400x ( PPGPO).
A B
Figura 2 : Fotomicrografias de HFI (Controle positivo). A) Imunoexpressão do anticorpo NF-κB (LSAB, 100X), B) Imunoexpressão do anticorpo NF-κB (LSAB, 200X).
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Foi encontrada uma diferença estatisticamente significativa na comparação entre os grupos de lesões em relação em relação à imunopositividade para NF-κB para o infiltrado inflamatório profundo apresentando as variações no Líquen plano reticular -> 19,15% a 60,08% Líquen plano erosivo -> variação de 15,44% a 62,60% e Hiperplasia fibrosa inflamatória -> variação de 28,72% a 67,22%.
No líquen plano reticular essa imunoexpressão foi inferior à verificada nas hiperplasia fibrosa inflamatória utilizando a significância de 5% (p < 0,005), conforme observamos na tabela 4. Contudo, as diferenças entre o líquen plano erosivo e os demais grupos de lesões não apresentaram significância estatística.
Tabela 4. Parâmetros utilizados no teste ANOVA one-way, seguido pelo teste post-hoc de Bonferroni, para a análise dos percentuais de imunopositividade nuclear do NF-κB no infiltrado inflamatório profundo de lesões de líquen plano reticular, líquen plano erosivo e hiperplasia fibrosa inflamatória. Natal, RN – 2019.
a,b Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas na comparação
entre os grupos.
Legenda: IC – intervalo de confiança.
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral / UFRN.
5.2.2 VEGF165
Foi observado que para todos os casos de LPO presentes nesse estudo, houve marcação do VEGF165, tanto em tecido epitelial como também na células do infiltrado inflamatório e vasos sanguíneos, como mostra a Figura 3 e
Grupo n Média ± desvio
padrão IC (95%) P
Líquen plano reticular 30 33,16 ± 11,05a 29,03 – 37,28 0,005 Líquen plano erosivo 10 39,11 ± 15,33a,b 28,15 – 50,08
Hiperplasia fibrosa
inflamatória 15 47,15 ± 10,38
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4. Nos casos de HFI, essa marcação foi com menor intensidade comparada com a das lesões de LPO.
Figura 3: Fotomicrografias LPO Reticular. A ) Imunoexpressão do anticorpo
anti-VEGF165 (LSAB, 100X) (PPGPO), B) Aumento de 400x ( PPGPO).
FONTE: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral /UFRN.
Figura 4: Fotomicrografias HFI (controle positivo). Imunoexpressão do anticorpo
anti-VEGF165 (LSAB, 100X) (PPGPO).
FONTE: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral /UFRN.
No que diz respeito a imunoexpressão nos tipos reticular e erosivo de LPO não houve diferença significativa, foram expressos de maneira semelhante nos vasos sangíneos. Identificando que não apresentou relação entre os tipos de LPO e a formação de vasos sanguíneos marcados por VEGF165.
B A
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6 DISCUSSÃO
O LPO é reconhecido como uma doença inflamatória crónica não infecciosa que acomete a mucosa oral, envolvendo o epitélio escamoso estratificado e a lâmina própria subjacente, e pode apresentar também lesões na pele. As causas que originam e / ou perpetuam o LPO são em maioria, desconhecidas. As teorias prevalecentes giram em torno de desordens mediadas por células T aos antígenos exógenas ou ainda, de uma resposta (imuno-mediada), desregulada à antígenos de ceratinócitos autólogos, porém os que seriam particularmente os gatilhos de iniciação para essa doença ainda são desconhecidos (KURAGO, 2016).
Os resultados clínicos desse estudo concluíram que a idade média dos pacientes foi de 52,5 anos e que a maioria dos pacientes eram do gênero feminino (76%), o que colabora com os resultados de outros estudos (KURAGO, 2016; ALAMIR, et al., 2019), os quais relatam que o LPO é mais frequente no gênero feminino e comum em adultos de meia idade.
O estudo de DU, et al., (2017) identificou que o NF-κB participou da ativação imunológica dos ceratinócitos, apresentando imunoexpressão no revestimento epitelial do LPO, fato que não foi visto no presente estudo, cujos resultados apontaram, que não houve diferença estatisticamente significativa na imunoexpressão do NF-κB no revestimento epitelial dos casos de LPO estudados
Nos estudos de ZHAO, et al.,(2012) e ZHANG, et al., (2015) observaram uma correlação positiva entre a expressão de NF-κB e a ativação em ceratinócitos, sugerindo que o aumento da atividade de NF-κB pode representar a base de manutenção da resposta inflamatória no LPO. Os resultados da presente pesquisa não identificaram diferença estatisticamente significativa na imunoexpressão dessa proteína sobre o revestimento epitelial, o que não corrobora como estudo anterior, sugerindo que as alterações epigenéticas possam ser predominantes, e a etiopatogêse do LPO não dependeria somente de vias de processo inflamatório, a exemplo do fator de transcrição NF-κB.
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células mononucleares que se infiltraram no tecido de lesões de LPO, evidenciando uma translocação nuclear de NF-κB, podendo sugerir que muitos linfócitos pertencentes ao infiltrado inflamatório subepitelial do tecido LPO foram ativados. Esses achados divergem da presente pesquisa, onde a imunoexpressão do NF-κB, tanto em área de infiltrado inflamatório subepitelial (superficial) quanto de infiltrado inflamatório profundo foi inferior a imunoexpressão dos casos controle positivo (Hiperplasia fibrosa inflamatória).
Estudos recentes apontam a importante função do NF-κB no processo de formação das células T regulatórias, levando assim este fator de transcrição a desempenhar um papel fundamental para a progressão da inflamação (GRINBERG-BLEYER, 2017), embora os resultados desse estudo tenham mostrado que houve uma menor imunoexpressão do NF-κB nas lesões de LPO em relação aos casos de HFI (controle positivo).
Essa menor imunoexpressão do NF-κB nas lesões de LPO em relação aos casos de HFI (controle positivo), verificada no presente trabalho pode sugerir que a via do fator de transcrição NF-κB tem participação importante na resposta inflamatória presente nessa patologia, porém não seria um fator causal isolado, sugerindo que a inflamação pode ser uma resultante ou um agravante de alterações epigenéticas que já afetem o sistema imune deste paciente e levem ao desenvolvimento dessa doença. Essas alterações poderiam atuar sobre esses linfócitos TCD4+, os quais tem sua contribuição para a etiopatogênese do LPO já previamente esclarecidas.
O estudo de ZHANG, et al.,(2015) verificou que não há diferenças entre os LPO reticular e LPO erosivo no que diz respeito a imunoexpressão de NF-κB, este resultado foi semelhante ao encontrado nessa pesquisa, onde as diferenças na expressão dessa proteína no líquen plano erosivo e no líquen plano reticular não apresentaram significância estatística.
A angiogênese é o processo que conduz à formação de novos vasos sanguíneos a partir da vasculatura já existente. Este processo tem uma atuação importante em processos fisiológicos, e também nas patologias. As células endoteliais (CE) são estimuladas a germinarem a partir de vasos existentes, através de fatores de crescimento oriundos do tecido a ser vascularizado. Os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF), particularmente VEGFA, são reguladores cruciais da angiogênese e são
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expressos em vários tipos celulares, incluindo células endoteliais, células inflamatórias e fibroblastos (AL- HASHAMI, et al., 2007).
Diversos estudos (MONACO, et al., 2004; CHRISTOPOULOS, et al., 2011; MAHMOUD E AFIFI, 2016b); apontaram o VEGF como o principal componente regulador responsável pela proliferação e diferenciação de células endoteliais envolvido na patogénese e progressão do LPO, tendo concordância com os resultados encontrados neste estudo, pois todos os casos estudados tiveram imunoexpressão de VEGF165 positiva em relação aos casos de HFI (controle positivo).
Segundo XIE, et al., (2010), a ativação do fator de transcrição NF-κB está diretamente ligada a supra-regulação do VEGF, estimulando a angiogênese. No presente estudo foi observado a imunoexpressão do VEGF165 em todos os casos estudados, podendo-se inferir que o processo de angiogênese tem função importante no processo inflamatório do LPO.
Foi observado nesse estudo que todos os casos de LPO, tiveram uma imunoexpressão do VEGF165, tanto em tecido epitelial como também na células do infiltrado inflamatório e vasos sanguíneos. Nos casos de HFI, essa marcação foi com menor intensidade comparada com a das lesões de LPO concordando com os estudos de (SCARDINA et al., 2009; MAHMOUD, AFIFI, 2016b ; AL- HASSINY, et al., 2018) que também observaram a imunoexpressão do VEGF165 no tecido conjuntivo das lesões de LPO.
A imunoexpressão de VEGF165 em todos os casos estudados nessa pesquisa não teve diferença no que diz respeito aos tipos de LPO Reticular e Erosivo, pois tiveram a expressão no tecido conjuntivo em ambos os casos na mesma proporção como foi visto em outras pesquisas (MITTAL, SHANKARI, PALASKAR, 2009, SCARDINA et al., 2009, MARDANI et al., 2012).
Esses achados confirmam que a angiogênese tem uma função bastante efetiva nas lesões de LPO, e sugerem também que independente do tipo de LPO, o VEGF165 estará atuando em todo o tecido epitelial e no infiltrado inflamatório atuando na origem e perpetuação da resposta inflamatória, que é um componente importante nessa doença.
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7 CONCLUSÕES
• Observou-se maior imunoexpressão do VEGF165 nos casos de LPO em relação aos casos controle, sugerindo a participação dessa proteína nessas lesões.
• A menor imunoexpressão do NF-κB nos casos de LPO, podem sugerir que a atuação da resposta inflamatória seria coadjuvante na etiopatogenia e perpetuação do LPO.
• A menor imunoexpressão do NF-κB nos casos de LPO, pode ser um indício de que a presença de alterações epigenéticas no sistema imunológico seja necessária para desencadear a doença modalidades terapêuticas mais eficazes contra essa patologia.
• Os resultados da presente pesquisa sugerem que a imunoexpressão de NF-κB e VEGF165 têm papel na patogênse do LPO.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite você participar da pesquisa “Expressão imuno-histoquímica das proteínas NF-κB e VEGF165 no líquen plano oral”, que é coordenada pelo professor Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa. Sua participação é voluntária, o que significa que o(a) senhor(a) poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade.
Essa pesquisa procura analisar a expressão de algumas proteínas no material da biópsia que foi retirada da sua boca e está guardado no Departamento de Odontologia. O objetivo dessa pesquisa é compreender como essas substâncias funcionam no organismo.
Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será revelado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar o seu nome. Ninguém vai saber que você participou da pesquisa.
A pesquisa será desenvolvida a partir de dados coletados das fichas de requisição de biópsia (local da biópsia, tempo da lesão, aspecto, sintomas) e do material da biópsia que você já fez à época do seu atendimento. Não vai ser feito nenhum tratamento, pois você já foi tratado da lesão. O risco da sua participação é mínimo, nenhum procedimento clínico vai ser realizado com a finalidade da pesquisa. Todos os cuidados vão ser tomados com a manipulação da sua ficha e com o material da sua biópsia. Apenas as pessoas da equipe da pesquisa terão acesso a esses materiais.
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poderão contribuir para ampliar os conhecimentos científicos relacionados ao líquen plano oral, assim como, no desenvolvimento de tratamentos mais eficazes melhorando a qualidade de vida dos pacientes.
Se você ou o seu acompanhante tiverem alguns gastos pela sua participação nessa pesquisa, eles serão assumidos pelo pesquisador e reembolsado para vocês. Se você sofrer qualquer dano decorrente desta pesquisa, sendo ele imediato ou tardio, previsto ou não, você será indenizado.
(Rubrica do Participante) (Rubrica do Pesquisador)
Durante todo o período da pesquisa você poderá tirar suas dúvidas ligando para (Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa -Departamento de Odontologia da UFRN-Av Senador Salgado Filho 1787 Lagoa Nova-Natal/RN, e-mail: antoniodelisboa@uol.com.br, fone: 84 32154138 ).
Qualquer dúvida sobre a ética dessa pesquisa você deverá ligar para o Comitê de Ética em Pesquisa – instituição que avalia a ética das pesquisas antes que elas comecem e fornece proteção aos participantes das mesmas – da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, nos telefones (84) 3215-3135 / (84) 9.9193.6266, através do e-mail cepufrn@reitoria.ufrn.br ou pelo formulário de contato do site <www.cep.propesq.ufrn.br> .
Você ainda pode ir pessoalmente à sede do CEP, de segunda a sexta, das 08:00h às 12:00h e das 14:00h às 18:00h, na Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Campus Central. Lagoa Nova. Natal/RN.
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Após ter sido esclarecido sobre os objetivos, importância e o modo como os dados serão coletados nessa pesquisa, além de conhecer os riscos, desconfortos e benefícios que ela trará pra mim e ter ficado ciente de todos os meus direitos, concordo em participar da pesquisa: “Expressão imuno-Histoquímica do papel das proteínas NF-κB e do VEGF165 no líquen plano oral” e autorizo a divulgação das informações por mim fornecidas em
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congressos e/ou publicações científicas desde que nenhum dado possa me identificar.
Natal, / /
DECLARAÇÃO DO PESQUISADOR RESPONSÁVEL
Como pesquisador responsável pela pesquisa intitulada “Análise da expressão imunoistoquímica do papel das proteínas NF-κB e do V no líquen plano oral” declaro que assumo a inteira responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos metodologicamente e direitos que foram esclarecidos e assegurados ao participante deste estudo, assim como manter a confidencialidade e sigilo sobre a identidade do mesmo.
Declaro ainda estar ciente que na inobservância do compromisso ora assumido estarei infringido as normas e diretrizes propostas pelas Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde – CNS que regulamenta pesquisas envolvendo seres humanos.
Natal, ____/ /
__________________________________________ Prof. Dr. Antonio de Liboa Lopes Costa
Pesquisador Responsável
Continuação do Parecer: 2.753.728
