Cristiana do Carmo
Duarte Mendes
Cristiana do Carmo
Duarte Mendes
Impacto de pesticidas em espécies de cladóceros
Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Toxicologia, realizada sob a orientação científica do Prof. Doutor Fernando Gonçalves, Professor Associado com Agregação do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro
o júri
presidente Doutora Maria da Conceição Lopes Vieira Santos, Professora Associada da Universidade de Aveiro
Doutor Fernando José Mendes Gonçalves, Professor Associado com Agregação da Universidade de Aveiro (orientador)
Doutor José Paulo Filipe Afonso de Sousa, Professor Auxiliar da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
agradecimentos A realização desta Dissertação de Mestrado só foi possível graças a
colaboração de várias pessoas, às quais não quero deixar de exprimir os meus sinceros agradecimentos.
Em primeiro lugar, ao Professor Doutor Fernando Gonçalves que aceitou orientar-me neste trabalho e fê-lo com toda a dedicação e espírito crítico. Agradeço-lhe também a amizade, o apoio, o incentivo, o contributo científico e os seus conselhos tão necessários à consecução deste trabalho.
Um agradecimento enorme à Joana Pereira pela a atenção que sempre me dispensou, pela valiosa e pronta ajuda, pelo seu saber, pelas palavras amigas, enfim... por tudo.
Ao Sérgio e à Sofia, agradeço-lhes o ombro amigo que me ofereceram e onde me apoiei em momentos de desânimo.
Estou grata também à Catarina e ao Nelson pelo companheirismo e pelas brincadeiras que de algum modo alegravam os momentos de maior pressão. O meu reconhecimento também à Ana Marta, à Ana Sofia, ao Bruno, à Sara e à Ruth pelo companhia e sobretudo pela paciência que tiveram comigo. À minha mãe, ao meu pai e ao meu irmão quero agradecer-lhes o apoio, o incentivo e a compreensão que sempre me deram.
E finalmente, a todos os que, de maneiras tão diferentes tornaram possível e “escreveram” comigo esta dissertação, o meu MUITO OBRIGADA!
palavras-chave Daphnia; reprodução; taxa de cresimento diário; taxa de crescimento
intrínseco; pesticidas; mistura de pesticidas; Metomil; Propanil; Stam Novel Flo 480®; Lannate®; toxicidade; sinergismo; antagonismo.
resumo Os pesticidas são actualmente considerados as substâncias antropogénicas
mais prejudiciais, porque causam efeitos indesejáveis não só em organismos alvo como também em espécies não alvo. A sua toxicidade normalmente afecta os organismos existentes noutros locais e/ou ambientes, não se restringindo apenas ao local de aplicação. Por esta razão, os organismos aquáticos estão mais expostos a misturas do que a compostos individuais. A finalidade principal deste estudo foi analisar possíveis efeitos toxicológicos num organismo padrão, D. magna, submetido a exposições agudas e crónicas ao pesticida Stam Novel Flo 480® e respectiva substância activa (Propanil) bem como a misturas destes compostos.
Os resultados obtidos demonstraram que a D. magna perante exposições agudas aos tóxicos é mais sensível ao Propanil do que ao Stam Novel Flo 480® (solução comercial). Relativamente às misturas de pesticidas, os
resultados demonstraram que a mistura de Stam Novel Flo 480® com Lannate® produziu um aumento da toxicidade (sinergismo) aguda enquanto que a combinação de Propanil com Metomil exibiu um efeito antagónico em D. magna.
Os ensaios crónicos desenvolvidos em D. magna evidenciaram que quase todos os compostos afectaram a sua reprodução e crescimento. Na verdade, a fecundidade, a taxa de crescimento diário e a taxa de crescimento intrínseco (r) foram os parâmetros mais sensíveis ao Stam Novel Flo 480® e à mistura do Propanil com Metomil. A mistura do Stam Novel Flo 480® com Lannate®apenas afectou a taxa de crescimento diário de D. magna. O Propanil apenas inibiu a taxa de crescimento diário e a taxa de crescimento intrínseco (r).
Em suma, os pesticidas são capazes de induzir efeitos agudos e crónicos em organismos não alvo. Neste estudo, não só as soluções comerciais
apresentaram toxicidade para os organismos aquáticos testados, mas também as suas respectivas substâncias activas.
keywords Daphnia; life-history traits; fecundity; growth rate; population growth rate; pesticides; mixture of pesticides; toxicity; Methomyl; Propanil; Stam Novel Flo 480®; Lannate®; synergism; antagonism.
abstract Among the anthropogenic chemicals, pesticides may cause the most serious
problems because they can impair target and non-target organisms, because their mode of application. Consequently, their toxicity is usually not restricted to the local where they are applied, reaching frequently other environmental compartments. For this reason, the aquatic organisms are not exposed to single substances but rather to multiple and complex mixtures of pesticides. The present study aimed to analyse the acute and chronic effects of Stam Novel Flo 480® and its active ingredient Propanil and also of a mixture of pesticides (Stam Novel Flo 480® and Lannate®) and active ingredients (Propanil and Methomyl) in Daphnia magna (standard species).
The results indicated that D. magna was more sensitive to the acute exposure to Propanil than to Stam Novel Flo 480® (commercial solution). Relatively to the mixture of pesticides, the results demonstrated that combination of Stam Novel Flo 480® and Lannate® produce greater than additive (synergism) acute toxicity and the mixture of Propanil and Methomyl exhibited less than additive
(antagonism) acute toxicity to D. magna.
The chronic assays showed that Stam Novel Flo 480® plus Lannate® exposure impaired the daily growth rate of D. magna while daily growth rate and
population growth rate were more susceptible to Propanil. However for Stam Novel Flo 480® and for the mixture of Propanil and Methomyl, fecundity, were the most sensitive parameters. Propanil only affected the daily growth rate and population growth rate.
Thus, the pesticides are able to induce acute and chronic effects in non-target organisms. In this study, either the commercial solutions or the respective active ingredients showed toxicity to the tested organism.
ÍNDICE
Lista de Figuras...viii Lista de Tabelas...x CAPÍTULO I Introdução geral ...1 1. Ecossistemas Lênticos ...31.1. Género Daphnia (Crustacea: Cladocera)...4
2. Toxicidade de Pesticidas ...6
2.1. Contaminação de sistemas aquáticos por pesticidas ...6
2.2. Avaliação da toxicidade de pesticidas...8
2.2.1. Propanil...9 2.2.2. Metomil...11 2.2.3. Mistura de pesticidas ...13 3. Objectivos ...14 4. Estrutura da Dissertação ...14 CAPÍTULO II Acute and chronic effects of Stam Novel Flo 480® (commercial solution) and its active ingredient Propanil in Daphnia magna...17
CAPÍTULO III
Acute and chronic effects of a mixture of pesticides and active ingredients in Daphnia magna...37
CAPÍTULO IV
Discussão geral...59
CAPÍTULO V
Lista de Figuras
Fig. 1. Metabolismo do Propanil no arroz.
Fig. 2. Number of neonates produced during 21 days by D. magna at different
concentrations of Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard
error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 3. Number of neonates from the first brood of D. magna, at different
concentrations of Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard
error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 4. Size of D. magna at the first reproduction, at different concentrations of
Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗
indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 5. Daily growth rate (DGR) of D. magna at different concentrations of Stam
Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates
the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 6. Population growth rate (r) of D. magna, at different concentrations of Stam
Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates
the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 7. Total number of neonates produced during 21 days by D. magna at
Methomyl. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 8. Number of neonates from the first brood for D. magna, at different
concentrations of Stam Novel Flo 480® plus Lannate® and Propanil plus Methomyl.
Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 9. Size of D. magna at the first reproduction, at different concentrations of
Stam Novel Flo 480® plus Lannate® and Propanil plus Methomyl. Errors bars
represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 10. Daily growth rate (DGR) of D. magna at different concentrations of Stam
Novel Flo 480® plus Lannate® and Propanil plus Methomyl. Errors bars represent
standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Fig. 11. Population growth rate (r) of D. magna, at different concentrations of
Stam Novel Flo 480® plus Lannate® and Propanil plus Methomyl. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05).
Lista de Tabelas
Tabela I. Propriedades físico-químicas de Propanil. Tabela II. Propriedades físico-químicas de Metomil.
Table III. Test concentrations (mg/L) plus control for each of the acute and chronic assays.
Table IV. EC50 values (mg/L) after 48h exposures to Stam Novel Flo 480® and
Propanil with the respective 95% confidence limits for D. magna.
Table V. NOECs and LOECs (mg/L) determined for sublethal endpoints for D.
magna.
Table VI. EC50 values (mg/L) at 48h exposures to Stam Novel Flo 480®, Lannate®,
Propanil and Methomyl when present individually and in mixtures with the respective 95% confidence limits for D. magna.
CAPÍTULO I
1.
E
COSSISTEMASL
ÊNTICOSA água é indispensável à evolução e manutenção de todos os ecossistemas, constituindo, mesmo, o suporte essencial de vida de muitas espécies.
Cerca de 97,5% da água é salgada e estão confinados nos mares e oceanos. Dos 3% de água doce, perto de 2% está congelada na calotes polares, restando 1% para o consumo humano, irrigação, indústria, transportes e actividades recreativas (www.inag.pt). A exploração “despreocupada” da água doce, bem como a degradação da sua qualidade, por exemplo devido à descarga frequente de esgotos domésticos e industriais, à promoção da erosão dos solos, ao uso indiscriminado de fertilizantes e pesticidas na agricultura, têm contribuido para a degradação progressiva de diversos ecossistemas dulçaquícolas.
No último século, o uso intensivo de pesticidas na agricultura acelerou o processo de eutrofização de lagos e rios. Eutrofização é um termo que define um desequilíbrio do sistema aquático devido à entrada excessiva de nutrientes e consequente incapacidade dos organismos para os consumirem (Leaf e Chatterjee, 1999). Este fenómeno implica um aumento da produtividade, frequentemente caracterizada por uma florescência de algas que pode conduzir a uma deplecção de oxigénio (Abrantes et al., 2006; Kagalou et al., 2003; Sperling, 1997). Durante o processo de eutrofização observa-se, muitas vezes, que lagos de água transparente com diversas comunidades de invertebrados, de peixes e de macrófitas submersas, passam a ser lagos dominados pelo fitoplâncton e praticamente desprovidos de macrófitas submersas (Gillis et al., 2003; Perrow et al., 1999).
Os efeitos da eutrofização acarretam inúmeras alterações, que conduzem a modificações na estrutura das comunidades aquáticas e ao modo como é mediada a transferência de energia dos produtores primários para níveis tróficos superiores (Kagalou et al., 2003), podendo mesmo verificar-se, em casos extremos, uma diminuição drástica da biodiversidade nos níveis tróficos mais elevados (Myulert et al., 2003). Por esta razão, a eutrofização é considerada como uma das principais
causas da degradação de lagos e lagoas (Castro et al., 2005; Madgwick, 1999; Kagalou et al., 2003).
É de extrema importância compreender a estrutura e o modo de funcionamento dos ecossistemas de água doce por forma a maximizar a sua gestão, tendo sempre em conta a elevada susceptibilidade dos ecossistemas lênticos face à acção antropogénica (Sperling, 1997).
Nos ecossistemas aquáticos lênticos, a estrutura e o desenvolvimento da comunidade de organismos planctónicos dependem, principalmente, das propriedades físico-químicas da água e da sua constituição (Weithoff et al., 2000). Por esta razão, a comunidade planctónica (fitoplâncton e zooplâncton) pode ser um indicador eficaz da condição ou estado de saúde do sistema lêntico. O facto dos organismos zooplanctónicos ocuparem uma posição intermédia na cadeia trófica dos lagos, torna-os responsáveis pelos processos “top-down” e “bottom-up”, ou seja, medeiam o controlo que os níveis tróficos mais elevados fazem sobre os níveis de base e vice-versa (DeSanto, 1978; Stemberger e Lazorchak, 1994). Neste contexto, o zooplâncton desempenha um papel fundamental em lagos, uma vez que reduz a quantidade de algas através da filtração dado e constitui uma importante fonte de alimento para os peixes planctívoros (Lauridsen et al., 1999). Desta forma, o zooplâncton assume um papel regulador fulcral na cadeia alimentar dos ecossistemas lênticos.
1.1. Género
Daphnia
(Crustacea: Cladocera)
O zooplânton de água doce é constituído, fundamentalmente, por três grupos de organismos: copépodes, rotíferos e cladóceros. Estes últimos formam um grupo importante nas cadeias alimentares planctónicas pela sua capacidade de filtrar partículas, que variam em tamanho e podem ser desde bactérias a algas, relativamente grandes (Montel e Lair, 1997).
De entre os cladóceros, o grupo mais estudado e, geralmente, mais abundante nas comunidades zooplanctónicas dulçaquícolas são os dafnídeos e mais particularmente o género Daphnia. Trata-se de um organismo de pequenas dimensões, translúcido, filtrador não selectivo, ingerindo algas, bactérias, protistas e pequenos detritos. Reproduz-se assexuadamente por partenogénese cíclica, podendo ocasionalmente reproduzir-se sexuadamente (Gyllstrõm e Hansson, 2004). A partenogénese, que predomina sob condições ambientais favoráveis (e.g. baixa densidade populacional, grande disponibilidade de alimento), permite que os organismos resultantes das ninhadas duma progenitora original sejam geneticamente idênticos a essa progenitora, pelo que são designados de clones. Este processo propicia a uma rápida expansão da população (Olmstead e LeBlanc, 2001).
Quando os recursos são escassos ou quando as condições ambientais ameaçam a sobrevivência da população, devido ao aumento da densidade populacional, à falta de alimento, ao fotoperíodo reduzido ou à presença de predadores, os dafnídeos passam a reproduzir-se sexuadamente. A reprodução sexuada começa com a produção assexuada de machos e com a formação de ovos sexuados que posteriormente podem ser fertilizados por esses machos (Olmstead e LeBlanc, 2001). Desta fecundação resultam ovos de resistência que são envoltos por uma membrana protectora (efípia), permitindo que estes organismos passem longos períodos de tempo em condições ambientais adversas (Innes, 1997).
Dentro do zooplâncton, o género Daphnia é o mais usado em estudos de toxicidade por ser um dos organismos zooplanctónicos mais sensíveis a factores
de stress, possuir pequenas dimensões, apresentar um ciclo de vida curto e
reprodução partenogénica (Villarroel et al., 1999; Lewis e Weber, 1985). Por outro lado, o estabelecimento e manutenção de culturas de Daphnia em laboratório é relativamente simples e pouco oneroso, existindo já uma série de normas standardizadas para a avaliação de toxicidade que aprovam a sua utilização corrente em ecotoxicologia e avaliação de stress.
2.
T
OXICIDADE DEP
ESTICIDASOs pesticidas estão, em teoria, destinados à defesa da produção vegetal e podem ser compostos por uma ou mais substâncias capazes de prevenir ou combater espécies nocivas às plantas e/ou aos produtos agrícolas. A designação “pesticida” inclui varios tipos de produtos conforme o alvo em causa: fungicida (fungos), insecticida (insectos), herbicida (infestantes), acaricida (ácaros), nematodicida (nemátodes), moluscicida (lesma e caracóis) (Bayer, 2000).
De acordo com a Direcção Geral de Protecção das Culturas (DGPC) do Ministério do Desenvolvimento Rural e das Pescas, em 2003, foram vendidos em Portugal 17 030 910 Kg de pesticidas (expresso em substância activa), registando-se um decréscimo de 2,3% relativamente a 2002. Os fungicidas vendidos representaram 76% do mercado de produtos fitofarmacêuticos. Os herbicidas representaram 13,9% do total de produtos vendidos enquanto que as vendas de insecticidas/acaricidas representaram 6,3% do total vendido (Vieira, 2005).
2.1. Contaminação de sistemas aquáticos por pesticidas
Inicialmente pensou-se que as aplicações de pesticidas poderiam afectar apenas os organismos alvo, sem consequências ambientais (Patakioutas e Albanis, 2002). Na actualidade, estes produtos são considerados substâncias antropogénicas mais prejudiciais, porque causam efeitos indesejáveis entre os quais a mortalidade em espécies terrestres e/ou aquáticas, para além dos organismos nocivos que pretendem combater. Para além disso, quando usados na protecção de culturas, são introduzidos directa e deliberadamente no ambiente, podendo contaminar solos, águas superficiais e subterrâneas, via infiltração ou dispersão directa (Hanazato, 2001; Reis, 2003, Cerejeira et al., 2003).O potencial dos pesticidas para contaminar o solo e a água está relacionado com as suas propriedades físico-químicas, nomeadamente a solubilidade em água (quantidade máxima de pesticida que se dissolve num litro de água), capacidade de adsorção, expressa pela constante Koc (medida que traduz o grau de afinidade
do pesticida a partículas do solo), e o tempo de meia vida (tempo necessário para que metade da quantidade do pesticida se degrade em água) (Durand e Barcelo, 1990; Orme e Kegley, 2004). A adsorção e a desadsorção de pesticidas em colóides orgânicos e inorgânicos são os principais processos que afectam o destino de tais químicos no solo. As propriedades do solo, tais como o conteúdo de areia, siltes, argila, matéria orgânica, pH e condutividade, influenciam a absorção, persistência, degradação e lixiviação dos pesticidas (Liu et al., 2002). A intensidade e a abundância das chuvas bem como a intensidade do uso de pesticidas também podem contribuir para elevar o potencial de contaminação de águas e solo (Novak et al., 1998).
De facto, os pesticidas e seus resíduos são os agentes mais devastadores para os ecossistemas aquáticos e organismos, podendo afectar um ou até todos os níveis tróficos da cadeia alimentar. De entre os vários mecanismos de contaminação do meio aquático lêntico existem dois que podem estar associados aos efeitos destes resíduos agrícolas: (1) bioconcentração, ou seja, processo de acumulação de um produto químico proveniente da água, alcançando no organismo concentrações mais altas do que as observadas no meio; (2) biomagnificação, aumento da concentração de compostos químicos ao longo da cadeia alimentar devido à absorção directa, conjugada com a absorção indirecta derivada da ingestão de organismos já contaminados. Assim, é comum observar concentrações mais elevadas de tóxicos nos predadores de topo do que nos organismos pertencentes a níveis tróficos inferiores (Islam e Tanaka, 2004; Rickwood e Galloway, 2004).
Neste contexto, a análise da toxicidade de um composto nos níveis mais baixos da cadeia alimentar (fitoplâncton e zooplâncton) é considerada como um importante indicador do seu impacto no ecossistema (Hanazato, 2001).
2.2. Avaliação da toxicidade de pesticidas
Geralmente, os pesticidas induzem alterações relevantes nos parâmetros reprodutivos de Daphnia. Demonstrou-se que os pesticidas induzem a produção de neonatos mais pequenos em Daphnia, sugerindo que quando exposta a pesticidas, uma determinada população de Daphnia tornar-se-á cada vez mais sensível a químicos, uma vez que o neonato é o estágio de vida mais sensível (Hanazato, 2001).
Os pesticidas podem mesmo afectar a estrutura de comunidades num ecossistema aquático já que promovem a alteração da dominância de Daphnia para a dominância de zooplanctontes mais pequenos, tais como rotíferos e Bosmina (Hanazato, 2001). Foi sugerido que os pesticidas, ao induzirem a dominância de espécies de zooplâncton pequenas, reduzem na globalidade o tamanho médio dos indivíduos na comunidade zooplanctónica (Hanazato, 1998). A dáfnia é muito competitiva na comunidade zooplanctónica, provocando a diminuição das populações da maioria dos taxa de zooplâncton mais pequenos. Por consequência, uma comunidade em que o género Daphnia é dominante apresenta uma baixa riqueza específica. No entanto, se a população de Daphnia for destruída ou afectada por pesticidas, as espécies pequenas de zooplâncton aumentam em abundância, aumentando a riqueza específica da comunidade (Hanazato, 1998).
Em ecossistemas aquáticos não contaminados, a principal via de transferência de energia e de carbono faz-se através da relação fitoplâncton – zooplâncton (fundamentalmente Daphnia) - peixes. Nos locais contaminados por pesticidas, essa transferência passa a ser mais efectiva via fitoplâncton - cladóceros pequenos - predadores invertebrados - peixes. Assim, a eficiência da transferência de energia dos produtores primários para os predadores de topo, é menor em ecossistemas que sofram influência de pesticidas (Hanazato, 2001). Hanazato (1998) afirmou que a redução da transferência de energia é um efeito comum não só devido à contaminação por pesticidas e metais pesados, mas também à acidificação, eutrofização e aquecimento global.
Para se avaliar o potencial de contaminação das massas de água pelos químicos usados nas actividades agrícolas e os seus efeitos no ecossistema, podem ser realizados testes agudos e crónicos estandardizados com cladóceros, especialmente com espécies de Daphnia. Nos testes agudos são registados os efeitos tóxicos directos, como a mortalidade ou a imobilização, sendo determinados estatiscticamente o LC50 (“lethal concentration”) ou o EC50
(“effective concentration”), respectivamente. Estes parâmetros indicam a concentração em que 50 % dos organismos morrem ou ficam imobilizados após uma exposiçaõ estática e delimitada no tempo (no caso da Daphnia – 48hr) a uma determinada gama de concentrações de um tóxico. Nos testes crónicos são registados os efeitos tóxicos na fecundidade, no crescimento somático dos indivíduos (taxa de crescimento diário ou taxa de crescimento somático) e na taxa de crescimento da população extrapolada a partir da amostra que é testada (taxa de crescimento intrínseco).
2.2.1. Propanil
O Propanil (3,4-dicloropropioanilida) (Tabela I), substância activa de pesticidas como o Stam Novel Flo 480®, é um herbicida selectivo de contacto,
muito usado na produção do arroz (Oryza sativa). Em Portugal, este herbicida sofreu um considerável aumento de utilização a partir de 2003 (Vieira, 2005).
Este produto é quimicamente classificado como uma anilida pertencente à classe das fenilamidas (Villarroel et al., 2003). É absorvido por via foliar, difundindo-se pelos tecidos da planta. Actua parando o crescimento radicular, necrosando as folhas e inibindo a função clorofilina das infestantes (Perera et al., 1999).
O herbicida Propanil é selectivo para aplicações em emergência ou pós-plantação em arroz semeado ou plantado. Controla infestantes gramíneas (milhãs - Echinochloa crusgalli) e infestantes de folha larga (dicotiledóneas) (Hoagland et
Tabela I. Propriedades físico-químicas de Propanil (Orme e Kegley, 2004).
Solubilidade 152 mg/L
Peso molecular 218,08 g
Ponto de fusão 85-93ºC
Koc 518
Tempo de meia-via no solo (T1/2) 1-3 dias
Tempo de meia-vida na água (T1/2) 5000 dias
Estrutura química
A tolerância do arroz a este herbicida deve-se à elevada actividade da enzima arilacilamidase que hidrolisa, rapidamente, o Propanil em 3,4-dicloroanilina (DCA) e em ácido propaniónico. Este é metabolizado em dióxido de carbono por β-oxidação, enquanto que o DCA é enzimaticamente conjugado com a glucose para formar N-(3,4–diclorofenil)glucosilamina e/ou com outros sacarídeos (xilose e frutose) para formar sacarídeos conjugados com o DCA (Fig. 1) (Carey et al., 1997).
Propanil
O H HO – C – CH2 – CH3 + H – N
Ácido propaniónico DCA
CO2 Sacarídeos conjugados
(xilose, frutose)
N-(3,4diclorofenil)glucosilamina
Este processo hidrolítico é a base de todo o mecanismo selectivo para o controlo de infestantes no arroz, desde que os baixíssimos níveis de arilacilamidase presentes nas infestantes sejam insuficientes para hidrolizar o Propanil (Hoagland et al., 1999).
Propanil é considerado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como sendo ligeiramente perigoso. Porém, quando em contacto directo com a pele, olhos, inalação pode provocar ardor, confusão e náuseas. Estudos já realizados revelam que este composto também causa toxicidade aguda noutros mamíferos. Em ratos, por exemplo, induz alterações no sistema imunitário através da redução da actividade das células citolíticas e afecta os eritrócitos causando a metamoglobinemia e anemia (McClure et al., 2001). Sinais de toxicidade aguda também incluem depressão do sistema nervoso central, perda de reflexos relacionados com o equilíbrio e cianose (Richards et al., 2001).
O Propanil devido à sua elevada solubilidade e ao elevado tempo de degradação apresenta um potencial risco de contaminação dos sistemas aquáticos adjacentes à sua aplicação. Segundo a DGPC (www.dgpc.min-agricultura.pt), o Propanil é perigoso para os organismos aquáticos, não devendo ser aplicado em terrenos agrícolas adjacentes a cursos de água. É considerado um produto de toxicidade moderada para os peixes, mas para o zooplâncton essa toxicidade pode ser de ligeira a elevada. Villarroel et al. (2003) demonstraram que o herbicida Propanil afectou D. magna, provocando uma redução do crescimento e reprodução ou até a morte.
2.2.2. Metomil
O Metomil (S-metil-N-(metilcarbomoiloxi)tioacetimidato) (Tabela II), substância activa de pesticidas como o Lannate® , é um insecticida com um largo
espectro de acção, ou seja, é muito usado no tratamento foliar de vegetais, frutos, plantas ornamentais entre outras culturas, e no controlo de insectos
lepidópteros (www.inchem.org). Em Portugal, este herbicida sofreu um considerável aumento de utilização a partir de 2003 (Vieira, 2005).
Este produto é quimicamente classificado como um carbamato, sendo um insecticida sistémico que actua por contacto e ingestão (Farré et al., 2002). É um potente inibidor da colinesterase (Testud et al., 1999; Tsatsakis et al., 2001).
Tabela II. Propriedades físico-químicas de Metomil (Orme e Kegley, 2004). Solubilidade em água 547 g/L
Peso molecular 162,2 g
Koc 43
Tempo de meia-via no solo (T1/2) 46 dias
Tempo de meia-vida na água (T1/2) 30 dias
Estrutura química
O S N O NH
Metomil é considerado pela OMS como sendo muito perigoso (Orme e Kegley, 2004). Porém, até agora, não foram registados casos de morte por envenamento com metomil (Tsatsakis et al., 2001). Devido à elevada toxicidade do metomil, a ingestão intencional ou não, resulta, frequentemente, em crises agudas colinérgicas e até na própria morte (Testud et al., 1999). Este composto apresenta uma elevada toxicidade não só em mamíferos (ratazanas e ratos) (Farré et al., 2002) como também em invertebrados, principalmente em abelhas. Por isso, não deve ser aplicado na época de floração. Nos insectos, causa a hiperactividade, perda de coordenação, convulsões e morte.
A elevada solubilidade e o baixo coeficiente de partição solo:carbono orgânico do metomil promove o seu potencial de contaminação de águas (Itak et al., 1996). Segundo a DGPC (www.dgpc.min-agricultura.pt), o metomil é muito
perigoso para os organismos aquáticos, não devendo ser aplicado em terrenos agrícolas adjacentes a cursos de água. É considerado um produto de toxicidade moderada a elevada para os peixes e de toxicidade muito elevada para os invertebrados aquáticos, principalmente para D. magna (Farré et al., 2002).
2.2.3. Mistura de pesticidas
Os pesticidas diferem de todos os outros compostos químicos, por serem lançados para o ambiente com uma explícita intenção de exercer efeitos tóxicos num ou mais organismos alvo (Deneer, 2000). Por outro lado, a prática agrícola pode envolver o uso de mais do que um pesticida numa mesma cultura ou em diferentes culturas na mesma área (Cuppen et al., 2002). É ainda de assinalar que a toxicidade dos pesticidas não se limita apenas ao local onde são aplicados, podendo atingir outros locais e compartimentos ambientais através de vários processos de transporte e afectar, de forma agressiva, os organismos aí existentes. É principalmente nos cursos de água, próximos de áreas agrícolas, que é mais comum encontrar misturas de vários pesticidas (Deneer, 2000; Van Den Brink et al., 2002). A mistura de pesticidas pode ocorrer inadvertidamente, porque alguns compostos persistem por longos períodos no ambiente e/ou porque são aplicados repetidamente (Van Den Brink et al., 2002).
Os organismos aquáticos estão expostos a misturas de pesticidas e pressões físicas que, quando combinadas, podem causar nesses indivíduos alterações comportamentais, fisiológicas e bioquímicas, morte e outros efeitos adversos. Sempre que um organismo está exposto a misturas complexas de pesticidas, as respostas tornam-se difíceis de interpretar, à semelhança do que acontece com misturas de outros tóxicos. Os resultados podem reflectir efeitos: (1) aditivos, quando há uma mistura de compostos com acção semelhantes; (2) antagónicos, quando o efeito é menor do que o esperado considerando cada composto individualmente; (3) sinergísticos, quando há um aumento da toxicidade
da mistura em relação aos efeitos individuais (Herbrandson et al., 2002; Woods et al., 2002).
3. O
BJECTIVOSOs objectivos propostos para o desenvolvimento do presente trabalho foram:
#
estudar os efeitos agudos (imobilização) e crónicos (crescimento somático, fecundidade e crescimento populacional) causados pelo Stam Novel Flo® (solução comercial) e pelo Propanil (substância activa) em D. magna.#
estudar os efeitos agudos e crónicos causados pela mistura das duas soluções comerciais e das duas substâncias activas em D. magna.#
comparar as respostas de D. magna exposta aos diversos químicos testados: entre a solução comercial e a substância activa e entre os químicos per se e os químicos em mistura.4. E
STRUTURA DAD
ISSERTAÇÃOEsta dissertação foi dividida em quatro capítulos.
No capítulo I abordam-se os impactos das acções antropogénicas nos sistemas lênticos. Destaca-se, também, a importância da comunidade zooplanctónica por ser um indicador eficaz da condição e “estado de saúde” do
sistema lêntico. Neste contexto, caracteriza-se um género particular de cladóceros zooplanctónicos (género Daphnia), um dos mais estudados e, geralmente, mais abundantes na comunidade zooplanctónica. Analisa-se, em particular, a toxicidade de pesticidas em ecossistemas aquáticos, dando especial ênfase ao herbicida Propanil e ao insecticida Metomil. Consideram-se ainda as misturas de pesticidas e o seu potencial de contaminação dos ecossistemas aquáticos próximos.
No capítulo II analisam-se os efeitos provocados pelo herbicida Stam Novel Flo 480® e Propanil, na sobrevivência, crescimento e reprodução na espécie padrão de cladóceros, Daphnia magna.
No capítulo III apresentam-se as metodologias e os resultados obtidos, na análise da toxicidade aguda e crónica da mistura do herbicida Stam Novel Flo 480® com o insecticida Lannate®, assim como os obtidos face à mistura das duas
respectivas substâncias activas, Propanil e metomil, em D. magna.
Por último, no capítulo IV efectua-se uma discussão geral de todos os resultados obtidos.
CAPÍTULO II
Acute and chronic effects of Stam Novel Flo 480
®(commercial
Acute and chronic effects of Stam Novel Flo® (commercial solution) and its active ingredient Propanil in Daphnia magna
Mendes, C. D., Pereira, J. L*. and Gonçalves, F.
Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, Campus Universitário de Santiago, 3810-193 Aveiro, Portugal.
* Corresponding author: e-mail: jpereira@bio.ua.pt Phone: +351 234 370 788 Fax: +351 234 426 408
Abstract
Lentic ecosystems are frequently subjected to the input of xenobiotics, including pesticides. In these scenarios, the impact in non-target organisms is widely reported. Considering their key-position in lentic ecosystems, daphnids are generally used as bioindicators. This study purposes to evaluate the effects of the exposure to Stam Novel Flo 480®, a currently used amide-herbicide in Portuguese crops, and to its active ingredient (Propanil) on survival and reproduction of Daphnia magna. The acute assays showed that the 48hr-EC50 obtained for Stam Novel Flo 480® (3.554 mg/L) was almost twice of that
determined for his active ingredient Propanil (2.109 mg/L), therefore being the latest more toxic to D. magna. The chronic assays revealed slight differences between the effects of both compounds in the somatic and population growth rates and fecundity. In this way, this herbicide, which has a very slow degradation pathway, promotes changes in survival rates and in life-history traits of D. magna at very low concentrations.
Key Words: Daphnia magna; life-history traits; Propanil; Stam Novel Flo 480®; herbicide;
Introduction
Pesticides have been extensively used in a wide variety of agricultural applications in the control of insects, pathogens and weeds. They may cause the most serious problems, because they kill either the target or the non-target organisms (Hanazato, 2001; Patakioutas and Albanis, 2002) and they potentially to contaminate the surface and groundwater by spray drift, runoff and/or leaching (Cerejeira et al., 2003).
Propanil (IUPAC: 3,4-dichloropropioanilide), which is the active ingredient of several pesticides, including the herbicide Stam Novel Flo 480® (commercial solution), is extensively used in rice production. This acylanilide, which belongs to the phenylamides class (Villarroel et al., 2003), is a photosystem II (PSII) inhibitor (Mitsou et al., 2006), commonly used to control barnyardgrass (grass weeds) (Echinochloa crusgalli) and several broadleaf weeds (Hoagland et al., 1999). It is a selective contact herbicide used in the post-emergent treatment of rice (Oryza sativa) (Moore and Farris, 1997, Ferraz et al., 2004). This compound is readily adsorbed by foliage and causes chlorosis followed by foliar desiccation and necrosis in non-tolerant vegetables (Perera et al., 1999).
This herbicide reveals acute toxicity for several organisms in aquatic systems, being moderately toxic to fish and slightly to highly toxic to zooplankton (Orme and Kegley, 2004). Villarroel (2003) showed that D. magna was acutely affected by the herbicide and suffers reproduction and growth reduction at low concentrations of the chemical.
In the present study, two approaches of Stam Novel Flo 480® and Propanil toxicological effects were analysed in Daphnia: the first, acute concentration-immobilisation estimates (24-48hrs) and the second involved the determination of reproduction and growth effects along 21 days. Furthermore, the differences between the effects of the commercial solution and the respective active ingredient were comprised in this analysis.
Material and Methods
2.1. Test organisms
The stock cultures of D. magna were maintained in 1 L glass beakers filled with approximately 800 ml of the synthetic medium ASTM hard water (ASTM, 1980), under controlled incubation conditions (temperature 20±2ºC; photoperiod 16h L: 8h D). This medium was supplied with an organic additive obtained from the seaweed algae Ascophylum nodosum L. (Baird et al., 1988) and diluted with distilled water (Soares, 1989). The medium was renewed every other day and the organisms were fed with the green algae Pseudokirchneriella subcapitata (Korshikov) Hindak at a final concentration of 3.00x105 cell/mL (OECD, 1996), which was cyclically cultured in lab (Stein, 1973).
2.2. Test chemicals
The commercial solution of Stam Novel Flo 480® (Dow®, Portugal), 480 g/L Propanil concentrated, was obtained from a local supplier and the active ingredient Propanil (Pestanal®, 99.7% pure) was afforded from Sigma Aldrich®. The stock solutions were previously prepared by diluting or dissolving the appropriate quantities of each compound in ASTM and were stored at 4ºC in dark.
2.3. Experimental procedures
The bioassays were performed generally according to the OECD guidelines for Daphnia sp. acute immobilisation test (OECD, 2000) and D. magna reproduction test (OECD, 1996). All experiments were conducted with a single clone of D. magna (clone A sensu Baird et al., 1989). In the acute and chronic assays neonates (< 24-hr old), from the
third to the fifth broods in order to avoid or reduce maternal effects (Barata and Baird, 1998) were used.
The acute tests were carried in glass vessels containing 100 mL of test solutions, prepared by direct dilution of the stock solutions in the required ASTM volumes. Five neonates were used in each of the four replicates per tested treatment (Table III) and blank control (ASTM). Incubation conditions were similar to those described for the culture procedure. Test organisms were not fed during the test (48-hr) and the dissolved oxygen (Oxi 330 WTW) and pH (pH 330 WTW) were monitored at the beginning and end of the experience for validation purposes (OECD, 2000). The tests were screened at 24 and 48-hrs exposure-time and the immobilised daphnids were recorded.
Considering the acute assays results, several preliminary chronic tests were carried until a final range of concentrations, suitable for the accomplishment of statiscally valid fecundity data in the reproduction assays, became established (Table III). In these tests, the daphnids were individually maintained in glass vessels filled with 50 ml of test solutions, prepared by direct dilution of the stock solutions in the required ASTM volumes. Each treatment consisted of ten replicates and the tests were carried along the standardized 21 days in controlled incubation conditions: 20 ± 2ºC and with a 16L: 8D photoperiod. Following a semi-static approach, the medium was renewed every other day and the organisms were fed daily with P. subcapitata at the rate described for the culture procedure. Tests were screened daily and the produced viable and non-viable offspring were registered. The body length of the females was calculated at the beginning, at the moment of the first brood, and at the end of the test, by extrapolation from the moult exopodite length (Pereira et al., 2004).The somatic growth of the females was analysed by calculation of the Daily Growth Rate (DGR):
DGR = [ln(BLf) – ln(BLi)] / ∆t (days-1),
where BLf stands for the final body length (mm), BLi for the initial body length (mm) and
∆t for the time range (days) (Sobral, 1997; Burns, 2000). Fecundity data and the eventual mortality occurrence were integrated for the calculation of the Per capita Rate of Population Increase (RPI) (r, number per day) through the Euler- Lotka equation:
1 = Σ e-r.x . l
where x stands for the age class (days), lx for the probability of surviving to age x, and mx
for the fecundity at age x. The standard error was obtained according to the Jackknife technique (Meyer et al., 1986).
2.4. Statistical analysis
Probit analysis (Finney, 1971) was used to calculate the 48hr-EC50 immobilisation
values with the respective 95% confidence limits, for each acute assay. The sub-lethal effects of each tested chemical were statiscally tested, upon each endpoints of interest, by the means of analysis of variance (ANOVA), followed by the post- hoc multiple comparisons Dunnet test, for comparisons of each of the treatments with the control. The appropriate transformations were applied for the achievement of the ANOVA main assumptions (Zar, 1996).
Results
In general, either the commercial solution or the active ingredient showed high acute and chronic toxicity to Daphnia magna. The pH and dissolved oxygen registered monitoring values felled always within the protocol requirements, therefore validating the general conditions for the assays.
The daphnids immobilisation records after 48-hrs exposure to Stam Novel Flo 480® (Stam) and Propanil are shown in Table IV. The former presents the highest EC50 (3.554 mg/L), presenting an almost doubled value, when compared with the EC50 found for its active ingredient (2.109 mg/L). Moreover, narrow and non coincident 95% confidence intervals (Table IV) were achieved for both tests.
The acute immobilisation test comprises concentration within the range of 1.250-9.492 mg/L for Stam and 0.750-5.695 mg/L for Propanil, while the reproduction assays were performed within the 0.013-0.098 mg/L and 0.016-0.123 mg/L ranges, respectively
(Table III). The concentration ranges for the chronic assays were severely reduced when comparing with the ones of the acute tests which allowed the accomplishment of satisfactory EC50s and confidence intervals. The final chronic concentrations were achieved after consecutive reduction, based on the registry of aborted eggs and embryos released simultaneously with the moults in preliminary tests. In fact, concentrations above 0.098 mg/L for Stam and 0.123 mg/L for Propanil lead to a massive production of unviable progeny (eggs or embryos).
Once D. magna survival was not affected by the chosen sublethal exposure levels of both chemicals, the ponctual mortality registers were only considered for r (population growth rate)-related calculations. Table IV reports the NOEC and LOEC values found for reproduction, somatic and population growth endpoints.
The absolute fecundity of D. magna tended to decrease significantly (F=3.659; df=6, 60; P=0.004) with the increase of the Stam concentrations (Fig. 2). Propanil also significantly injury the fecundity registering statistical significant differences (F=4.175; df=6, 62; P=0.001) between control and treated groups at 0.055 mg/L (Treatment 4, 5 and 6) and higher Propanil concentrations (Fig. 2).
Regarding specifically the number of neonates at first brood there is a general reduction on the reproductive output of females subjected to increasing concentrations (Fig. 3). Statistical differences were recorded (F=6.761; df=6, 61; P<0.001) between the control and the higher concentration of Stam (0.098 mg/L – Treatment 6) and were observed (F= 4.106; df=6, 62; P=0.002) between the control and the two extreme concentrations of Propanil (0.082 and 0.123 mg/L – Treatments 5 and 6, respectively). Furthermore, the size of D. magna at the first reproduction decreased all along the test concentrations (Fig. 4). Stam concentrations of 0.019 mg/L and higher (Treatments 2, 3, 4, 5, 6) significantly reduced the females size (F=8.645; df=6, 61; P<0.001) while only the three higher concentrations (Treatments 4, 5 and 6) of Propanil showed statistical differences (F=2.645; df=6, 62; P=0.024).
Considering the somatic growth of D. magna, expressed in Fig. 5 as DGR, there was a significant reduction in all treatments of Stam and Propanil (F=13.095; df=6, 61; P<0.001 and F=40.191; df=6, 62; P<0.001, respectively) when compared with the control.
The per capita rate of population increase (r) combines both cumulative fecundity and survival of individuals during the test period and, as reported in Fig. 6, the increase of
Stam concentrations tends to reduce the population growth of D. magna, with significant statistical differences (F=4.494; df=6, 63; P<0.001) between the control and the higher concentration (0.098 mg/L – Treatment 6). For Propanil, despite the maintenance of the same trend, no significant differences were found in the range of tested concentrations of this species.
Discussion and Conclusions
Results showed that Stam and its active ingredient Propanil induced acute and chronic toxicity in Daphnia magna, revealing a high toxicity for these non-target organisms.
After 48 hours of exposure to Stam and Propanil, the EC50 values calculated for each compound indicated that D. magna was more sensitive to the acute exposure of Propanil (EC50 = 2.109 mg/L) than to the commercial solution (EC50 = 3.554 mg/L). Albeit this indication of the higher acute toxicity of the active ingredient the contrary was expected given that commercial formulations of pesticides are composed of the active ingredient enriched with a range of surfactants, solvents and other substances. Generally used to increment several properties of the product (e.g. mobility, solubility), the list and/or quantities of these adjuvant chemicals is not easily provided by the manufacturer therefore allowing suspicions related with their abilities to induce toxicity in non-target organisms. Moreover, several authors (Pereira et al., 2000; Goktepe and Plhak, 2002) have performed toxicological tests using active ingredients and formulated pesticides and showed that water samples fortified with formulated pesticides were more toxic to crustaceans than the respective active ingredient solution.
Villarroel et al. (2003) reported 48hrs-LC50 to Propanil of 5.01 mg/L, which is higher that obtained in this study. The microcrustacean Ceriodaphnia dubia was also reported as a sensitive organism to Propanil, with a 48hrs-LC50 of 1.65 mg/L (Moore et al., 1998) and the vertebrate P. promelas (fathead minow) showed a 48hrs-LC50 of 8.64 mg/L (Moore et al., 1998), suggesting the ability of low doses of Propanil to induce toxic effects even in higher trophic levels.
An organism must be able to obtain enough food for growth, reproduction and metabolic maintenance. The reduction of the feeding rate in primary consumers, as D. magna, could result in profound changes at the population level, since all of the main parameters for population growth and survival are dependent on the input of energy into the animals (Villarroel et al., 2003). Thus, chronic exposures of these organisms to an herbicide may reduce their ability to obtain adequate nutrition, probably through feeding depressions in quality (e.g., reduced ingestion or assimilation rates) and, consequently the organisms will decrease their records of fecundity and survival (Trubetskova and Lampert, 2002; Villarroel et al., 2003). In this way, the life-cycle-related tests on the exposure of D. magna to the herbicide can provide relevant information about low-dose effects in long terms exposure, therefore allowing interferences on both the direct effects of the toxic on the organisms and the indirect ones related with the decrease of the quality of the nutrition promoted by the toxic.
During the chronic assay, high rates of aborted eggs and embryos were recorded with exposures above 0.098 mg/L of Stam and 0.123 mg/L of Propanil. Since unviable offsprings (eggs and embryos) make impracticable the most of the calculations associated with the reproductive parameters, the concentrations ranges were reduced until viable neonates arise. In fact, Baird et al. (1989) reported that this pattern of chronic inhibition of reproduction in D. magna by 3,4-DCA (Propanil metabolite) was due exclusively to the acute lethal effects of the chemical on eggs developing in the brood chamber. Propanil has a very slow degradation pathway (half-life about 5000 days) (Orme and Kegley, 2004) and care was taken in proper storage of the stock solutions for delaying the Propanil degradation. Therefore, the above described observations on the viability of the progeny seems to evidence that as DCA, Propanil promotes, by itself, the abnormal development of eggs in Daphnia.
The LOECs determined for the several reproductive endpoints showed generally that Stam was more chronically toxic than Propanil, contrarily to what was found for the acute assays. Furthermore, as it was aforementioned, the greatest and most direct effect of Stam and Propanil exposure at sublethal concentrations was observed in the brood chamber affecting the neonates production.
Statistical analysis revealed a significant inhibition on fecundity for D. magna, when exposed to increasing concentrations of Stam (Fig. 2). Moreover, Stam induced a significant
inhibition of the DGR (Fig. 5), which indicates that at this toxic range the organisms allocated more energy in the reproduction than in growth, however not at an enough rate to balance the decrease in the progeny. The same pattern was registered for Propanil. Considering that the tested concentration ranges were adjusted to avoid relevant production of non-viable progeny, the hypothesis of the impact of the brood chamber to explain the fecundity reduction should be discarded. In this way, the effects on fecundity were probably due to changes in feeding-rate or nutrition processes. In fact Villarroel et al. (2003) found significant decreases in filtering and ingestion rates of Daphnia exposed to Propanil.
The life-history traits generally analysed in reproduction tests give special attention to the first brood due to its ecological relevance, as its release minimizes the extinction of the species in ecosystems, whenever their maintenance is constrained (Stibor and Lampert, 1993). When comparing the number of released neonates and the size of females at the first reproduction, Stam and Propanil were consistent as both the chemicals induced a significant inhibition in both endpoints. Hanazato (1998, 2001) reported that the number of offspring per clutch is not directly impaired by toxic chemicals and rather, it is a function of maternal body size, which in turn is governed by growth rate during the juvenile stage. Therefore, the decreasing pattern of the number of neonates herein observed with increasing concentrations of Stam and Propanil in D. magna results indirectly from the perturbation of juvenile growth. In fact, toxic chemicals such as pesticides reduce the growth rate of neonates and cause the neonates to mature at a smaller size with subsequently fewer eggs (Hanazato, 2001).
Until now, the effects of Stam and Propanil have been assessed at individual-level responses. Overall, Forbes and Callow (1999) came to the conclusion that r can be a better measure of responses to toxicants than the individual-level endpoints, because it integrates potentially complex interactions among life-history traits (e.g., survival, reproductive output, age at each brood release), providing a more relevant measure of ecological impacts. When exposed to Stam, the r of D. magna significantly decreased with the increase of concentrations. In fact, there was a high fecundity inhibition induced by Stam on the species, thereafter producing a relevant impact on the reduction of its population growth estimate. On the other hand, increasing concentrations of Propanil diminished (though not significantly) D. magna population growth estimate, which is in close agreement with the correspondent fecundity rates.
Stam affected either fecundity and population growth rate or the somatic growth of D. magna, therefore showing ability not only to affect the species at the individual-level but also to produce changes in the population structure in long-term exposures. Considering that Propanil only has affected the fecundity and somatic growth of the organisms, there are evidences of an additional toxicity stimulus related with the (unknown) adjuvant compounds that constitute, with the active ingredient, the commercial solution.
Acknowledgements
J. L. Pereira is a recipient of a PhD grant from the Portuguese Foundation for Science and Technology (SFRH/BD/13682/2003).
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Legend of Figures
Figure 2. Number of neonates produced during 21 days by D. magna at different concentrations of Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05). See Table I for test concentrations.
Figure 3. Number of neonates from the first brood of D. magna, at different concentrations of Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05). See Table I for test concentrations.
Figure 4. Size of D. magna at the first reproduction, at different concentrations of Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05). See Table I for test concentrations.
Figure 5. Daily growth rate (DGR) of D. magna at different concentrations of Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05). See Table I for test concentrations.
Figure 6. Population growth rate (r) of D. magna, at different concentrations of Stam Novel Flo 480® and Propanil. Errors bars represent standard error, and ∗ indicates the statistically significant differences to the control (p < 0.05). See Table I for test concentrations.
Figures
Control
Stam Novel Flo 480® Propanil Treatments C 1 2 3 4 5 6 Total num ber of neonates 0 20 40 60 80 100 120 140 * * * C * * * * Treatments C 1 2 3 4 5 6 Number of neonates of 1 st brood 0 2 4 6 8 10 12 * * * C Treatments C 1 2 3 4 5 6 Siz e of females at 1 st reproduct ion (m m) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 * * * * * * * * C Treatments C 1 2 3 4 5 6 Dail y grow th rate (day -1 ) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 * * * * * * * * * * * * C Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5
Treatments C 1 2 3 4 5 6 In tr in sic ra te o f in cr ea se ( da y-1 ) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 * C Figure 6
Tables
Table III. Test concentrations (mg/L) plus control for each of the acute and chronic assays.
Stam Novel Flow 480® Propanil
Acute assay1 Chronic assay Acute assay Chronic assay
C 0 0 0 0 1 1.250 0.013 0.075 0.016 2 1.875 0.019 1.125 0.024 3 2.813 0.029 1.688 0.036 4 4.219 0.043 2.531 0.055 5 6.328 0.065 3.797 0.082 6 9.492 0.098 5.695 0.123
1The concentrations were established regarding to the active ingredient (Propanil)
quantity in the commercial solution.
Table IV. EC50 values (mg/L) after 48h exposures to Stam Novel Flo 480® and Propanil
with the respective 95% confidence limits for D. magna.
EC50 Lower CL95% Upper CL95%
Stam Novel Flow 480® 3.554 3.165 4.051
Table V. NOECs and LOECs (mg/L) determined for sublethal endpoints for D. magna.
Stam Novel Flow 480® Propanil
NOEC LOEC NOEC LOEC Total number of neonates _____ _____ 0.036 0.123 Neonates at 1st brood 0.065 0.098 0.055 0.123 Size of females-1st brood 0.013 0.098 0.036 0.123 Population growth rate 0.065 0.098 _____ _____
CAPÍTULO III
Acute and chronic effects of a mixture of pesticides
and active ingredients in
Daphnia magna
Acute and chronic effects of a mixture of pesticides and active ingredients in Daphnia
magna
Mendes, C. D., Pereira, J. L*. and Gonçalves, F.
Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, Campus Universitário de Santiago, 3810-193 Aveiro, Portugal.
* Corresponding author: e-mail: jpereira@bio.ua.pt Phone: +351 234 370 788 Fax: +351 234 426 408
Abstract
This study is reported to the effects on Daphnia magna of the exposure to mixtures with the herbicide Stam Novel Flo 480® in combination with the insecticide Lannate® as well as with its active ingredients (Propanil and Methomyl). The Toxicity Units (TU) method was applied for the clarification of the responses shape in the exposure to each mixture: additive, greater than additive or less than additive responses. For the binary mixture of Stam Novel Flo 480® and Lannate® a TU of 0.905 was recorded while for the combination of Propanil and Methomyl the calculated TU achieved a value of 1.568. Results show that the combination of Stam Novel Flo 480® and Lannate® produce greater than additive (synergism) acute toxicity and the mixture of Propanil and Methomyl exhibited less than additive (antagonism) acute toxicity to D. magna. The chronic assays revealed that the daily growth rate of D. magna is susceptible to the binary combination of Stam Novel Flo 480® and Lannate® effects; whereas for its active ingredient Propanil and Methomyl, reproduction, daily growth rate and population growth rate were the most sensitive parameters.
Key Words: Daphnia magna, TU, mixture toxicity; life-history traits, Methomyl, Propanil, synergism, antagonism.
Introduction
The use of several types of agrochemicals is a widespread practice that enhances the presence of potentially toxic chemicals in the environment. Pesticides are brought into the environment with the explicit intention of exerting toxic effects on one or more target organisms (Deneer, 2000). Furthermore, normal agricultural practices may involve the use of combinations of several pesticides in the same crop or in different crops in the same area (Cuppen et al., 2002) which can generate final pools of complex mixtures that often have a higher toxic potential. Notwithstanding, their toxicity is usually not limited to the location where the agrochemicals are applied but reaches frequently other locations and environmental compartments through several types of physical transport (Deneer, 2000; Van Den Brink et al., 2002)
Traditional toxicity evaluations of pesticides are based mainly on the effects of a single test chemical substance in single species tests (e.g., alga, cladocerans, fish), using standard procedures under laboratory conditions and assessing standard endpoints such as EC50’s, LOEC’s or NOEC’s. Even though, it is possible that cooccurring pesticides may interact to produce unexpected effects and therefore integrated multilevel studies are generally needed to interpret these effects because of the variety of levels at which chemical contaminants may act (Banks et al., 2005; Cuppen et al., 2002). However, these studies need baseline information on each level to efficiently be settled and consequently provide effective and trustable data.
The mixtures of pesticides and physical stressors can cause behavioural, physiological or biochemical changes, death or other adverse effects in aquatic non-target organisms, eventually distinct from those observable in single exposures. While eventually more realistic, responses of an organism to pesticides mixtures can easily become difficult to interpret (Herbrandson et al., 2002). It is already stated that mixtures can produce effects that are additive, less than additive or antagonistic and more than additive or synergistic (Mahar and Watzin, 2005; Woods et al, 2002). Thus, when chemicals with similar modes of action are combined, it is generally assumed that they have additive effects (Herbrandson et al., 2002).
For mixtures of pesticides, with more specific and distinct modes of action, very little experimental work has been reported. Hoagland et al. (1993) studied the individual and
