Síntese, caracterização e possível atividade bactericida do complexo [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA CURSO DE QUÍMICA - BACHARELADO

KATHERINE LIMA BRUNO

SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E POSSÍVEL ATIVIDADE BACTERICIDA DO COMPLEXO [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl

NATAL 2019

SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E POSSÍVEL ATIVIDADE BACTERICIDA DO COMPLEXO [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl

Trabalho de conclusão de cursoapresentado ao curso de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Química.

Orientador: Prof. Dr. Francisco Ordelei Nascimento da Silva.

Co-orientadora: M.ª Dayana Patrícia da Silva Penha.

NATAL 2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Francisco Gurgel De Azevedo - Instituto Química - IQ

Bruno, Katherine Lima.

Síntese, caracterização e possível atividade bactericida do complexo (Cu(phen)(pyr)NO2)Cl / Katherine Lima Bruno. - NATAL: UFRN, 2019.

84f.: il.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) -

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra - CCET, Instituto de Química. Curso de Química Bacharelado.

Orientador: Dr. Francisco Ordelei Nascimento da Silva. Coorientador: Mª. Dayana Patrícia da Silva Penha.

1. Complexos de Cobre. 2. Pirazinamida. 3. Pseudomonas Aeruginosa. I. Silva, Francisco Ordelei Nascimento da. II. Penha, Dayana Patrícia da Silva. III. Título.

RN/UF/BSQ CDU 54

SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E POSSÍVEL ATIVIDADE BACTERICIDA DO COMPLEXO [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Química.

Aprovada em: ______/______/______

BANCA EXAMINADORA

______________________________________ Prof. Dr. Francisco Ordelei Nascimento da Silva

Orientador

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

______________________________________ Mª. Dayana Patrícia da Silva Penha

Co-orientadora e membro interno

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

______________________________________ Profª. Drª. Lívia Nunes Cavalcanti

Membro externo

Aos meus pais, por sempre apoiarem minhas decisões e por mostrarem que a educação é o caminho para a transformação.

Aos meus avós, in memoriam, por terem cuidado tão bem de mim e me ensinarem o real significado de amor.

sinônimos do que, costumeiramente, chamo de Deus. Gratidão a Ele pela proteção em tempos tão difíceis; por sempre colocar pessoas de luz em minha vida; e pela orientação de conduzir a todos os caminhos que me trouxessem até aqui.

À minha mãe, meu porto seguro, minha inspiração e combustível diário, que me criou sozinha por muito tempo e batalhou para que eu tivesse sempre o melhor. Verdadeiro significado de mulher guerreira, independente e forte. Toda a minha educação eu devo a você, minha heroína. Obrigada por aceitar minha vinda à Natal em busca dos meus sonhos. O meu amor por você é imensurável.

Aos meus avós, in memoriam, que cuidaram de mim enquanto minha mãe trabalhava. Por todo amor e carinho que me deram e me ensinaram a doar. Por toda a paciência e cuidado diário. Vocês foram essenciais para a construção do meu ser emocional.

Ao meu pai, ainda que, por certos anos, ausente, me ensinou a importância do perdão e da reconciliação. Ensinou-me sobre justiça, sobre o feliz ajudar o infeliz e sobre fazer o que ama. Nossa aproximação esse ano, mesmo distantes, foi muito significativo pra mim, obrigada por isso.

Ao meu padrasto, o qual foi um pai pra mim desde os meus 11 anos e me ensinou que o conhecimento é nosso maior tesouro, pois é a única coisa que ninguém nos tira. Obrigada por todo amor e por todo o incentivo que sempre me deu para trilhar as estradas do saber.

A toda minha família que esteve sempre comigo, em todos os momentos, e que, sem eles, não seria 1% do que sou hoje. Tenho a consciência que a maioria não teve oportunidade de ter uma graduação, mas dedico esse trabalho e meu título a todos vocês.

Ao meu amor, Lucas, que antes mesmo de ser namorado, foi amigo. Acompanha-me desde 2014 em minha jornada, sempre muito paciente, doce e acolhedor. Um exemplo de homem, amigo e amante. Obrigada por todo apoio e todo amor que me proporciona. Obrigada também pela compreensão e cuidado nesses últimos meses de turbulências acadêmicas. Que possamos sempre desfrutar e compartilhar momentos juntos, sejam eles quais forem. Minha fortaleza, meu melhor amigo, meu companheiro de vida. Aos meus sogros Viviane e Edilson por toda a força, acolhimento e momentos dedescontração, desde que cheguei em Natal.

ensinamentos diários, nem sempre sobre a química, e por toda a paciência, acompanhamento e motivação. Devo grande parte do meu crescimento acadêmico ao senhor.

À minha co-orientadora e amiga, Dayana, que desde o princípio me ajudou, ensinou e acompanhou, com toda a paciência, amor e atenção. Sou muito grata a você, um ser de luz, que considero como minha mãe acadêmica.

Aos professores Daniel e Ana Cristina por terem me acompanhado em minha trajetória acadêmica, no esclarecimento de dúvidas, na atenção, nos conselhos, na instrução e nos momentos de descontração.

A todos os meus professores, desde a escola até a graduação. Cada um de vocês foi responsável pelo meu encaminhamento até onde cheguei. Obrigada aos meus professores de química do ensino fundamental/médio, em especial Luciano, que criou e nutriu meu sentimento de amor pela química. Obrigada aos meus professores da graduação pelo entendimento e encantamento ainda maior por essa ciência tão mágica.

Ao Lucas Menezes, meu terapeuta, e hoje, amigo. Obrigada por me ajudar a segurar a barra quando eu achava que não tinha mais saída. Esses últimos meses foram bem desgastantes e você me ajudou a enxergar tudo com melhores olhos, ensinou que devo sempre ser eu mesma e que não há problema sentir qualquer sentimento. Você é luz!

Aos meus amigos extra-universidade, do Rio de Janeiro e de Natal, em especial Luísa, Bianca, Luana e os meus grandes amigos do Camões, Bahiense e CEI. Obrigada por confiarem sempre em mim e na minha capacidade. Por vocês sempre serem colo e por todo amor e carinho que amigos de verdade entregam. Vocês são os melhores! Suas amizades são meu ímpeto!

A todos os meus amigos da graduação que foram importantes em diversos momentos do meu dia a dia na faculdade. Obrigada por pularem de cabeça junto comigo nesse curso e nessa ciência. Cada um tem seu espaço em meu coração. Obrigada pelo convívio e compartilhamento de tantas experiências.

Aos meus amigos do Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros (LQCPol): Aimée, Alexsandro, Anallicy, Andresa, Beatriz, Dayana, Dayane, Francimar, Ghabriela, Juliany, Lalyson, Magno, Maria, Mayara, Talita,Thuanny, Verônica e Wendy. Obrigada por todos os momentos de alegria, atenção, ensinamentos, instruções

Ao laboratório de Microbiologia Clínica, em nome da profª. Drª. Maíza Rocha Abrantes, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela contribuição com os testes bacterianos.

À UFRN pela oportunidade de cursar Química.

Ao Programa de Educação Tutorial pelo meu engrandecimento, não só como aluna, mas como pessoa. Obrigada pelos ensinamentos acerca dos três pilares da Universidade: ensino, pesquisa e extensão.

Ao CNPq e ao FNDE pelo apoio financeiro, com concessão de oportunidade de bolsas de estudos em diferentes momentos da graduação.

Gratidão a todos que sempre acreditaram em mim e que, de alguma forma, contribuíram para a realização desse trabalho.

A ciência não pode resolver o mistério final da natureza. E isto porque, em última análise, somos parte do mistério que tentamos resolver.

complexos metálicos vêm desempenhando um papel muito importante na química bioinorgânica. Dentre esses, destacam-se os compostos de cobre(II), que desempenham um papel significativo em sistemas biológicos, sendo de ocorrência natural ou como agentes farmacológicos. Devido à diversidade estrutural e amplo espectro de suas atividades bioquímicas, esses complexos são notados pelo seu grande potencial na terapia antibiótica. Com o efeito sinérgico entre o metal e alguns ligantes que já possuem atividades no tratamento de diversas doenças, como fenantrolina, pirazinamida e nitrito, torna-se possível o desenvolvimento de fármacos com maior potencialidade. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo a síntese e caracterização de um novo complexo de cobre, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, com possível atividade bactericida ou bacteriostática frente à bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa. A obtenção do nitrocomplexo foi possível a partir da reação entre o seu precursor, [Cu(phen)Cl2], e os ligantes pirazinamida e nitrito, sendo caracterizado por técnicas espectroscópicas (infravermelho, Raman e UV-vis) e eletroquímica (voltametria cíclica). Por meio das espectroscopias vibracionais, foi possível verificar os principais modos vibracionais da fenantrolina, bem como o estiramento C=O da pirazinamida e os estiramentos do ligante nitrito no infravermelho, que evidenciaram sua coordenação via átomo de nitrogênio. Adicionalmente, foi possível, ainda, a visualização de estiramentos Metal-Ligante no Raman, exibindo a ligação do cobre-nitrogênio na região de 400 cm-1. Os espectros eletrônicos do composto de interesse na região do UV-vis apresentaram bandas intraligantes, entre 200 e 400 nm e uma banda d-d em 690 nm para o nitrocomposto. Os voltamogramas cíclicos permitiram a visualização de um sistema quase-reversível, com apenas um processo redox, tanto para o precursor como para o nitrocomposto, referente ao par Cu2+/1+_{. Além disso, o potencial redox, bem como de meia-onda diminuíram com} a troca dos ligantes cloretos por pirazinamida e nitrito, revelando não só uma maior estabilidade para o metal em sua forma oxidada, mas do maior caráter π-receptor e σ-doador desses ligantes. Por fim, foi testada a atividade bactericida do nitrocomplexo frente às bactérias Pseudomonas aeruginosa ATCC – 9027, o qual apresentou um valor de MIC de 229 μg/mL, apresentando atividade bacteriostática promissora, comparado a outros compostos da literatura.

In search of new more efficient structures in medicinal treatments, metal complexes have been playing a very important role in bioinorganic chemistry. These include copper(II) compounds, which play a significant role in biological systems, being naturally occurring or as pharmacological agents. Due to the structural diversity and broad spectrum of their biochemical activities, these complexes are noted for their great potential in antibiotic therapy. With the synergistic effect between the metal and some ligands that already have activities in the treatment of various diseases, such as phenanthroline, pyrazinamide and nitrite, it is possible to develop drugs with greater potential. In this context, the present work aims the synthesis and characterization of a new copper complex, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, with possible bactericidal or bacteriostatic activity against the bacteria of the species Pseudomonas aeruginosa. The nitrocomplex was obtained from the reaction between its precursor, [Cu(phen)Cl2], and the pyrazinamide and nitrite ligands, being characterized by spectroscopic (infrared, Raman and UV-vis) and electrochemical (cyclic voltammetry) techniques. Through the vibrational spectroscopies, it was possible to verify the main phenanthroline strains, as well as the pyrazinamide C=O stretch and the main nitrite stretches in the infrared, which showed its coordination via Nitrogen atom. Additionally, it was possible to visualize Metal-Binder strains in Raman, showing the binding of Copper-Nitrogen in the region of 400 cm-1. The electronic spectra of the compound of interest in the UV-vis region showed intraligant bands, between 200 and 400 nm and a d-d band at 690 nm for nitrocompound. The cyclic voltammograms allowed the visualization of a quasi-reversible system, with only one redox process, for both precursor and nitrocompound, referring to the pair Cu2+/1+. In addition, the redox as well as half-wave potential decreased with the exchange of the chloride ligands for pyrazinamide and nitrite, revealing not only greater stability for the oxidized metal, but also their greater π-receptor and σ-donor character of the last ligands. Finally, the bactericidal activity of nitrocomplex against Pseudomonas aeruginosa ATCC - 9027 was tested which presented a MIC value of 229 μg / mL, showing promising bacteriostatic activity compared to other compounds in the literature.

Figura 1 – Estrutura molecular da 1,10-fenantrolina... 24 Figura 2 –

Figura 3 –

Estrutura molecular da pirazinamida... Modos de coordenação do ligante pirazinamida a centros metálicos...

25

25 Figura 4 – Modos de coordenação do ligante nitrito a centros

metálicos... 27 Figura 5 – Diagrama esquemático das paredes celulares de bactérias

Gram-positivas(a) e Gram-negativas(b)... 28 Figura 6 – Pseudomonas aeruginosa... 29

Figura 7 – Mecanismos de resistência bacteriana... 29 Figura 8 – Estrutura proposta para o complexo precursor

[Cu(phen)Cl2]... 32 Figura 9 – Estrutura proposta para o complexo

[Cu(phen)(pyr)NO2]Cl... 32 Figura 10 – Espectro vibracional do complexo precursor [Cu(phen)Cl2] na região

de 4000 a 400 cm-1_{, em pastilha de} KBr... 37 Figura 11 – Espectro vibracional do complexo precursor [Cu(phen)Cl2] na região

de 1650 a 1000 cm-1_{(a) e de 1000 a 400 cm}-1_{(b),em pastilha de} KBr... 38 Figura 12 – Espectro vibracional do ligante pirazinamida na região de 4000 a 400

cm-1, em pastilha de KBr... 40 Figura 13 – Espectro vibracional do ligante pirazinamida na região de 1750 a 1000

cm-1(a) e de 1000 a 400 cm-1(b), em pastilha de KBr... 41 Figura 14 – Espectro vibracional do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl,

na região de 4000 a 400cm-1, em pastilha de KBr... 43 Figura 15 – Espectro vibracional do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl,

na região de 1700 a 1200cm-1, em pastilha de KBr... 44

KBr... 46 Figura 17 – Sobreposição dos espectros vibracionais do composto de interesse

(verde), [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, do precursor (vermelho), [Cu(phen)Cl2] e do ligante (preto), pirazinamida, na região de 4000 a 400cm-1(a) e de 1750 a 1000 cm-1(b), em pastilha de KBr... 47 Figura 18 – Sobreposição dos espectros de Infravermelho (vermelho) e Raman

(preto) do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, na região de 4000 a 400cm-1, em pastilha de KBr e em laser de 532 nm, respectivamente... 49 Figura 19 – Sobreposição dos espectros de Infravermelho (vermelho) e Raman

(preto) do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, na região de 4000 a 1800 cm-1(a), 1800 a 1000 cm-1(b) e de 1000 a 400 cm-1(c), em pastilha de KBr e em laser de 532 nm, respectivamente... 50 Figura 20 – Sobreposição dos espectros de Raman do composto de interesse

(verde) e do precursor (preto), na região de 500 a 100 cm-1 em laser de 532 nm... 51 Figura 21 – Espectro eletrônico do complexo precursor [Cu(phen)Cl2] na região de

190 a 900 nm, em meio aquoso, na concentração de 2,0 x 10-5 mol.L -1_{(a) e sua ampliação na região de 500 a 900} nm(b)... 53 Figura 22 – Sobreposição dos espectros do precursor e da fenantrolina na região de

190 a 900nm, na concentração de 2,0 x 10-5 mol.L-1(a) e sua ampliação na região de 190 a 320 nm(b)... 55 Figura 23 – Espectro eletrônico do complexo [Cu(phen)(pyr)(NO2)]Cl na região de

190 a 900 nm, em meio aquoso, na concentração de 2,0 x 10-5 mol.L -1_{(a) e sua ampliação na região de 500 a 900} nm(b... 56 Figura 24 – Sobreposição dos espectros do composto de interesse (verde),

Figura 25 – Sobreposição dos espectros do complexo [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl em água (preto), metanol (verde) e acetonitrila (vermelho) na região de 190 a 900 nm(a) na região de 500 a 1000 nm(b)... 59 Figura 26 – Sobreposição dos espectros do precursor [Cu(phen)Cl2](vemelho) e do

composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)(NO2)]Cl (verde), na região de 190 a 900nm e concentração de 2,0 x 10-5 mol.L-1(a) e sua ampliação na região de 500 a 900 nm(b)... 60 Figura 27 – Voltamograma cíclico do complexo precursor, [Cu(phen)Cl2], em

DMSO e TBAP 0,1M... 63 Figura 28 –

Figura 29 –

Voltamograma cíclico do complexo de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, em DMSO e TBAP 0,1 mol/L... Voltamogramas cíclicos sobrepostos do complexo de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl em diferentes velocidades (a) e a relação entre correntes de pico catódica e anódica (ipce ipa) e as raízes das velocidades de varredura(b) em DMSO e TBAP 0,1M...

66

67 Figura 30 – Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do composto precursor e de

interesse, em DMSO e TBAP 0,1M... 69 Figura 31 – Porcentagem de viabilidade do inóculo pela concentração do

Tabela 1 – Reagentes utilizados para os procedimentos experimentais e de análises... 31 Tabela 2 – Equipamentos utilizados para os métodos de

caracterização... 33 Tabela 3 – Atribuições das principais bandas do espectro de infravermelho do

composto precursor [Cu(phen)Cl2] e

referências... 39 Tabela 4 – Atribuições das principais bandas do espectro de infravermelho do

ligante pirazinamida e referências... 42 Tabela 5 – Principais bandas do espectro de infravermelho comuns ao

nitrocomposto, precursor e ligante, bem como suas atribuições... 48 Tabela 6 – Comprimentos de onda, absortividades molares e respectivas atribuições

das bandas do espectro do complexo precursor [Cu(phen)Cl2]... 60 Tabela 7 – Comprimentos de onda, absortividades molares e respectivas atribuições

das bandas do espectro do complexo

[Cu(phen)(pyr)(NO2)]Cl... 57 Tabela 8 – Efeito dos solventes (água, metanol e acetonitrila) nos deslocamentos

das bandas do complexo

[Cu(phen)(pyr)(NO2)]Cl... 59 Tabela 9 – Valores calculados para alguns dos parâmetros de reversibilidade para o

composto precursor [Cu(phen)Cl2]... 65 Tabela 10 – Valores calculados para alguns dos parâmetros de reversibilidade para o

composto de interesse [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl... 68 Tabela 11 – Valores de potenciais para o complexo precursor e de

interesse... 69 Tabela 12 – Dados comparativos das concentrações inibitórias mínima entre

nitrocomplexo e alguns complexos da literatura frente às bactérias

CV Voltametria Cíclica

DNA Ácido Desoxirribonucleico DMSO Dimetilsulfóxido

IV Infravermelho NHE

Ox

Eletrodo normal de hidrogênio Oxalato

Phen 1,10-fenantrolina Pyr Pirazinamida

R Raman

ROS Espécies reativas de oxigênio TBAP Perclorato de tetrabutilamônio %T Transmitância

1 2 2.1 2.2 INTRODUÇÃO... OBJETIVOS... OBJETIVO GERAL... OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 19 21 21 21 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA... BIOINORGÂNICA DO COBRE... COMPLEXOS COM FENANTROLINA... PIRAZINAMIDA NA MEDICINA... QUÍMICA DO NITRITO...

BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS: PSEUDOMONAS

AERUGINOSA... ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTERIOSTÁTICA DE COMPOSTOS DE COBRE... 22 22 23 24 25 27 29 4. METODOLOGIA... 31 4.1 4.2 4.2.1 4.2.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.2.1 4.3.2.2 4.3.2.3 4.3.2.4 5. 5.1 REAGENTES... PROCEDIMENTOS DE SÍNTESE... Síntese do complexo[Cu(phen)Cl2]... Síntese do complexo [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl... EQUIPAMENTOS E TÉCNICAS EXPERIMENTAIS... Equipamentos... Técnicas experimentais...

ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO... ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL RAMAN... ESPECTROSCOPIA ELETRÔNICA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA E VISÍVEL... ELETROQUÍMICA... ENSAIOS BACTERIANOS... RESULTADOS E DISCUSSÃO...

ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO E ESPALHAMENTO 31 31 31 32 33 33 33 33 33 34 34 34 36

5.1.1.1 5.1.1.2 5.1.1.3 5.1.1.4 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.4 6. 7.

Espectros do complexo precursor [Cu(phen)Cl2]... Espectros do ligante pirazinamida...

Espectros do composto de interesse

[Cu(phen)(pyr)(NO2]Cl... Comparação dos espectros de Infravermelho e Raman... ESPECTROSCOPIA ELETRÔNICA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA E VISÍVEL... Espectro do complexo precursor [Cu(phen)Cl2]... Espectro do complexo [Cu(phen)(pyr)(NO2)]Cl... Comparação entre os espectros do composto precursor, [Cu(phen)Cl2], e do de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl... ELETROQUÍMICA... Voltametria Cíclica do composto precursor, [Cu(phen)Cl2]... Voltametria Cíclica do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl... Comparação dos voltamogramas do composto precursor e de interesse... ENSAIOS BACTERIANOS... CONCLUSÃO... REFERÊNCIAS... 36 39 42 48 52 52 55 60 61 62 65 68 70 73 74

1. INTRODUÇÃO

Segundo a Organização Mundial de Saúde, a infecção microbiana está entre as cinco primeiras causas de óbito no mundo (NG et al., 2016), sendo esse quadro agravado devido ao aumento da resistência dos agentes patológicos aos fármacos utilizados (CIFUENTES-VACA et al., 2019). Dentre esses microrganismos, destaca-se a

Pseudomonas aeruginosa, principal bactéria oportunista causadora de infecções

hospitalares, afetando, principalmente, indivíduos com o sistema imunológico comprometido, como pacientes de fibrose cística, queimaduras, imunodeficiência ou aqueles que recebem ventilação artificial (KARAMI et al., 2019).

Devido à baixa eficiência de um amplo espectro de antibióticos convencionais frente aos microrganismos super-resistentes, a busca no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos antimicrobianos tornou-se um dos principais objetivos na química bioinorgânica e medicinal (LEITE et al., 2019).

Nesse contexto, os compostos de coordenação têm mostrado grande destaque em razão de sua maior potencialidade, principalmente pela presença de metais, os quais desempenham diversas funções no organismo. Dentre eles, o cobre, que além de apresentar baixa toxicidade, está presente como cofator em diferentes enzimas, como a superóxido dismutase (SOD) (SZÉKÁCS et. al., 2019), responsável pela eliminação dos radicais superóxido e considerada um antioxidante essencial nas células aeróbias. Esse metabolismo celular também pode levar à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que resultam em estresse oxidativo (HILEMAN et al., 2001). Devido a essa capacidade, complexos de cobrepodem gerar danos em moléculas vitais para o funcionamento das bactérias, como proteínas e o DNA (XIKERANMU, et. al, 2019).

Aliados às características do metal, alguns ligantes possuem particularidades que chamam atenção. Ligantes piridínicos, como a fenantrolina, são retratados na literatura como agentes quelantes que desempenham eficientes interações com o DNA.Complexos de cobre coordenados a essas moléculas apresentam afinidade mais forte (BARONE et al., 2013), danificando oxidativamente e clivando os ácidos nucleicos, mimetizando as nucleases (MEDICI et al., 2015). Em razão disso, podem exibir potenciais atividades antibacterianas contra bactérias da espécie Pseudomonas

aeruginosa (GOMLEKSIZ et al., 2013). Somadas às características da fenantrolina,

outro ligante com propriedades promissoras e já conhecidas na medicina é a pirazinamida, um antibiótico utilizado para o tratamento da tuberculose, doença causada pela bactéria Mycobacterium turbeculosis (VILLEMAGNE et al., 2014).Essa molécula,

quando coordenada a centros metálicos,pode seroxidada no meio celular, gerando assim, a forma ativa deste medicamento (LIMA et al., 2011).

Por sua vez o nitrito, atuando como ligante auxiliar,pode se reduzir a óxido nítrico no organismo, desempenhando diversas funções como a vasodilatação, respostas imunológicas e interação com ácido nucleico em que, a partir de reações do NO com espécies de O2-, O2 ou H2O2, forma radicais livres e pode clivar o DNA (HO et al., 1997). Adicionalmente, a formação desses produtos reativos, como o peroxinitrito (ONOO-) e trióxido de dinitrogênio (N2O3),está relacionada com sua potente ação antibacteriana, causandoestresses nitrosativos e oxidativos graves nas bactérias,levando à ruptura de suas membranas celulares e, como consequência, sua disfunção (LI et al., 2018).

Dessa forma, devido à relevância no estudo das moléculas e do metal descritos, este trabalho busca o desenvolvimento na síntese e caracterização de um complexo de cobre com os ligantes fenantrolina, pirazinamida e nitrito, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, que possua características antibacterianas ou bacteriostáticas frente à bactérias Pseudomonas

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Este trabalho tem como objetivo a contribuição para a química de coordenação no desenvolvimento de um novo complexo com cobre como centro metálico, devido suas características fisiológicas, em conjunto com os ligantes fenantrolina, pirazinamida e nitrito, os quais possuem aspectos biológicos interessantes que os dão aplicabilidades medicinais. O estudo terá como base sua síntese e caracterização, sendo verificada, ainda, a possibilidade de atividade bactericida ou bacteriostática do composto.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Sintetizar o complexo de cobre [Cu(phen)Cl2] como precursor para a síntese do composto de interesse [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, em que phen ≡ fenantrolina, pyr ≡ pirazinamida e NO2- ≡ nitrito;

 Estudar e caracterizar os complexos e ligantes por meio das técnicas espectroscópicas vibracionais na região do infravermelho (IV) e Raman (R) e eletrônica na região do ultravioleta e visível (UV-Vis), bem como avaliar as características eletroquímicas por meio da técnica de voltametria cíclica (CV);  Realizar ensaios de atividade antibacteriana e bactericida do complexo de

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 3.1. BIOINORGÂNICA DO COBRE

A Química Bioinorgânica é uma subárea da Química Inorgânica que lida com o papel molecular que metais e metaloides desempenham em sistemas vivos, sendo benéficos ou tóxicos e utilizados como medicamento ou como diagnóstico (REEDIJK, 2013). Além disso, apesar de terem grande relevância, os metais de transição presentes no organismo são conhecidos comoelementos-traço,devidosuas baixas concentrações.

Um exemplo é o cobre,um dos metais de maior destaque, que desempenhadiversos papeis biológicos. No corpo humano, esse oligoelemento é encontrado em quantidades relativamente altas, sendo encontrado, em sua maior parte, no esqueleto e medula óssea, seguido dos músculos esqueléticos, fígado, cérebroe sangue (CRISPONI et al., 2010) .

O uso de cobre em sistemas biológicos coincide com o início de uma atmosfera de oxigênio há 1,7 bilhão de anos. A presença de O2 permitiu a oxidação do Cu(I) insolúvel ao Cu(II) mais solúvel, estável e biodisponível, o que levou à exigência de um metal ativo redox compotenciais na faixa de 0 a 800 mV (vs NHE). Como resultado, o cobre desempenha um papel fundamental em muitas proteínas que reagem com O2(BOALet al., 2009; SANTINI et al., 2014), devido, principalmente, a sua aptidão em alternar entre suas formas oxidada e reduzida.Ainda, os efeitos dos metais caracterizados por estados variáveis de oxidação, como o cobre, dependem acentuadamente da forma predominante do metal (nesse caso, Cu2+_{), que por sua vez} depende do potencial redox e do ambiente de coordenação.

Grande parte do cobre, no corpo humano, é destinada a diversas funções, principalmente como cofator de diferentes enzimas redox,dentre elas a superóxido dismutase (SOD)(SZÉKÁCS et. al., 2019), uma enzima antioxidante que atua na desintoxicação de radicais livres de superóxido (O2-) no citoplasma, as ROS – ou espécies reativas de oxigênio – catalisando a dismutação dos ânions superóxidos em espécies menos reativas – peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio molecular (O2)(XIKERANMU, et. al, 2019), controlando o estresse oxidativo.

Devido sua influência sobre o estresse oxidativo, a homeostase do cobre é importante ainda na proteção contra doenças degenerativas humanas que afetam uma ampla variedade de funções fisiológicas, como a aterosclerose, diabetes, doenças inflamatórias, câncer, doenças neurológicas, hipertensão, doenças oculares, doenças pulmonares e doenças hematológicas (BHAT et al., 2019).

O cobre também é essencial na síntese e desnaturação de neurotransmissores, na formação de pigmentos, na síntese de tecido conjuntivo e no metabolismo do ferro (CRISPONI et al., 2010). Está envolvido, ainda, no transporte de oxigênio, reações de oxigenação, transferência de elétrons, respiração celular e redução de nitrito.Além do mais, vários relatórios alertaram que complexos de cobre têm atividades antibacterianas, antivirais, antifúngicas, anti-inflamatórias e podem atuar também como agentes antitumorais (TITI et al., 2019).Todas essas ações do cobre, que é eficaz, principalmente, no controle de microorganismos, devem-se, portanto, aos seus mecanismos de ação, que incluem múltiplos efeitos tóxicos (como a geração de espécies reativas de oxigênio, peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e degradação do DNA), os quais estão intimamente ligados ao comportamento redox Cu(I)/Cu(II) (GIANNOUSIet al., 2014).

3.2. COMPLEXOSCOM FENANTROLINA

A fenantrolina– 1,10-fenantrolina, pela IUPAC – é um composto orgânico heterocíclico aromático que contém átomos de nitrogênio doadores em sua estrutura e é usado como ligante na química de coordenação, ligando-se fortemente a maioria dos íons metálicos (FERREIRA et al., 2018). Por ser um ligante bidentado e forte agente quelante, mantém o sistema de coordenação mais estável. Além disso, a sua alta afinidade com o cobre contribui ainda mais para tal estabilidade (RUIZ-AZUARA et

al., 2010).

Em relação à natureza desse ligante nos complexos, a fenantrolina atua, simultaneamente, como σ-doador, devido à presença do par de elétrons no orbital sp2 _no heteroátomo de nitrogênio e como π-receptor por possuir orbitais π deslocalizados, associados aos sistemas de anéis aromáticos (PATRA et al., 2018). A figura 1, a seguir, ilustra a estrutura molecular da fenantrolina.

Figura 1: Estrutura molecular da 1,10-fenantrolina

Fonte: Autora, 2019.

Os complexos com ligantes heterocíclicos planares como a fenantrolina, já retratados na literatura, ligam-se facilmente ao DNA e apresentam afinidade mais forte com o DNA do que os correspondentes ligantes livres (BARONE et al., 2013) podendo aumentar a eficácia de um fármaco. Sistemas cobre-fenantrolina são conhecidos pelas suas propriedades de danificar oxidativamente e clivar os ácidos nucleicos, mimetizando as nucleases (MEDICI et al., 2015), bem como interagir com o DNA via intercalação e ainda, exibir atividades anticancerígenas promissoras, induzindo apoptose em células tumorais pela inibição do proteassoma (ZHANG et al., 2012).

Estudos indicam que essas características, que envolvem excelentes atividades biológicas, clínicas, quimioterapêuticas e farmacológicas, devem-se a presença de conjugação aromática aliada a coplanaridade desse ligante em seus complexos (HEMALATHAet al., 2019). Além disso, outras investigações que relacionam sua estrutura e atividade mostraram que a presença de um anel aromático central condensado pode preservar o efeito antiploriferativo e a natureza do segundo ligante doador – nesse caso, o nitrogênio – tendo efeito sobre a atividade biológica (EREMINAet al., 2019).

3.3. PIRAZINAMIDA NA MEDICINA

A pirazinamida, apresentada na figura 2, é uma amida primária, constituinte da família das pirazinas, e é conhecida como um agente antimicobacteriano muito eficaz, com papel bem estabelecido no tratamento da tuberculose, desde 1952 (LIMA et al., 2011), podendo encurtar a terapia de 9-12 meses a 6 meses. O surgimento de cepas resistentes a esse antibiótico representa um grave problema de saúde pública, por isso inúmeras pesquisas vêm sendo feitas baseadas na síntese de complexos com centros

metálicos – dentre eles, o cobre – os quais mostraramter propriedades antibacterianas aprimoradas e mais eficientes do que o antibiótico puro (ALIMUDDINet al., 2014; PHOLWATet al., 2014).

Figura 2: Estrutura molecular da pirazinamida

Fonte: Autora, 2019.

Adicionalmente, a pirazinamida foi relatada como um ligante que pode se coordenar de forma mono ou bidentada, formando complexos metálicos estáveis, e muitos desses apresentando atividade antitubercular. Essa capacidade de coordenação por diferentes sítios da molécula deve-se a presença de quatro átomos doadores – dois nitrogênios do anel da pirazina, um nitrogênio amino e o oxigênio da carbonila amídica – tendo, então, diferentes modos de coordenação de centros metálicos, os quais são apresentados na figura 3, a seguir.

Figura 3: Modos de coordenação do ligante pirazinamida a centros metálicos

Fonte: Autora, 2019.

Portanto, existem muitas estruturas que podem ser propostas para compostos de metal-pirazinamida, devido esse potencial de ser um ligante multidentado e capacidade de interação de diversos modos (CHINIFOROSHAN et al., 2015).

3.4. A QUÍMICA DO NITRITO

O íon nitrito (NO2-_{) é uma espécie de grande importância em diversos âmbitos} biológicos, seja com atividades bioquímicas, fisiológicas ou terapêuticas. Pode ser utilizado como indicador de qualidade da água ou como adubo nitrogenado na agricultura; na indústria alimentícia, é utilizado como conservante por possuir atividades antioxidantes e antibacterianas, além de dar cor e sabor à comida (PONTALTI, 2011). No entanto, em altas temperaturas no preparo do alimento ou em condições de baixos pH’s na digestão – no estômago – o nitrito converte-se a NO+_, podendo reagir com aminas biogênicas, ocasionando na formação de substâncias carcinogênicas: as N-nitrosaminas (DE MEY et al., 2014; SALLAN et al., 2019).

Em sistemas biológicos, o nitrito pode converter-se a óxido nítrico (NO) via reação do nitrito com algumas proteínas – hemoglobina ou mioglobina, por exemplo –, enzimasou via redução ácida, tendo grande importância na indústria farmacêuticadevido às diversas funções e benefícios ao organismo: é um potente vasodilatador e relaxante muscular; atua na regulação da respiração mitocondrial; contribui para prevenção de lesão de tecidos e enfarte, causados pela falta de fluxo sanguíneo (isquemia); é considerada uma molécula sinalizadora e mensageira do sistema nervoso central, coordenando funções motoras e memória; é importante no ciclo do nitrogênio humano; e, por fim, atua no sistema imunológico como antiparasitário, antimicrobiano e antitumoral (GLADWIN et al., 2005).

Adicionalmente, pesquisas relatam que sua potente ação antibacteriana contra um amplo espectro de bactérias se dá por meio de uma reação com radicais livressuperóxido (O2-_{), que resulta em subprodutos reativos como peroxinitrito (ONOO} -) e trióxido de dinitrogênio (N2O3-). Estes produtos podem causar estresses nitrosativos e oxidativos graves nas bactérias,levando à ruptura da membrana bacteriana e disfunção celular (LI et al., 2018).

Em meio a tantas características promissoras, houve um crescente interesse em pesquisas que tenham como utilização o íon nitrito coordenado a centros metálicos como ligante auxiliar. Na química de coordenação, esse íon é um ligante versátil, podendo coordenar-se aos metais de transição de diferentes formas.Em complexos mononucleares, a coordenação pode ocorrer via átomo de nitrogênio, na formação de nitrocompostos, ou oxigênio, formando nitritocompostos. Já em complexos binucleares,

a coordenação pode originar compostos bidentados ou em ponte (BYUN et al., 2006; HEINECKE et al., 2010). Esses modos de ligação são representados na figura 4, abaixo.

Figura 4: Modos de coordenação do ligante nitrito a centros metálicos

Fonte: NAKAMOTO, 1997.

Adicionalmente, os modos de coordenação também podem ser comparados em razão de sua estabilidade no complexo. Nitrocomplexos tendem a conferir maior estabilidade devido aos elétrons π do nitrito estarem deslocalizados entre os dois oxigênios ligados ao nitrogênio, deixando o nitrogênio mais pobre eletronicamente e, com isso, aumentando o caráter π receptor do ligante. Já nos nitritocomplexos, esses elétrons estão localizados apenas entre a ligação do nitrogênio com um oxigênio, não retirando tanta densidade eletrônica do oxigênio e, como consequência, conferindo o caráter σ doador a esse átomo do ligante.

3.5. BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS: PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Bactérias gram-negativas e gram-positivas são seres unicelulares – que consistem em apenas uma célula - e procarióticos, isto é, que não possuem envoltório nuclear e organelas membranosas. No entanto, esses microrganismos diferem-se, basicamente, na composição e estrutura de sua parede celular. Bactérias gram-positivas apresentam uma espessa camada de peptidoglicano e, internamente, a membrana plasmática (BORZANI

et al., 2001; TORTORA et al., 2012).

No caso das gram-negativas, além do peptidoglicano – menos espesso para estas – e da membrana plasmática, possuem uma membrana externa, composta por

lipopolissacarídeos e proteínas, e um periplasma, uma camada coloidal que possui diversas enzimas, quimiorreceptores e oligossacarídeos (BORZANI et al., 2001; TORTORA et al., 2012). A figura 5, a seguir, mostra um diagrama esquemático com as diferenças das paredes celulares de bactérias gram-positivas e gram-negativas:

Figura 5: Diagrama esquemático das paredes celulares de bactérias Gram-positivas(a) e

Gram-negativas(b).

Fonte: CAMARGO, 2019.

No presente trabalho, o composto sintetizado foi testado na espécie Pseudomonas

aeruginosa, bactérias gram-negativas, baciliformes e aeróbias (figura 6). Além disso,

caracterizam-se por serem bactérias oportunistas, por causarem infecção em indivíduos com o sistema imunológico comprometido, podendo afetar o aparelho respiratório, urinário, queimaduras, ou causar também outras infecções sanguíneas. Essa característica, associada à sua alta resistência a um grande número de antibióticos, tornam-nas a terceira causa de infecções hospitalares, ficando atrás apenas de

Figura 6: Pseudomonas aeruginosa

Fonte:OOSTHUIZEN – CDC, 2017.

Adicionalmente, as características de resistência dessas bactérias estão associadas à superexpressão de bombas de efluxo, baixa permeabilidade da membrana externa, síntese de enzimas inativadoras de antibióticos e formação de biofilmes (GHAZALIBINA et al., 2019). Os mecanismos de resistência bacteriana são ilustrados na figura 7, a seguir:

Figura 7: Mecanismos de resistência bacteriana

Fonte: ANVISA, 2017.

3.6. ATIVIDADE BACTERICIDA E BACTERIOSTÁTICADE COMPOSTOS DE COBRE

Doenças acometidas por bactérias são umas das principais causas de óbito no mundo e com a crescente resistência desses organismos - seja por uso indiscriminado do medicamento ou por mecanismos gerais de resistência como a bomba de efluxo, a

modificação de enzima, a inativação de antibióticos ou a alteração de permeabilidade de membrana - torna-se necessário o desenvolvimento de novos fármacos, a fim de combater esse problema (MOIR et al., 2012).

A síntese de novos compostos antibacterianos baseia-se em estratégias de modificação e/ou adição de ligantes ou moléculas de produtos naturais a um antibiótico, os quais já tenham alguma ação bactericida/antibacteriana conhecida e com baixa toxicidade, podendo não só superar a resistência, mas também, melhorar seu aspecto farmacodinâmico e cinético em uso clínico (CIFUENTES-VACA et al., 2019).

Muitos complexos que possuem o cobre como centro metálico, com ligantes heterocíclicos como a fenantrolina ou antibióticos conhecidos,bem como apresentando características antibacterianas, já foram descritos na literatura (JIMÉNEZ-GARRIDOet

al., 2005; CHAVIARAet al., 2005; PSOMASet al., 2006; EFTHIMIADOUet al., 2007;

KATSAROUet al., 2008; EFTHIMIADOUet al., 2008; PATEL et al., 2010;CHOHAN

et al., 2010;NG et al., 2016; YAMAMOTO et al., 2017; KUMAR et al., 2018;

CIFUENTES-VACA et al., 2019; SUZUKI et al., 2019; SATHEESH et al., 2019; LEITE et al., 2019).

De acordo com a bibliografia, esses compostos possuem atividade antibacteriana devido a cinco princípios: I) O efeito quelato, isto é, ligantes coordenados ao íon metálico de forma bidentada, como a fenantrolina, apresentam maior efeito antimicrobiano; II) Natureza dos ligantes,mostrando maior eficiência para complexos com ligantes que tenham N-doador; III) A carga total do complexo, em que, geralmente, a eficiência antimicrobiana diminui na ordem: catiônica> neutra> aniônica; IV) A natureza do contra-íon, o qual pode interagir com a parede celular bacteriana; V) E a nuclearidade do centro de metal no complexo. Compostos dinucleares, geralmente, são mais ativos que os mononucleares (PATEL et al., 2010).

Desta forma, em busca de novas estruturas eficientes, os complexos metálicos vêm desempenhando um papel muito importante na química bioinorgânica e têm sido notados pelo seu grande potencial na terapia antibiótica, devido à sua diversidade estrutural e amplo espectro de suas atividades biológicas, já retratadas na literatura. Alia-se, portanto, as características do metal, bem como as dos ligantes, com diferentes propriedades e possíveis atividades biológicas. Tendo isso em vista, foi realizada a síntese de um composto de cobre (II) com diferentes ligantes ativos, com aplicação em bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa, as quais são uma das principais causas

de morte no mundo, como consequência de sua forte resistência aos antibióticos convencionais.

4. METODOLOGIA 4.1. REAGENTES

Todos os reagentes, utilizados para as sínteses, testes de solubilidade, e análises espectroscópicas e eletroquímicas, estão discriminados na tabela 1, abaixo:

Tabela 1: Reagentes utilizados para os procedimentos experimentais e de análises

Reagente Fórmula

Molecular Pureza Fabricante

Acetonitrila P.A. CH3CN 99,9% Panreac

Água destilada H2O – –

Álcool metílico P.A. CH4O 99,9% NEON

Brometo de Potássio KBr – Shimadzu Corporation

Cloreto de cobre (II) P.A. Dihidratado

CuCl2.2H2O 99,0% Vetec Química Fina

Dimetilformamida-N, N P.A. C3H7ON 99,8 % Vetec Química Fina Dimetilsulfóxido P.A. ACS C2H6OS 99,0% Vetec Química Fina 1,10-Fenantrolina P.A. C12H8N2 99,5 % Vetec Química Fina Fosfato de tetrabutilamônio C16H38NO4P 99,0% Sigma - Aldrich

Nitrito de sódio NaNO2 99,0% Vetec Química Fina

Pirazinamida C5H5N3O 99,0% Sigma - Aldrich

Fonte: Autora, 2019.

4.2. PROCEDIMENTOSDE SÍNTESE

4.2.1. SÍNTESE DO COMPLEXO [Cu(phen)Cl2]

O composto precursor foi obtido de acordo com a proporção molar do sal CuCl2.2H2O e o ligante fenantrolina. O procedimento de síntese para o complexo [Cu(phen)Cl2], de coloração verde, foi semelhante ao referenciado na literatura (BOLTZ et al, 2011; SORENSON, 1976), com 95% de rendimento. Na Figura 8 é apresentada a estrutura proposta para o precursor.

Figura 8: Estrutura proposta para o complexo precursor [Cu(phen)Cl2]

Fonte: Autora, 2019.

4.2.2. SÍNTESE DO COMPLEXO [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl

Para a síntese do complexo de interesse [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, mostrado na figura 9, foram dissolvidos 100 mg (0,318 mmol) do complexo precursor, [Cu(phen)Cl2], em 20 mL de metanol e, em seguida, misturados com a pirazinamida (39,15 mg, 0,318 mmol), mantendo sob agitação durante 4h. Após esse tempo, adicionou-se o NaNO2 (43,86 mg, 0,636 mmol), deixando reagir por mais 2h. O composto, de coloração verde escura, foi lavado com metanol, filtrado a vácuo e mantido em dessecador. O rendimento da reação foi de 56%.

Figura 9: Estrutura proposta para o complexo [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl

4.3. EQUIPAMENTOS E TÉCNICAS EXPERIMENTAIS 4.3.1. EQUIPAMENTOS

Tabela 2: Equipamentos utilizados para os métodos de caracterização

Equipamento Fabricante Modelo

Espectrofotômetro IV Shimadzu FTIR-8400S

Espectrofotômetro UV-Vis Agilent Technologies 8453 Potenciostato Basi-Bioanalytical Systems, Inc. Epsilon

Fonte: Autora, 2019. 4.3.2. TÉCNICAS EXPERIMENTAIS

4.3.2.1. ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO

Para a obtenção dos espectros vibracionais na região do infravermelho, as amostras sólidas dos complexos foram preparadas com brometo de potássio (KBr), sendo juntamente triturados até a formação de um pó fino e homogêneo, o qual foi levado para a prensagem para a obtenção da pastilha. A análise e leitura foram realizadas utilizando um espectrofotômetro de Infravermelho, de série IRAffinity-1, modelo FTIR-8400S da Shimadzu, por meio do software IRsolutionversão 1.60, com janela espectral de 4000 a 400 cm-1_{. Posteriormente, os resultados obtidos foram} tratados noprogramaOrigin8.0.

4.3.2.2. ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL RAMAN

Os espectros Raman foram obtidos no estado sólido a partir de amostras dos compostos previamente triturados. Todas as análises foram realizadas utilizando o laser 532 nm, grade de difração com 1200T, objetiva de 50x, tempo de leitura de 10 a 30s e utilizando uma média de 10 acumulações. A faixa de análise utilizada nos espectros foi de 100 a 4000 cm-1.O único tratamento utilizado foi o de background. O equipamento utilizado foi um microscópio Raman da Horiba, modelo Xplora, com software LabSpec, versão 6.0. Posteriormente, os espectros foram tratados no programa Origin 8.0.

4.3.2.3. ESPECTROSCOPIA ELETRÔNICA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA E VISÍVEL

Para a obtenção dos espectros eletrônicos nas regiões do ultravioleta e visível, as amostras foram preparadas com a dissolução dos compostos em meio aquoso, bem como em metanol e acetonitrila, empregando-se cubetas retangulares de quartzo com caminho óptico de 1 cm. A análise e leitura foram realizadas utilizando um espectrofotômetro Uv-visível Agilent, modelo 8453, na faixa espectral de 190 a 900 nm. Os resultados obtidos foram tratados no programa Origin 8.0. Por sua vez, a absortividade molar (ε) dos complexos foi obtida a partir dos coeficientes angulares dos gráficos de absorção versus concentração do composto, de acordo com a Lei de Lambert-Beer (Equação 1). Para isso, foram preparadas dez soluções com concentrações distintas para o complexo analisado, de forma que a absorbância atingisse um valor máximo de absorbância aproximadamente igual 1.

Equação 1: Lei de Lambert-Beer

𝐴 = 𝜀 × 𝑏 × 𝑐

Fonte: SKOOG, 2009.

4.3.2.4. ELETROQUÍMICA

A técnica utilizada para as análises eletroquímicas foi a voltametria cíclica, realizada em meio orgânico, com a utilização de dimetilsulfóxido(DMSO) como solvente e perclorato de tetrabutilamônio (TBAP) como eletrólito suporte. A célula eletroquímica utilizada era composta por três eletrodos: eletrodo de trabalho de carbono vítreo, eletrodo auxiliar de platina e eletrodode prata, previamente preenchido com solução de eletrólito suporte como referência, utilizando o ferroceno como padrão externo. Os voltamogramas foram obtidos em um potenciostato da Bioanalytical Systems, modelo Epsilon, software BASiEpsilon-EC, versão 2.13.77 e posteriormente tratados no programa Origin 8.0.

4.3.2.5. ENSAIOS BACTERIANOS

Inicialmente, a avaliação da atividade antimicrobiana foi feita com o pré-inóculo (etapa na qual se adiciona o microrganismo ao meio), sendo feito a partir da repicagem da cepa de referência em placas de meio Ágar BHI (Infusão ou Caldo Cérebro Coração, com nutrientes) e, após, deixou-se em estufa por aproximadamente 24 horas e a uma

temperatura de 37ºC, esta necessária para o crescimento dos microrganismos. Posteriormente, foi então preparado o inóculo por meio da ressuspensão das colônias do pré-inóculo em solução salina de soro fisiológico 0,9%, até atingir a turbidez de 0,5 na escala McFarland (ou 08 UFC/mL - unidade formadora de colônia por mililitro). Após isso, transferiu-se 100 μL da solução do inóculo para um tubo com 9,9 mL de solução salina, obtendo-se, então, uma concentração de 106 UFC/mL.

Com a utilização do método de microdiluição em caldo, foi feita a triagem da atividade antimicrobiana, partindo da metodologia descrita pelo CLSI (ClinicalandLaboratory Standards Institute)(COCKERILL et al., 2012), tendo algumas modificações. Primeiro, em uma microplaca de 96 poços, foi adicionado 100µL do caldo Mueller-Hinton (MH), juntamente com 100 µL do complexo na concentração inicial de 400 μM, sendo seguido de concentrações seriadas e, por fim, 100 µL da suspensão do inóculo. A microplaca foi incubada por 18 horas a 35 + 2 ºC sob agitação (200 rpm) e a avaliação da densidade óptica foi realizada em um leito de microplacas (EpochBiotek, Winooski, EUA) no comprimento de onda de 595 nm.

Os microorganismos utilizados no ensaio da atividade antimicrobiana do complexo [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl foram obtidos no laboratório de Microbiologia Clínica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte em colaboração com a professora Dra. Maíza Rocha Abrantes.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO E ESPALHAMENTO RAMAN

Na espectroscopia de infravermelho, para absorver radiação e ter modos ativos nessa região, uma molécula deve sofrer variação no momento dipolo durante seus movimentos vibracionais (HOLLER, SKOOG, CROUCH, 2009). Já no espalhamento Raman, os modos vibracionais são ativos quandoa dispersão da luz monocromática envolve uma distorção momentânea dos elétrons de uma ligação em uma molécula, fazendo com que esta fique temporariamente polarizabilizada. Essas técnicas são, portanto, uma das ferramentas mais importantes como complemento para a determinação de estruturas de espécies orgânicas, inorgânicas e biológicas, determinando grupos funcionais (HOLLER et. al, 2009.), tipos de ligação e ainda os efeitos e modos de coordenação em um complexo.

Assim, são apresentadose discutidos os espectros de infravermelho do ligante pirazinamida e os espectros de infravermelho e Raman do complexo precursor, [Cu(phen)Cl2], ede interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl.

5.1.1. Espectros de Infravermelho

5.1.1.1. Espectros do complexo precursor [Cu(phen)Cl2]:

O composto [Cu(phen)Cl2], também denominado de diclorofenantrolina, foi utilizado como precursor do complexo de interesse. Seu espectro de infravermelho é apresentado na figura 10 a seguir.

Figura 10: Espectro vibracional do complexo precursor [Cu(phen)Cl2] na região de 4000 a 400 cm-1_{, em pastilha de KBr.} 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 10 20 30 40 50 60 70 3041 3010

% T

Número de onda (cm

)

De acordo com a figura 10, são observadas bandas presentes na região de 3079 a 3010 cm-1_{, referentes aos estiramentos simétricos e assimétricos do grupo C-H de} aromáticos (PAVIA et al., 2010).

Na figura 11, a seguir, é apresentado o mesmo espectro, porém com ampliação na região de 1650 a 1000 cm-1(a) e de 1000 a 400 cm-1(b) para melhor visualização das bandas nessa região.

Figura 11: Espectro vibracional do complexo precursor [Cu(phen)Cl2] na região de 1650 a 1000cm-1_{(a) e de 1000 a 400 cm}-1_{(b),em pastilha de KBr.}

1500 1000 10 20 30 40 50 60 70 % T 1000 500 10 20 30 40 50 60 70 Número de onda (cm-1)

a)

b)

Na região de 1650 a 1000 cm-1_{, são observadas bandas em 1606, 1584, 1515 e 1495} cm-1_{, todas referentes aos estiramentos C=C e C=N do anel aromático da fenantrolina,} bem como a banda em 1422 cm-1, referente ao estiramento C-N. Já em 1146 e 1107 cm -1_{, as bandas são características de deformação angular da ligação C-H no plano. Já na} região de 1000 a 400 cm-1, pode-se observar a presença de algumas bandas como em 854 e 721, características de deformações angulares da ligação C-H, dessa vez, fora do plano, bem como em 644cm-1, referente à deformação angular do anel.

Todas as bandas apontadas no espectro estão de acordo com resultados da literatura com o mesmo composto precursor (BOLTZ et al., 2011; AWAD et al., 2010). Esses resultados são expressos na tabela 3 e comparados com o resultados do trabalho em questão, apresentados juntamente com as respectivas atribuições.

Tabela 3: Atribuições das principais bandas do espectro de infravermelho do composto

precursor [Cu(phen)Cl2] e referências.

Atribuição Número de onda (cm-1_{) BOLTZ et al., 2011 AWAD et al., 2010}

ν(C-H) 3079 – 3010 3080 – 3012 3079 – 3010 ν(C=C, C=N) 1606, 1584, 1515 e 1495 1607, 1586, 1516 e 1495 1606, 1584 e 1517 ν(C-N) 1422 1423 1426 δ(C-H) no plano 1146 – 1107 – 1146 e 1106 δ(C-H) fora do no plano 854 – 721 722 856 e 722 δ(anel) 644 – 644 Fonte: Autora, 2019.

5.1.1.2. Espectros do ligante pirazinamida:

A pirazinamida é um ligante de grande interesse devido a suas características biológicas e seus espectros de infravermelho já foram estudados por alguns autores (COTTON et al., 1960; EEDARA et al., 2016; AL-OTAIBI et al., 2019), estando todos os valores de número de onda apresentados de acordo com a bibliografia. O espectro dessa molécula é apresentado na figura 12 a seguir.

Figura 12: Espectro vibracional do ligante pirazinamida na região de 4000 a 400 cm-1_{, em} pastilha de KBr. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 30 35 40 45 50

3160

3152

3412

% T

Número de onda (cm

)

3289

Nesse espectro, aparecem bandas em 3412 e 3289 cm-1_{, as quais são referentes aos} estiramentos assimétrico e simétrico da ligação N-H da amida, respectivamente. Já na região entre 3160 e 3052 cm-1, as bandas presentes são referentes ao estiramento da ligação C-H dos carbonos sp2 _{do anel pirazínico (PAVIA et al., 2010).}

Diminuindo a faixa de número de onda do espectro para a região de 1750 a 1000 cm-1(a) e de 1000 a 400 cm-1(b)no intuito de visualizar melhor o espectro, são observadas algumas outras bandas características, apresentadas na figura 13.

Figura 13: Espectro vibracional do ligante pirazinamidana região de 1750 a 1000 cm-1_{(a) e} de 1000 a 400 cm-1_{(b), em pastilha de KBr.} 1500 1000 30 35 40 45 50

a)

b)

De acordo com o espectro apresentado na figura 13, estão presentes algumas bandas como em 1713 cm-1, característica de estiramento C=O de carbonilas amídicas, em 1609, 1580, 1524, 1478 e 1436 cm-1, bandas de estiramento C=C e C=N do anel pirazínico e as bandas em 1373, 1164, 1086, 1053 e 1024 cm-1, referentes ao estiramento das ligações C-N e C-C (SILVERSTEIN et al., 2006; PAVIA et al., 2010).

Por fim, as bandas que aparecem nos números de onda de 869, 785, 668, 619 e 518 cm-1 são caracterizadas como deformações angulares da ligação C-H de carbono sp2do anel pirazínico (SILVERSTEIN et al., 2006).

A tabela 4 mostra todos os números de onda da pirazinamida e suas atribuições, comparando com a literatura:

Tabela 4: Atribuições das principais bandas do espectro de infravermelho do ligante

pirazinamida e referências.

Atribuição Número de onda (cm-1_{) EEDARAet al., 2016}

νassim (N-H) 3412 3410 νsim (N-H) 3289 3287 ν(C-H) 3160 – 3052 3147 - 3052 ν(C=O) 1713 1703 ν(C=C, C=N) 1609, 1580, 1524, 1478 e 1436 1607, 1580, 1524, 1478 e 1434 ν(C-N, νC-C) 1373, 1164, 1086, 1053 e 1024 1375, 1159, 1085, 1053 e 1021 δ(C-H) 869, 785, 668, 619 e 518 869, 784, 663, 618e 509 Fonte: Autora, 2019.

5.1.1.3. Espectros do composto de interesse [Cu(phen)(pyr)(NO2]Cl

A figura 14, a seguir, apresenta o espectro de infravermelho do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2], no qual se observam bandas características tanto do precursor – [Cu(phen)Cl2] – quanto o aparecimento das bandas relacionadas aos ligantes – pirazinamida e nitrito – coordenados ao metal.

Figura 14: Espectro vibracional do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl,na região de 4000 a 400cm-1_{, em pastilha de KBr.} 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 120 3048 3054 3080 3223

% T

Número de onda (cm

)

Na região de 4000 a 400 cm-1_{, são observadas algumas das bandas, localizadas em} 3410 e 3223 cm-1, características de estiramento assimétrico e simétrico, respectivamente, da ligação N-H da pirazinamida, que devido à coordenação ao metal, tem os deslocamento de frequência de estiramento esperados com a mudança do ambiente químico. Já as bandas na região de 3080 a 3054 cm-1 são atribuídas como estiramento da ligação C-H de carbono sp2 da fenantrolina (PAVIA et al., 2010).

Para melhor visualização e identificação de outras bandas importantes, o espectro do composto foi ampliado numa região de 1700 a 1200 cm-1, de acordo com a figura 15.

Figura 15: Espectro vibracional do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl,na região de 1700 a 1200cm-1_{, em pastilha de KBr.} 1700 1600 1500 1400 1300 1200 0 20 40 60 80 100 120 1271 1378 1395 1425 1493 1517 1584 1607

% T

Nessa faixa do espectro, pode-se observar uma banda em 1656 cm-1_{, referente ao} estiramento da ligação C=O da pirazinamida que, se comparada ao ligante livre, com a banda localizada em 1713 cm-1_{, diminuiu em 57 cm}-1_{. Isso ocorre devido à três} possíveis efeitos: 1) o principal efeito dessa diminuição está relacionado ao ligante nitrito, também ligado ao centro metálico. Por ser um ligante mais π-receptor, isto é, mais forte que a pirazinamida, o NO2- _{retira densidade eletrônica do cobre, fazendo com} que o metal fique deficiente e retire, consequentemente, densidade do anel pirazínico da pirazinamida. Isso implica na deslocalização de elétrons da carbonila pelo anel, por ressonância, ocasionando no enfraquecimento da ligação Carbono-Oxigênio, e diminuindo a frequência de estiramento da banda no infravermelho; 2) como a carbonila da pirazinamida está ligada na posição meta do anel pirazínico em relação ao nitrogênio 4 do heterociclo, que é uma posição retiradora de elétrons, a ligação C=O fica deficiente eletronicamente, diminuindo também, sua frequência de estiramento; 3) por fim, aliado a esse efeito, mas bem menos pronunciado, também pode ser levada em consideração, segundo a literatura (AKYUZet al., 2007), a interação do oxigênio carbonílico com o hidrogênio amídico, por meio de ligação de hidrogênio, fazendo com que a densidade

eletrônica, já enfraquecida na ligação C=O, torne-seainda mais fraca devido o compartilhamento de densidade eletrônica do oxigênio com o hidrogênio.

É observado, também, em 1713 cm-1 _{(figura 17b) uma banda, a qual aparece na} mesma região da pirazinamida livre, indicando parte da pirazinamida não coordenada, ou seja, com impureza correspondente a esse ligante livre.

Seguindo o espectro, as bandas que aparecem em 1607, 1584 e 1517 cm-1, referentes ao estiramento da ligação C=C, e em 1493 e 1425 cm-1, referentes ao estiramento C=N, são comuns tanto à fenantrolina quanto à pirazinamida, indicando a coordenação desses ligantes ao metal.

As bandas em 1395 e 1048 cm-1 representam, respectivamente, os estiramentos das ligações C-N e C-C da pirazinamida. Pode-se observar que a frequência do estiramento C-N foi deslocado para maiores números de onda, se comparada com a pirazinamida livre, e esse fato indica, segundo a literatura (CORRÊA, et. al, 2007), a coordenação da pirazinamida via átomo de nitrogênio (4, meta à carbonila) do anel pirazínico.

Além disso, as bandas em 1378 e 1271 cm-1 representam os estiramentos assimétrico e simétrico, respectivamente, da ligação N-O do íon nitrito, NO2-, coordenado ao metal, estando esses valores de acordo com a literatura. Comparando com outros autores da literatura (TOPCHIYAN et al., 2019; SUPRIYA et al., 2009; MARTIROSYAN et al., 2006) esses valores também indicam a coordenação do nitrito via átomo de nitrogênio. De acordo com a equação ∆ν = νa – νs (KURTIKYAN et al, 2007), que indica a diferença entre os estiramentos assimétrico e simétrico do NO2-_{, se} aplicada a esse trabalho, tem-se que: ∆ν = 1378 – 1271 = 107 cm-1. Esse resultado é indicativo da ligação do tipo nitro (M-N-O2), segundo a bibliografia (NAKAMOTO, 1997) devido a diferença desses números de onda apresentar um valor baixo e próximo a 100 cm-1. Caso esse valor fosse 300 cm-1 ou similar, a ligação seria do tipo nitrito (M-O-N-O), isto é, via átomo de Oxigênio.

Seguindo o espectro, a última região analisada foi na faixa espectral entre 1200 a 400 cm-1, apresentando também outras bandas características, como mostradas na figura 16.

Figura 16: Espectro vibracional do composto de interesse, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, na região de 1200 a 400cm-1_{, em pastilha de KBr.} 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 20 40 60 80 100 120 721 850 1048

% T

Número de onda (cm

)

Asbandas em 1146, 850 e 721 cm-1 são referentes às deformações angulares no plano, para a primeira, e fora do plano, para as duas últimas, respectivamente, da ligação C-H dos aneis aromáticos da fenantrolina (SILVERSTEIN et al., 2006; PAVIA

et al., 2010). Vale salientar que todas essas alterações e deslocamentos das bandas já

são esperados e isso ocorre devido à coordenação desses ligantes e à mudança do ambiente químico e estrutural do complexo sintetizado.

Para efeito de comparação e indicação da formação do complexo final, a figura 17, aponta os principais números de onda do nitrocomposto, [Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, e relaciona com as bandas em comum tanto do precursor, [Cu(phen)Cl2], como do ligante pirazinamida, destacando as principais frequências de estiramento.

Figura 17: Sobreposição dos espectros vibracionais do composto de interesse (verde),

[Cu(phen)(pyr)NO2]Cl, do precursor (vermelho), [Cu(phen)Cl2] e do ligante (preto), pirazinamida, na região de 4000 a 400cm-1_{(a) e de 1750 a 1000 cm}-1_{(b), em pastilha de KBr.}

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 80 160 3052 3080 3010 3079 3412 % T

Número de onda (cm

)

a)

Número de onda (cm

)

b)