INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Complexos de vanilina e derivados: síntese,
caracterização e estudo biológico
Wendy Marina Toscano Queiroz de Medeiros
Tese de Doutorado Natal/RN, agosto de 2018
WENDY MARINA TOSCANO QUEIROZ DE MEDEIROS
COMPLEXOS DE VANILINA E DERIVADOS: SÍNTESE,
CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO BIOLÓGICO.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, como um dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Química, pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Orientador (a): Prof.ª Dra. Ana Cristina Facundo de Brito Pontes
Co-orientador: Prof. Dr. Daniel de Lima Pontes
NATAL, RN 2018
Medeiros, Wendy Marina Toscano Queiroz de.
Complexos de vanilina e derivados: Síntese, caracterização e estudo biológico / Wendy Marina Toscano Queiroz de Medeiros. -2018.
174 f.: il.
Tese (douotrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Programa de Pós-Graduação em Química. Natal, RN, 2018.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Cristina Facundo de Brito Pontes.
Coorientador: Prof. Dr. Daniel de Lima Pontes.
1. Compostos de coordenação - Tese. 2. Cobre - Tese. 3. Zinco - Tese. 4. Fenantrolina- Tese. 5. Vanilóides - Tese. I. Pontes, Ana Cristina Facundo de Brito. II. Pontes, Daniel de Lima. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU CDU 546.55
Aos meus pais, Joana e Francisco, pelo amor incondicional, incentivo, dedicação em todos os momentos e pela educação que me proporcionaram.
Dedico este trabalho aos dois, e principalmente a você, minha mãe, meu maior exemplo de fé e perseverança.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por abençoar e guiar meus passos, sempre me fortalecendo e me ajudando a superar os obstáculos que encontro em minha caminhada. Obrigada meu Deus por tantas graças e por mais essa conquista alcançada em minha vida.
Às minhas irmãs Tuyanne e Sayama, por acreditarem em mim e permanecerem sempre ao meu lado. Obrigada pela família maravilhosa que somos.
Ao meu namorado Cristiano Bessa, pelo amor, carinho, incentivo e por toda força que tem me dado para concluir este trabalho. Obrigada pelo seu apoio e por estar sempre me ajudando a não desanimar diante das dificuldades.
Ao meu orientador Prof. Dr. Daniel Pontes, por todos os ensinamentos, discussões e contribuições que foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho. Obrigada pela confiança e pela orientação ao longo desses oito anos de convivência e muito aprendizado.
Aos professores Dra. Ana Cristina, Dr. Ótom Anselmo e Dr. Francisco Ordelei, pelos conselhos, sugestões e colaborações que foram de grande valia.
À Mayara Jane, pela contribuição com os ensaios biológicos; Aos meus orientandos, Francimar e Lalyson: aprendi muito com vocês. Obrigada por me proporcionarem ter essa experiência de orientação; Aos demais que fizeram e fazem parte do Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros: Verônica, Aimée, Anallicy, Dayana, Thuanny, Alexsandro, Juliany, Talita, Andresa, Magno, Katherine e Marco. Obrigada pela ajuda e incentivo que recebi de vocês, pelas trocas de experiências e momentos de descontrações.
A todos os meus amigos que sempre me incentivaram e torceram pelo meu sucesso; À Fernanda Saadna, pelo apoio constante, afeto e por toda confiança depositada em mim ao longo de todos esses anos de amizade. Sei que sempre posso contar com você.
Aos Professores Dr. Javier Alcides Ellena, do Instituto de Física de São Carlos, e Alejandro Ayala, do Laboratório de Cristalografia Estrutural da Universidade Federal do Ceará, pelas análises de difração de Raios-x de monocristal.
Ao Laboratório de Bioinorgânica e Catálise da Universidade Federal do Paraná, na pessoa da professora Dra. Shirley Nakagaki, pela contribuição com as análises de EPR.
Aos Professores Dr. Eduardo Henrique Silva de Sousa, do Laboratorio de bioinorgânica da Universidade Federal do Ceará, e Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha do Centro de Biociências da UFRN, pelas parcerias com os ensaios biológicos realizados.
Às professoras Caroline Medeiros e Aurigena Antunes, juntamente com a aluna de mestrado Emanuella Tavares, do Departamento de Biofísica e Farmacologia do Centro de Biociências da UFRN, pela parceria com os estudos in vivo realizados com os filmes de quitosana modificados.
Ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, principalmente à central analítica, nas pessoas dos técnicos Joadir, Marcondes, Jhonatans e Elânea.
Ao Programa de Pós Graduação em Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e à CAPES, pela ajuda financeira através da concessão da minha bolsa.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram no desenvolvimento desse trabalho.
“Tente uma, duas, três vezes e se possível tente a quarta, a quinta e quantas vezes for necessário. Só não desista nas primeiras tentativas, a persistência é amiga da conquista. Se você quer chegar aonde a maioria não chega, faça o que a maioria não faz.”
RESUMO
Com o presente trabalho tem-se como objetivo contribuir para o desenvolvimento da química bioinorgânica dos sistemas vanilóides com íons metálicos de cobre (II) e zinco (II), através da síntese e estudo estrutural de novos complexos metálicos de cobre(II)-phen e zinco(II)-phen aliados aos ligantes vanilóides de interesse biológico. Dentre os compostos sintetizados, destaca-se os complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] com estruturas elucidadas através da difração de Raio-X, associada às técnicas espectroscópicas e eletroquímica, as quais evidenciaram a formação de um sistema octaédrico com distorção tetragonal com alongamento do eixo axial (complexo de cobre) e compressão do eixo axial (complexo de zinco). Os ensaios biológicos realizados com o [Cu(phen)(van)2] demonstraram elevada atividade antitumoral. Esses resultados motivaram o desenvolvimento dos novos derivados [M(phen)(vglu)2], CS-MPV, [M(phen)(vpca)2] e [M(phen)(vpcaZnCl2)2], com M = Cu2+ e Zn2+, os quais possam vir a potencializar a atividade anticancerígena já apresentada por esse sistema. Esses derivados foram caracterizados por IV e UV-Vis, sendo os complexos de cobre caracterizados ainda por eletroquímica e os complexos de zinco caracterizados por RMN 1H. Através do infravermelho e UV-Vis foi possível indicar a presença do ligante fenantrolina em todos os complexos sintetizados, através de estiramentos dos anéis da phen e bandas intensas com transições π- π* na região do ultravioleta, respectivamente. As bases de Schiff formadas foram indicadas através do estiramento do grupo C=N (IV) e transições n- π* do grupo imina (UV-Vis). Os voltamogramas cíclicos dos complexos de cobre apresentaram par redox do metal, referente ao processo redox Cu2+/Cu1+, bem como processos de oxidação dos ligantes vanilóides. Os espectros de RMN 1H apresentaram sinais com deslocamentos e acoplamentos que estão de acordo com as estruturas propostas para os complexos de zinco. No CS-MPV, filmes de quitosana foram modificados com [M(phen)(van)2], onde em meio aquoso os complexos precursores são facilmente liberados, podendo atuar como sistemas carregadores que possam ser seletivos quanto à via e a forma de administração dos complexos com vanilina. Além da caracterização estrutural, o CS-MPV foi analisado quanto à liberação e quantificação de [M(phen)(van)2] presente nos filmes, através de UV-Vis e eletroquímica. Os ensaios in vivo realizados com os filmes CS-ZPV mostraram potencial atividade cicatrizante em feridas cutâneas para o complexo [Zn(phen)(van)2] liberado na lesão dos ratos.
ABSTRACT
The main objective of the present work is to contribute to the development of bioinorganic chemistry of the vanilloid systems with copper(II) and zinc(II) metal ions through the synthesis and structural study of new metal complexes of copper(II)-phen and zinc(II)-phen associated with vanilloid ligands of biological interest. Among the compounds synthesized, the [Cu(phen)(van)2] and [Zn(phen)(van)2] complexes is highlighted, with structures elucidated by X-ray diffraction, associated with spectroscopic and electrochemical techniques, which evidenced the formation of an octahedral system with tetragonal distortion with axial axis elongation (copper complex) and compression of the axial axis (zinc complex). Biological assays performed with [Cu(phen)(van)2] demonstrated high antitumor activity. These results motivated the development of the new derivatives [M(phen)(vglu)2], CS-MPV, [M(phen)(vpca)2] and [M(phen)(vpcaZnCl2)2], with M = Cu2+ e Zn2+, which may potentiate the anticancer activity already presented by this system. These derivatives were characterized by IV and UV-Vis, with the copper complexes still characterized by electrochemistry and the zinc complexes characterized by 1H NMR. Through the infrared and UV-Vis it was possible to indicate the presence of the ligand phenanthroline in all the synthesized complexes, through stretches of phen rings and intense bands with π-π transitions in the ultraviolet region, respectively. The formed Schiff bases were indicated by stretching the C=N (IV) group and n-π * transitions of the imine group (UV-Vis). The ciclic voltammograms of copper complexes have metal redox pair, related to the Cu2+/Cu1+ redox process, as well as oxidation processes of vanilloid ligands. The 1H NMR spectra showed signals at shifts and couplings that are consistent with the structures proposed for zinc (II) complexes. In CS-MPV, chitosan films were modified with [M(phen)(van)2], where in aqueous media the precursor complexes are easily released and can act as loading systems that can be selective for the route and form of administration of complexes with vanillin. In addition to the structural characterization, the CS-MPV was analyzed for the release and quantification of [M(phen)(van)2] present in the films, through UV-Vis and electrochemistry. The in vivo assays performed with the CS-ZPV films showed potential healing activity in skin wounds to the [Zn(phen)(van)2] complex released in rat injury.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Formação de adutos através da reação de substituição nucleofílica entre DNA e complexos metálicos, que resultam em coordenações de esfera (a) interna e (b) externa. (c) Interação de esfera externa envolvendo
ligações não covalentes... 28
Figura 2 - Interação da cisplatina com o DNA... 29
Figura 3 - Reação esquematizada da condensação entre amina primária e aldeído catalisada por ácido... 31
Figura 4 - Fórmula estrutural do composto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído... 32
Figura 5 - Fórmula estrutural dos compostos vanilina, capsaicina, eugenol e ácido ferúlico, com destaque ao grupo vanilóide em vermelho... 34
Figura 6 - Fórmula estrutural da 2-amino-2-deoxi-D-glucose... 35
Figura 7 - Atuação esquemática da glucosamina em tecidos do corpo humano... 35
Figura 8 - Fórmula estrutural proposta para a quitosana... 36
Figura 9 - Fórmula estrutural da molécula 2-picolilamina... 37
Figura 10 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) cis-[Cu(phen)Cl2] e (b) [Zn(phen)Cl2]... 43
Figura 11 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2]... 44
Figura 12 - Fórmula estrutural proposta para a base de Schiff vglu... 44
Figura 13 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(vglu)2] e (b) [Zn(phen)(vglu)2]... 45
Figura 14 - Possíveis fórmulas estruturais resultantes das modificações da quitosana com [M(phen)(van)2], (a) originadas de uma reação intracadeia envolvendo ambos os aldeídos presentes no complexo precursor, (b) estrutura resultante de uma reação de reticulação inter-cadeias e/ou (c) originadas pela reação de apenas um dos grupos aldeídos disponíveis no complexo... 46
Figura 15 - Fórmulas estruturais propostas para os complexos (a) [Cu(phen)(vpca)2] e (b) [M(phen)(vpca)2]... 47
Figura 16 - Fórmulas estruturais propostas para (a) [Cu(phen)(vpca-ZnCl2)2] e (b) [Zn(phen)(vpca-ZnCl2)2]... 48
Figura 17 - Exibição ORTEP dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Cu(phen)(van)2], com átomos elipsoides e probabilidade de 50%... 57
Figura 18 - Estruturas possíveis para complexo metálico octaédrico com dois ligantes vanilóides... 61
Figura 19 - Comprimentos das ligações de complexos de cobre (II) com íons N2O4 (R = aldeído). (a) L,L = N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina; (b) L = H2O; (c) L,L = N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina; (d) [Cu(phen)(van)2] (presente trabalho)... 63
Figura 20 - Gráfico do parâmetro T versus a media do comprimento de ligação Cu–Oaxial (Raxial). Compostos: (1) [Cu(van-NO2)2(tetrametileno)]; (2) [Cu(van)2(tetrametileno)]; (3) [Cu(phen)(van)2]; (4) [V(guaicol)2(tetrametileno)]; (5) [Mn(van)2(H2O)2]; (6) [Fe(van)2(H2O)2]; (7) [Ni(van)2(H2O)2]; (8) [Co(van)2(H2O)2]; (9) [Zn(metoxiacético)2(H2O)2]; (10) [Zn(van)2(H2O)2]; (11) [Cu(van)2(H2O)2]; (12) [Ti(guaiacol)2(Cl)2]; (13) [Cu(van)2(tetrametileno)2]; (14) [Zn(phen)(van)2]... 64
Figura 21 - Espectros de EPR do [Cu(phen)(van)2] (a) em solução congelada de DMF e (b) em estado sólido... 65 Figura 22 - Desdobramento do campo cristalino para um complexo de Cu2+ com
distorção tetragonal com alongamento axial... 66 Figura 23 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos
[Zn(phen)(van)2] (preto) e [Cu(phen)(van)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm-1... 69 Figura 24 - Sobreposição dos espectros vibracionais do [Zn(phen)(van)2] (preto) e
[Cu(phen)(van)2] (vermelho) na região de 1700 a 500 cm-1... 69 Figura 25 - Sobreposição dos espectros vibracionais do (a) cis-[Cu(phen)Cl2]
(preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho) e vanilina (azul) e (b) [Zn(phen)Cl2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho) e vanilina (azul) na região de 1750 a 500 cm-1... 70 Figura 26 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos complexos
[Cu(phen)(van)2] (preto), concentrações 1,7 x 10-5 mol L-1 e 3,6 x 10-3 mol L-1 para a ampliação na região das bandas d-d, e [Zn(phen)(van)2] (vermelho), 1,7 x 10-5 mol L-1... 74 Figura 27 - (a) Espectro eletrônico da vanilina (1,1 x 10-4 mol L-1) obtido em
solução aquosa com diferentes pH (3,0 a 9,5) (b) Sobreposição dos espectros da vanilina (preto) e íon vanilato (vermelho)... 76 Figura 28 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em água (preto) e metanol
(vermelho) dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2]. 77 Figura 29 - Sobreposição dos espectros eletrônicos do complexo [Cu(phen)(van)2]
em água (preto), metanol (vermelho), DMF (verde) e acetonitrila (azul)... 78 Figura 30 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vanilina de
-1000 a -1000 mV,e do complexo [Cu(phen)(van)2] de (b) -450 a 400 mV e (c) -500 a 1000 mV... 79 Figura 31 - Mecanismo de oxirredução da Vanilina... 80 Figura 32 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo
[Cu(phen)(van)2] em diferentes velocidades de varredura... 82 Figura 33 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente do pico
catódico do complexo [Cu(phen)(van)2]... 83 Figura 34 - Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)Cl2], obtido em D2O,
300 MHz... 85 Figura 35 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação
homonuclear para o composto [Zn(phen)Cl2], em D2O, 300 MHz... 86 Figura 36 - Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(van)2], obtido em
D2O, 300 MHz... 87 Figura 37 - Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(van)2], obtido em
D2O, 300 MHz, na região de 6,5 a 10 ppm... 88 Figura 38 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação
homonuclear para o composto [Zn(phen)(van)2], em D2O, 300 MHz... 90 Figura 39 - Ensaio de clivagem de DNA empregando o DNA do plasmídeo
pBR322 (8,3 ng µL-1 por poço) com (a) o complexo metálico [Cu(phen)(van)2], e também com (b) 10 mmol L-1 de glutationa (GSH) ou (c) 1 mmol L-1 de H2O2. Todas as incubações foram realizadas durante 90 minutos no escuro... 91 Figura 40 - Estudo de clivagem de DNA do complexo precursor de cobre. Foi
[Cu(phen)(Cl)2] (M1) em diferentes concentrações (40, 20, 10, 5 e 1 μM). A reação ocorreu na presença de GSH 10 mM e H2O2 1 mM, no escuro durante 90 minutos a 25 °C. O controle de DNA (ctrl1) contém apenas DNA; O controle de DNA 2 (ctrl2) contém DNA com complexo [Cu(phen)(van)2]; O controle de DNA 3 (ctrl3) contém DNA com GSH; O controle de DNA 4 (ctrl4) contém DNA com H2O2... 92 Figura 41 - Estudo mecanicista das espécies oxidantes envolvidas na clivagem de
DNA. Foi utilizado DNA de plasmídeo (8,3 ng / L por poço), GSH (1,5 mmol L-1), [Cu(phen)(van)2] (40 μmol L-1) juntamente com inibidores de radicais livres: histidina (histologia, 13 mmol L-1), manitol (man., 13 mmol L-1 ), SOD (4 U L-1), TEMPO (3,9 mmol L -1) e catalase (cat., 3, 9 μmol L-1
) incubados durante 60 minutos a 25 ºC. Reações realizadas sob condições aeróbicas (gel superior) e anaeróbicas (gel inferior)... 94 Figura 42 - Ciclo catalítico proposto para oxidação e redução do complexo
[Cu(phen)(van)2] pela GSH com produção de superóxido: (I) redução de Cu (II) por GSH; (II) produção de O2•- via reoxidação de Cu (I); (III) produção de H2O2 por oxidação de Cu (I); e (IV) produção final de HO•... 95 Figura 43 - Detecção de superóxido utilizando a reação NBT a 37 ºC. (A)
Alteração de cor após 60 minutos de reação de GSH (1,5 mmol L-1) com [Cu(phen)(van)2] a 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 75 μmol L-1. (B) Curvas cinéticas para a reação de GSH (1,5 mmol L-1) e complexo (75, 60, 50, 40, 30, 20 e 10 μmol L-1) usando NBT (50 μmol L-1
) como seletivo. Esta reação foi monitorada durante 60 minutos a 37 °C... 96 Figura 44 - Viabilidade celular de [Cu(phen)(van)2] para (a) 786-0 (b) HUH-7, (c)
B16-F10... 97 Figura 45 - Viabilidade celular de (a) CuCl2 (b) o-fenantrolina e (c) vanilina contra
linha celular 786-0... 97 Figura 46 - Estudos de citometria de fluxo para (a) células não tratadas (controle
negativo), células tratadas com (b) cisplatina 10 μmol L-1 e (d) 50 μmol L-1 (controle positivo), e tratadas com (c) 10 μmol L-1 e (e) 50 μmol L-1 de [Cu(phen)(van)2]... 99 Figura 47 - Gráfico de histograma 3D da análise de citometria de fluxo em células
786-0 tratadas sem (controle) e com [Cu(phen)(van)2] (5, 10, 20 e 50 μmol L-1
)... 101 Figura 48 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos
[Zn(phen)(vglu)2] (preto) e [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm-1... 102 Figura 49 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos
[Zn(phen)(vglu)2] (preto) e [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) na região de 1720 a 500 cm-1... 103 Figura 50 - Sobreposição dos espectros vibracionais do (a) [Cu(phen)(van)2]
(preto), [Cu(phen)(vglu)2] (vermelho) e vglu (azul) e (b) [Zn(phen)(van)2] (preto), [Zn(phen)(vglu)2] (vermelho) e vglu (azul) na região de 1720 a 500 cm-1... 104 Figura 51 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos complexos
[Cu(phen)(vglu)2] (preto), concentrações 9,5 x 10-6 mol L-1 e 2,2 x 10-4 mol L-1 para a ampliação na região das bandas d-d, e [Zn(phen)(vglu)2] (vermelho), concentrações 1,49 x 10-5 mol L-1 e 1,2 x 10-4 mol L-1 para
expansão do espectro... 106 Figura 52 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos compostos
(a) [Cu(phen)(vglu)2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho), D-glucosamina (azul) e base de Schiff vglu (verde) e (b) (a) [Zn(phen)(vglu)2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho), D-glucosamina (azul) e base de Schiff vglu (verde)... 108 Figura 53 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a)
[Cu(phen)(vglu)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vglu)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho)... 108 Figura 54 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vglu de -1000
a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vglu)2] de (b) -350 a 350 mV e (c) -450 a 1100 mV... 111
Figura 55 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo
[Cu(phen)(vglu)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -320 a 320 mV... 113 Figura 56 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos
de redução do complexo [Cu(phen)(vglu)2]... 114 Figura 57 - Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(vglu)2] em DMSO,
499,60 MHz... 114 Figura 58 - Sobreposição dos espectros de infravermelho da quitosana não
modificada (vermelho) e (a) CS-CPV (preto) e (b) CS-ZPV (preto)... 116 Figura 59 - Sobreposição dos espectros de IV dos compostos (a) vglu (preto),
CS-CPV (vermelho) e [Cu(phen)(vglu)2] (azul) e (b) vglu (preto), CS-ZPV (vermelho) e [Zn(phen)(vglu)2] (azul)... 117 Figura 60 - MEV dos filmes CS, CS-CPV e CS-ZPV com ampliações de 500,
1000, 2000 e 4000 X... 119 Figura 61 - MEV/EDS dos filmes (a) CS-CPV e (b) CS-ZPV... 120 Figura 62 - Espectros das soluções de PBS, obtidos após diferentes tempos de
imersão dos filmes modificados (a) CS-CPV (ta = 0 min, tb = 1 min, tc = 5 min, td = 15 min, te = 30 min, tf = 60 min, tg = 120 min, t = 1320 min), com a curva cinética para todos os dados obtidos e (b) CS-ZPV (ta = 0 min, tb = 1 min, tc = 5 min, td = 15 min, te = 30 min, tf = 60 min, tg = 120 min, th = 1305 min), com a curva cinética para todos os dados obtidos... 121 Figura 63 - Curvas de calibração dos complexos (a) [Zn(phen)(van)2], para λ = 271
nm, e (b) [Zn(phen)(van)2], para λ = 228 nm... 122 Figura 64 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos dos compostos (a) vanilina,
1,6 x 10-3 mol L-1, [Cu(phen)(van)2], 9,0 x 10-4 mol L-1 e do composto liberado no filme de cobre, 1,96 x 10-4 mol L-1, e (b) vanilina, 1,6 x 10 -3
mol L-1, [Zn(phen)(van)2], 9,0 x 10-4 mol L-1 e do composto liberado no filme de zinco 1,91 x 10-4 mol L-1... 123 Figura 65 - Sobreposição dos voltamogramas de Pulso Diferencial (DP) dos
complexos (a) [Cu(phen)(van)2] e (b) [Zn(phen)(van)2], liberados no meio PBS em diferentes tempos... 124 Figura 66 - Análise macroscópica da ferida cutânea com (a) 0 dias, (b) 7 dias e (c)
14 dias, após a administração de CS-ZPV2... 125 Figura 67 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos
[Zn(phen)(vpca)2] (preto) [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm-1... 126 Figura 68 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos
[Zn(phen)(vpca)2] (preto) e [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 1750 a 500 cm-1... 127 Figura 69 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos (a) [Cu(phen)(van)2]
(preto), [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e pca (azul) e (b) [Zn(phen)(van)2] (preto), [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) e pca (azul) na região de 1750 a 700 cm-1... 128 Figura 70 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos
[Cu(phen)(vpca)2] (preto) e [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) em meio aquoso com ampliação da região do visível... 130 Figura 71 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso dos compostos
(a) [Cu(phen)(vpca)2] (preto), [Cu(phen)(van)2] (vermelho) e 2-picolilamina (verde) e (b) [Zn(phen)(vpca)2] (preto), [Zn(phen)(van)2] (vermelho) e 2-picolilamina (verde)... 131 Figura 72 - Sobreposição dos espectros eletrônicos em meio aquoso (preto) e
metanol (vermelho) dos complexos (a) [Cu(phen)(vpca)2] e (b) [Zn(phen)(vpca)2]... 132 Figura 73 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vpca de -1000
a 1200 mV,e do complexo [Cu(phen)(vpca)2] de (b) -500 a 250 mV e (c) -450 a 1100 mV... 134 Figura 74 - Voltamogramas de pulso diferencial do [Cu(phen)(vpca)2] em KCl 0,1
mol L-1pH 7,0 dos processos de (a) oxidação e (b) redução... 136
Figura 75 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo
[Cu(phen)(vpca)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -420 a 160 mV... 137 Figura 76 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos
de oxidação do complexo [Cu(phen)(vpca)2]... 138 Figura 77 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos
[Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho) na região de 4000 a 400 cm-1... 139 Figura 78 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos complexos
[Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho) na região de 1780 a 500 cm-1... 139
Figura 79 - Sobreposição dos espectros vibracionais dos (a)
[Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho) na região de 1780 a 500 cm-1... 140 Figura 80 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos
[Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto), 1,15 x 10-5 mol L-1, e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (vermelho), 7,0 x 10-6 mol L-1, em meio aquoso... 143 Figura 81 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a)
[Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Cu(phen)(vpca)2] (vermelho) e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] (preto) e [Zn(phen)(vpca)2] (vermelho), obtidos em meio aquoso... 145 Figura 82 - Sobreposição dos espectros eletrônicos dos complexos (a)
[Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso (preto), metanol (vermelho) e acetonitrila (verde), e (b) [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso (preto) e metanol (vermelho)... 147 Figura 83 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do (a) ligante vpca de -1000
mV e (c) -700 a 1100 mV... 149
Figura 84 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos do complexo
[Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] em diferentes velocidades de varredura, na região de -650 a 300 mV... 151 Figura 85 - Gráfico da raiz quadrada da velocidade versus corrente dos processos
de redução do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]... 151 Figura 86 - Sobreposição dos voltamogramas cíclicos em KCl 0,1 mol L-1, pH 7,0,
dos complexos (a) [Cu(phen)(van)2], (b) [Cu(phen)(vglu)2], (c) [Cu(phen)(vpca)2] e (d) [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]... 153 Figura 87 - Espectro de RMN 1H para 2-picolilamina, obtido em MeOD, 300 MHz,
na região de 3,2 a 8,9 ppm... 155 Figura 88 - Espectro de RMN 1H para 2-picolilamina, obtido em MeOD, 300 MHz
na região de 4,5 a 8,75 ppm... 156 Figura 89 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação
homonuclear para a molécula 2-picolilamina, em MeOD, 300 MHz... 157 Figura 90 - Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtido
em MeOD, 300 MHz na região de 0 a 10,0 ppm... 158 Figura 91 - Espectro de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], obtido
em MeOD, 300 MHz na região de 6,5 a 10,0 ppm... 159 Figura 92 - Diagrama de contorno de RMN bidimensional de correlação
homonuclear para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], em MeOD, 300 MHz... 161
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Reagentes utilizados no presente trabalho... 42 Tabela 2 - Dados cristalográficos e refinamento estrutural para os complexos
[Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2]... 56 Tabela 3 - Distâncias (Å) e ângulos (°) selecionados em torno dos átomos de
cobre para o complexo [Cu(phen)(van)2]... 57 Tabela 4 - Distâncias (Å) e ângulos (°) selecionados em torno dos átomos de
zinco para o complexo [Zn(phen)(van)2]... 58 Tabela 5 - Parâmetros de EPR para o complexo [Cu(phen)(van)2]... 67 Tabela 6 - Parâmetros de EPR para o complexo [Cu(phen)(van)2], em
comparativo com a literatura (GAJEWSKA, et al., 2014)... 68 Tabela 7 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos
complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2]... 73 Tabela 8 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos
complexos [Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2] em meio aquoso... 75 Tabela 9 - Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos
[Cu(phen)(van)2] e [Zn(phen)(van)2], utilizando água e metanol como solventes... 78 Tabela 10 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos
de oxirredução do Cu2+/1+/ Cu1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(van)2].... 82 Tabela 11 - Dados de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)Cl2]... 85 Tabela 12 - Dados de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(van)2]... 88 Tabela 13 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos
complexos [Cu(phen)(vglu)2], e [Zn(phen)(vglu)2]... 105 Tabela 14 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos
complexos [Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2] em meio aquoso... 107 Tabela 15 - Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos
[Cu(phen)(vglu)2] e [Zn(phen)(vglu)2], utilizando água e metanol como solventes... 110 Tabela 16 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos
de oxirredução do Cu2+/1+/ Cu1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vglu)2].. 112 Tabela 17 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos
complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2]... 129 Tabela 18 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos
complexos [Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2] em meio aquoso... 130 Tabela 19 - Dados comparativos entre as bandas de absorção dos complexos
[Cu(phen)(vpca)2] e [Zn(phen)(vpca)2], utilizando água e metanol como solventes... 133 Tabela 20 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos
de oxirredução do Cu2+/1+/ Cu1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vpca)2].. 136 Tabela 21 - Atribuições das principais bandas presentes nos espectros de IV dos
complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2]... 142 Tabela 22 - Atribuição das bandas presentes nos espectros eletrônicos dos
complexos [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2] e [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2] em meio aquoso... 144 Tabela 23 - Dados comparativos entre as bandas de absorção do complexo
[Cu(phen)(vpcaZnCl2)2], utilizando água, metanol e acetonitrila como solventes, e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2], utilizando água e
16
metanol como solventes... 148 Tabela 24 - Parâmetros para determinação da reversibilidade frente aos processos
de oxirredução do Cu2+/1+ e Cu1+/2+ para o complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]... 150 Tabela 25 - Potenciais de oxidação dos ligantes vanilóides nos voltamogramas dos
complexos [Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]... 152 Tabela 26 - Potenciais de oxidação e redução dos voltamogramas dos complexos
[Cu(phen)(van)2], [Cu(phen)(vglu)2], [Cu(phen)(vpca)2] e [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2]... 154 Tabela 27 - Dados de RMN 1H para o composto 2-picolilamina... 157 Tabela 28 - Dados de RMN 1H para o complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2]... 160
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
4-NQO 4-nitroquinolina 1-oxide
786-0 Células de carcinoma renal humano
Abs Absorbância
ATP Adenosina Trifosfato
B16-F10 Células de melanoma de rato
CCDC Cambridge Crystallographic Data Centre
CS quitosana
CS-CPV quitosana modicicada com [Cu(phen)(van)2] CS-ZPV quitosana modicicada com [Zn(phen)(van)2]
CV Voltametria Cíclica
DMEM Dulbecco modification of Minimum Essential Media
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DP Pulso diferencial
EPR Ressonância Paramagnética de Elétrons FITC Isotiocianato de fluoresceína
GSH Glutationa
HUH-7 Células de hepatocarcinoma humano
IC50 concentração para 50% de inibição de um composto
I.L. Intraligante
IP Imidazo-fenantrolina
IV Infravermelho
LMCT Transferência de Carga do Ligante para o Metal
MEOD Metanol deuterado
MLCT Transferência de Carga do Metal para o Ligante
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetra-brometo de zinco NBT Nitroazul de tetrazólio
ORTEP Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot Phen 1,10-fenantrolina
RMN Ressonância Magnética Nuclear
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SOD Superóxido desmutase
TEMPO N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina UV-Vis Ultravioleta e Visível
Van Vanilina
Vglu 2-Deoxy-2-[(E)-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)amino]hexopyranose Vpca 2-metóxi-4-{(E)-[(piridin-2-ilmetil)imina]metil}fenol
LISTA DE SÍMBOLOS Deformação Angular Frequência de estiramento g// Fator-g paralelo g Fator-g perpendicular Variação
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 22 2 OBJETIVOS... 25 2.1 OBJETIVOS GERAIS... 25 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 25 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 27 3.1 QUÍMICA BIOINORGÂNICA... 27 3.2 BASES DE SCHIFF... 30 3.3 VANILINA... 32 3.4 GLUCOSAMINA E QUITOSANA... 35 3.5 2-PICOLILAMINA... 37
3.6 BIOQUÍMICA DO COBRE (II)... 38
3.7 BIOQUÍMICA DO ZINCO (II)... 39
4 PARTE EXPERIMENTAL... 42
4.1 REAGENTES UTILIZADOS... 42
4.2 PROCEDIMENTOS DE SÍNTESES... 43
4.2.1. Síntese do sistema [M(phen)Cl2], com M = Cu2+ e Zn2+... 43
4.2.2. Síntese do sistema [M(phen)(van)2] , com M = Cu2+ (1) e Zn2+ (2)... 43
4.2.3. Síntese da base de Schiff vglu (2-Deoxy-2-[(E)-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)amino]hexopyranose)... 44
4.2.4. Síntese do sistema [M(phen)(vglu)2], onde vglu = 2-Deoxy-2-[(E)-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)amino]hexopyranose e M = Cu2+ (3) e Zn2+ (4)... 44
4.2.5. Preparação dos filmes de quitosana... 45
4.2.6. Síntese do sistema CS-MPV, com M = Cu2+ (5) ou Zn2+ (6)... 46
4.2.7.. Síntese do sistema [M(phen)(vpca)2], onde vpca = 2-metóxi-4-{(E)-[(piridin-2-ilmetil)imina]metil}fenol e M = Cu2+ (7) e Zn2+ (8)... 47
4.2.8. Síntese do sistema [M(phen)(vpca-ZnCl2)2], com M = Cu2+ (9) e Zn2+ (10).. 48
4.3 METODOS DE CARACTERIZAÇÃO... 48
4.3.1. Difração de Raio-X... 49
4.3.2. Ressonância Paramagnética de Elétrons (EPR)... 49
4.3.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN - 1H)... 49
4.3.4. Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho (IV)... 50
4.3.5. Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível... 50
4.3.6. Eletroquímica... 50
4.3.7. Análise de clivagem de DNA plasmidial por eletroforese em gel... 51
4.3.8. Análise do superóxido: redução com NBT... 51
4.3.9. Cultura celular... 51
4.3.10. Ensaio de viabilidade celular (MTT)... 52
4.3.11. Anexina V-FITC/PI Dupla Coloração e Análise por Citometria de Fluxo.. 52
4.3.12. Ensaio de Ciclo celular... 53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 55
5.1 SISTEMA [M(phen)(van)2], M = Cu2+ (1) e Zn2+ (2)... 55
5.1.1. Estrutura Cristalina do sistema [M(phen)(van)2]... 55
5.1.2. Ressonância Paramagnética de Elétrons do complexo [Cu(phen)(van)2]... 64
5.1.3. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(van)2]... 68
sistema [M(phen)(van)2]... 74
5.1.5. Voltamogramas dos compostos Vanilina e [Cu(phen)(van)2]... 79
5.1.6. Ressonância Magnética Nuclear de 1H dos complexos [Zn(phen)Cl2] e
[Zn(phen)(van)2]... 84
5.1.7. Ensaios biológicos do complexo [Cu(phen)(van)2]... 90
a) Atividade de Nuclease... 90 b) Ensaio de geração de superóxido... 95
c) Investigações de citotoxicidade....
...
96 d) Medições de citometria de fluxo... 98 e) Análise do ciclo celular... 99
5.2 SISTEMA [M(phen)(vglu)2], M = Cu2+ (3) e Zn2+ (4)... 101
5.2.1. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vglu)2]... 101
5.2.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vglu)2]... 105
5.2.3. Voltamogramas do ligante vglu e do complexo [Cu(phen)(vglu)2] ... 110
5.2.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1H do complexo [Zn(phen)(vglu)2]... 114
5.3 SISTEMA CS-MPV, M = Cu2+ (5) e Zn2+ (6)... 115
5.3.1. Espectros Vibracionais na região do Infravermelho do sistema CS-MPV... 115 5.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) acoplado ao Sistema de
Dispersão de Energia (EDS) para o sistema CS-MPV... 118 5.3.3. Avaliação da liberação e quantificação do teor de [M(phen)(van)2] nos
filmes de quitosanas modificadas... 120 5.3.4. Aplicação do filme CS-ZPV na cicatrização de feridas cutâneas... 124
5.4 SISTEMA [M(phen)(vpca)2], M = Cu2+ (7) e Zn2+ (8)... 126
5.4.1. Espectros vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vpca)2]... 126
5.4.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vpca)2]... 129
5.4.3. Voltamogramas do ligande vpca e do complexo [Cu(phen)(vpca)2]... 134
5.5 SISTEMA [M(phen)(vpcaZnCl2)2], M= Cu2+ (9) e Zn2+ (10)... 138
5.5.1. Espectros vibracionais na região do Infravermelho do sistema [M(phen)(vpcaZnCl2)2]... 138
5.5.2. Espectros de absorção eletrônica na região do Ultravioleta e Visível do sistema [M(phen)(vpcaZnCl2)2]... 142
5.5.3. Voltamogramas do ligante vpca e do complexo [Cu(phen)(vpcaZnCl2)2].... 148
5.5.3.1 Comparativo entre os complexos [Cu(phen)(L)2], com L = van, vglu, vpca e vpcaZnCl2... 152
5.5.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1H do ligante 2-picolilamina e do complexo [Zn(phen)(vpcaZnCl2)2]... 155
6 CONCLUSÃO... 163
Introdução
1 INTRODUÇÃO
A química bioinorgânica visa investigar e influenciar os processos biológicos, a partir do desenvolvimento de complexos metálicos biologicamente ativos (DAVID e MEGGERS, 2008). Esta área vem se ampliando desde a década de 70, despertando o interesse de muitos pesquisadores que objetivam produzir novos fármacos, associando as propriedades dos metais a medicamentos, tornando-os mais eficazes, com menos efeitos colaterais e menores resistências no organismo.
Muitas descobertas relevantes vêm sendo realizadas na área da bioinorgânica, como, por exemplo, desenvolvimentos de novos complexos metálicos e agentes organometálicos com atividade anticancerígena, os quais possuem fortes interações com o DNA, como é o caso da cisplatina, um complexo de platina descoberto em 1978, utilizado no tratamento de diferentes tipos de câncer (DAVID e MEGGERS, 2008).
A cisplatina, embora eficiente para alguns tipos de câncer, apresenta uma série de limitações quanto ao seu uso, devido em parte à sua baixa seletividade, causando danos tanto a células tumorais quanto a células saudáveis, o que gera efeitos colaterais adversos. Com isso, novos compostos de coordenação vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de fornecer novas alternativas para tratamentos de câncer, utilizando para isso centros metálicos essenciais para o organismo, tais como ferro, cobre, zinco e molibdênio.
Dentre esses, complexos de cobre se destacam por apresentarem aplicações biológicas relevantes, estando a maioria delas diretamente relacionadas aos danos causados em moléculas celulares, modificando suas estruturas e induzindo processos tais como fragmentação de DNA, mutações e apoptose. Particularmente, sistemas de cobre(II) com o ligante o-fenantrolina têm sido potencialmente investigados por causar danos oxidativos ao DNA, apresentando alta eficiência nucleolítica, acarretando em atividade antitumoral, antibacteriana e antifúngica (LINDER, 2001).
De maneira semelhante, compostos de zinco são reconhecidos como sistemas biologicamente ativos, recebendo especial atenção por atuar na fragmentação do DNA através de processos hidrolíticos, acarretando na morte de células tumorais (ANBU, et al., 2012).
No entanto, não são encontrados na literatura dados de complexos contendo cobre ou zinco ligados a moléculas dipiridínicas ou derivados e, tendo ainda a presença de dois ligantes vanilóides, originando uma estrutura octaédrica.
Compostos contendo grupos vanilóides são substâncias orgânicas que apresentam o grupo 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeido substituídos na posição 1 em sua estrutura. Estão incluídos nesta classe a vanilina, o ácido vanílico, eugenol e a capsaicina.
A vanilina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído, é uma substância bastante utilizada na indústria alimentícia e de cosméticos, por ser o ingrediente ativo responsável pelo aroma de baunilha (WU, et al., 2009). Além da sua importância industrial e econômica, a vanilina também tem sido reconhecida como um composto bioativo, apresentando atividade antioxidante (TAI, et al., 2011), antimutagênica (SHAUGHNESSYA; SETZER e DEMARINIC, 2001), anti-inflamatória (MAKNI, et al., 2011) e potencial efeito de proteção contra o câncer (DURANT e KARRAN, 2003).
Tendo em vista a relevância dos complexos metálicos com vanilinas, bem como das aplicações biológicas de compostos com sistemas zinco (II) e cobre (II) – diiminas, o desenvolvimento deste trabalho tem como objetivo a síntese e caracterização dos novos sistemas vanilóides [M(phen)(van)2], [M(phen)(vglu)2], [M(phen)(vpca)2] e [M(phen)(vpcaZnCl2)2], com M = Cu2+ e Zn2+, e posterior avaliação da sua atividade biológica, visando a obtenção de resultados relevantes frente às dificuldades encontradas no desenvolvimento de fármacos eficazes.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
O objetivo para este trabalho foi gerar novos conhecimentos sobre a química de coordenação dos vanilóides, sintetizando e caracterizando novos complexos de cobre(II) e zinco(II) com esses ligantes, a fim de obter compostos com potencialidade para atuar como bioativos no tratamento do câncer.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Sintetizar novos complexos de cobre(II) e zinco(II) com fenantrolina, associados ao ligante vanilina, [M(phen)(van)2], bem como bases de Schiff derivadas da vanilina, [M(phen)(vglu)2], e [M(phen)(vpca)2], além de sintetizar complexos trinucleares, [M(phen)(vpcaZnCl2)2], e poliméricos, CS-MPV;
Caracterizar os complexos obtidos através das técnicas de difração de Raio X de monocristal, Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho (IV), Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível (UV-Vis), Espectroscopia de Ressonância Paramagnética de Elétrons (EPR), Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e Eletroquímica (voltametria cíclica).
Avaliar a atividade antitumoral dos novos complexos sintetizados, através de ensaios de atividade de nuclease, geração de superóxido, citotoxicidade, citometria de fluxo e análise do ciclo celular.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 QUÍMICA BIOINORGÂNICA
As características funcionais dos metais em sistemas biológicos são fundamentais para a manutenção da vida. Metais como V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn e Mo representam menos de 0,05% da biomassa presente nos meios biológicos, entretanto, mesmo em baixas concentrações, são essenciais para as funções vitais de diferentes organismos.
As funções biológicas desempenhadas por elementos e compostos inorgânicos são diversificadas, podendo atuar como mensageiros, transportadores de elétrons e oxigênio, catalizadores de reações de oxirredução e ácido-base, entre outras (DEMICHELI, 2003). Cerca de um terço de todas as proteínas presentes no organismo possuem metais em suas estruturas, os quais são fundamentais para seu desempenho funcional. Dentre eles, pode-se citar o ferro e o cobre, que são centro-ativos de várias metaloenzimas e também de proteínas transportadoras de oxigênio, como a hemoglobina e a hemocianina; o magnésio ligado a grupos fosfatos, participando de reações enzimáticas envolvendo o ATP e outros compostos que contêm fosfato; o manganês, o cobalto e o zinco, atuando como constituintes de sítios ativos de enzimas que catalisam diversas reações importantes para o metabolismo, tais como hidrólise e descarboxilação de vários compostos; e a atuação do zinco em várias proteínas que regulam a expressão dos genes no núcleo celular (ORVIG e ABRAMS, 1999).
Dentre essa variedade de funções, a bioinorgânica se destaca no desenvolvimento de novos complexos metálicos com atividade anticancerígena, fator que provém das suas interações com o DNA. A interação entre o DNA e centros metálicos catiônicos é favorecida pela substituição nucleofílica, fato que se deve à presença de pares de elétrons na estrutura do ácido em questão. A Figura 1 apresenta os três tipos de interação que podem ocorrer entre o DNA e o complexo metálico.
Figura 1–Formação de adutos através da reação de substituição nucleofílica entre DNA e complexos metálicos,
que resultam em coordenações de esfera (a) interna e (b) externa. (c) Interação de esfera externa envolvendo ligações não covalentes.
Fonte: Adaptado de http://heritagetrackers.com/services/genetic-genealogy/.
No primeiro tipo, Figura 1a, o ataque nucleofílico do DNA ocorre sobre o centro metálico, e, nesse caso, o nucleófilo se coordena diretamente a ele, fazendo parte da esfera de coordenação interna; no segundo, Figura 1b, o ataque nucleofílico é direcionado ao átomo do ligante, estabelecendo uma interação de esfera externa; no terceiro, Figura 1c, também de esfera externa, a coordenação ocorre através de ligações não covalentes, como é o caso das ligações de hidrogênio, entre o DNA e o ligante. Para esse ultimo caso, a interação não é classificada como substituição nucleofílica.
Pesquisas sobre compostos de coordenação que pudessem ser utilizados no tratamento do câncer tiveram início com o desenvolvimento da cisplatina, um complexo de platina descoberto em 1978, utilizado no tratamento de diferentes tipos de câncer (DAVID e MEGGERS, 2008). Sugere-se que a base da ação quimioterápica da cisplatina e dos complexos correlatos para esse fim seja a formação de complexos estáveis entre a Pt(II) e o DNA (DAVIS; TINKER; FRIEDLANDER, 2014).
A cisplatina quando administrada permanece como espécie dicloro neutra até ser introduzida no interior da célula, onde ocorre a liberação dos cloretos (ligantes) e as espécies catiônicas resultantes são atraídas eletrostaticamente pelo DNA, ocorrendo a complexação aos átomos de N das bases nucleicas, conforme ilustrado na Figura 2. A complexação da platina leva à curvatura da hélice, sugerindo que o DNA se torne incapaz de se reproduzir ou se reparar, dessa forma, a célula torna-se marcada para morrer num processo conhecido por apoptose.
Figura 2–Interação da cisplatina com o DNA
Fonte: Adaptado de Naik (2014).
Apesar da eficiência, a cisplatina possui efeitos colaterais altamente indesejáveis, como diminuição da função renal, anemia e infertilidade, por isso, grandes esforços vêm sendo realizados para obter complexos que sejam eficientes, mais seletivos no organismo e que apresentem poucos efeitos colaterais.
Assim, diferentes compostos de coordenação vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de fornecer novas alternativas para o tratamento de câncer, utilizando para isso centros metálicos essenciais para o organismo, tais como ferro, cobre, zinco e molibdênio, uma vez que a platina não é um elemento essencial para o organismo e que, também por isso, pode causar efeitos adversos.
No que diz respeito à seletividade de moléculas citotóxicas em relação a células alvo, os açúcares, especificamente a glicose, tem sido alvo de muitos estudos, tendo em vista que as células cancerígenas capturam maior quantidade de glicose do que as células normais (NASCIMENTO, et al., 2016). De modo geral, todas as células requerem glicose para a sobrevivência, mas, devido ao seu rápido crescimento e proliferação, as células tumorais têm atividade metabólica aumentada, em comparação com células não proliferantes, com consumo de glicose ainda maior.
As células cancerosas são conhecidas por alterar as suas vias metabólicas, deslocando de fosforilação oxidativa mitocondrial para glicólise anaeróbia em baixas concentrações de oxigênio. O último é um processo energeticamente ineficiente que requer uma quantidade em excesso de glicose (NASCIMENTO, et al., 2016). Por isso a importância em utilizar complexos metálicos com açúcares, tendo em vista que as células cancerígenas deverão capturar essas moléculas com maior eficiência, em comparativo às células normais no organismo.
Além da atividade antimutagênica, os complexos metálicos atuam na redução de radicais livres que estão muitas vezes presentes em excesso no organismo, tendo em vista que a reatividade dos metais e a capacidade em variar os seus estados de oxidação influenciam de
forma direta muitos processos de oxirredução que ocorrem no meio biológico (FRANZ e HAAS, 2009). Além disso, há um crescente interesse na utilização de metais de transição em processos neurológicos, com destaque a alguns estudos envolvendo a participação de metais em doenças de Alzheimer e de Parkinson (DAVID e MEGGERS, 2008).
Outra aplicação importante para os compostos de coordenação está associada à catálise bioinorgânica. Nos últimos anos, diversas discussões vêm sendo geradas acerca da formação de novos complexos metálicos capazes de catalisar transformações químicas em organismos vivos, resultando na produção de novos fármacos catalíticos, os quais podem ser utilizados em doses reduzidas quando comparados aos não-catalíticos (MEGGERS; SASMAL e STREU, 2013).
Assim, através de estudos e desenvolvimento de novos complexos bioativos, a química de coordenação tem contribuído de forma singular para ampliar os conhecimentos acerca dos processos biológicos que ocorrem no organismo e, com isso, possibilita a obtenção de fármacos mais eficazes.
3.2. BASES DE SCHIFF
As bases de Schiff são moléculas constituídas pelo grupo imina (C=N), com o átomo de nitrogênio ligado a um grupo arila ou alquila, mas não a um hidrogênio. Essas moléculas são formadas a partir da reação de condensação entre aminas primárias e compostos carbonilados, podendo ser carbonilas de aldeídos ou de cetonas. Durante a reação, o par de elétrons isolados do nitrogênio ataca a carbonila formando um intermediário hemiaminal, em seguida ocorre desidratação, ao mesmo tempo em que a imina é formada, conforme esquematizado na Figura 3.
Figura 3–Reação esquematizada da condensação entre amina primária e aldeído catalisada por ácido.
Fonte: Araújo (2011).
As primeiras bases de Schiff foram sintetizadas por Hugo Schiff, em 1864, através de reações da anilina com aldeídos, como acetaldeído, valeraldeído, benzaldeído e cinamaldeído, e, a partir daí, seguiram-se outros trabalhos com resultados semelhantes, gerando uma nova classe de compostos: as iminas, que posteriormente ficaram conhecidas como bases de Schiff (TIDWELL, 2008).
As bases de Schiff têm se destacado no campo da bioinorgânica, por apresentarem propriedades químicas e biológicas relevantes, tais como, biocompatibilidade e variabilidade estrutural (KAZEMI, et al., 2015). As importantes propriedades físicas e biológicas das bases de Schiff estão diretamente relacionadas às ligações de hidrogênio intermoleculares e equilíbrios na transferência de prótons (SAHU; THAKUR e KASHYAP, 2012). Essa classe de compostos desempenha um importante papel nos sistemas biológicos, presentes em diversas enzimas e proteínas que atuam no organismo, tais como, sintase triptofano, transaminases, transcetolases, entre outras (SAHU; THAKUR e KASHYAP, 2012).
Esses compostos apresentam propriedades relevantes, como a capacidade em ligar-se reversivelmente ao oxigênio, atividade catalítica em reações de hidrogenação de olefinas e capacidade de formar complexos com metais de transição (DEDE; KARIPCIN e CENGIZ, 2009).
Características como a doação moderada de elétrons do átomo de nitrogênio, atuando como base de Lewis, bem como os efeitos estéricos e eletrônicos facilmente ajustáveis tornam as bases de Schiff ligantes versáteis, capazes de formar complexos estáveis com diferentes metais de transição, além de estabilizá-los em diferentes geometrias e estados de oxidação.
Estudos de complexos com bases de Schiff utilizados no desenvolvimento de novas moléculas farmacêuticas são relatados na literatura, por apresentarem aplicações biológicas relevantes, como a atividade antitumoral (KARTHIKEYAN et al., 2006); (ABDALLAH et al., 2009), a qual está associada à sua propriedade em interagir com o DNA, tendo em vista que o DNA é conhecido como um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas anticancerígenas. Além disso, esses sistemas imínicos também apresentam atividade antifúngica (KARTHIKEYAN et al., 2006); (ABDALLAH et al., 2009), antiviral, antituberculosa, antimalárica, vasorrelaxante, analgésica (BHARTI et al., 2010), anticonvulsivante (KARTHIKEYAN et al., 2006) e antibacteriana (ABDALLAH et al., 2009); (BHARTI et al., 2010).
3.3.VANILINA
A vanilina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído, cuja fórmula estrutural é apresentada na Figura 4, é uma substância bastante utilizada na indústria alimentícia e de cosméticos, por ser o ingrediente ativo responsável pelo aroma de baunilha (WU, et al., 2009). Além da sua importância industrial e econômica, a vanilina também tem sido reconhecida como um composto bioativo, apresentando atividade antioxidante (TAI, et al., 2011), antimutagênica (SHAUGHNESSYA; SETZER e DEMARINIC, 2001), anti-inflamatória (MAKNI, et al.,2011) e potencial efeito de proteção contra o câncer (DURANT e KARRAN, 2003).
Figura 4 – Fórmula estrutural do composto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído
O H OH O CH3 Fonte: Autora (2018).
Ohta foi o primeiro pesquisador a descobrir, em 1986,que a vanilina tem a capacidade de reduzir as mutações causadas pelos agentes químicos 4-nitroquinolina 1-oxide (4-NQO) e furilfuramida (AF-2) em bactérias (OHTA, et al.,1986). Posteriormente, foi descoberto que a
vanilina era capaz de inibir também mutações espontâneas em bactérias (FLORA, et al.,1994), (SHAUGHNESSY; SETZER e DEMARINI, 2001).
Imanishi e colaboradores constataram que a vanilina reduz significativamente as mutações causadas por radiação ultravioleta, raio-X e etilnitrosoureia também em células de mamíferos (células pulmonares de hamster: V79) (IMANISHI, et al.,1990).
Adicionalmente, a vanilina tem a capacidade de suprimir a metástase de células de câncer de mama em ratos (LIRDPRAPAMONGKOL, et al.,2005) e atenua a expressão dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1β e IL-6, em ensaios com ratos (MAKNI, et al., 2011).
O grupo aldeído presente na estrutura da vanilina possui elevada reatividade e, como consequência, muitos derivados da vanilina são originados por reações que têm este grupo como centro reativo. Dentre os derivados, as bases de Schiff, formadas pela condensação da amina primária com o aldeído vanilina, se destacam nesse trabalho.
Reações com a vanilina para a formação de bases de Schiff possibilitam diversas aplicações na área da química e da biologia (SABAA; MOHAMED e ORABY, 2009), com elevado potencial em atividades antibacterianas e antitumorais (ZHANG; WANG e DING, 2010).
A vanilina também possui em sua estrutura o grupo vanilóide – constituído pelo anel aromático e os grupos substituintes metóxi e fenol – o qual apresenta importantes atividades em sistemas biológicos. Compostos que, semelhantemente à vanilina, possuem o grupo vanilóide em suas estruturas, normalmente favorecem a apoptose, além de apresentarem importantes características antioxidantes e antimicrobianas (MEDEIROS, 2014). Alguns exemplos de derivados vanilóides que possuem importantes aplicações biológicas como a capsaicina, o eugenol e o ácido ferúlico são apresentados na Figura 5. Tendo como base esses exemplos de vanilóides apresentados, pode-se destacar a importância que este grupo possui para diversas atividades biológicas no organismo.
Figura 5– Fórmulas estruturais dos compostos vanilina, capsaicina, eugenol e ácido ferúlico, com destaque ao
grupo vanilóide em vermelho
Fonte: Autora (2018).
As características estruturais dos vanilóides possibilitam a utilização destes como ligantes, uma vez que cada um dos seus grupos funcionais, éter e fenol, dispõem de um par de elétrons não ligante, disponível para interagir com centros metálicos, coordenando-se preferencialmente de forma bidentada.
O ambiente de coordenação bidentado assimétrico dos ligantes vanilóides, no qual um dos átomos de oxigênio doadores é um grupo metóxido enquanto o outro é um fenol, possibilita a obtenção de compostos com diferentes arranjos estruturais.
Complexos octaédricos contendo dois ligantes vanilóides na esfera de coordenação em cis, em conjunto com um ligante bidentado adicional ou ainda dois ligantes monodentados, normalmente originam compostos onde os grupos metóxidos estão posicionados trans aos átomos doadores dos ligantes adicionais. (Esta organização estrutural é identificada no presente trabalho como cis-I).
No entanto, também é possível se obter complexos octaédricos com os grupos metóxidos posicionados trans um ao outro e, consequentemente, tendo os oxigênios fenólicos trans aos ligantes adicionais (denominado nesse trabalho de cis-III). Esses complexos são extremamente raros, devido à dificuldade em se direcionar a posição dos ligantes na etapa de síntese (MEDEIROS, et al., 2018).
É importante destacar que o posicionamento dos átomos de oxigênio nos ligantes vanilóides tem uma influência direta sobre as propriedades estruturais e químicas dos complexos. A estrutura cis-I ocasiona um encurtamento das ligações do eixo z (Ofenol -M-Ofenol), enquanto que os compostos cis-III apresentam alongamento do eixo z, agora composto
por Ometóxido-M-Ometóxido. Essas variações estruturais dos complexos representam alterações químicas significativas, tendo consequências sobre a reatividade, labilidade dos ligantes e potencial redox.
3.4.GLUCOSAMINA E QUITOSANA
A molécula 2-amino-2-deoxi-D-glucose, também chamada de glucosamina, é um aminomonossacarídeo derivado principalmente da quitina – um polissacarídeo natural. A Figura 6 apresentada a fórmula estrutural da glucosamina.
Figura 6– Fórmula estrutural da 2-amino-2-deoxi-D-glucose
Fonte: Autora (2018).
A glucosamina é uma molécula bioativa, conhecida por ser o componente essencial dos tecidos conjuntivos, cartilagens e ligamentos, e, assim, contribui para a flexibilidade, resistência e elasticidade desses tecidos no corpo humano (SALAZAR, et al., 2014). Esse monossacarídeo também desempenha importantes funções na formação de fluidos sinoviais, pele, osso, unhas, válvulas do coração, vasos sanguíneos e secreções mucosas dentro dos sistemas digestivo, respiratório e urinário (CARTER, 2001). Na Figura 7 é apresentada a atuação da glucosamina em alguns tecidos do corpo humano.
Figura 7– Atuação esquemática da glucosamina em tecidos do corpo humano
As glucosaminas possuem importância biológica e farmacêutica, atuando como inibidores reversíveis de glicosidase e agentes antidiabéticos (SAH, et al., 2001). A D-glucosamina, especificamente, também promove a formação e reparação de cartilagem, além de ser utilizada como suplemento no tratamento de osteoartrite (PESSOA; TOMAZ e HENRIQUES, 2003), tendo em vista seu papel importante na formação de vários tecidos do corpo humano.
Atualmente, a glucosamina tem ganhado destaque devido suas características de rápida absorção, além de apresentar várias hidroxilas e o grupamento amino, o que a torna uma molécula de fácil modificação (SANTOS, 2010).
O grupamento amino presente na estrutura da glucosamina possibilita a formação de bases de Schiff com aldeídos ou cetonas, as quais possuem importantes atividades biológicas e catalíticas. As primeiras bases de Schiff formadas por reações entre glucosaminas e salicilaldeídos foram preparadas por Irvine e Hynd, em 1913. Tais sínteses foram realizadas por meio de reações entre cloridrato de glucosamina e salicilaldeído, em solução aquosa de bicarbonato de sódio, com formação de produto insolúvel em água (NGUYEN, et al., 2011).
Dentre os derivados da glucosamina, destaca-se a quitosana (Figura 8), um polissacarídeo catiônico produzido através da desacetilação parcial da quitina, que consiste em monômeros de D-glucosamina e N-acetil-D-glicosamina. É encontrada principalmente no exoesqueleto de artrópodes, especialmente crustáceos, através de um processo de alcalinização sob altas temperaturas (ZHANG, et al., 2015).
Figura 8 - Fórmula estrutural da quitosana
Fonte: Autora (2018).
A quitosana apresenta potenciais aplicações em sistemas biológicos, tais como transportadores catalíticos, membrana de separação (PAGNONCELLI, 2008), adsorção de proteínas e liberação controlada de fármacos. Pode ser utilizada sob a forma de fibras, membranas, hidrogéis, filmes, microesferas ou cápsulas (ZOU; LI e LI, 2015). As propriedades mais relevantes da quitosana estão relacionadas à sua biodegradabilidade,
biocompatibilidade, não toxicidade, disponibilidade comercial e insolubilidade em soluções aquosas neutras e alcalinas, além de apresentar atividade antifúngica e antibacteriana, o que faz com que esse biopolímero seja alvo de estudos que envolvam regeneração de tecidos vivos, cicatrização de feridas e administração de medicamentos, particularmente, através do desenvolvimento de filmes como sistemas de transporte.
Filmes de quitosana tem despertado interesse na área farmacêutica visto que são flexíveis, difíceis de quebrar, duráveis, possuem valores moderados de permeabilidade à água e oxigênio e inibem o crescimento microbiano (MARTÍNEZ-CAMACHO, et al., 2010). Essas características, combinadas com certa bioadesividade (HE; DAVIS e ILLUM, 1998) favorecem a aplicação tópica de filmes de quitosana como transportadores do composto ativo, que deverá ser liberado sob condições específicas, de forma controlada.
O grupo aldeído da vanilina pode sofrer uma reação de base de Schiff com aminas da quitosana e formar uma estrutura de rede que favorece a estabilização e liberação controlada do composto ativo (ZOU; LI e LI, 2015).
3.5.2-PICOLILAMINA
A 2-picolilamina, 2-(aminometil)piridina, é constituída por um anel piridínico e uma amina como substituinte, conforme fórmula estrutural apresentada na Figura 9.
Figura 9 – Fórmula estrutural da molécula 2-picolilamina
Fonte: Autora (2018).
O grupo amina presente na molécula picolilamina possui grande reatividade e, com isso, possibilita uma série de modificações estruturais gerando novos derivados, como é o caso das bases de Schiff, que possuem atividades biológicas relevantes, além de favorecer diferentes interações com o DNA, o qual é um alvo importante para moléculas com atividade anticancerígena (KAZEMI, et al., 2015).
Complexos contendo bases de Schiff derivadas da 2-picolilamina vem sendo investigados por apresentarem atividade de clivagem do DNA, devido à elevada afinidade
entre eles. No entanto, para estes complexos sintetizados, são apresentados apenas estudos de caracterização estrutural e de ligação ao DNA (ENGIN, et al., 2016).
A molécula 2-picolilamina (pca) tem sido utilizada como ligante em muitos compostos biologicamente ativos, se coordenando a íons metálicos através dos átomos doadores de nitrogênio piridínico e da amina, de forma bidentada. Muitos complexos metálicos que possuem derivados da picolilamina são usados como modelos que mimetizam tanto a estrutura quanto a reatividade dos sítios metálicos em sistemas biológicos e, com isso, torna-se possível compreender mecanismos mais complexos pretorna-sentes no organismo, além de mostrar que a picolilamina possui um amplo espectro de atividades biológicas (RAFIQUE, et al., 2015).
3.6.BIOQUÍMICA DO COBRE (II)
O cobre é um dos poucos metais que pode ser encontrado na sua forma elementar na natureza. Possui massa atômica igual a 63,6u e está localizado no grupo 11 da tabela periódica, sendo, portanto, um metal de transição. A configuração eletrônica da camada de valência deste metal é 3d10, 4s1, apresentando como principais estados de oxidação os valores +1 e +2.
O cobre é essencial para muitas formas de vida, sendo o elemento principal em mais de 300 proteínas em humanos (CRISPONI, et al., 2010). Seu caráter bioessencial foi descoberto em 1925 (LINDER,1991), porém, sua importância biológica foi reconhecida apenas nas últimas décadas, com os avanços no estudo da química bioinorgânica deste metal (LIPPARD e BERG, 1994).
Por se tratar de um elemento biologicamente ativo, o cobre possui aplicações biológicas relevantes, estando à maioria delas diretamente relacionadas com a facilidade de interconversão entre os seus estados de oxidação (I) e (II). A propriedade redox do cobre é essencial para várias vias metabólicas, como a respiração mitocondrial, eliminação de radicais livres e a absorção de ferro onde atua como um cofator catalítico.
Ao mesmo tempo, o cobre é um elemento de fundamental importância nos mecanismos de reações de várias enzimas, como, por exemplo, no transporte de elétrons (citocromo c oxidase), na produção de melanina (tirosinase) e na inativação de radicais como o íon superóxido (superóxido dismutase).
