UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Parasitologia
Dissertação
CLONAGEM E EXPRESSÃO DA PROTEINA GP
19 DE Ehrlichia canis
Fernanda Antunes Brum
Pelotas, Dezembro de 2010.
FERNANDA ANTUNES BRUM
CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEINA GP19 DE EHRLICHIA canis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do Titulo de Mestre em Parasitologia.
Orientação:
Banca examinadora:
Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite (Orientador) Prof. Dr. Luciano da Silva Pinto (UFPel)
Dra. Talita Bandeira Roos (UFPel) Prof. Dr. Leandro Nizoli (UFPel)
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, pelo dom da vida.
Aos meus pais e meu irmão, pelo incentivo, carinho e palavras de apoio. Aos meus amigos de laboratório o meu muito obrigado por esses anos de trabalho duro, mais de muita amizade, companheirismo, em especial ao Relber que sem ele não conseguiria terminar esse trabalho, muito, mais muito obrigado por tudo.
Ao amigo Luciano da Silva Pinto, pelo carinho, amizade e claro muitos ensinamentos que com certeza vou levar por toda a minha vida.
Ao meu orientador Fabio Leivas Leite, que me deu a chance de trabalhar com ele e com isso aprender não só sobre trabalho, mas também sobre amizade e dedicação.
Ao meus colegas de mestrado, em especial a Gabriela, Alice, Samara, pelo companheirismo.
Aos colegas da biotecnologia, obrigado pelos ensinamentos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia – Instituto de Biologia, por acreditar nesse trabalho.
A Universidade Federal de Pelotas, verdadeiro centro de excelência,que colocou a meu dispor instrumentos para aperfeiçoar o meu aprendizado contribuindo assim para a sociedade.
Por fim, agradeço a todos que de alguma forma colaboraram para a realização direta ou indireta deste trabalho.
RESUMO
BRUM, Fernanda Antunes. Clonagem e Expressão da Proteína gp19 de
Ehrlichia canis. 2010. 50 f. Dissertação (Mestrado) – Programa de
Pós-Graduação em Parasitologia – Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A Ehrlichia canis é a responsável pela erliquiose monocitica canina (EMC). O período de incubação da EMC é de 8 a 20 dias; a doença apresenta três fases: aguda, subclínica e crônica. As espécies de E. canis são transmitidas para o cão e para o homem pelo carrapato da espécie Rhipicephalus
sanguineus. O diagnóstico é realizado através de esfregaços sanguíneos,
métodos sorológicos ou reação em cadeia da polimerase (PCR), sendo a imunofluorescencia o método mais utilizado. Recentemente E. canis, foi descrita como sendo capaz de causar doença grave em humanos, com casos de óbito principalmente em crianças e idosos. A proteína gp 19 é um importante antígeno imunodominante, pois induz rápida resposta imunológica nos cães. A similaridade entre as amostras geograficamente distintas sugere que a proteína gp19 possa ser usada para ensaios de imunoenzimáticos de diagnóstico, bem como em programas vacinais, pois esta proteína é especifica para E. canis não tendo assim reações cruzadas com outros gêneros de Ehrlichia. O gene gp 19 foi amplificado pela reação da polimerase em cadeia (PCR) utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos contendo sítios para enzimas de restrição. O produto da PCR, após digestão, foi purificado e clonado no vetor pAE e inserido em E. coli TOP 10 competente por eletroporação. Dos clones identificados extraiu-se o plasmídio, o qual foi digerido com as enzimas de restrição para comprovar a presença do inserto. Após seleção dos clones recombinantes contendo o gene ligado ao vetor, este foi purificado e inserido por choque térmico na cepa de expressão E. coli Star cultivado e induzido para expressar a proteína gp19. Esta expressão foi verificada por gel de SDS-Page 12% e confirmada por Dot-Blot.
Palavras-chave: Ehrlichia canis; Expressão de proteína; Rhipicephalus
ABSTRAT
BRUM, Fernanda Antunes. Cloning and Expression of the gp19 protein of Ehrlichia canis . 2010. 54 f. Dissertation (Master Degree) – Programa de Pós-Graduação em Parasitologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
The Ehrlichia canis is a canine monocytic ehrlichiosis responsible for (EMC). The incubation period of EMC is 8 to 20 days, the disease has three phases: acute, subclinical and chronic. The species E. canis is transmitted to the dog and the man by the tick Rhipicephalus sanguineus. It is diagnosed by blood smear, serological or polymerase chain reaction (PCR), with the immunofluorescence method used. Recently E. canis was described as being capable of causing severe disease in humans, with death cases, mainly children and elderly. The gp 19 protein is an important immunodominant antigen, it induces rapid immune response in dogs. The similarity between the geographically distinct samples suggests that the gp19 protein can be used for testing the diagnostic immunoassays, as well as vaccination programs, because this protein is specific for E. canis and thus not have cross reactions with other genera of Ehrlichia.Este study aimed to clone and express the glycoprotein 19 of Ehrlichia canis in Escherichia coli for use as immunobiological, rapid and accurate detection of this disease. The gp 19 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers containing sites for restriction enzymes. The PCR product after digestion, was purified and cloned into a vector and inserted into E. pAE coli TOP 10 competent by electroporation. Of the identified clones was extracted plasmid, which was digested with restriction enzymes to confirm the presence of the insert. After selection of recombinant clones containing the gene linked to the vector, this was purified by heat shock and inserted in expression strain E. coli Star, cultured and induced to express the protein gp19.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Orelha de um cão com varias fases de Riphicephalus sanguineus ...6
Figura 2: Mórula de Ehrlichia canis ...10
Figura 3: Inserção do gene gp19 no vetor pAE...23
Figura 4: Gene gp19...23
Figura 5: Amplificação do gene gp19, por PCR...26
Figura 6: Digestão do vetor pAE... 27
Figura 7: Extração do plasmidio recombinante...28
Figura 8: Digestão do pAE+gp19...29
Figura 9: Gel SDS-Page 12%,...30
Figura 10: Gel SDS-Page 12%, purificação da proteína...31
ABREVIAÇÕES µL – Microlitro
Amp.- Ampicilina
BSA – Albumina de soro bovino cm – Centímetros DO – Densidade Óptica DAB - Diaminobenzidina h - Hora kb - Quilobase mg - Miligrama min - Minuto mL – Mililitro mM - Milimolar ηg - Nanogramas
PBS - Phosphote buffer saline (Tampão fosfato-salino)
PBS-T – Phosohote buffer saline com Tween-20 (Tampão fosfato-salino com Tween-20)
rpm – Rotação por minuto V - Volts
SUMÁRIO 1. Introdução Geral...1 2. Revisão:...3 2.1. Introdução...3 2.2. Etiologia do Agente...3 2.2.1. Gênero Ehrlichia...5 2.3. Vetor...5 2.4. Patogenia...8 2.5. Diagnóstico...11 2.5.1. Diagnóstico Clinico... 11 2.5.2. Diagnóstico Laboratorial...11
2.5.3. Isolamento do Agente em Cultura de Célula...12
2.5.4. Exames Microscópios do Agente Etiológico...12
2.5.5. Diagnóstico Sorológico...13
2.5.6. Diagnóstico Molecular...15
2.6. Proteínas de Ehrlichia canis...16
2.7. Tratamento...18
2.7.1. Evolução Pós-Tratamento...18
2.8. Profilaxia...19
3. Materiais e Métodos...21
3.1. Reação da Cadeia da Polimerase (PCR)...21
3.1.1. Eletroforese de DNA em gel de agarose...21
3.1.2. Purificação das reações da PCR...22
3.2. Digestão e ligação do inserto ao vetor...22
3.3. Preparo de Células Competentes...23
3.4. Analise do DNA plasmidial recombinante...24
3.5. Expressão da Proteína gp19...24
3.5.1. Precipitação com Sulfato de Amônia...25
3.6. Dot-Blot...25
4. Resultados...26
5. Conclusão...33
6. Perspectiva Futuras...34
Objetivo Geral
Este estudo teve como objetivo clonar e expressar a proteína gp19 de
Ehrlichia canis para ser utilizada como imunobiologico.
Objetivos Específicos
1- Clonar o gene gp19 de E. canis em Escherichia coli;
2-Expressar a proteína gp 19 de E. canis em Escherichia coli cepa Star 3- Utilizar a proteína em “Dot Blot”;
