APLICAÇÃO DE UM ELETRODO DE DIAMANTE DOPADO COM BORO NA DETERMINAÇÃO ELETROANALÍTICA
DE VITAMINA B12
Relatório apresentado ao Departamento de Química
da Universidade Federal de Santa Catarina,
como requisito parcial da disciplina de
Estágio II (QMC 5512)
Orientador: Almir Spinelli
Florianópolis
Julho/2019
Dentre todos aqueles que, de alguma forma, participaram positivamente da minha jornada, agradeço especialmente:
- A minha família, por todo o apoio e incentivo durante todos esses anos;
- Ao professor Almir Spinelli, pela confiança depositada e por todo apoio durante a realização deste trabalho;
- Ao doutorando Edson Roberto Santana, pela amizade e pelas contribuições para a realização deste trabalho;
- Aos colegas e amigos do laboratório 310 – GEPEEA - do qual faço parte;
- A todos os professores do Departamento de Química da UFSC que contribuíram para a minha formação acadêmica;
- A todos os amigos que fiz durante o curso;
- À Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina (FAPESC) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro e por possibilitar a realização deste trabalho;
- Ao Departamento de Química da UFSC por todo o suporte na realização deste trabalho.
1 INTRODUÇÃO... 10
2 REVISÃO DA LITERATURA... 11
2.1 Vitamina B12... 11
2.1.1 Suplementação de vitamina B12... 12
2.1.2 Determinação de vitamina B12... 13
2.2 Eletrodo de diamante dopado com boro... 15
3 OBJETIVOS... 18
3.1 Objetivo geral... 18
3.2 Objetivos específicos... 18
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 19
4.1 Reagentes e soluções... 19
4.2 Tratamento eletroquímico da superfície do BDDE... 19
4.3 Instrumentação... 20
4.3.1 Medidas eletroquímicas... 20
4.3.2 Medidas de espectrometria UV-vis... 20
4.4 Preparação das amostras... 21
4.5 Desenvolvimento do método analítico... 21
4.6 Segurança no laboratório e tratamento/destino dos resíduos gerados... 22
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 23
5.1 Caracterização eletroquímica da superfície do BDDE... 23
5.2 Comportamento eletroquímico da VB12sobre o eletrodo de diamante dopado com boro... 25
5.3 Estudo do pH e natureza do eletrólito de suporte... 26
5.4 Seleção da técnica eletroanalítica... 28
5.5 Otimização dos parâmetros da voltametria de onda quadrada... 29
5.5.1 Frequência... 29
5.6 Curva de calibração... 31
5.7 Método comparativo... 34
5.8 Determinação de VB12em produtos de suplementação... 34
5.8.1 Amostra de pasta de dente... 35
5.8.2 Amostra de suplemento em comprimidos... 36
6 CONCLUSÃO... 39
FIGURA 1. Estrutura química da cobalamina, sendo R = OH−, CN−, H2O ou
CH3−...11 FIGURA 2. Voltamogramas cíclicos na ausência (linha pontilhada) e na presença
(linha contínua) de 0,1 mmol L−1 de VB12 em solução tampão B-R (pH 2,0) com
velocidade de varredura de 100 mV
s−1...14 FIGURA 3. (A) Voltamogramas cíclicos para K3[Fe(CN)6] 3−/4− 0,5 mmol L−1 em
solução KCl 0,1 mol L−1 sobre o BDDE: (a) sem tratamento da superfície, (b)
tratamento anódico aplicando E = +1,0 V por 180 s, (c) tratamento catódico aplicando E = −1,0 V por 180 s em H2SO40,5 mol L−1. υ = 100,0 mV s−1. (B) Gráficos
de Nyquist obtidos a circuito aberto: Rsé a resistência da solução, Rcté a resistência
à transferência de carga, Cdl é a capacitância da dupla camada elétrica e Zw é a
impedância de
Warbug...23
FIGURA 4. Voltamogramas cíclicos para VB12 em solução tampão B-R 0,3 mol L−1
(pH 5,0) sobre o BDDE: (a) branco, (b) VB12 0,1 mmol L−1, = 50,0 mV
s−1...25 FIGURA 5. Voltamogramas cíclicos para VB120,1 mmol L1 sobre BDDE em solução
tampão B-R 0,3 mol L1 em diferentes valores de pH (A) pH 2,0 a 7,0 e (B) pH 8,0 a
12,0; , = 50,0 mV s−1. (C) Variação de ipnos diferentes valores de pH (n = 3) e (D)
variação de Epo em função do pH (n =
3)...27
FIGURA 6. Resultados de correntes para as diferentes soluções tampão testadas
como eletrólito de suporte nos pH 9, 10 e
11...28
FIGURA 7. (A) Voltamogramas de VB12 3,0 mol L1 sobre BDD em solução tampão
B-R 0,3 mol L1 (pH 10,0) em diferentes técnicas eletroanalíticas e velocidades de
variação de potencial: (A) = 50,0 mV s1e (B) = 100,0 mV s1, sendo (a) SWV, (b)
DPV e (c)
LSV...29
FIGURA 8. (A) Voltamogramas de SWV para VB12 3,0 mol L−1 em solução tampão
B-R 0,3 mol L1 (pH 10,0) sobre o BDDE em diferentes valores de frequência de
aplicação do potencial: (a) 20; (b) 10; (c) 30; (d) 40; (e) 50; (f) 60; (g) 70; (h) 80; (i) 90 e (j) 100 Hz mantendo fixo a = 50 mV e ΔEs = 5,0 mV. (n = 3)...30
FIGURA 9. (A) Voltamogramas de onda quadrada para VB12 3,0 μmol L−1 em
solução tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 10,0) sobre o BDDE em diferentes valores de
FIGURA 10. Voltamogramas de onda quadrada para VB12 3,0 μmol L−1 em solução
tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 10,0) sobre o BDDE em diferentes valores de
incremento de potencial: (a) 8,0; (b) 7,0; (c) 6,0; (d) 5,0; (e) 4,0; (f) 3,0; (g) 2,0 e (h)
1,0 mV, mantendo fixo f = 20 Hz e a = 70 mV. (n =
3)...31
FIGURA 11. (A) Voltamogramas de onda quadrada em solução tampão B-R 0,3 mol
L−1 (pH 10,0) sobre o BDDE em diferentes concentrações de VB12: (a) branco; (b)
0,25; (c) 0,50; (d) 0,75; (e) 1,0; (f) 1,5; (g) 2,0; (h) 2,5; (i) 3,0; (j) 3,5; (k) 4,0; (l) 4,5 e (m) 5,0 μmol L−1. (B) Curva de calibração (n = 3). a = 70 mV, f = 20 Hz e ΔEs = 2,0
mV...32
FIGURA 12. (A) Espectros UV-vis para solução padrão de VB12: (a) branco em água;
(b) 0,83; (c) 1,64; (d) 3,22; (e) 4,76; (f) 6,25; (g) 7,69; (h) 9,09; (i) 10,5; (j) 11,8; (k)
13,0; (l) 14,3 µmol L−1. (B) Curva de calibração (n =
3)...34
FIGURA 13. (A) Voltamogramas de onda quadrada para (a) branco, (b) 1,5 mL de
amostra de pasta de dente, e (c-f) adições sucessivas de 100,0 µL de solução padrão de VB12 0,1 mmol L−1 em solução tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 10,0)
empregando o BDDE. (B) Curva de adição de padrão de VB12 (a) e curva de
calibração de VB12
(b)...35
FIGURA 14. (A) Espectros UV-vis para (a) branco, (b) 1,0 mL de amostra de pasta
de dente, (c-g) adições sucessivas de 50,0 µL de solução padrão de VB12 0,1 mmol
L−1 em água. (B) Curva de adição de padrão de VB12 (a) e curva de calibração de
VB12
(b)...36
FIGURA 15. (A) Voltamogramas de onda quadrada para (a) branco, (b) 100,0 µL de
amostra de suplemento, e (c-f) adições sucessivas de 100,0 µL de solução padrão de VB12 0,1 mmol L−1 em solução tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 10,0) empregando o
BDDE. (B) Curva de adição de padrão de VB12 (a) e curva de calibração de VB12
(b)...36
FIGURA 16. (A) Espectros UV-vis para (a) branco, (b) 50,0 µL de amostra de
suplemento, (c-g) adições sucessivas de 50,0 µL de solução padrão de VB12 0,1
mmol L−1 em água. (B) Curva de adição de padrão de VB12(a) e curva de calibração
de VB12
TABELA 1 Valores de corrente de pico e de potencial de pico para as três condições
da Figura 3...24
TABELA 2 Parâmetros obtidos pelos picos da Figura
4...26
TABELA 3 Comparação de dados de performance para a determinação de VB12
para este trabalho e literatura
anterior...………...33
TABELA 4 Determinação de VB12 em diferentes amostras pelo método voltamétrico
ΔEp– potencial de pico;
ΔEs – incremento de potencial (do inglês, step potential sweep);
AAS – espectrometria de absorção atômica (do inglês, atomic absorption
spectrometry);
a – amplitude de pulso;
BDD – diamante dopado com boro (do inglês, boron doped diamond);
BDDE – eletrodo de diamante dopado com boro (do inglês, boron doped diamond
electrode);
B-R – Britton-Robinson;
Bzm – dimetilbenzimidazol (do inglês, dimethylbenzimidazole);
Cdl– capacitância da dupla camada elétrica (do inglês, double layer capacitance);
CE – eletroforese capilar (do inglês, capillary electrophoresis); CV – voltametria cíclica (do inglês, cyclic voltammetry);
CVD – deposição química de vapor (do inglês, chemical vapor deposition); DPV – voltametria de pulso diferencial (do inglês, differential pulse voltammetry); EIS – espectroscopia de impedância eletroquímica (do inglês, electrochemical
impedance spectroscopy);
Ep– potencial de pico;
Epc –potencial de pico catódico;
f – frequência de aplicação dos pulsos;
HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês, high performance liquid
cromatography);
ip– corrente de pico;
LOD – limite de detecção (do inglês, limit of detection);
LOQ – limite de quantificação (do inglês, limit of quantification);
LSV – voltametria de varredura linear (do inglês, linear sweep voltammetry); MS – espectrometria de massa (do inglês, mass spectrometry);
Rct– resistência à transferência de carga (do inglês, resistance to charge transfer);
Rs– resistência ôhmica (do inglês, ohmic resistance);
SWV – voltametria de onda quadrada, (do inglês, square wave voltammetry); VB12– Vitamina B12;
A deficiência de vitamina B12 (VB12) no organismo está associada a várias doenças
relacionadas a distúrbios neurológicos e hematológicos. A fim de evitar estas disfunções em pessoas com dietas restritas ou com problemas de má absorção, existem diversos tipos de suplementos de VB12 disponíveis comercialmente. Assim,
torna-se relevante o desenvolvimento de um novo método analítico de alta sensibilidade, custo benefício baixo, rápido e simples para detecção de VB12. Um
eletrodo de diamante dopado com boro (BDDE) foi submetido a um pré-tratamento de 30 min (catódico) e 30 min (anódico) em H2SO4 0,5 mol L−1 obtendo resultados
promissores justificados por estudos de voltametria cíclica e espectroscopia de impedância eletroquímica. Sobre o BDDE, os voltamogramas cíclicos da VB12
apresentaram sinal redox em torno de −0,8 V referente ao par redox Co(I/II) e em aproximadamente 0,1 V relativo ao par redox Co(II/III). Para uma determinação eletroquímica sensível de VB12 os parâmetros experimentais (pH, eletrólito de
suporte, técnica eletroanalítica) foram otimizados para o monitoramento do par redox Co (I/II). Os experimentos eletroquímicos foram realizados usando o potenciostato portátil PalmSens3. A curva de calibração para VB12 foi obtida por voltametria de
onda quadrada e uma faixa linear foi encontrada de 0,25 a 5,0 μmol L−1 com limite
de detecção de 0,1 μmol L−1. O BDDE foi empregado para a determinação de VB12
em produtos de suplementação vitamínica como: creme dental, e comprimidos de suplemento. Os resultados obtidos foram comparados àqueles fornecidos por espectrometria UV-Vis. Testes estatísticos foram aplicados concluindo que não houve diferenças significativas entre a exatidão e a precisão de ambos os métodos.
Palavras-chave: eletrodo de diamante dopado com boro, vitamina B12,
1 INTRODUÇÃO
Encontrada principalmente em alimentos de origem animal, a vitamina B12
(VB12) exerce importantes funções no organismo humano. Sua deficiência está
relacionada a uma série de doenças, tais como: anemia perniciosa, degeneração nervosa e doenças cardiovasculares.1
Quando a alimentação não garante uma quantidade saudável de VB12 ao
organismo, seja por problemas na absorção, ou pela adesão a dietas veganas e vegetarianas, torna-se importante recorrer a suplementos de VB12. Estes produtos
estão disponíveis comercialmente nas mais diferentes formas e teores do princípio ativo. Sendo assim, mostra-se necessário o desenvolvimento de metodologias para o controle de qualidade dos diversos tipos de suplementação de VB12.
Neste sentido, as técnicas eletroanalíticas oferecem uma série de características como sua simplicidade, rapidez operacional, alta sensibilidade, baixo custo e, nos últimos anos, a miniaturização e portabilidade dos equipamentos são fatores que aumentam ainda mais o interesse nesta área de pesquisa.
O eletrodo utilizado nas medidas eletroanalíticas tem grande influência na eficiência da técnica. O eletrodo de diamante dopado com boro tem as vantagens de possuir alta estabilidade, ampla janela de potencial e baixas correntes de fundo. Além disso, sua aplicação é ampla e cada vez mais são estudados analitos das mais diferentes linhas de pesquisa. Produtos como hipertensivos, vitaminas, antibióticos e analgésicos já foram efetivamente empregados em determinações eletroanalíticas pelo eletrodo de diamante dopado com boro. Compostos orgânicos como neurotransmissores, aditivos alimentícios e pesticidas também foram amplamente estudados sobre esse eletrodo.
Dessa forma, este trabalho tem como objetivo desenvolvel uma metodologia eletroanalítica através do estudo de um eletrodo de diamante dopado com boro para a detecção e quantificação de vitamina B12 em amostras de produtos de
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Vitamina B12
O termo vitamina B12 (VB12) é utilizado para denominar uma série de
compostos que possuem o grupo cobalamina, como exibido na Figura 1.2
Figura 1. Estrutura química da cobalamina, sendo R = OH−, CN−, H2O ou CH3−.
Fonte: Lovander et al.2, 2018. Reproduzida com permissão de J. Electrochem. Soc., 165, G18-G49
(2018). Copyright 2019, The Electrochemical Society.
Sua estrutura contém um anel corrínico planar coordenado a um centro metálico de cobalto(III) octaédrico, uma cadeia de nucleotídeo terminado ao grupo 5,6-dimetilbenzamidazol (do inglês, dimethylbenzimidazole - Bzm) ligado a um átomo de carbono do anel corrínico e um radical R como ligante axial. Dependendo do ligante axial coordenado ao cobalto central, diferentes nomes são dados a VB12; o
grupo cianeto dá o nome de cianocobalamina; o metil, de metilcobalamina; íon hidroxila, de hidroxocobalamina e água, de aquocobalamina.2 Quando o grupo Bzm
está ligado ao cobalto na cobalamina, dá-se a forma o nome de base-on, e quando não está ligado, o nome de base-off.3,4
O átomo de cobalto pode existir em três diferentes estados de oxidação na VB12, cada um com uma geometria específica; octaédrica para o Co(III), pirâmide de
base quadrada para o Co(II) e quadrada planar para o Co(I). A redução do Co(III) a Co(II) e Co(I) é acompanhada pela perda dos ligantes axiais.3
No corpo humano, a VB12 age no funcionamento do sistema nervoso,
formação de glóbulos vermelhos do sangue, metabolismo de células e ácidos graxos e atividade coenzimática na síntese de DNA.2,5 Sua deficiência está associada a
diversos problemas relacionados a desordens hematológicas e neurológicas. Os sintomas incluem fadiga, fraqueza, boca seca, depressão, perda de apetite, perda de peso, demência, dificuldade de manter o equilíbrio e perda de memória.2
Entretanto, o excesso de VB12 pode também causar doença hepática,
neurotoxicidade, insuficiência renal ou distúrbios mieloproliferativos.6,7
A VB12 não só não pode ser sintetizada, mas também não pode ser
armazenada no corpo humano, devido à sua natureza hidrossolúvel. Assim, deve ser ingerida diariamente, sendo a dose diária recomendada de 2,4 µg. Ela é sintetizada apenas por certas bactérias, mas por nenhuma planta, permanecendo acumulada nos tecidos animais por meio de interações microbianas na cadeia alimentar natural. Assim, as fontes primárias de VB12são principalmente de produtos de origem animal,
como peixe, carne, fígado, ostras, moluscos, ovos e leite. 8,9,10Apesar de uma dieta
balanceada normalmente conter níveis adequados de VB12, a suplementação é
necessária para indivíduos com problemas de saúde envolvendo má absorção no organismo, ou por dietas restritivas.6
Em relação a restrição na alimentação, pessoas adeptas a dieta vegana, na qual não estão inclusos os alimentos de fonte animal, correm maior risco de desenvolver alguma deficiência de VB12. Na dieta vegetariana, ao contrário da
vegana, fazem parte alguns alimentos de fonte animal, por exemplo, leite, iogurte, queijo e ovos; mesmo assim, são fontes limitadas de VB12. Embora existam opções
como cereais e produtos de soja fortificados com VB12, estudos mostraram que os
vegetarianos apresentaram ingestão abaixo do recomendado.12 2.1.1 Suplementos de vitamina B12
A fim de se evitar deficiência de VB12 em pessoas com dietas restritas, tais
como veganos e vegetarianos e pessoas com problemas de absorção, estão disponíveis no mercado diversos produtos de suplementação. Estudos demostraram que o uso de produtos de suplementação mostraram-se eficientes na restauração da concentração de VB12 na corrente sanguínea. Nos Estados Unidos, associações e
agências governamentais recomendam fortemente que no caso de uma dieta vegetariana e vegana é necessária a adesão a suplementação de VB12.13
A cianocobalamina é a forma mais utilizada em produtos de suplementação vitamínica devido à sua alta estabilidade, baixo custo-benefício e segurança.13 Com
dosagem bastante variada, são encontrados suplementos que contenham de 10 µg a 5000 µg nas mais diferentes matrizes, tais como: cápsulas, comprimidos, sprays, cremes dentais entre outras.14 Um estudo recente relatou que o uso de creme dental
fortificado com VB12 poderia ser usado para aumentar o teor de VB12 em pessoas
idosas ou para evitar a depleção de vitaminas.15 A dosagem de muitos suplementos
pode parecer excessiva, mas deve se considerar que nem toda VB12 é realmente
absorvida pelo organismo. Levando em consideração a insuficiência de dados publicados em torno da toxicidade de VB12, atualmente, não há definido um nível
máximo de ingestão de VB12 tolerável em alimentos ou suplementos. Em
contrapartida, suspeita-se que o consumo de longa duração de mega-doses podem vir a causar danos ao fígado e rins caracterizando um quadro de hipervitaminose de VB12.14,16
2.1.2 Determinação de vitamina B12
Muitas doenças são associadas à insuficiência de vitaminas e, consequentemente, existe um crescente interesse no desenvolvimento de metodologias capazes de quantificá-las nos mais diversos tipos de amostras.17
A determinação de VB12 em amostras alimentícias encontra dificuldades pela
sua baixa concentração (3-20 ng g−1) comparado a outras vitaminas pela
contaminação por bactérias produtoras de VB12 dando falsos resultados e pelas
interações entre VB12e proteínas, diminuindo a disponibilidade da vitamina.11
As técnicas mais utilizadas para a detecção de VB12 incluem testes
microbiológicos com Lactobacillus leichmannii, radioscopia, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), quimioluminescência, testes fluorimétricos, eletroforese capilar (CE), espectrometria de massa (MS) e espectrometria de absorção atômica (AAS).11
As técnicas mencionadas têm se mostrado eficazes, porém, encontram uma série de limitações, tais quais a lentidão, a ausência de especificidade e o alto custo,
além de algumas dessas técnicas não serem capazes de distinguir o cobalto livre do cobalto ligado a VB12.18
Dentre as diversas técnicas, as técnicas eletroquímicas têm chamado atenção por serem de fácil operação, alta sensibilidade e baixo custo.19 Diversos trabalhos
foram realizados para o estudo e determinação de VB12. Diferentes eletrodos, como
o eletrodo de carbono vítreo20, eletrodo de carbono impresso21, eletrodo de ouro22,
eletrodo de grafite23, entre outros, foram usados para a quantificação e determinação
de VB12.
Stanković et al.24 (2016) estudaram o comportamento eletroquímico da VB12
usando um eletrodo de diamante dopado com boro (do inglês, boron doped diamond
electrode - BDDE). O voltamograma cíclico (Figura 2) da VB12 apresenta dois picos
de oxidação em aproximadamente +1,0 e +1,2 V (vs. Ag/AgCl) e um pico de redução em aproximadamente −0,8 V referente a redução do Co(III). Para a quantificação da VB12 em amostras de urina, os autores monitoraram o pico de +1,2 V utilizando a
voltametria de onda quadrada. A curva de calibração mostrou-se linear de 2,0 a 11,0 e de 11,0 a 35,0 μmol L−1, com limite de detecção de 0,7 μmol L−1.
Figura 2. Voltamogramas cíclicos na ausência (linha pontilhada) e na presença (linha contínua) de
VB120,1 mmol L−1em solução tampão B-R (pH 2,0) com velocidade de varredura de 100 mV s−1.
Fonte: Stanković et al.24, 2016. Reproduzida com permissão de J. Electrochem. Soc., 163, B348-B351
(2016). Copyright 2019, The Electrochemical Society.
Recentemente, Parvin et al.19 (2018) publicaram um estudo acerca do
ferrimagnéticas incorporadas a dendrímeros de triazina por eletropolimerização de pirrol (Au/PPy/FMNPs@TD). A curva de calibração foi obtida, monitorando a reação redox Co(II/III), em solução tampão B-R (pH 7,0) como eletrólito de suporte e, como técnica eletroanalítica foi utilizada a voltametria de pulso diferencial. Como resultado, os autores obtiveram faixa linear de 2,50 a 500 nmol L−1 com limite de detecção de
0,91 nmol L−1, sendo possível aplicar o sensor na determinação de VB12em matrizes
alimentícias.
Em nosso grupo de pesquisa, Kreft et al.3 (2012) aplicaram a voltametria
cíclica de onda quadrada para monitorar o comportamento eletroquímico da VB12
sobre um eletrodo de filme de bismuto. A reação estudada foi do par redox Co(I/II), com potencial de pico em −0,84 V vs. Ag/AgCl em KCl(sat) por voltametria de onda
quadrada. A curva de calibração foi obtida em solução tampão B-R (pH 12,0) com faixa linear de 0,100 a 1,000 µmol L−1e limite de detecção de 33,1 nmol L−1.
Singh et al.23 (2018) quantificaram VB12 com um eletrodo de grafite modificado
com nanotubos de carbono de paredes múltiplas funcionalizados com azul de metileno adsorvido em óxido de grafeno reduzido. Com o uso da voltametria de pulso diferencial, os autores obtiveram uma curva de calibração de 28,5 µmol L−1a
1,95 mmol L−1 e limite de detecção de 75,9 µmol L−1, monitorando o sinal de redução
do Co(III) em −0,9 V (vs. Ag/AgCl). Foi possível determinar VB12 em amostras de
soro e urina.
2.2 Eletrodo de diamante dopado com boro
O diamante há muito tempo deixou de ser somente uma pedra preciosa graças às suas características físicas e químicas. Dentre essas características estão: a extrema resistência a corrosão química, grande faixa de transparência de comprimento de onda (região de raios X, de infravermelho a ultravioleta) e alta condutividade térmica (2600 W m−1 K−1), além de ser o material conhecido com
maior dureza (aproximadamente 90 GPa).25
O diamante é um isolante elétrico capaz de suportar grandes campos elétricos, podendo se tornar eletricamente atrativo quando se introduz um dopante aceptor de elétrons em sua estrutura. O boro possui um elétron a menos que o carbono e, por ter um raio atômico menor, sua dopagem no diamante é relativamente fácil. Por ser
um aceptor de elétrons, o material se torna dopado com buracos, criando um semicondutor do tipo p.26
Eletrodos de diamante são bastante úteis para determinações eletroanalíticas, principalmente quando dopados com boro. As vantagens desse eletrodo são alta estabilidade, superfície inerte, baixa corrente capacitiva e ampla janela de potencial.26,27
Os diamantes utilizados na eletroquímica são sintetizados. Os métodos mais utilizados são alta temperatura e alta pressão (do inglês, pressure
high-temperature - HPHT) e deposição química de vapor (do inglês, chemical vapor deposition - CVD). Para o crescimento de diamante dopado com boro (do inglês, boron doped diamond - BDD), o método mais favorável é a CVD. Esse método
deposita o BDD com um plasma de uma mistura de gases contendo carbono (como o metano), hidrogênio e diborano. Isso acontece sobre um substrato adequado e o crescimento é iniciado a partir de nanopartículas de diamante.26,27
A resposta eletroquímica dos eletrodos de diamante é influenciada por uma série de fatores, como o tipo e a concentração do dopante, características morfológicas, defeitos no filme, orientação cristalográfica, presença de uma fase amorfa impura de carbono (carbono sp2) e as terminações da superfície.28,29
As terminações da superfície do eletrodo de diamante dopado com boro (do inglês, boron doped diamond electrode - BDDE) afetam as propriedades elétricas do eletrodo. Essas terminações podem ser geradas e alteradas por métodos eletroquímicos; redução da água para terminações de hidrogênio ou oxidação da água para terminações de oxigênio. A taxa da transferência de carga elétrica pode ser afetada pela terminação da superfície.26
Segundo Suffredini et al.27, as respostas eletroquímicas do BDDE são
fortemente afetadas pelo pré-tratamento aplicado à superfície antes das medições; o tratamento anódico é capaz de transformar uma resposta eletroquímica de um composto sabidamente reversível à comportamento aparentemente irreversível. Porém, o pré-tratamento catódico anterior às medições leva a uma melhora na atividade eletroquímica sem alterar o comportamento do analito eletroativo. Mesmo um tratamento catódico brando (−3,0 a −5,0 V) em meio ácido é capaz de resultar numa superfície terminada em hidrogênio suficiente para exibir um efeito significativo na cinética da transferência eletrônica de um par redox, quando comparado a uma superfície terminada em oxigênio.
O pré-tratamento catódico, como reportado por Salazar-Banda et al.26, afeta a
reversibilidade da reação redox [Fe(CN)6]3−/4−em função do tempo, ou seja, um
aumento da separação dos potenciais dos picos de redução e oxidação. Isso acontece em consequência da oxidação das terminações de hidrogênio para terminações de oxigênio. Esse processo pode ser acelerado com a aplicação de um potencial eletroquímico oxidativo.
As propriedades químicas e físicas do material são afetadas por esse tratamento, já que a superfície com terminações de hidrogênio é hidrofóbica com uma afinidade eletrônica negativa e alta condutividade e a superfície com terminações de oxigênio é hidrofílica com afinidade eletrônica positiva e baixa condutividade. Para processos de transferência de elétrons de esfera interna, a mudança na superfície pode afetar a cinética da transferência eletrônica de forma significativa.25,30
As aplicações eletroanalíticas do BDDE são amplas e têm sido estudadas por diversas linhas de pesquisa. Em determinações farmacêuticas, já foram efetivamente empregados na eletroanálise da maioria das classes comercialmente relevantes, como anti-hipertensivos (captopril, hidroclorotiazida e etc.), analgésicos (codeína, diclofenaco e etc.), antibióticos (ciprofloxacina, oxacilina e etc.), anti-inflamatórios (ibuprofeno, diclofenaco e etc.), vitaminas (ácido fólico, -tocofenol e
etc.) e antidepressivos (fluoxetina, imipramina e etc.).31
Outras classes de compostos orgânicos também foram amplamente estudadas sobre o BDDE, como neurotransmissores (dopamina, serotonina e etc.), hidrocarbonetos aromáticos e heterociclos (1-naftol, nicotina e etc.), nucleotídeos modificados e constituintes de DNA e RNA (adenina, 8-oxoguanina e etc.), quinonas e compostos fenólicos (bisfenol A, estradiol e etc.), aditivos alimentícios (capsaicina, aspartame e etc.), pesticidas (clomazona, metil paration e etc.) entre outros (glicose, glicerol, oxitocina, ricina, colesterol e etc.).32
Dessa forma, o BDEE tem provado sua utilidade frente a aplicações analíticas. Seguindo essa tendência, esse trabalho foi realizado com o propósito de fazer a determinação de um analito de grande relevância para determinações vitamínicas, a VB12.
3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral
Desenvolver uma metodologia eletroanalítica através da aplicação de um eletrodo de diamante dopado com boro para detecção e quantificação de vitamina B12em amostras de produtos de suplementação.
3.2 Objetivos específicos
a) Avaliar a aplicação dos tratamentos catódico e anódico na superfície do BDDE; b) Caracterizar a superfície do BDDE por voltametria cíclica e espectroscopia de
impedância eletroquímica;
c) Avaliar o comportamento eletroquímico da VB12sobre o BDDE;
d) Otimizar as condições experimentais (pH, eletrólito suporte, técnica eletroanalítica);
e) Construir a curva de calibração nas condições otimizadas;
f) Determinar parâmetros analíticos como faixa linear, limites de detecção e quantificação;
g) Quantificar a VB12em produtos de suplementação;
h) Avaliar a precisão dos resultados fornecidos pelo BDDE através de ensaios de repetibilidade interdia e intradia;
i) Avaliar a exatidão do método eletroanalítico pela comparação dos resultados com os obtidos pelo método espectrométrico.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Reagentes e soluções
Todos os reagentes e soluções empregados neste estudo são de grau analítico e adquiridos comercialmente. As soluções aquosas foram preparadas em água ultrapura com resistividade de 18,2 MΩ cm, purificada com o sistema Milli-Q (Milipore, EUA). Soluções estoque de VB12 (cianocobalamina )(Sigma-Aldrich/Merck,
Alemanha) 0,1 mmol L−1 foram preparadas solubilizando em água ultrapura e
estocadas sob refrigeração a 5 °C. Para obtenção de concentrações menores, as devidas diluições foram feitas.
Para o estudo de pH, foi utilizada a solução tampão Britton Robinson (B-R) 0,3 mol L−1de pH 2,0 a 12,0, sendo ajustado com soluções de HCl ou NaOH 6,0 mol L−1.
Para os estudos de eletrólito suporte, foram usadas quatro soluções: Britton-Robinson (B-R) (H3BO3/CH3COOH/H3PO4), H3BO3·KCl/NaOH, Ringer
(Na2HPO4/NaOH) e NaOH nos valores de pH de 9,0; 10,0 e 11,0. Essas soluções
foram estocadas sob refrigeração a 5 °C por até 90 dias.33
As soluções estoque de K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 5,0 mmol L−1 e KCl 0,1 mol
L−1(Sigma-Aldrich/Merck, Alemanha) foram preparadas em água ultrapura. 4.2 Tratamento eletroquímico da superfície do BDDE
Para manter a superfície do BDDE com terminações de hidrogênio, o eletrodo foi submetido a um tratamento eletroquímico durante 1 h em H2SO4 0,5 mol L−1no
início de cada semana de trabalho; 30 min de tratamento anódico (+2,0 V) seguidos de um tratamento catódico (−2,0 V) de 30 min. No início de cada dia de trabalho, o eletrodo foi lavado com água ultrapura e sua superfície submetida a um tratamento brando durante 6 min; 3 min de tratamento anódico (+2,0 V) seguidos de um tratamento catódico (−2,0 V) de 3 min.26
4.3 Instrumentação
4.3.1 Medidas eletroquímicas
As medidas voltamétricas foram realizadas em um potenciostato/galvanostato portátil Palmsens3 (Palm Instruments BV, Holanda) acoplado a um computador com o software PSTrace (versão 5.4) para aquisição e tratamento dos dados. Para a realização das análises, uma célula eletroquímica de 10,0 mL contendo os três eletrodos foi empregada: eletrodo de diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho (nível de dopagem 8000 ppm, área exposta de 0,28 cm²) (Adamant Technologies, Suíça), eletrodo de Ag/AgCl (KCl 3,0 mol L−1) como eletrodo de
referência e um fio de platina como eletrodo auxiliar.
A caracterização da superfície do BDEE, na ausência e após a aplicação do tratamento eletroquímico, foi efetuada por espectroscopia de impedância eletroquímica (do inglês, electrochemical impedance spectroscopy – EIS), realizada no mesmo equipamento. Os espectros de EIS foram obtidos em eletrólito de suporte KCl 0,1 mol L−1 contendo K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 5,0 mmol L−1 em circuito aberto,
amplitude de 5,0 mV e a faixa de frequência de 0,1 a 50 000 Hz.
4.3.2 Medidas de espectrometria UV-vis
A técnica de espectrometria UV-vis foi usada como método comparativo sendo realizada na faixa de comprimento de onda de 200 a 600 nm, num espectrofotômetro ultravioleta-visível UV-1800 (Shimadzu, Japão) conectado a um
software UVProbe (versão 2.50) para aquisição e processamento de dados. Uma
célula de quartzo com um comprimento de caminho óptico de 1,0 cm foi utilizada para realizar as medidas. A absorbância máxima das amostras e soluções contendo diferentes concentrações de VB12 foi monitorada no comprimento de onda de 361
4.4 Preparação das amostras
Foram usadas duas amostras neste trabalho: comprimidos de suplementação de VB12 (Sundown Naturals, EUA) e pasta de dente fortificada com VB12 (Sante,
Alemanha), ambas adquiridas comercialmente.
Para a amostragem dos comprimidos, foram tomados cinco comprimidos. Os comprimidos foram macerados, pesados e uma fração foi diluída em água ultrapura, filtrada por gravidade com papel filtro de 25 µm e avolumada para 25,0 mL.
Para a amostra de pasta de dente, a VB12 foi extraída em etanol por banho
ultrassônico por 1 h. Posteriormente, o material foi filtrado por gravidade em papel filtro de 25 µm e a solução avolumada para 25,0 mL com etanol.34
4.5 Desenvolvimento do método analítico
A validação de um método analítico é a demonstração de que o mesmo é adequado para o seu propósito. Os parâmetros empregados para este fim foram: linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação.
A linearidade diz respeito à capacidade do método de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração ou massa da espécie química de interesse, resultando numa faixa linear. Os valores de concentração ou massa da espécie devem ter uma relação matemática com o sinal analítico obtido. Essa relação matemática pode ser expressa na forma de uma equação de reta, sendo chamada de curva de calibração. A faixa linear de uma curva é o intervalo de concentração ou massa da espécie medida na qual a relação linear simples, que obedece a equação y = ax + b, é verdadeira.24
A precisão de um método é o grau de concordância mútua entre as medidas individuais, ou seja, é a repetibilidade da medida. Já a exatidão, é a concordância da medida com o valor verdadeiro, isto é, a veracidade da medida. Quanto menos dispersos os dados obtidos, maior é a precisão do método e, quanto menor o erro entre o valor conhecido e o valor medido, maior a exatidão.25
Limite de detecção (do inglês, limit of detection – LOD) é a menor medida que pode ser detectada com uma razoável certeza por meio de um procedimento experimental. É possível calculá-lo utilizando os valores da curva de calibração segundo a equação: LOD = 3s/S, no qual s é o desvio padrão do coeficiente linear e
S é o coeficiente angular. O limite de quantificação (do inglês, limit of quantification – LOQ) é a menor concentração do analito que pode ser medida com uma razoável certeza. Toda curva de calibração deve conter o LOQ. A equação para calculá-lo é: LOQ = 10s/S.26, 38
4.6 Segurança no laboratório e tratamento/destino dos resíduos gerados
Os resíduos gerados em laboratórios de ensino, pesquisa e extensão se diferenciam daqueles gerados pela indústria pelo seu baixo volume, mas grande diversidade de composições, dificultando um tratamento padrão para todos.39
Os resíduos gerados na execução deste projeto são ácidos (ácido sulfúrico, ácido bórico, ácido fosfórico) e vitamina B12. A UFSC utiliza o programa de Gestão e
Gerenciamento de Resíduos, no qual admite a prestação do serviço de manejo de resíduos perigosos para o campus Florianópolis pela empresa Proactiva Meio Ambiente Brasil Ltda. Todos os resíduos são acondicionados em bombonas fornecidas pela UFSC conforme o procedimento recomendado pelo programa de Gestão e Gerenciamento de Resíduos da UFSC.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Caracterização eletroquímica da superfície do BDDE
As técnicas eletroquímicas de voltametria cíclica e espectroscopia de impedância eletroquímica podem ser aplicadas ao par redox K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]
em um eletrodo com o objetivo de avaliar as características eletroquímicas do mesmo. Essas propriedades são fortemente afetadas pela aplicação de tratamentos eletroquímicos antes das análises.40
A Figura 3A apresenta os voltamogramas cíclicos para K3[Fe(CN)6] 0,5 mmol
L−1 em solução KCl 0,1 mol L−1 na ausência e sob diferentes tratamentos para o
BDDE.
Figura 3. (A) Voltamogramas cíclicos para K3[Fe(CN)6] 0,5 mmol L−1 em solução KCl 0,1 mol L−1
sobre o BDDE: (a) sem tratamento da superfície, (b) tratamento anódico aplicando E = +1,0 V por 180 s, (c) tratamento catódico aplicando E = −1,0 V por 180 s em H2SO40,5 mol L−1. υ = 100,0 mV s−1. (B)
Gráficos de Nyquist obtidos em circuito aberto: Rs é a resistência da solução, Rct é a resistência à
transferência de carga, Cdl é a capacitância da dupla camada elétrica e Zw é a impedância de
Warburg.
Os valores de corrente de pico, potencial de pico e separação dos picos obtidos na Figura 3A estão dispostos na Tabela 1. As maiores intensidades de corrente foram alcançadas pela aplicação de um tratamento catódico, cerca de 50% maior do que pela ausência de tratamento.
Tabela 1. Valores de corrente e potencial de pico para as três condições da Figura 3A.
Voltamograma Reação anódica Reação catódica ΔEp(mV)
ip(μA) Ep(mV) ip(μA) Ep(mV)
a +19,120 +302 −19,768 +185 117
b +26,115 +398 −22,151 +129 269
c +30,065 +281 − 30,023 +205 76
A diferença entre o potencial de pico de redução e o potencial de pico de oxidação (ΔEp) fornece uma medida da reversibilidade da reação, idealmente 59,2
mV. Quanto maior o valor deste desvio, maior é a dificuldade de transferência eletrônica na superfície do eletrodo e, consequentemente, menos reversível é a reação.41
O menor valor de ΔEp encontrado foi de 76 mV, referente ao tratamento
catódico aplicado à superfície do eletrodo (Figura 3A – curva c). Em contrapartida, a maior diferença de potencial encontrada para a separação dos picos foi de 269 mV para o tratamento anódico (Figura 3A – curva b). Na ausência de algum tratamento, obteve-se um valor intermediário de 117 mV (Figura 3A – curva a). Esses resultados mostram que uma menor reversibilidade de reação é obtida quando o eletrodo é tratado anodicamente e um aumento da reversibilidade quando tratado catodicamente.41
Outras informações acerca da da influência dos tratamentos eletroquímicos na transferência eletrônica - podem ser obtidos por estudos de EIS (Figura 3B). Nos gráficos de Nyquist (−Z’’ vs. Z’), o diâmetro do semi-círculo equivale a resistência à transferência de carga (do inglês, resistance to charge transfer – Rct) do par redox
sobre a superfície do eletrodo.
Os valores de Rctobtidos usando K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 0,5 mmol L−1, foram
menores para o BDDE quando tratado catodicamente com valor de 219,9 Ω. Concordando com o resultado encontrado para a separação dos picos na voltametria cíclica, o BDDE com tratamento anódico exibiu maior resistência à transferência de carga, com Rct igual 358,7 Ω, seguido do BDDE na ausência de
tratamento, com 329,6 Ω.
O circuito equivalente inserido na Figura 3B é o modelo que descreve a reação eletroquímica que acontece na célula eletroquímica. A resistência ôhmica ou
resistência da solução (Rs) é a resistência não compensada da solução entre o
eletrodo de trabalho e o de referência. A resistência de polarização (Rct) é
resistência à transferência de carga na interface eletrodo/solução. A impedância de Warburg (Zw) é a impedância relacionada às limitações da transferência de massa
devido a processos difusionais adjacentes ao eletrodo. A capacitância da dupla camada elétrica (Cdl) é a capacitância na interface eletrodo/solução formada pela
dupla camada elétrica.42
Para reações de transferência eletrônica de esfera interna, a mudança na química da superfície do eletrodo pode alterar significantemente a cinética da transferência eletrônica.25 O par redox K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] tem comportamento
de esfera interna quando usado em eletrodos de diamante.43
5.2 Comportamento eletroquímico da VB12 sobre o eletrodo de diamante
dopado com boro
O comportamento eletroquímico da VB12 sobre o BDDE foi investigado por
voltametria cíclica. Os voltamogramas cíclicos para VB12 0,1 mmol L−1 em solução
tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 5,0) foram obtidos ao se aplicar uma variação de
potencial de +0,5 a −1,2 V, seguido da varredura reversa de −1,2 a +0,5 V, com = 50,0 mV s1, conforme apresenta a Figura 4.
Figura 4. Voltamogramas cíclicos para VB12 em solução tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 5,0) sobre o
Os valores obtidos pela Figura 4 estão dispostos na Tabela 2.
Tabela 2. Parâmetros obtidos pelos picos da Figura 2.
Picos Ep(mV) ip(μA) Reação ΔEp(mV)
1 −741 +0,222 Co(I) → Co(II) 10 2 −751 −0,173 Co(II) → Co(I) 3 +177 +0,556 Co(II) → Co(III) 299 4 −122 −0,356 Co(III) → Co(II)
O método proposto foi sensível a ambas as reações redox. Os picos 1 e 2 são referentes à reação redox Co(I/II), com ΔEpde 10 mV. Para os picos 3 e 4, a reação
redox é Co(II/III) com ΔEp de 299 mV. Isso demonstra uma maior velocidade de
transferência de elétrons na reação redox Co(I/II). Dessa forma, a janela de potencial escolhida para os estudos posteriores foi de 1,2 a 0,2 V, englobando a reação com maior velocidade de transferência de elétrons.
5.3 Estudo do pH e natureza do eletrólito de suporte
A influência da natureza e do pH do eletrólito de suporte perante a resposta eletroquímica da VB12 foram examinados empregando a voltametria de onda
quadrada, por ser uma técnica mais sensível para reações reversíveis. As respostas de corrente e potencial de pico foram avaliadas para o intervalo de pH de 2,0 a 12,0, utilizando solução tampão B-R 0,3 mol L1. Os voltamogramas obtidos para VB12 em
cada um dos valores de pH são apresentados nas Figuras 5A e 5B.
O gráfico da Figura 5C destaca como as correntes de pico variam em função do pH do eletrólito de suporte. Nota-se que a corrente aumenta conforme o pH aumenta, com um máximo valor em pH 10,0. Com o propósito de se desenvolver um método sensível para a determinação de VB12, adotou-se, assim, o valor de pH 10,0
Figura 5. Voltamogramas de onda quadrada para VB120,1 mmol L1sobre BDDE em solução tampão
B-R 0,3 mol L1 em diferentes valores de pH (A) pH 2,0 a 7,0 e (B) pH 8,0 a 12,0 (f = 50 Hz, a = 50
mV, ΔEs = 5 mV). (C) Variação de ip nos diferentes valores de pH (n = 3) e (D) variação de Ep em
função do pH (n = 3).
Como é possível ver na Figura 5D, o Ep se desloca para valores mais
negativos de potencial à medida que o pH do meio aumenta de 2,0 a 7,0, e permanece constante de pH 7,0 a 12,0. A relação linear entre Epe pH (para pH entre
2,0 e 7,0), exibida na Figura 5D, com inclinação de 48,5 mV pH1, próxima ao
coeficiente teórico da equação de Nernst (59,2 mV pH1), o que indica a
transferência do mesmo número de mols de elétrons e prótons na reação. Esta afirmação está de acordo com o que foi reportado para a reação de oxidação do par Co(I/II) na VB12. 19,44
O valor de pKa da VB12 pode ser encontrado pela intersecção das retas na
Figura 5D, sendo próximo a pH 7,0. A diferença entre esse valor e o relatado na literatura (pKa 4,7) deve-se à característica adsortiva do BDDE. Um desvio do
comportamento esperado em decorrência da adsorção da VB12 no eletrodo já foi
relatado por Kreft e co-autores em um eletrodo de filme de bismuto.3,25
Foram testadas diferentes soluções como eletrólitos de suporte nos valores de pH de 9,0; 10,0 e 11,0, como apresentado na Figura 6. As soluções testadas foram B-R, H3BO3.KCl/NaOH, Ringer e NaOH. A maior intensidade de corrente foi obtida
usando a solução tampão B-R em pH 10,0, desta forma, visando uma maior sensibilidade ao método, selecionou-se a solução tampão B-R pH 10,0 para as próximas análises.
Figura 6. Resultados de correntes obtidas para as diferentes soluções testadas como eletrólito de
suporte nos pH 9, 10 e 11.
5.4 Seleção da técnica eletroanalítica
Três técnicas eletroanalíticas foram investigadas com o objetivo de fornecer a maior sensibilidade para a quantificação da VB12. As técnicas avaliadas foram
voltametria de onda quadrada (do inglês, square wave voltammetry – SWV), linear (do inglês, linear sweep voltammetry – LSV) e pulso diferencial (do inglês, differential
pulse voltammetry – DPV).
Os voltamogramas da Figura 7 exibem os resultados obtidos pelas três técnicas em duas diferentes velocidades de varredura. As maiores intensidades de corrente foram obtidas optando-se monitorar a reação redox a uma menor velocidade de varredura. A SWV se mostrou a técnica mais sensível para este fim, fornecendo as maiores intensidades de corrente. Este resultado pode ser explicado, visto que na SWV, as correntes são medidas duas vezes, uma ao final do pulso
direto (i1) e outra ao final do pulso reverso (−i2). O sinal obtido da intensidade de
corrente é a resultante da leitura dessas duas correntes Δi = i1 – (−i2). Este
procedimento favorece uma maior intensidade de corrente para sistemas reversíveis, como é o caso do par redox Co(I/II) monitorado neste estudo.45
Figura 7. Voltamogramas para VB12 3,0mol L1sobre BDDE em solução tampão B-R 0,3 mol L1
(pH 10,0) em diferentes técnicas eletroanalíticas e velocidades de variação de potencial: (A)= 50,0 mV s1e (B)= 100,0 mV s1, sendo (a) SWV, (b) DPV e (c) LSV.
5.5 Otimização dos parâmetros da voltametria de onda quadrada
O objetivo da otimização dos parâmetros da técnica é garantir os maiores valores de corrente e melhor perfil voltamétrico, tornando a metodologia mais seletiva e sensível.
A velocidade efetiva de análise por SWV é dada em função do incremento de potencial (ΔEs) e a frequência de aplicação dos pulsos (f). Em cada incremento de potencial, dois pequenos e opostos pulsos de potenciais são impostos com o objetivo de realizar ambas as reações redox. O dobro da altura de cada pulso é denominada amplitude de pulso (a).46
5.5.1 Frequência
Para a otimização da frequência de pulsos, variou-se os valores de frequência de 10 a 100 Hz, mantendo-se fixos os demais parâmetros: a = 50 mV e ΔEs = 5,0 mV. Os resultados são apresentados na Figura 8, com as maiores intensidades de corrente obtidas em 20 Hz conforme é destacado na Figura 8B.
Figura 8. (A) Voltamogramas de onda quadrada para VB123,0 µmol L−1em solução tampão B-R 0,3
mol L1(pH 10,0) sobre o BDDE em diferentes valores de frequência de aplicação de pulso: (a) 20; (b)
10; (c) 30; (d) 40; (e) 50; (f) 60; (g) 70; (h) 80; (i) 90 e (j) 100 Hz mantendo fixo: a = 50 mV e ΔEs = 5,0 mV. (n = 3).
5.5.2 Amplitude de pulso
Para o estudo de variação da amplitude de pulso (Figura 9), a frequência e o incremento foram mantidos constantes em 20,0 Hz e 5,0 mV, respectivamente. As maiores amplitudes de pulso forneceram os maiores valores de corrente, porém há um alargamento dos picos com o aumento da amplitude, o que é indesejável. Adotando um compromisso entre intensidade de corrente e qualidade do sinal analítico, selecionou-se o valor de 70 mV de amplitude de pulso para as análises subsequentes.
Figura 9. (A) Voltamogramas de onda quadrada para VB123,0 μmol L−1em solução tampão B-R 0,3
mol L−1(pH 10,0) sobre o BDDE em diferentes valores de amplitude de pulso: (a) 100; (b) 90; (c) 80;
5.5.3 Incremento de potencial
Por último, foi avaliada a variação do incremento de potencial. Os resultados podem ser observados na Figura 10. O aumento do incremento de potencial levou a uma diminuição da intensidade do sinal analítico, como é mostrado na Figura 10B. Um aumento no valor do ΔEs provoca um aumento da velocidade efetiva da SWV, o que pode não ser favorável para se monitorar uma reação de cinética lenta, que pode ser o caso do reação redox Co(I/II). Assim, o valor de ΔEs escolhido para os próximos estudos foi 2,0 mV.
Figura 10. (A) Voltamogramas de onda quadrada para VB123,0 μmol L−1em solução tampão B-R 0,3
mol L−1(pH 10,0) sobre o BDDE em diferentes valores de incremento de potencial: (a) 8,0; (b) 7,0; (c)
6,0; (d) 5,0; (e) 4,0; (f) 3,0; (g) 2,0 e (h) 1,0 mV, mantendo fixo f = 20 Hz e a = 70 mV. (n = 3)
5.6 Curva de calibração
A curva de calibração para VB12 foi construída mediante adições de alíquotas
de solução padrão ao eletrólito de suporte, empregando as condições experimentais otimizadas. A Figura 11A apresenta os voltamogramas de onda quadrada para a VB12através do monitoramento da reação redox Co(I/II). As intensidades de corrente
aumentaram proporcionalmente com o aumento da concentração de VB12 no
intervalo de 0,25 a 5,0 mol L−1. A curva de calibração é exibida na Figura 11B.
O coeficiente de correlação obtido para a curva de calibração foi de 0,9995, com coeficiente linear de − 0,04318 ± 0,02085A e coeficiente angular de 0,62217 ± 0,00595 A L mol−1. O LOD e o LOQ foram calculados, respectivamente, iguais a
Figura 11. (A) Voltamogramas de onda quadrada em solução tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 10,0)
sobre o BDDE em diferentes concentrações de VB12: (a) branco; (b) 0,25; (c) 0,50; (d) 0,75; (e) 1,0; (f)
1,5; (g) 2,0; (h) 2,5; (i) 3,0; (j) 3,5; (k) 4,0; (l) 4,5 e (m) 5,0 μmol L−1. (B) Curva de calibração (n = 3). a
= 70 mV, f = 20 Hz e ΔEs = 2,0 mV.
Foram comparados estes resultados com os obtidos no trabalho de Stankovic et
al., no qual os autores também empregaram um BDDE para determinação de VB12,
porém monitorando o sinal referente ao par redox Co(II/III). Os autores construíram a curva de calibração em solução tampão B-R (pH 2,0), a qual apresentou duas inclinações: de 2,0 até 11,0 μmol L−1 e 11,0 até 35,0 μmol L−1 com LOD de 700 nmol
L−1. Comparando ambos os trabalhos, a faixa linear usada nesta pesquisa foi mais
limitada, porém seus limites se mostraram menores que o de Stankovic e co-autores. A Tabela 3 apresenta outros trabalhos dedicados a determinação eletroanalítica de VB12 usando eletrodos não modificados e eletrodos quimicamente
modificados. São apresentados também os valores de pH dos meios analisados, bem como a reação redox selecionada para a análise. O LOD obtido neste trabalho encontra-se dentro da faixa dos demais limites obtidos aplicando um eletrodo não modificado para eletroanálise de VB12.
Tabela 3. Comparação de dados de performance para a determinação de VB12para este trabalho e
literatura anterior.
Eletrodo pH LOD(nmol L-1) Reação
monitorada Referência Eletrodo modificado SWCNT-PGEa 2,0 0,89 Co(I/II) 47 MMA/SAM/Aub 2,0 1,0 Co(II/III) 48 DBCH-CPEc 2,5 0,85 Co(I/II) 49 BiFEd 12,0 33,1 Co(I/II) 3 Eletrodo não modificado CPEe 2,5 150 Co(I/II) 49
Grafite SPEf 3,0 0,07 Co(I/II) 21
CGEg 3,0 1x106 Co(II/III) 20
BDDE 2,0 700 Co(II/III) 24
BDDE 10,0 110 Co(I/II) Este trabalho
aEletrodo de grafite de lápis modificado com quitosana e nanotubes de carbono de parede simples. bEletrodo de ouro modificado com monocamada auto organizada de ácido mercaptoacético. cEletrodo de pasta de carbono modificado com trans-1,2-dibromociclohexano.
dEletrodo de filme de bismuto. eEletrodo de pasta de carbono. fEletrodo impresso de grafite. gEletrodo de carbono vítrio.
A repetibilidade da resposta de corrente obtida com o BDDE foi estimada em solução tampão B-R 0,3 mol L−1 (pH 10,0) contendo VB12 3,0 μmol L−1 usando as
condições otimizadas. O desvio padrão relativo (do inglês, relative standard
deviation – RSD) dos valores de corrente de medidas realizadas no mesmo dia com
o eletrodo sendo submetido a apenas um pré-tratamento no início do dia de trabalho (repetibilidade intradia) foi de 5,60% (n = 5), o que significa uma boa precisão entre as respostas obtidas. A repetibilidade interdia das respostas do BDDE foi avaliada através de cinco medidas de corrente em dias consecutivos, sendo o eletrodo submetido ao pré-tratamento da superfície no início de cada dia de experimentos. Para isso, utilizou-se as mesmas condições experimentais anteriores sendo obtido um valor de RSD igual a 7,10% (n = 5) para a VB12. Estas avaliações permitem
afirmar que o BDDE tem grande potencial para ser aplicado na quantificação de VB12
5.7 Método comparativo
Com o objetivo de verificar a exatidão do método eletroanalítico proposto, os resultados foram comparados com aqueles obtidos por um segundo método, a espectrometria UV-vis. Assim, foi construída uma curva de calibração para a VB12
por adições sucessivas de solução padrão em água. Foram monitorados os valores de absorbância máximos no comprimento de onda de 361 nm e os resultados são apresentados na Figura 12.
A curva de calibração exibida na Figura 12B foi linear na faixa de concentração de 0,83 a 14,3 µmol L−1 (r = 0,999) com equação de Abs = 0,0234 (± 1,695 ×
10−4)[VB12] – 0,001 (± 0,0020) obtendo LOD e LOQ de 282,0 e 854,7 nmol L−1,
respectivamente.
Figura 12. (A) Espectros UV-vis para solução padrão de VB12: (a) branco em água; (b) 0,83; (c) 1,64;
(d) 3,22; (e) 4,76; (f) 6,25; (g) 7,69; (h) 9,09; (i) 10,5; (j) 11,8; (k) 13,0; (l) 14,3 µmol L−1. (B) Curva de
calibração (n = 3).
5.8 Determinação de VB12em produtos de suplementação
O BDDE foi testado quanto a sua aplicabilidade para análises de VB12 em
duas amostras: pasta de dente e comprimidos de suplementação. As amostras foram tratadas como descrito no material e métodos (Seção 4.4). Para minimizar os efeitos de matriz, o método usado para determinação das amostras foi o método de adição de padrão.
5.8.1 Amostra de pasta de dente
Na Figura 13 estão apresentados os resultados de uma das replicatas para a amostra de pasta de dente usando o método eletroquímico. Os voltamogramas de onda quadrada são mostrados na Figura 13A, com o branco (curva a), amostra (curva b) e amostra com adições sucessivas de solução padrão de VB12(curvas c-f).
Com as adições da solução padrão, as correntes de pico aumentaram linearmente, fornecendo a curva de adição de padrão da Figura 13B, que é apresentada juntamente com a curva de calibração construída anteriormente (Seção 5.6). Nota-se que a inclinação da curva de adição de padrão é semelhante à inclinação da curva de calibração, isto indica que não houve interferência proveniente dos componentes da matriz na determinação de VB12.
Figura 13. (A) Voltamogramas de onda quadrada para (a) branco, (b) 1,5 mL do extrato da amostra
de pasta de dente, e (c-f) adições sucessivas de 100,0 µL de solução padrão de VB120,1 mmol L−1
em solução tampão B-R 0,3 mol L−1(pH 10,0) empregando o BDDE. (B) Curva de adição de padrão
de VB12(a) e curva de calibração de VB12(b).
Os resultados para uma das replicatas para a quantificação de VB12 na amostra
de pasta de dente pelo método espectrométrico estão dispostos na Figura 14. Os espectros UV-vis para o branco (curva a), amostra (curva b) e adições sucessivas de solução padrão de VB12 (curvas c-g) são mostrados na Figura 14A. A curva de
adição de padrão, bem como a curva de calibração construída anteriormente, são mostradas na Figura 14B. Como as inclinações são semelhantes, é possível concluir que não houve interferência dos componentes da matriz na análise realizada.
Figura 14. (A) Espectros UV-vis para (a) branco, (b) 1,0 mL do extrato da amostra de pasta de dente,
(c-g) adições sucessivas de 50,0 µL de solução padrão de VB120,1 mmol L−1em água. (B) Curva de
adição de padrão de VB12(a) e curva de calibração de VB12(b).
5.8.2 Amostra de suplemento em comprimidos
Na Figura 15 estão apresentados os resultados de uma das replicatas para a amostra de suplemento em comprimidos usando o método eletroquímico. Os voltamogramas de onda quadrada são mostrados na Figura 15A, com o branco (curva a), amostra (curva b) e amostra com adições sucessivas de solução padrão de VB12(curvas c-f).
Figura 15. (A) Voltamogramas de onda quadrada para (a) branco, (b) 100,0 µL de amostra de
suplemento em comprimido, e (c-f) adições sucessivas de 100,0 µL de solução padrão de VB120,1
mmol L−1em solução tampão B-R 0,3 mol L−1(pH 10,0) empregando o BDDE. (B) Curva de adição de
padrão de VB12(a) e curva de calibração de VB12(b).
As correntes de pico aumentaram linearmente com as adições da solução padrão, fornecendo a curva de adição de padrão da Figura 15B, juntamente apresentada
com a curva de calibração construída anteriormente (Seção 5.6) para comparação. Novamente, como as inclinações são semelhantes, é possível concluir que não houve interferência dos componentes da matriz na análise realizada.
Os resultados para uma das replicatas para a quantificação de VB12 na
amostra de suplemente em comprimido pelo método espectrométrico estão dispostos na Figura 16. Os espectros UV-vis para o branco (curva a), amostra (curva b) e adições sucessivas de solução padrão de VB12 (curvas c-g) são mostrados na
Figura 16A. A curva de adição de padrão, bem como a curva de calibração construída anteriormente, são mostradas na Figura 16B. Como as inclinações da curva de calibração e da curva de adição de padrão mais uma vez são semelhantes, é possível concluir que os componentes da matriz não interferiram no resultado obtido.
Figura 16. (A) Espectros UV-vis para (a) branco, (b) 50,0 µL de amostra de suplemento em
comprimido, (c-g) adições sucessivas de 50,0 µL de solução padrão de VB120,1 mmol L−1 em água.
(B) Curva de adição de padrão de VB12(a) e curva de calibração de VB12(b).
A Tabela 4 reúne os resultados das análises para as duas amostras por ambos os métodos, bem como os testes estatísticos envolvendo os mesmos. As concentrações de VB12 determinadas tanto nos comprimidos, como na pasta de
dente, foram bastante próximas das concentrações declaradas nos rótulos dos produtos.
Os testes t de Student e F são aplicados com o objetivo de se comparar resultados obtidos por métodos diferentes, avaliando as precisões e as médias. As equações usadas para o cálculo desses testes são dispostas em seguida.50
2 1 2 1 1 1 n n S x x t a
Onde: é o valor médio das amostras obtido pelo método voltamétrico; é o valor médio das amostras obtido pelo método comparativo; Sa é a estimativa do desvio
padrão agregado; n é o número de repetições e SD é o desvio padrão amostral. O teste F foi usado para comparar a precisão entre os resultados obtidos pelo método voltamétrico e pelo UV-vis. Os valores de F calculado são exibidos na Tabela 4. Para as amostras, os valores de F calculado foram inferiores ao F crítico, indicando que não existe diferença significativa entre a precisão dos dados obtidos por ambos os métodos.
Tabela 4. Determinação de VB12em diferentes amostras pelo método voltamétrico e espectrométrico.
Amostra Comprimido Pasta de dente
Valor rotulado (g g-1) 15000 100,0
Técnica SWV UV-vis SWV UV-vis
Valor encontrado (g g-1) 14866 ± 1476 15549 ±408 102,1 ± 3,76 104,6 ± 2,76 Er(%) −4,4 −2,4 tcalculado 0,57 1,49 Fcalculado 13,09 1,24 an = 3.
bEr= erro relativo entre as técnicas. ctcrítico= 2,78.
dFcrítico= 19,00.
Para a comparação das médias fornecidas pelos dois métodos, foi aplicado o teste t de Student. O valor de t tabelado é obtido a partir da tabela de distribuição de Student para (n1 + n2 − 2) graus de liberdade e nível de confiança de 95%. Os
valores de t para as amostras são encontrados na Tabela 4. Todos os valores de t calculados foram inferiores ao valor de t crítico, indicando que não houve diferença significativa entre as médias obtidas pelos dois métodos.
2 2 menor maior SD SD F
6 CONCLUSÃO
A metodologia eletroanalítica desenvolvida neste trabalho mostrou-se apta à
detecção e quantificação da vitamina B12 em amostras de produtos de
suplementação.
A superfície do BDDE foi primeiramente avaliada quanto a aplicação dos tratamentos catódico e anódico usando como sonda redox [Fe(CN)6]3−/4−. Como
resultado, obteve-se uma melhora na resposta analítica quando aplicado um tratamento catódico de −2,0 V durante 1 h; o que proporcionou uma melhora na transferência eletrônica em virtude da superfície rica em H, juntamente com a adsorção do analito, que promoveu a transferência eletrônica por esfera interna.
Em relação ao comportamento eletroquímico da VB12 sobre o BDDE, os
voltamogramas cíclicos mostraram dois picos de redução e dois picos de oxidação da VB12, correspondendo aos pares redox Co(I/II) e Co(II/III), com uma transferência
de elétrons mais rápida para o primeiro par.
As condições experimentais foram otimizadas juntamente com os parâmetros da técnica de voltametria de onda quadrada a afim de se desenvolver uma metodologia sensível para o monitoramento da VB12. A curva de calibração foi obtida
na faixa de concentração de 0,25 a 5,0 µmol L−1 com limites de detecção e
quantificação iguais a 110,0 e 335,0 nmol L−1, respectivamente.
O BDDE foi aplicado com sucesso na determinação de VB12 em duas
amostras de produtos de suplementação usando como método a adição de padrão, a qual não apresentou interferência dos componentes da matriz das amostras. Os resultados foram avaliados quanto a exatidão e precisão, usando como comparação o método espectrométrico UV-vis;
Por fim, aplicou-se testes estatísticos nos resultados obtidos. O teste F indicou que não existe diferença significativa entre a precisão dos valores obtidos pelos dois métodos. Assim como, não houve diferença significativa entre as médias de ambas as metodologias, como evidenciado pelo teste t.
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