MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
A INFLUÊNCIA DO ÍLEO E DO CÓLON SOBRE A REGENERAÇÃO HEPÁTICA: UM ESTUDO COMPARATIVO
CLÁUDIA NUNES OLIVEIRA
NATAL/RN 2019
i AUTOR
Cláudia Nunes Oliveira
A INFLUÊNCIA DO ÍLEO E DO CÓLON SOBRE A REGENERAÇÃO HEPÁTICA: UM ESTUDO COMPARATIVO.
Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
NATAL/RN 2019
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde
ii
Ficha catalográfica:
Oliveira, Claudia Nunes.
A influência do íleo e do cólon sobre a regeneração hepática: um estudo comparativo / Claudia Nunes Oliveira. - 2019. 80f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2019.
Orientador: Aldo da Cunha Medeiros.
1. Fígado - Dissertação. 2. Regeneração - Dissertação. 3. Íleo - Dissertação. 4. Colectomia - Dissertação. 5. Hepatectomia -
Dissertação. 6. Ratos - Dissertação. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II. Título.
iii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde Prof. Dr. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
iv AUTOR
Cláudia Nunes Oliveira
A INFLUÊNCIA DO ÍLEO E DO CÓLON SOBRE A REGENERAÇÃO HEPÁTICA: UM ESTUDO COMPARATIVO
Aprovada em 13/ 11/ 2019
Banca examinadora:
Presidente da Banca: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros Membros da Banca: Prof. Dr. Rejane Andrade de Carvalho
Prof. Dr. Joabe dos Santos Pereira Dr. Maria Goretti Freire de Carvalho Dr. Cipriano da Cruz Formiga
v
DEDICATÓRIA
À Deus Ao meu pai Jethro Oliveira (in memoriam)
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus, expressão suprema do amor, por permitir que eu trilhasse essa jornada e chegasse até aqui.
À minha família, minha mãe, Jurucema Nunes Oliveira, meu esposo, Dênis de Amorim Santos, meus filhos, Lucas Feitosa Oliveira Moreira e Maria Eduarda Oliveira Amorim e a minha irmã Selma Regina Nunes Oliveira, por todo apoio e amor, sem os quais eu não poderia concluir essa etapa da minha vida.
Ao meu orientador Dr. Aldo da Cunha Medeiros por compartilhar seu conhecimento e dedicar seu tempo na orientação desse trabalho. Agradeço especialmente pelas palavras sábias nos momentos certos que trouxeram tranquilidade para o desenvolvimento desse projeto.
À minha amiga e companheira de vida acadêmica, professora Keyla Borges Ferreira Rocha pela amizade constante, o apoio técnico e palavras de incentivo! Começamos esse caminho juntas, nos comprometendo a apoiar incondicionalmente uma à outra.
À Ítalo Medeiros de Azevedo pelo apoio na análise estatística e preciosos ensinamentos sobre o tema.
Aos professores Luiz Reginaldo Menezes da Rocha, Carlos André Nunes Jatobá, Joabe dos Santos Pereira, e aos técnicos do Laboratório do Departamento de Patologia Ana Rogéria Pereira da Silva e Rondinelli de Oliveira Santos pela colaboração no desenvolvimento desta pesquisa.
A todos os demais docentes e funcionários do Departamento de Patologia e Cirurgia Experimental da UFRN por todo apoio e incentivo.
vii
”Tudo neste mundo tem o seu tempo; cada coisa tem a sua ocasião. Há tempo
de nascer e tempo de morrer; tempo de plantar e tempo de arrancar; tempo de matar e tempo de curar; tempo de derrubar e tempo de construir. Há tempo de ficar triste e tempo de se alegrar; tempo de chorar e tempo de dançar; tempo de espalhar pedras e tempo de ajuntá-las; tempo de abraçar e tempo de afastar. Há tempo de procurar e tempo de perder; tempo de economizar e tempo de desperdiçar; tempo de rasgar e tempo de remendar; tempo de ficar calado e tempo de falar. Há tempo de amar e tempo de odiar; tempo de guerra e tempo de paz. O que é que a pessoa ganha com todo o seu trabalho? Eu tenho visto todo o trabalho que Deus dá às pessoas para que fiquem ocupadas. Deus marcou o tempo certo para cada coisa. Ele nos deu o desejo de entender as coisas que já aconteceram e as que ainda vão acontecer, porém não nos deixa compreender completamente o que ele faz. Então entendi que nesta vida tudo o que a pessoa pode fazer é procurar ser feliz e viver o melhor que puder.”
Eclesiastes, 3:1-12 (NTLH) BÍBLIA SAGRADA
viii RESUMO
Objetivo: O cólon e o íleo desempenham papéis significativos na fisiologia do fígado. Estudos sobre hepatectomia e colectomia ou enterectomia simultâneas são escassos e controversos. O objetivo deste trabalho foi investigar e comparar os efeitos da ressecção de íleo e cólon na regeneração hepática. Métodos: Vinte e quatro ratos Wistar foram alocados no grupo I - (Sham), grupo II - hepatectomia a 70%; grupo III - hepatectomia à 70% + ressecção ileal e grupo IV - hepatectomia a 70% + colectomia parcial. No sexto dia, foram medidas as enzimas hepáticas séricas, albumina, fator de crescimento para hepatócitos (HGF) e fator de crescimento transformador alfa (TGF-α). A taxa de regeneração hepática foi estimada. A análise imuno-histoquímica do Ki-67 foi realizada no fígado remanescente. Resultados: Os níveis de enzimas hepáticas foram significativamente maiores nos ratos do grupo III em comparação aos demais grupos (p<0,001). No grupo IV, os níveis foram significativamente menores do que nos grupos II e III (p<0,001). A albuminemia foi significativamente menor nos ratos do grupo III em comparação com os outros grupos (p<0,001). A albuminemia não foi diferente na comparação dos grupos I e IV (p>0,05). Os níveis de HGF e TGF-α no grupo IV foram significativamente maiores do que nos outros grupos (p<0,001). A taxa de regeneração hepática foi maior no grupo IV do que nos grupos II e III, sendo a diferença significativa (p=0,002). A expressão em hepatócitos de Ki-67 foi significativamente maior no fígado remanescente do grupo IV do que no grupo III (p=0,002). Não houve diferença na expressão de Ki-67 entre os grupos II e IV (p>0,05). Conclusão: A ressecção de íleo e cólon tem efeitos diferentes na regeneração hepática. A ressecção do cólon influencia positivamente a regeneração hepática, enquanto a ressecção do íleo influencia negativamente o processo regenerativo, em um modelo de rato.
ix ABSTRACT
Purpose: The colon and ileum play significant roles on liver physiology. Studies about simultaneous hepatectomy and colectomy or enterectomy are scarce and controversial. We investigated and compared the effects of ileum and colon resection on liver regeneration. Materials and Methods: Twenty four Wistar rats were allocated in group I-(sham), group II-70% hepatectomy; group III-70% hepatectomy+ileal resection, and group IV-70% hepatectomy+partial colectomy. On the sixth day, serum hepatic enzymes, albumin, hepatocyte growth-factor (HGF) and transforming growth factor-alpha (TGF-α) were measured. The hepatic regeneration rate was estimated. Ki-67 immunohistochemical analysis was done in remnant liver. Results: Hepatic enzymes levels were significantly higher in group III rats comparing to the other groups (p<0.001). In group IV, the levels were significantly lower than in groups II and III (p<0.001). Albuminemia was significantly lower in group III rats comparing with the other groups (p<0.001). Albuminemia was not different comparing groups I and IV (p>0.05). HGF and TGF-α levels in group IV were significantly higher than in the other groups (p<0.001). Liver regeneration rate was higher in group IV than in groups II and III, and the difference was significant (p=0.002). The hepatocytes expression of Ki-67 was significantly higher in the remnant liver of group IV than in group III (p=0.002). There was no difference in Ki-67 expression between groups II and IV (p>0.05). Conclusion: Ileum and colon resection have different effects on liver regeneration. Colon resection positively influences liver regeneration, while ileum resection negatively influences the regenerative process, in a rat model.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AF: Fosfatase alcalina
ALT: Alanina aminotransferase
AP-1: Complexo proteína ativadora 1
AR: Anfiregulina
AST: Aspartato aminotransferase
CCR: Câncer colorretal
c-Met: Receptor tirosino-quinase do gene transformador MNNG HOS
CONCEA: Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
Cyp7A1: Colesterol 7-alfa hidroxilase
DRH: Déficit de regeneração hepática
EGF: Fator de crescimento epidérmico
ELISA: Ensaio de imunoabsorção enzimática
ERK1/2: Quinase 1/2 regulada por sinal extracelular
FGF: Fator de crescimento fibroblástico
FGFR4: Receptor para fator de crescimento fibroblástico 4
FoxM1b: Forkhead box protein M1
FRX: Receptor farnesóide X
HB-EGF: EGF ligante de heparina
HE: Hematoxilina & Eosina
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IL-6: Interleucina 6
INCA: Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
MEC: Matriz extracelular
NF-kB: Fator de transcrição nuclear kappa
PBS: Tampão fosfato-salino
PCNA: Antígeno nuclear de célula em proliferação
RH: Regeneração hepática
RMHMC: Razão massa hepática/massa corporal
STAT-3: Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3
TGF-α: Fator de crescimento transformador alfa TGF-β: Fator de crescimento transformador beta
TNF: Fator de Necrose Tumoral
TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Procedimento cirúrgico: Laparotomia exploradora mediana 28
Figura 2 - Identificação dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado 28
Figura 3 - Ressecção dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado 29
Figura 4 - Peça cirúrgica após a ressecção dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado
29
Figura 5 - Inclusão dos fragmentos hepáticos em parafina após processamento. 30 Figura 6 - Inclusão em parafina: posicionamento dos fragmentos nos moldes de metal para confecção dos blocos.
30
Figura 7 - Inclusão dos fragmentos: preenchimento dos moldes com parafina líquida.
31
Figura 8 - Resfriamento dos blocos de parafina em placa fria. 31
Figura 9 - Retirada dos blocos de parafina dos moldes após o resfriamento. 32
Figura 10 - Bloco de parafina pronto para a microtomia. 32
xiii SUMÁRIO Introdução ... 14 Justificativa ... 21 Objetivos ... 22 Método ... 23 Artigo produzido ... 34 Conclusões ... 46
Comentários, críticas e sugestões ... 46
Referências ... 49
Apêndices ... 53
1. INTRODUÇÃO
O fígado desempenha uma ampla gama de funções metabólicas e secretoras essenciais para a homeostase sistêmica. Essas funções incluem o metabolismo de glicose, lipídios e a síntese e secreção de proteínas séricas e fatores da coagulação
1. Outra atividade chave realizada pelos hepatócitos é o metabolismo de compostos
endógenos e exógenos que precisam ser biotransformados para serem excretados do nosso organismo. Esta função implica em exposição contínua à estímulos tóxicos gerados durante o processo de detoxificação, que pode eventualmente levar à morte celular. Para evitar perda da função hepática os organismos desenvolveram uma notável resposta regenerativa do fígado garantindo a sua sobrevivência 2,3. O fígado
possui uma capacidade única de se regenerar após dano agudo, seja por lesão parenquimatosa, seja por ressecção, através de um processo de hiperplasia compensatória inicial, enquanto mantém o balanço metabólico e sua capacidade funcional 4. A capacidade regenerativa do fígado é reconhecida ao longo da história
da humanidade, tendo seu primeiro registro histórico no conhecido mito de Prometheus. Conta a lenda grega que Prometheus, irmão de Atlas, após desentender-se com Zeus por revelar o desentender-segredo do fogo dos deudesentender-ses do Olimpo, teve sua perna acorrentada no alto de um penhasco e foi condenado a alimentar diariamente uma águia com parte de seu fígado. Entretanto, segundo descreve a mitologia, durante a noite o órgão sofria regeneração e assim era fonte renovável de alimento ao pássaro 5,6.
Em 1890 Ponfick foi um dos primeiros estudiosos a fornecer evidências experimentais para esse fenômeno que mais tarde foi estudado por vários pesquisadores. Após remoção parcial do fígado, observou-se que o tecido remanescente rapidamente aumentava de tamanho com uma vívida multiplicação celular. A regeneração incluía todas as estruturas hepáticas, e o processo permanecia a uma taxa decrescente até que o peso do fígado regenerado fosse o mesmo de um fígado normal 7. Em outro artigo histórico publicado em 1931, Higgins e Anderson
relataram a remoção de dois lobos no rato (os lobos médio e lateral esquerdo) produzindo, com a intervenção, a redução de 70% do tamanho do fígado, sendo este modelo de ressecção bem tolerado e com resultados confiáveis 8,9. Este modelo,
também conhecido por hepatectomia parcial a 70%, possui duas características fundamentais que o torna bastante útil na área experimental: a possibilidade de realizar uma ressecção não associada à necrose e inflamação, permitindo a
observação dos processos relevantes à regeneração; e a rapidez da realização da ressecção hepática com estimulação inicial imediata do processo de regeneração 10.
No rato, ao final do 7º ao 10º dia após a hepatectomia, o fígado apresenta uma grande recomposição, atingindo cerca de 93% do seu tamanho original a partir dos lobos remanescentes, e ao final do 20º dia, o fígado atinge o volume inicial 9,11. No modelo
de hepatectomia parcial em ratos, os hepatócitos são as primeiras células a entrar em divisão, nas 24 horas iniciais após a ressecção, seguindo-se pela proliferação das células ductais biliares, células de Kupffer e células estreladas, e finalmente as células endoteliais 11,12. Apesar desses aspectos positivos associados ao modelo, é
necessário compreender que, nas doenças hepáticas, outras condições patológicas estão associadas como necrose, inflamação, neoplasias, além da possível associação com patologias em outros órgãos, ou como no caso do nosso estudo, associado à ressecção concomitante de outros tecidos durante intervenções terapêuticas, fazendo do processo de regeneração do fígado mais complexo em si mesmo.
As intervenções cirúrgicas onde são realizados procedimentos de ressecções intestinais extensas associadas à hepatectomia estão cada vez mais frequentes. No intestino delgado, as indicações cirúrgicas incluem ressecções por lesões traumáticas, infarto mesentérico, enterite regional e outras indicações de enterectomia. Particularmente nos casos de trauma é comum a indicação de enterectomia e hepatectomia concomitantes. No intestino grosso, a principal indicação relaciona-se à presença de metástases hepáticas associadas à neoplasia colônica em curso13.
Existem ainda situações onde a ressecção cirúrgica combinada do íleo terminal e porção inicial do cólon faz-se necessária, relacionada principalmente ao tratamento de doenças presentes na região da transição ileocecal, tais como neoplasias malignas do íleo terminal, ceco, apêndice cecal, ou até mesmo doenças não neoplásicas. Neste contexto, o estudo da regeneração hepática assume importante destaque, sendo a
capacidade de regeneração um fator crítico influenciando o prognóstico de pacientes após hepatectomia parcial 14.
O câncer colorretal (CCR) é uma das principais causas de morte associada ao câncer em populações ocidentais e a terceira causa mais frequente de morte por câncer no mundo, com incidência de 9% em homens e 8% em mulheres15-19. Nos
Estados Unidos há uma estimativa diagnóstica de 1.762.450 novos casos de câncer durante o ano de 2019, sendo 145.600 casos de câncer colorretal, com expectativa de 51.200 mortes 15. No Brasil, o câncer colorretal apresenta taxas semelhantes à
Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA) para o Brasil, estimam-se 17.380 casos novos de câncer de cólon e reto em homens e 18.980 em mulheres para cada ano do biênio 2018-2019. Esses valores correspondem a um risco estimado de 16,83 casos novos a cada 100 mil homens e 17,90 para cada 100 mil mulheres 19.
Nas neoplasias malignas colorretais avançadas, o fígado é a localização mais comum de metástase, sendo que as metástases hepáticas estão presentes em 20 a 40% dos pacientes no momento do diagnóstico inicial 16, com cerca de 25 a 30% dos
pacientes diagnosticados com CCR desenvolvendo metástases hepáticas durante o curso de sua doença 17. Estudos mostram que menos de 25% dos pacientes com
metástases hepáticas decorrentes de CCR são elegíveis para ressecção curativa, sendo a principal causa de contraindicação cirúrgica, um volume hepático futuro insuficiente (tecido hepático remanescente pós-ressecção), comprometendo a adequada regeneração do órgão, entretanto a ressecção hepática constitui a única abordagem curativa para a metástase hepática colorretal, sendo sua indicação baseada em fatores relacionadas ao tumor como número de lesões, tamanho e distribuição no fígado 16,17.
Em indivíduos sadios, a massa hepática é regulada em uma proporção precisa com a massa corpórea, mantendo o equilíbrio necessário para o adequado metabolismo do órgão 10,12,20. Em contraste com todos os outros órgãos, a razão entre
peso do fígado e do corpo precisa ser mantida sempre em 100% do que é necessário para a homeostase do organismo. O ajuste do tamanho do fígado a 100% do que é necessário para a homeostase foi chamado por Michalopoulos, e outros autores, de “hepatostat” 10,12,21,22,23. A razão massa hepática/massa corpórea é especificamente
restaurada pela regeneração após lesão hepática ou ressecção. Mecanismos complexos envolvidos nesse processo hepático exclusivo englobam uma variedade de vias regenerativas que são específicas para diferentes tipos de lesão e, embora diversos estudos tenham sido realizados para investigar os mecanismos que regulam a massa hepática e regeneração, a natureza precisa dos sinais envolvidos ainda não está completamente elucidada 12.
Mesmo que o termo regeneração hepática seja utilizado para descrever o processo de recuperação do órgão após uma lesão, sabe-se que as alterações observadas constituem, na verdade, predominantemente um processo de hiperplasia compensatória, mais do que regenerativo em si. O fígado remanescente se expande em massa para compensar a perda tecidual, com mobilização dos hepatócitos remanescentes, resultando em ondas de hipertrofia e pequenos ciclos de divisão
celular, resultando em um fígado metabolicamente funcional, porém, arquiteturalmente, um órgão diferente 20,24,25. No fígado, a regeneração completa é a
regra após pequenas lesões destrutivas, desde que haja preservação do estroma reticular de sustentação 14.
O processo regenerativo ocorre em estágios distintos, iniciando-se com a ação de citocinas produzidas pelas células de Kupffer e outras células inflamatórias ativadas pelo dano, responsáveis pela iniciação celular (priming). Nesta fase, por ação principalmente do fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina-6 (Il-6) as células tornam-se capazes de reconhecer e responder à sinalização dos fatores de crescimento 20,24. Os receptores dessas citocinas, uma vez ativados nos hepatócitos, ativam fatores de transcrição que estimulam genes para receptores de fatores de crescimento específicos 26. A Il-6, tal como o TNF-α, não possui função de mitógeno
direto para hepatócito, embora possa desempenhar esse papel, além de possuir atividade antiapoptótica 20,24. O segundo estágio consiste na ação dos fatores de crescimento sobre os hepatócitos iniciados, estimulando o seu metabolismo, sua entrada e progressão no ciclo celular. Nesta fase os hepatócitos sofrem uma ou duas rodadas de replicação para restaurar a massa hepática 24. A onda de replicação
celular envolve não apenas a proliferação de hepatócitos, mas também dos demais tipos celulares não parenquimatosos 24,27. Na fase de replicação ocorre ativação de
diversos genes que codificam importantes fatores de transcrição, como o complexo proteína ativadora 1 (AP-1), o transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT-3), e o fator de transcrição nuclear kappa (NF-kB), importantes reguladores do ciclo celular, do metabolismo energético, dentre outras funções 20,24. O terceiro estágio, ou
fase terminal, consiste no retorno das células ao estado de quiescência original, envolvendo a ação de citocinas antiproliferativas da família do fator de crescimento transformador beta (TGF-β). Em situações distintas, onde a capacidade regenerativa do fígado encontra-se prejudicada, a regeneração pode ocorrer através de células progenitoras do fígado (células-tronco) ou até mesmo de células derivadas da circulação 5,24,28,29.
Os principais fatores de crescimento envolvidos na regeneração hepática são o fator de crescimento para hepatócitos (HGF), seu receptor c-Met, e o fator de crescimento epidérmico (EGF), sendo considerados mitógenos completos para hepatócitos. Os receptores para ambos, HGF e EGF são ativados precocemente após a hepatectomia parcial, cerca de 30-60 minutos após o procedimento 11,12. O HGF age
células estreladas hepáticas como um peptídeo único (pró-HGF) e depositado na matriz pericelular e extracelular (MEC) dos hepatócitos periportais, podendo ser encontrado em outras fontes teciduais tais como os pulmões e rins 10,11,12. Sua
liberação e ativação envolve um processo de remodelação da MEC pela ação do ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA) 12. A ação do HGF não se restringe
aos hepatócitos já que o receptor c-Met pode ser expresso também em células endoteliais e outras células epiteliais 11.O EGF é produzido pelas glândulas de Brunner
duodenais, sendo lançado constantemente na luz intestinal, onde é absorvido intacto, retornando à circulação através do sistema porta 11,12,20. A família de ligantes que
ativam os receptores do EGF, além do próprio EGF, incluem o fator de crescimento transformador alfa (TGFα), fator de crescimento semelhante ao EGF ligante de heparina (HB-EGF) e a Anfiregulina (AR) 10. O TGF-α é um fator de crescimento
autócrino, produzido e ativado no hepatócito, age como mitógeno primário com notável papel na regulação inicial de outros mediadores como o HGF, sendo essencial no processo de regeneração através do estímulo à proliferação celular, podendo a dosagem dos seus níveis, ser utilizada para controlar e avaliar o grau de regeneração em pacientes submetidos à hepatectomia 4. Os papeis do HGF e EGF nas fases
iniciais do processo de regeneração hepática estão bem estabelecidos, porém não está claro se sua atividade é também importante nas fases tardias da reconstrução, especialmente sob a influência de fatores com potencial antiproliferativo 11.
O papel do íleo no processo de regeneração está intimamente relacionado ao seu papel na viabilização do ciclo enterohepático. Importantes alterações nas vias metabólicas ocorrem durante a regeneração hepática, podendo estar relacionadas não somente àquelas associadas ao processo regenerativo em si, mas também às adaptações sofridas pelo tecido hepático remanescente necessárias para suprir as demandas do organismo 24,30,31. O metabolismo dos ácidos biliares e a sua
homeostasia têm sido reconhecidos como importante fator na regeneração 9,14,32,33,
podendo afetar de maneira significativa o processo regenerativo 34,35,36. A manutenção
da homeostasia dos ácidos biliares durante o processo de regeneração, impede o seu acúmulo intracelular e consequentemente sua toxicidade hepática e retardo no processo de regeneração, ao mesmo tempo que estimula a síntese do fator de crescimento para fibroblastos 15 e 19 (FGF15/19). Ambas ações através da ativação do receptor farnesóide X (FRX), presente tanto nos hepatócitos como nos enterócitos ileais 9,14,30. Logo após a ressecção hepática, há uma rápida elevação dos ácidos
através da circulação portal 10,30. Ativação do FXR nos enterócitos, pela ação direta
dos ácidos biliares absorvidos, desencadeia a expressão de diferentes genes envolvidos no transporte dos ácidos biliares, porém também ativa a transcrição do fator de crescimento fibroblástico 15 em ratos (sendo seu homólogo humano o FGF19). No hepatócito em regeneração, a manutenção de baixa concentração dos ácidos biliares é importante para impedir toxicidade, à medida que os ácidos biliares são substâncias detergentes que podem danificar as membranas celulares e ativar a morte hepatocelular 37. A ativação do FXR do hepatócito pelo FGF produz inibição da
expressão dos genes envolvidos na síntese, conjugação, absorção e secreção de moléculas, controlando os níveis dos ácidos biliares sintetizados pela célula, entre outras vias metabólicas reguladoras no citosol do próprio hepatócito, como o metabolismo lipídico, metabolismo da glicose e síntese proteica 30,38,39,40. A ativação
do FXR/FGFR4 possui não apenas efeitos metabólicos, mas também efeitos pró-proliferativos no fígado e outros tecidos, através da ativação das vias de proliferação por meio da ativação do STAT-3 e da quinase 1/2 regulada por sinal extracelular (ERK1/2) 14,30,41. Em resumo, sob o ponto de vista molecular, podemos afirmar que
ambos, o FXR intestinal e hepático, contribuem para a regeneração hepática após hepatectomia parcial de duas maneiras: protegendo o fígado remanescente contra o estresse dos ácidos biliares através da supressão da colesterol 7-alfa hidroxilase (Cyp7A1) na então denominada “resposta adaptativa hepatocítica”; e promovendo a proliferação dos hepatócitos particularmente através da indução do fator de transcrição Forkhead box protein M1 (FoxM1b) por meio do STAT-3, ambas as ações possivelmente relacionadas 41. Essas evidências apoiam a importância do íleo no
processo de regeneração uma vez que está diretamente relacionado com a manutenção da homeostasia dos ácidos biliares e na orquestração da resposta regenerativa hepática, demonstrando a existência de um mecanismo dedicado que ajusta os níveis e circulação dos ácidos biliares durante este processo.
A evolução dos estudos relacionadas ao mecanismo de regeneração hepática, pode ser dividida em 03 momentos distintos. A visão original do processo acreditava que um único agente humoral poderia funcionar como chave, capaz de desbloquear todos os eventos necessários para a regeneração hepática. Na sequência surge a ideia de que a ativação de uma única via envolvendo múltiplos componentes poderia ser responsável pela regeneração. A visão mais atual reconhece que é necessária uma atividade de múltiplas vias para a regeneração hepática. Esta última, permanece uma simplificação de uma realidade mais complexa, à medida que a regeneração
hepática requer a ativação de múltiplas vias, porém essas vias não agem independentes umas das outras. O padrão de interação entre as vias é particularmente complexo porque podem envolver modos de operação simultâneos e/ou sequencias, ocorrer em diferentes tipos de células hepáticas e estar presentes em estágios particulares do processo de regeneração 24.
Além da complexidade e multiplicidade de vias envolvidas no processo de regeneração dentro do próprio órgão, tem se demonstrado também a participação de diferentes tecidos e órgãos, em particular do intestino. O papel da homeostasia dos ácidos biliares tem sido alvo de diversos estudos, implicando de maneira direta o íleo no processo de regeneração. O intestino grosso parece exercer também influência importante sobre o processo de regeneração. Considerando-se as diversas doenças presentes nesses segmentos intestinais que podem evoluir com comprometimento concomitante do fígado, seja por comprometimento neoplásico por metástases, seja comprometimento traumático ou até mesmo inflamatório, cujo tratamento envolve a ressecção combinada de segmentos hepáticos e intestinais; considerando a necessidade do adequado funcionamento do órgão para manutenção da homeostasia do nosso organismo e bem estar dos pacientes; considerando as dificuldades inerentes ao procedimentos de transplante hepático, entendemos ser de fundamental importância o conhecimento das influências do íleo e do cólon sobre o processo de regeneração hepática.
Este estudo tem como objetivo comparar os efeitos da enterectomia parcial do íleo e da colectomia parcial sobre a regeneração hepática, analisando os aspectos morfológicos histopatológicos, bioquímicos relacionados ao dano e recuperação da função hepática, níveis de fatores de crescimento e a relação da massa hepática/massa corporal, contribuindo para uma melhor compreensão desse processo.
2. JUSTIFICATIVA
Alguns animais inferiores como os répteis, estrela do mar, e outros, têm capacidade de regenerar órgãos e membros, função esta que os mamíferos não possuem. O fígado é o único órgão dos mamíferos que é capaz de se regenerar após a perda parcial de sua massa, como no caso da hepatectomia parcial. Dada a complexidade dos mecanismos da regeneração hepática, cada vez mais estudada após o grande avanço da cirurgia e do transplante hepático, e a alta prevalência de situações em que é necessária a ressecção do intestino delgado e intestino grosso, a necessidade de elucidar e melhor compreender os processos e os fatores intercorrentes na regeneração são primordiais.
Já é bem estabelecido na literatura que o mecanismo de regeneração hepática é dependente de vários fatores associados que atuam de forma sequencial e/ou simultâneos como as citocinas e fatores de crescimento, porém ainda existem dúvidas acerca do real papel que a ressecção de vísceras como o cólon e o intestino delgado exercem na regeneração hepática. Este estudo se propõe a avaliar e comparar as interferências do íleo e do cólon sobre o mecanismo de regeneração hepática, ou seja: quais seriam as possíveis influências de uma enterectomia e colectomia na regeneração do fígado após uma hepatectomia em modelo murino? Isso foi quantificado através da estimativa de exames laboratoriais como as enzimas hepáticas e os fatores de crescimento, da quantificação da massa de regeneração hepática e análise histopatológica/imuno-histoquímica.
Pesquisa bibliográfica minuciosa em bases de dados eletrônicas revelou grande escassez de estudos nesta linha de pesquisa: alteração na regeneração hepática após enterectomia ou colectomia simultânea com hepatectomia. Desse modo, o presente estudo experimental justifica-se pela grande frequência com que as duas intervenções cirúrgicas são realizadas simultaneamente. O nosso protocolo experimental teve a intenção de dar contribuição importante para o conhecimento de aspectos ainda não completamente esclarecidos onde existem poucos trabalhos elucidativos na área.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Analisar e comparar as influências do íleo e do cólon na regeneração do fígado após hepatectomia.
3.2. Objetivos específicos
Analisar e comparar as consequências da ressecção do íleo e do cólon na função do fígado remanescente após hepatectomia parcial, através de provas bioquímicas de função hepática com dosagem do ALT, AST, FA e Albumina.
Analisar e comparar as consequências da ressecção do íleo e do cólon na função do fígado remanescente após hepatectomia parcial, sobre os valores dos fatores de crescimento HGF e TGFα
Analisar e comparar se a ausência do íleo ou do cólon interferem na razão massa hepática/massa corporal e no cálculo da regeneração hepática;
Analisar as alterações histopatológicas e marcador de proliferação celular Ki-67 no fígado em regeneração.
4. MÉTODO
Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética no Uso de Animais sob o protocolo de número 054/2010. O cuidado com os animais seguiu padrões da legislação brasileira para o conhecimento científico uso de animais (Lei 11.794 / 2008, CONCEA).
Foram utilizadas 24 ratas Wistar (Rattus norvegicus), com pesos variando entre 194 e 330g, fornecidas pelo Biotério do Centro de Ciências da Saúde da UFRN, e mantidas em gaiolas individuais de polipropileno com ciclos de 12 h claro-escuro, com acesso ad libitum a água e ração para roedores (Presence, Campinas, SP), passando previamente por um período de sete dias para aclimatação no laboratório. Um dia antes das operações os animais foram mantidos em dieta líquida. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos, cada um com 6 ratos: grupo 1, sham; grupo 2, hepatectomia 70%; grupo 3, ressecção do íleo + hepatectomia 70%; grupo 4, colectomia + hepatectomia 70%. Todos os animais receberam antibioticoterapia profilática com Enrofloxacino, numa dose de 0,2 ml (via subcutânea) por animal, e anestesiados com injeção intraperitoneal de cloridrato de Cetamina 70 mg/Kg associado a Xilazina 7mg/Kg. Foram operados sob técnica asséptica após tricotomia abdominal e antissepsia com álcool a 70%. A dor pós-operatória foi controlada com analgesia (Meperidina via subcutânea na dose de 10 mg/Kg, uma dose única diária nos 3 primeiros dias).
Procedimento cirúrgico
Os animais do grupo I, operação sham, foram submetidos à laparotomia mediana (Figura 1) e manipulação delicada do íleo/cólon e do fígado com pinça de dissecção atraumática, sendo a ferida operatória fechada em seguida com sutura contínua com fio de Nylon 4-0. Os animais do grupo II, hepatectomia parcial, foram submetidos à laparotomia mediana com ressecção dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado (Figuras 2, 3 e 4), correspondendo a 70% do tecido hepático, sendo a ferida operatória fechada em seguida com sutura contínua com fio de Nylon 4-0. Os animais do grupo III, ressecção do íleo + hepatectomia 70%, foram submetidos à laparotomia mediana com ressecção dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado, correspondendo a 70% do tecido hepático, seguida da ressecção parcial do íleo distando 1 cm proximal ao ceco, removendo-se 30 cm de íleo. A continuidade intestinal foi restaurada com anastomose término-terminal em plano único em sutura do tipo
pontos separados, usando-se polipropileno 6-0, com auxílio de microscópio cirúrgico DFV (São Paulo, Brasil), aumento 10x, sendo a ferida operatória fechada em seguida com sutura contínua com fio de Nylon 4-0. Os animais do grupo IV, ressecção do cólon + hepatectomia 70%, foram submetidos à laparotomia mediana com ressecção dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado, correspondendo a 70% do tecido hepático, seguida da ressecção completa do ceco e 10,0 cm do cólon proximal (ascendente). A continuidade intestinal foi restaurada com anastomose íleocólica término-terminal em plano único em sutura do tipo pontos separados, usando-se polipropileno 6-0, com auxílio de microscópio cirúrgico DFV (São Paulo, Brasil), aumento 10x, sendo a ferida operatória fechada em seguida com sutura contínua com fio de Nylon 4-0. Todos os animais foram pesados antes do procedimento, logo após a anestesia.
Nas primeiras 24 horas do pós-operatório, os animais receberam apenas água, seguidas por uma dieta sólida até a eutanásia e, no período de observação, foram mantidos em uma sala de controle pós-operatória do Núcleo de Cirurgia Experimental da UFRN. No sexto dia do pós-operatório, os animais foram pesados e submetidos à anestesia com a mesma metodologia acima descrita, com realização de punção cardíaca para coleta de sangue (5 ml) para análises bioquímicas. A eutanásia foi realizada com superdose de anestésico intraperitoneal na dose de 100mg/Kg (Tiopental sódico). O fígado remanescente dos animais dos grupos II, III e IV foi removido, bem como todo o fígado dos animais do grupo I, sendo lavados em solução fisiológica à 0,9%, pesados em balança de precisão. Parte do fígado foi separado para dosagem dos fatores de crescimento e o restante colocado em solução fixadora de formol tamponado à 10%.
Dosagens bioquímicas
Todo o soro do sangue coletado dos animais no sexto dia de pós-operatório foi processado por centrifugação a 3.000 rpm por dez minutos, e armazenado a -40° C até ser dosado. Foram medidos os níveis séricos de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), albumina e fosfatase alcalina (AF) com kits Wiener, Konelab Autoanalyzer, Finlândia.
Análise dos fatores de crescimento
As amostras de fígado foram pesadas e colocadas em 10 volumes (p/vol) de um kit inibidor de protease contendo 10 nmol/L de ácido etilenodiaminotetraacético, 2 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonil, 0,1 mg/mL de inibidor de tripsina de soja, 1,0 mg/mL de albumina de soro bovino, em PBS isotônico pH 7,0. As amostras de fígado foram rompidas com um homogeneizador de tecidos, e os lisados foram incubados a 4° C por 2 horas. As amostras foram manipuladas por 2 ciclos de centrifugação, durante 10 minutos, a 4 ° C. O fator de crescimento para hepatócitos (HGF) e o fator de crescimento transformador-α (TGF-α), foram dosados através de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), usando kits ABCAM (Massachusetts, EUA) e um leitor de microplacas (BioTek, Vermont EUA), seguindo as instruções do fabricante.
Razão massa hepática/massa corporal (RMHMC)
Após o período de observação todos os ratos foram pesados (B) em balança de precisão, o fígado totalmente removido e igualmente pesado (A). Os dados adquiridos foram expressos como percentagem da razão de A (massa hepática) para B (massa corporal), multiplicada por 100, calculada pela fórmula:
𝐑𝐌𝐇𝐌𝐂 =𝐌𝐚𝐬𝐬𝐚 𝐡𝐞𝐩á𝐭𝐢𝐜𝐚
𝐌𝐚𝐬𝐬𝐚 𝐜𝐨𝐫𝐩𝐨𝐫𝐚𝐥𝐱𝟏𝟎𝟎
O parâmetro foi obtido pela aplicação da fórmula nos animais pertencentes ao grupo Sham no momento da eutanásia. Essa razão multiplicada por 100 estabeleceu o percentual que o fígado representa sobre a massa corporal de cada animal.
A fórmula para o cálculo da razão da massa hepática/massa corporal também foi aplicada nos animais dos grupos do experimento após a eutanásia, estabelecendo a percentual de massa hepática real alcançada após o período de regeneração (RMHMC A).
Avaliação da regeneração hepática
O peso total estimado do fígado no pré-operatório para todos os grupos do experimento foi calculado a partir do cálculo da média da razão da massa hepática/massa corporal obtida pela análise do grupo Sham (RMHMCSham).
A RMHMC na eutanásia foi calculada em todos os grupos do experimento utilizando-se a fórmula do cálculo anteriormente apresentada, sendo denominado RMHMC real alcançada (RMHMCA). A RMHMC do grupo Sham serviu como
parâmetro para o cálculo da RMHMC do fígado residual (RMHMCR) no momento do
procedimento cirúrgico da hepatectomia (pós-operatório imediato) para todos os animais do experimento. Considerando que o procedimento cirúrgico da hepatectomia parcial corresponde à remoção de 70% do fígado do cobaio, o valor da RMHMCR
corresponderá a 30% do valor da RMHMC calculada para o grupo Sham. A média do valor da RMHMC do grupo Sham calculado, serviu de parâmetro para estabelecer a RMHMC ideal a ser alcançada, ou seja, regeneração completa da massa hepática, passando a ser denominado RMHMC final projetada (RMHMCP).
Para o cálculo da regeneração hepática (RH) foi utilizado o método proposto por Sasanuma et AL 42. A RH foi definida como o peso do fígado por 100 g de peso
corporal (RMHMC) na eutanásia / peso hepático projetado no pré-operatório por 100 g (RMHMC) de peso corporal × 100. Essa fórmula compara a relação entre a razão massa hepática/massa corporal real alcançada (RMHMCA) e a razão massa
hepática/massa corporal final projetada (RMHMCP), sendo definida como:
𝐑𝐇 =𝐑𝐌𝐇𝐌𝐂𝐀
𝐑𝐌𝐇𝐌𝐂𝐏𝐱𝟏𝟎𝟎 Onde:
RH➔ Percentual de regeneração hepática;
RMHMCA➔ Razão de Massa Hepática/Massa Corporal real alcançada no momento da eutanásia (após o período de observação pós hepatectomia);
RMHMCP➔ Razão de Massa Hepática/Massa Corporal final projetada no momento da eutanásia. Em todos os animais hepatectomizados dos experimentos, a RMHMCP foi igual ao valor da RMHMCSham.
Análise histológica e Imuno-histoquímica
As amostras hepáticas, colhidas no momento do procedimento cirúrgico e do sacrifício (eutanásia), foram fixadas em formol tamponado à 10% durante 48 horas. Após a fixação, o tecido hepático foi seccionado com espessura de 5 mm e recortados com equipamento tipo “punch”, no calibre de 06 mm, para uniformização das amostras, em seguida processados durante 18 horas em processador automático de
tecidos, utilizando-se equipamento Leica TP 1020 (Nussloch, Alemanha). Após inclusão dos fragmentos e confecção dos blocos (Figuras 5, 6, 7, 8, 9 e 10), os cortes histológicos foram obtidos com micrótomo Leica RM 2125 RTS (Nussloch, Alemanha), na espessura de 03 micra, em lâminas previamente silanizadas. As amostras foram coradas pela técnica histoquímica da Hematoxilina/Eosina e submetidas à reação imuno-histoquímica com Ki67 usando kit ABCAM Anti-Ki67 antibody [SP6] - Proliferation Marker ab16667 (Boston, USA). O índice de marcação dos hepatócitos com Ki-67 (Figura 11) foi determinado através da avaliação em seis campos de grande aumento sequenciais, a partir do “hot spot”, cada campo correspondendo à aproximadamente 100 hepatócitos, sendo a positividade expressa como percentual (%). Foram consideradas marcações positivas para o Ki67 os núcleos corados em castanho. Na coloração da Hematoxilina & Eosina (HE) foram contados o total de mitoses inequívocas em hepatócitos, sem limitação do campo, correspondendo à totalidade do fragmento processado, além da avaliação histopatológica de rotina das possíveis alterações associadas à lesão celular como esteatose e degeneração hidrópica. Tanto a contagem de mitoses como a análise imuno-histoquímica foram realizadas em Microscópio ótico, modelo CX41 (Olympus, Tóquio, Japão). As reações imuno-histoquímicas foram realizadas conforme orientação do fabricante.
Análise estatística
O teste ANOVA seguido dos testes de Tukey e Kruskal-Wallis foram usados para comparar os parâmetros entre os grupos. Para todos os testes adotou-se o nível de significância de 5%, utilizando o pacote estatístico SPSS®21, IBM, USA.
Figura 1: Procedimento cirúrgico: Laparotomia exploradora mediana
Figura 3: Ressecção dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado
Figura 4: Peça cirúrgica após a ressecção dos lobos médio e lateral esquerdo do fígado
Figura 5: Inclusão dos fragmentos hepáticos em parafina após processamento.
Figura 6: Inclusão em parafina: posicionamento dos fragmentos nos moldes de metal para confecção dos blocos.
Figura 7: Inclusão dos fragmentos: preenchimento dos moldes com parafina líquida.
Figura 9: Retirada dos blocos de parafina dos moldes após o resfriamento.
5. ARTIGO PUBLICADO
Artigo publicado no periódico Journal of Investigative Surgery (Órgão oficial
da Academy of Surgical Research - USA), doi:
10.1080/08941939.2019.1687793
5.1.
Effect of the Ileum and Colon on Liver Regeneration
Cláudia Nunes OliveiraI, Keyla Borges Ferreira RochaI, Ítalo Medeiros de AzevedoI,
Eryvaldo Sócrates Tabosa do EgitoII, Aldo Cunha MedeirosIII
IFellow PhD degree, Postgraduate Program in Health Sciences, Federal University of
Rio Grande do Norte, Natal-RN, Brazil. Technical procedures, acquisition of data, statistics analysis, critical revision. All these authors had the same participation on the study.
II
Full Professor, Department of Pharmacy, UFRN, Natal-RN, Brazil. CNPq/PQ.1D fellowship. Analysis and interpretation of data, technical procedures, critical revision.
IIIFull Professor, MD, PhD, Chief, Nucleus of Experimental Surgery, Federal University
of Rio Grande do Norte, Natal-RN, Brazil. Conception, design, intellectual and scientific content of the study, critical revision, final approval.
ABSTRACT
Purpose: The colon and ileum play significant roles on liver physiology. Studies about
simultaneous hepatectomy and colectomy or enterectomy are scarce and controversial. We investigated and compared the effects of ileum and colon resection on liver regeneration. Materials and Methods: Twenty four Wistar rats were allocated in group I-(sham), group II-70% hepatectomy; group III-70% hepatectomy+ileal resection, and group IV-70% hepatectomy+partial colectomy. On the sixth day, serum hepatic enzymes, albumin, hepatocyte growth-factor (HGF) and transforming growth factor-alpha (TGF-α) were measured. The hepatic regeneration rate was estimated. Ki-67 immunohistochemical analysis was done in remnant liver. Results: Hepatic enzymes levels were significantly higher in group III rats comparing to the other groups (p<0.001). In group IV, the levels were significantly lower than in groups II and III (p<0.001). Albuminemia was significantly lower in group III rats comparing with the other groups (p<0.001). Albuminemia was not different comparing groups I and IV (p>0.05).
Cytokines HGF and TGF-α levels in group IV were significantly higher than in the other groups (p<0.001). Liver regeneration rate was higher group IV than in groups II and III, and the difference was statistically significant (p=0.002). The hepatocytes expression of Ki-67 was significantly higher in the remnant liver of group IV than in group III (p=0.002). There was no difference in Ki-67 expression between groups II and IV (p>0.05). Conclusion: Ileum and colon resection have different effects on liver regeneration. Colon resection positively influences liver regeneration, while ileum resection negatively influences the regenerative process, in a rat model.
Keywords: Liver; Regeneration; Ileum; Colectomy; Hepatectomy; Rats.
INTRODUCTION
To avoid loss of liver function, living organisms developed an important regenerative response for liver survival and several liver regeneration experimental animal models have been used [1-3]. The loss of functional liver mass results from
several factors, such as hepatic trauma, transplantation and surgical resection. These injuries trigger a regenerative response involving factors controlling cell growth, angiogenesis, and tissue remodeling. These events lead sequentially to hepatocyte proliferation, restoration of functional liver mass, and a return to homeostasis. This process involves the expression of cytokines, highlighting the hepatocyte growth factor (HGF) and the transforming growth factor-α (TGFα). They have been studied as mitogenic factors in animal models of liver regeneration and in cultured hepatocytes. They could activate secondary or delayed gene responses to stimulate DNA synthesis and cell proliferation, contributing to the regenerative process by accelerating the effects of complete mitogens. [1].
Massive small bowel and colon resections, associated with hepatectomy, have been increasingly performed, especially in trauma care [4]. It has been shown that 50% resection of the intestine is associated with a significant reduction in hepatic total mass [5]. Furthermore, the role of the small intestine in regulating the recovery of liver mass after injury has been investigated, suggesting that intestine is the source of humoral factors essential for liver regeneration after partial hepatectomy [6].
The main indication for synchronous resection of colon and liver is hepatic metastases associated with colon cancer [7]. Twenty percent of these patients have been submitted to partial hepatectomy, improving their survival [8]. In cases in which hepatectomy is indicated, there is a need for a significant volume of remnant liver
that can maintain its function. Thus, liver regeneration plays an important role in prognosis of patients after simultaneous colectomy and hepatectomy [9].
In liver regeneration, the liver/body mass ratio is specifically restored after partial liver resection [10]. Several studies have been conducted to investigate the mechanisms that regulate liver regeneration. However, despite important advances in the nature of the signals involved, many aspects remain to be elucidated [1]. The role of the small intestine in liver regeneration has been studied, but the effect of the colon is still poorly understood and controverse [11,12]. Based on these data, the objective of this experimental rat model was to compare the effects of ileum and colon resection on liver regeneration.
MATERIALS AND METHODS
This study was approved by the institutional Ethics Committee on Animal Experimentation under protocol number 054/2010. Animal care complied with the Brazilian legislation for the scientific use and management of animals (Law number 11.794/2008, CONCEA). Twenty-four Wistar rats (Rattus norvegicus) weighing 261±34g were provided by the Health Sciences Center of the Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil. They were kept in individual polypropylene cages with particle and temperature control (22°C), 12-h light-dark cycles, with ad libitum access to water and rat food. The rats had undergone a 7-day acclimation period in the laboratory. The animals received a liquid diet one day before the operations.
The rats were randomized into 4 groups of 6 rats each. All animals were intraperitoneally (i.p.) injected with ketamine hydrochloride (70mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), and operated on using the aseptic technique after abdominal shaving and antisepsis with 70% alcohol. After anesthesia, all animals received a single dose of prophylactic antibiotic (5 mg/kg of enrofloxacin, s.c.). Group I rats (sham) underwent median laparotomy and a delicate manipulation of the ileum, colon and liver with atraumatic forceps, and the surgical wound was then closed with 4-0 nylon suture. Group II (partial 70% hepatectomy) rats underwent resection of the left and middle liver lobes, corresponding to 70% of the hepatic tissue. Group III rats (ileum resection + 70% hepatectomy) were submitted to median laparotomy, 70% hepatectomy and resection of 30 cm of the small intestine from 1 cm proximal to the cecum. Intestinal continuity was restored with end-to-end jejunocolic anastomosis using 6-0 polypropylene suture and a DFV 10x power surgical microscope (São Paulo, Brazil).
In group IV (colectomy+70% hepatectomy) the rats were submitted to 70% hepatectomy and resection of the cecum plus 10 cm of colon, followed by ileocolic anastomosis. Postoperative pain was controlled with a single daily dose of analgesia on the first 3 days (10 mg/kg of meperidine s.c.). The animals were weighed before surgery.
In the first 24 hours after surgery, the animals received only water, followed by solid rodent diet until euthanasia. They were kept in the postoperative control room. On the sixth day, the rats were weighed and anesthetized using the before mentioned technique. Blood was collected for analysis by cardiac puncture (5 ml). Euthanasia involved intraperitoneal injection of sodium thiopental (100mg/kg). The remnant liver of groups II, III and IV rats were removed as well as the whole liver of group I rats. The liver samples were washed in 0.9% saline, weighed on a precision scale and then placed in 10% buffered formalin solution.
Calculation of Hepatic Regeneration
The liver of group I (sham) rats was considered total liver weight in the preoperative period. The remnant liver weight of groups II, III and IV animals was used to calculate the liver regeneration (LR) rate, according to previous study [11]. Breafly, LR was defined as liver weight per 100 g of body weight at euthanasia/preoperative projected liver weight per 100 g of body weight × 100.
Biochemical Analysis
Blood serum from animals on the sixth postoperative day was separated by centrifugation at 3000 g for ten minutes, and stored at -40°C until dosing. Serum levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), albumin and alkaline phosphatase (AF) were measured using Wiener and Konelab Autoanalyzer kits (Finland).
Growth Factors Cytokine analysis
Liver samples were weighed and placed in 10 volumes (wt/vol) of a protease inhibitor kit containing 10 nmol/L ethylenediaminetetraacetic acid, 2 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.1 mg/mL soybean trypsin inhibitor, 1.0mg/mL bovine serum albumin, in isotonic PBS, pH 7.0. The liver samples were disrupted with a tissue homogenizer, and lysates were incubated at 4°C for 2 hours. Samples were manipulated by 2 rounds of centrifugation for 10 minutes at 4°C. Hepatocyte growth
factor (HGF) and transforming growth factor-α (TGF-α) were assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using ABCAM kits (ABCAM, Massachusetts, USA) and a microplate reader (BioTek, Vermont, USA), following the instructions of the manufacturers.
Immunohistochemistry
The liver samples were fixed in 10% buffered formalin for 48 hours. After fixation, they were sectioned to a thickness of 5 mm and cut with punch-type equipment (6 mm in diameter) in order to standardize the samples, then treated for 18 hours in an automatic tissue processor (Leica TP 1020, Germany). The histological sections were obtained with a microtome (Leica RM 2125 RTS, Germany), at a thickness of 3 microns, on previously silanized slides. Samples were submitted to immunohistochemical reaction with Ki67 using Anti-Ki67 antibody [SP6 ab16667] kits (ABCAM, Massachusetts, USA). The sections were counterstained with hematoxylin. The hepatocyte labeling index with Ki-67 was determined by evaluating 100 hepatocytes from the 6 highest positive fields at high power (400x), and the percentage of positive nuclei was expressed as the Ki-67 labeling index. Immunohistochemical analysis was performed in a CX41 optical microscope (Olympus, Tokyo, Japan).
Statistics
The ANOVA test, followed by the Tukey and Kruskal-Wallis tests, were used to compare intergroup parameters. The significance level was set at 5% for all tests, using the SPSS®21 statistical package, IBM, USA.
RESULTS
All animals survived after the experimental model procedures, and no significant intergroup difference was found in the body weight (p>0.05). On the sixth postoperative day, biochemical measurements showed significantly higher levels of ALT, AST and AF in animals submitted to 70% hepatectomy+ileal (group III) resection compared to sham group rats and the 70% hepatectomy+colectomy group (group IV) (p<0.001). Albuminemia was significantly lower in the 70% hepatectomy+ileal resection group rats when compared to the other groups (p<0.001). The highest albuminemia levels occurred in sham (group I) and 70% hepatectomy+colectomy group rats. There was
no significant difference in AST, AF and albumin levels between the sham and 70% hepatectomy+colectomy group rats (p>0.05). These data are summarized in Table 1.
The HGF and TGF-α levels in the 70% hepatectomy+colectomy group rats were significantly higher than in their sham, 70% hepatectomy and 70% hepatectomy+ileal resection counterparts (p<0.001). The HGF and TGF-α levels of the hepatectomy+ileal resection group were significantly lower than in the other hepatectomized groups (p<0.001). Data are summarized in Table 2.
Table 1 Biochemical data and their statistical interpretation.
Variables I Sham II 70% Hepatectomy III 70% Hepatectomy + ileal resection IV 70% Hepatectomy + colectomy p-value ALT (IU/L) 46.6 ± 3.01* 211.5± 19.98* 269.2 ± 25.82* 128.7 ± 5.13* <0.001 AST (IU/L) 50.1 ± 2.17* 69.4 ± 2.92*† 80.7 ± 2.90*† 49.1 ± 2.05† <0.001 AF (IU/L) 154.6 ± 15.34* 214.42± 13.34*† 290.7 ± 11.63*,† 161.5 ± 6.14† <0.001 Albumin (g/L) 4.7 ± 0.48* 3.6 ± 0.31* 2.7 ± 0.30*† 4.1 ± 0.26† <0.001 AST - Aspartate aminotransferase; ALT - Alanine aminotransferase; AF - Alkaline phosphatase.
Mean ± standard deviation
P-value of analysis of variance (ANOVA).
Values on the same line followed by equal symbols represent statistically significant differences (Tukey’s test)
Table 2 Growth factor values and their statistical interpretation. Growth factors I Sham II 70% Hepatectomy III 70% Hepatectomy + ileal resection IV 70% Hepatectomy + colectomy p-value HGF (pg/mL) 282.9 ± 13.3* 357.0 ± 29.64* 248.87 ± 10.78* 408.2 ± 18.24* <0.001 TGF-α (ng/mL) 0.9 ± 0.13* 2.43 ± 0.43* 1.68 ± 0.53* 3.8 ± 0.35* <0.001 HGF, Hepatocyte growth factor; TGF-α, Transforming growth factor-α.
Mean ± standard deviation
P-value of analysis of variance (ANOVA).
Concerning the liver regeneration rate (RR), the 70% hepatectomy+colectomy group had RR higher than in the 70% hepatectomy and the 70% hepatectomy+ileal resection groups, and the difference was significant (p=0.002). Data are summarized in Table 3.
Table 3 Liver regeneration rate on the sixth postoperative day.
II 70% Hepatectomy III 70% Hepatectomy + ileal resection IV 70% Hepatectomy + colectomy p-value Regeneration rate (%) 20.72 ± 11.83 23.56 ± 11.54 36.68 ± 8.79 0.002 Mean ± standard deviation.
P-value of analysis of variance (ANOVA).
Table 4 Quantitative analysis determined by immunohistochemical staining of
hepatocytes for the Ki-67 labeling index (%). I Sham II 70% Hepatectomy III 70% Hepatectomy + ileal resection IV Hepatectomy 70% + colectomy p-value Ki-67 1.0 ± 0.0* 6.7 ± 1.88* 4.8 ± 1.72* 8.7 ± 3.12* 0.002
Mean ± standard deviation. P-value, Kruskal-Wallis test.
Values on the same line followed by equal symbol represent statistically significant differences.
The liver expression of the Ki-67 immunohistochemical marker was significantly higher in the remnant liver of group IV rats than in groups II and III (p = 0.002). These data are summarized in table 4. Figure 1 illustrates Ki-67 expression in each group.
Figure 1 Hepatocyte proliferation was determined by immunohistochemical staining for Ki-67 and
quantitative analysis of Ki-67 labeling was performed. A = sham group; B = 70% hepatectomy + ileal resection; C = 70% Hepatectomy; D = 70% Hepatectomy + colectomy. A 200 μm bar is shown.
DISCUSSION
Analysis of the biochemical parameters revealed that cecocolic resection in the hepatectomized rats resulted in a significantly improved response than in those submitted only to hepatectomy. The opposite occurred in the absence of ileum in hepatectomized rats. In these animals, liver function was compromised by elevated levels of ALT, AST and AF, with albumin levels significantly lower than in the other groups. These results indicate significant injury to the liver parenchyma on the sixth postoperative day, possibly associated with damage caused by ileal resection.
Ileal resection likely altered bile acid homeostasis, which was important for liver regeneration, in the 70% hepatectomy + ileal resection group. Zhang et al (2013) demonstrated that farnesoid X receptor (FXR) expressed in the liver and intestine activates the expression of fibroblast growth factor 15 (FGF15) in the ileum [13]. This contributes to suppressing CYP7a1 transcription, decreasing bile acid synthesis, and enhancing liver regeneration. It has been demonstrated that FGF15 released from the ileum has important effects on the enterohepatic cycle [14]. In addition to controlling
A B
bile acid synthesis, FXR stimulation activates pro-mitogenic mechanisms [15]. In the present study, we used ileal resection as a possible factor influencing liver regeneration, based on these mechanisms and other regulatory molecular factors of the enterohepatic cycle [16]. Qiu et al (2009) reported a change in functional liver mass, autophagy and apoptosis after small bowel resection in mice [12]. In our laboratory we have evaluated functional liver mass, using aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, gamaglutamiltransferase and biodistribution of pertechnetate labeled phytate (99m-Tc-phytate), a radiocolloid used to validate the assessment of liver function in postoperative period of ileal resection in an animal model. We observed a significant reduction of functional liver capacity in rats subjected to 50 cm ileum resection [17].
The present study involved major surgery, mainly in rats submitted to 70% hepatectomy and enterocolic resection. No infections or deaths occurred, likely due to the training and extensive rodents digestive tract surgery experience of the team and the use of prophylactic antibiotic. All animals were operated on by the same researcher (ACM). Cecocolic resection had a positive effect on liver regeneration, corroborating the results of Sasanuma et al (2009) [11], who performed hepatectomy plus a minimal 1 cm colon resection. Hachiya et al (2008) reported that ileocecal resection reduced the hepatic DNA synthesis rate on day 1 posthepatectomy. However, it should be noted that they included ileal resection in their experimental model [18]. It has been reported that total colectomy induces the conversion of an intact quiescent liver to a state of replicative competence [18].
The significantly higher levels of the multifunctional cytokines HGF and TGF-α in the 70% hepatectomy + colectomy group rats, compared to the other groups, may have stimulated hepatocyte proliferation, since both are considered complete mitogens exhibiting direct hepatotrophic effects. Cytokines are produced by Kupffer cells, including tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (Il-6), HGF and TGF-α, among others [19]. Once activated in the hepatocytes, the receptors of these cytokines activate genes that encode transcription factors such as AP-1, STAT-3 and NF-kB, which stimulate the expression of receptors for specific growth factors, allowing them to recognize and respond to signaling growth factors such as HGF and TGF-α [20,21]. It is not yet known whether the colon plays a role in the regulation and/or expression of such cytokines. We observed lower HGF and TGF-α levels in the 70% hepatectomy + ileal resection group rats, when compared to groups II and IV. Because HGF is derived from hepatic stroma, with its release stimulated by hepatic damage from matrix
remodeling, HGF levels were expected to be elevated in hepatectomized animals, as observed in the 70% hepatectomy group. When the cecocolic resection was added, HGF levels were significantly higher than in the other groups.
The hepatic regeneration rate, based on the whole liver weight of the sham animals and on the remnant liver weight of hepatectomized animals, is based on an earlier study [11]. In the present study, the liver regeneration rate in rats submitted to hepatectomy 70% + colectomy (group IV) was significanty higher than in the hepatectomy (group II) and hepatectomy + ileal resection (group III) groups (p=0.002).
To examine liver proliferative activity after ileal and colon resections, immunohistochemical staining for the proliferation indicator Ki-67 was performed. This antigen is expressed during all phases of the cell cycle. Ki-67 has important roles in both interphase and mitotic cells, and its cellular distribution changes during cell cycle progression [21,22]. Ki-67 expression was significantly higher in the remnant liver of the rats submitted to 70% hepatectomy + colectomy, compared to the 70% hepatectomy + ileal resection group and group II rats (70% hepatectomy). In conclusion, these results demonstrate that the ileum and colon exert distinct effects on the liver regeneration. Colectomy promoted liver regeneration, while ileum resection negatively influenced the regenerative process. Our findings may have clinical implications and further studies are needed to confirm them.
REFERENCES
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