i
UFRRJ
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
TESE
Produção de Anticorpos IgY de Galinhas e IgG de
Coelhos para Análise de Auxina e Citocininas
.
Cleiton Mateus Sousa
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS IgY DE
GALINHAS E IgG DE COELHOS PARA
ANÁLISE DE AUXINA E CITOCININAS
.
Cleiton Mateus Sousa
Sob a Orientação do Professor
Ricardo Motta Miranda
E Co-orientação do Professor
Ronald Bastos Freire
Tese
submetida
como
requisito
parcial
para
obtenção do grau de Doutor
em Fitotecnia.
Seropédica, RJ
Julho de 2008
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
CLEITON MATEUS SOUSA
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, no Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia.
TESE APROVADA EM 25 de Julho de 2008.
Ricardo Motta Miranda, PhD, UFRRJ (Orientador)
Leonardo Oliveira Medici, DSc, UFRRJ
Marco Antonio Stephano, DSc, USP
Lázaro Eustáquio Pereira Peres, PhD, ESALQ-USP
iv A Valdivino Mateus e Aparecida Helena
v
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me concedido a vida;
Ao professor Ricardo Motta Miranda, o qual fez papel de pai, amigo e orientador durante o período de permanência na Rural. Agradeço pela confiança, incentivo e a oportunidade de ingressar no meio acadêmico sob a sua orientação desde o primeiro período da graduação;
Ao professor Ronald Bastos Freire pela amizade, motivação e orientação. Sempre transmitindo mensagens positivas, de motivação e jamais mediu esforços para superar todos os obstáculos que surgiram durante o decorrer do trabalho;
Ao Instituto de Zootecnia da UFRuralRJ pela doação de animais (coelhos e galinhas) utilizados na obtenção dos anticorpos;
A EMBRAPA-Agrobiologia pelo empréstimo de materiais, reagentes e equipamentos utilizados na purificação de anticorpos e determinação de densidade ótica de amostras.
A FAPERJ pelo financiamento parcial do projeto através da concessão de duas bolsas na categoria Cientista do Nosso Estado;
A CAPES pelo financiamento parcial do projeto através da concessão de uma bolsa do programa PRODOC e 21 meses de bolsa de doutorado;
A Dra. Flávia Venâncio pelo empenho no ajuste de metodologias e amizade;
Aos professores e funcionários do Departamento de Fitotecnia;
A todos os professores que contribuíram na minha formação;
Aos colegas da Escola Agrotécnica Federal de Ceres, GO;
A equipe do Laboratório de Imunologia, Aline, Kelly, Thiago, Rodrigo, Deise, Felipe, pela amizade e colaboração na execução deste trabalho;
vi A equipe do LCTV-DFITO-IA, José Fausto, Fábio, Erich, Murilo, Léo, pelo convívio e colaboração nas atividades no laboratório;
Aos colegas do Curso, Ariane, Arison, Madelon, Mariluci, Mariella, Edilson, Zé Dias pela amizade e auxílios;
Aos amigos Deusimar, Márcio Emanoel, Raphael, Bárbara, José Henrique, Cida, Júnior, Gilma, Kaká, Nádia, Luis, Beto e Vitor pela amizade e companheirismo nos momentos em que passamos juntos;
Aos membros da banca examinadora que contribuíram na elaboração final da tese;
Por fim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram na realização deste trabalho.
vii
BIOGRAFIA
Cleiton Mateus Sousa, filho de Valdivino Mateus de Sousa e Aparecida Helena Mateus, nasceu no primeiro dia do mês de agosto de 1981 na cidade de Rubiataba - GO.
Em 1996 ingressou no curso técnico em Agropecuária da Escola Agrotécnica Federal de Ceres, GO, concluindo em 1998. Ingressou na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro em Março de 1999 e, em Maio de 2003, graduou-se em Licenciatura em Ciências Agrícolas. Neste período, foi estagiário e bolsista de Iniciação Científica (PIBIC-CNPq) no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, sob a orientação do Prof. Ricardo Motta Miranda, e desenvolveu trabalhos científicos direcionados com a regeneração e multiplicação de plantas in vitro.
Ingressou no Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia, ao nível de Mestrado, em 2003, na mesma Universidade e defendeu a dissertação na área de Cultura de Tecidos Vegetais, intitulada “Otimização de protocolos para a propagação in vitro de gérbera (Gerbera
jamesonii)”, em janeiro de 2005.
Em março do mesmo ano ingressou no mesmo curso, em nível de Doutorado, também sob a orientação do prof. Dr. Ricardo Motta Miranda e co-orientação do prof. Dr. Ronald Bastos Freire. Em 2006 foi aprovado em concurso para professor na Escola Agrotécnica Federal de Ceres, GO. Desenvolveu Tese visando a produção de anticorpos policlonais contra moléculas de hormônios vegetais, para uso na detecção e quantificação de auxina e citocininas em tecidos vegetais.
viii
RESUMO GERAL
SOUSA, Cleiton Mateus. Produção de anticorpos IgY de galinhas e IgG de coelhos para
análise de auxina e citocininas. Seropédica: UFRRJ, 2008. 61 p. (Tese, Doutorado em
Fitotecnia). Instituto de Agronomia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
A determinação do nível hormonal endógeno pode ser uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento vegetal. Atualmente, fica limitada devido a complexidade das metodologias adotadas, uma vez que demandam equipamentos e reagentes de alto custo e ainda apresentam baixo rendimento. Por outro lado, os ensaios imunoenzimáticos possuem algumas vantagens que superam essas limitações, demonstrando um potencial de uso prático na dosagem de hormônios vegetais. Entre os ensaios imunoenzimáticos, destaca-se o teste Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), o qual vem sendo utilizado na detecção de moléculas com baixo peso molecular. No entanto, o teste ELISA exige anticorpos específicos e que sejam capazes de reconhecer as moléculas de interesse, no caso os hormônios vegetais. Hoje no mercado não há anticorpos disponíveis para a determinação das moléculas hormonais. Diante disso, propôs-se produzir e caracterizar anticorpos contra moléculas de AIA, 2ip e zeatina e posteriormente, usá-los na detecção dessas moléculas. Para isso, as moléculas hormonais foram conjugadas com proteína (BSA) para posterior imunização de galinhas poedeiras ou coelhos. A partir do soro de coelhos ou de gemas de ovos de galinhas os anticorpos foram purificados e caracterizados através do teste de imunodifusão, SDS-PAGE e teste ELISA. Os anticorpos que apresentaram melhores resultados foram utilizados na detecção de moléculas hormonais em amostras de tecidos de plântulas mantidas in vitro. O teste de imunodifusão revelou que os anticorpos obtidos foram capazes de detectarem a molécula em estudo. Através do SDS-PAGE verificou-se que os anticorpos obtidos em gemas de ovos de galinhas apresentaram maior pureza que os obtidos em coelhos, sugerindo que os mesmos possuem maior potencial de uso prático. A partir dos resultados do teste ELISA, observou-se que os anticorpos contra AIA não apresentaram potencial de uso prático na determinação dessa molécula em amostras vegetais. Sendo assim, a detecção de moléculas hormonais em amostras de tecidos vegetais ficou restrita a 2ip e a zeatina. A detecção dessas duas moléculas em extrato bruto, obtidos a partir de plântulas de gérbera mantidas in vitro, revelou que o nível endógeno de zeatina foi superior ao nível de 2ip. Plântulas com seis semanas após a repicagem apresentaram maior nível de zeatina do que plântulas recém repicadas, enquanto para o 2ip, essa diferença não foi evidente. O uso de anticorpos obtidos em gemas de ovos de galinhas permitiu a detecção e quantificação de zeatina e 2ip em amostras vegetais utilizando o teste ELISA.
Palavras chaves: produção de anticorpos, ELISA, determinação hormônios vegetais, gérbera
ix
ABSTRACT
SOUSA, Cleiton Mateus. Production of antibodies IgY from chicken and IgG from
rabbits for analysis of auxin and cytokinins. Seropédica: UFRRJ, 2008. 61 p. (Thesis,
Doctorate in Plant Science). Instituto de Agronomia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
The determination of plant hormones can be an excellent tool for to study the plant development. Today, the complexity of methods, equipment and reagents of high cost limit the use with practice of routine. Some advantages of methods immunoassay can exceed those limitations, showing a potential of practical use in determination of plant hormones. The test Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) is utilized in detection of molecules with low molecular weight. However, the ELISA requires specific antibodies against molecules of interest, in the case, plant hormones. Today in the market there is not available antibodies for the determination of hormonal molecules. Faced with that, proposed be produced and characterize antibodies against molecules of AIA, 2ip and zeatin and subsequently, for use the detection those molecules. For that, the hormonal molecules were conjugated with protein (BSA) for subsequent immunization of chicken or rabbits. From the serum of rabbits or yolks eggs the antibodies were purified and characterized through the test of precipitation of double diffusion, SDS-PAGE and test ELISA. The antibodies that presented better results were utilized in detection of plant hormones molecules in samples of plantlets in vitro of gerbera. The test of precipitation of double diffusion revealed that the antibodies productized were capable of will detect the molecule in study. Through in the SDS-PAGE was verified that the antibodies obtained in eggs yolks of chicken presented superior purity than them obtained in serum of rabbits. From the results of the test ELISA, observed itself that the antibodies against AIA did not present potential of practical use. The detection of plant hormones in samples of tissue stayed restricted to 2ip and zeatin. The detection of those two molecules in crude extract, obtained from plantlets in vitro of gerbera, revealed that the level endogenous of zeatin was higher of level 2ip. Plantlets with six weeks after multiplication presented higher level of zeatin than plantlets with one week after multiplication. For the 2ip, that difference was not evident. The use of antibodies obtained in eggs yolks of chicken permitted the determination of zeatin and 2ip in samples plant utilizing the test ELISA.
Key words: production of antibodies, ELISA, determination of plant hormones, gerbera in
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Comportamento da produção de anticorpos após a imunização dos animais.
Fonte: Carlos Sinogas – material didático. 12
Figura 2. Diálise de conjugado contra água destilada à 4 ºC com duas trocas diárias
durante 72 horas. 15
Figura 3. Coelho mantido no biotério para a imunização e obtenção de anticorpos
contra hormônios vegetais. 18
Figura 4. Galinhas mantidas em gaiolas para a imunização e obtenção de anticorpos contra hormônios vegetais.
19
Figura 5. Preparo de emulsão do conjugado com o adjuvante de Freund para inoculação
dos animais. 19
Figura 6. Inoculação intradérmica do antígeno, em coelho, pelo método dos múltiplos
sítios. 20
Figura 7. Imunização de galinhas com inoculação do conjugado com adjuvante
completo de Freund no músculo peitoral. 21
Figura 8. Obtenção do soro a partir da amostra de sangue coletada na veia marginal da
orelha do coelho. 21
Figura 9. Teste de imunodifusão em gel de agarose. Soro – 1; Conjugado inoculado (AIA-BSA) – 2; Conjugado de captura (AIA-OVA) - 3; Outro conjugado de captura – 4 (AIA-KLH); Carreador usado no inóculo (BSA) – 5; Carreador de captura (OVA) – 6 e hapteno (AIA) – 7.
23
Figura 10. Valores de absorbância das soluções de AIA, BSA e conjugado AIA-BSA. 25
Figura 11. Valores de absorbância das soluções de AIA, OVA e do conjugado AIA-OVA.
26
Figura 12. Valores de absorbância das soluções de AIA KLH e do conjugado AIA-KLH.
26
Figura 13. Valores de absorbância das soluções de 2ip, BSA e do conjugado 2ip-BSA. 27
Figura 14. Resposta alérgica dos coelhos após a inoculação do conjugado AIA-BSA. 27
xi Figura 16. Revelação do teste de imunodifusão utilizando soro obtido em coelho e
vários conjugados ou haptenos. Soro – 1; Conjugado inoculado (AIA-BSA) – 2; Conjugado de captura (AIA-OVA) - 3; Outro conjugado de captura – 4 (AIA-KLH); Carreador usado no inoculo (BSA) – 5; Carreador de captura (OVA) – 6 e hapteno (AIA) – 7.
28
Figura 17. Solução de gemas diluídas com água ácida (esquerda) ou água gelada
(direita). 29
Figura 18. Precipitação das IgY’s após 45 minutos do preparo. Esquerda água ácida e a direita com água gelada (4°C).
30
Figura 19. Comparação da precipitação de IgY’s após 12 horas da diluição. A esquerda o método utilizando água gelada (4°C) e a direita o método utilizando água ácida.
30
Figura 20. Dificuldade na precipitação de IgY’s contra AIA com os métodos utilizando
água ácida ou Sulfato de Amônia. 31
Figura 21. SDS-PAGE dos anticorpos anti-hormônios purificados de soro de coelho e de gema de ovos de galinhas, evidenciando a cadeia pesada (Fc) e a cadeia leve (Fab) do anticorpo. 1 e 4- IgG anti-AIA e anti-2ip respectivamente, 2 e 3 - IgY anti-AIA e 5 – IgY anti-2ip.
32
Figura 22. SDS-PAGE dos anticorpos obtidos a partir de gemas de ovos de galinhas, evidenciando a cadeia pesada (Fc) e a cadeia leve (Fab) do anticorpo. 32
Figura 23. Revelação da placa de ELISA na titulação do conjugado AIA-OVA e
anti-AIA. 33
Figura 24. Absorbância de IgG anti-AIA, em diferentes diluições, obtidas após os diversos reforços.
34
Figura 25. Absorbância de IgY anti-AIA, em diferentes diluições, obtidas após os diversos reforços.
35
Figura 26. Revelação da placa de ELISA na titulação do conjugado zeatina-OVA e anti-zeatina.
35
Figura 27. Revelação da placa de ELISA na titulação do conjugado 2ip-OVA com anti-2ip.
36
Figura 28. Absorbância de IgY anti-2ip, em diferentes diluições, obtidas após os diversos reforços.
36
xii diversos reforços.
Figura 30. Absorbância de IgY anti-2ip, em diferentes diluições, obtidas após os diversos reforços.
37
Figura 31. Absorbância de IgG anti-2ip, em diferentes diluições, obtidas após os diversos reforços.
38
Figura 32. Absorbância de IgY anti- zeatina, em diferentes diluições, obtidas após os diversos reforços.
38
Figura 33. Comparação dos anticorpos anti-AIA obtidos em coelhos (IgG) e galinhas (IgY) após o primeiro reforço.
39
Figura 34. Comparação dos anticorpos anti-2ip obtidos em coelhos (IgG) e galinhas (IgY) após o primeiro reforço.
40
Figura 35. Curva padrão do 2ip. 41
Figura 36. Determinação do indicie de competição do 2ip através de ELISA de competição.
42
Figura 37. Determinação do IC50 de zeatina, na faixa de 0-50 nanomoles, através de ELISA de competição.
43
Figura 38. Determinação do IC50 do AIA através de ELISA de competição. 43
Figura 39. Esquema dos procedimentos adotados na obtenção do extrato vegetal. 51
Figura 40. Ilustração das etapas do teste ELISA realizado. 52
Figura 41. Nível endógeno de zeatina e 2ip determinados através de ELISA, em plântulas de gérbera recém repicadas (início) e com seis semanas in vitro (fim), cultivadas em meio Murashige & Skoog (1962) adicionado de 1 mg L -1 de BAP.
53
ABREVEATURAS
ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay AIA - Ácido Indolacético
xiii 2ip – 2-isopenteniladenina
BSA – Soro Albumina Bovina OVA - Ovalbumina
KLH - Hemocianina
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de Poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio IgY – anticorpos obtidos a partir de gemas de ovos de galinhas
IgG - anticorpos obtidos a partir de soro de mamíferos
IC50 – Concentração do composto que inibe 50% da ação biológica dos anticorpos HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
pH – Potencial de Hidrogênio GA3 – Ácido giberélico
PBS – Tampão Fosfato-Salino
EDPC – Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida NaOH – Hidróxido de Sódio
TBE - Tampão Tris (solução contendo uma mistura de base T, Ácido Bórico e EDTA). NaCl -Cloreto de Sódio
HCl – Ácido Clorídrico Fc- Cadeia pesada do anticorpo Fab – Cadeia leve do anticorpo
MS – Meio de Cultura Murashige & Skoog BAP - 6-benzilaminopurina SÍMBOLOS SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ... 1 AIA Zeatina 2ip
14
2. OBTENÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS CONTRA MOLÉCULAS DE
AUXINA E CITOCININAS. ... 4
2.1 INTRODUÇÃO ... 6
2.1.2. Anticorpos ... 7
2.1.3. Produção de anticorpos ... 8
2.1.4 Obtenção de conjugados de haptenos com carreadores ... 10
2.1.5 Imunização ... 11
2.1.6 Extração e purificação ... 13
2.2 MATERIAL E MÉTODOS ... 15
2.2.1 Conjugação das moléculas hormonais (haptenos) com proteínas (carreadores) ... 15
2.2.1.1 Conjugação de AIA-BSA com Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida (EDPC) ... 15
2.2.1.2 Conjugação de AIA-OVA com Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida (EDPC) ... 16
2.2.1.3 Conjugação de AIA-KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin - hemocianina) com Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida (EDPC) ... 16
2.2.1.4 Produção de conjugados de citocininas ... 17
2.2.2 Produção e caracterização de anticorpos ... 18
2.2.3 Preparo da emulsão para inoculação ... 19
2.2.4 Imunização de coelhos ... 20
2.2.5 Imunização de aves ... 20
2.2.6 Coleta de sangue em coelhos e em galinhas ... 21
2.2.7 Sangria e preparação do soro ... 21
2.2.8 Purificação de IgG ... 22
2.2.9 Isolamento e purificação de IgY ... 22
2.2.10 Teste de sensibilidade (imunodifusão) ... 23
2.2.11 Caracterização de anticorpos por SDS-PAGE ... 23
2.2.12 Caracterização dos anticorpos com ELISA ... 24
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 25
2.3.1 Imunização dos coelhos e das galinhas ... 27
2.3.2 Purificação de IgG ... 28
2.3.3 Teste de sensibilidade (imunodifusão) ... 28
2.3.4 Isolamento e purificação de IgY ... 29
2.3.5 Caracterização de anticorpos por SDS-PAGE ... 31
2.3.6 Caracterização dos anticorpos com ELISA ... 33
2.4 CONCLUSÕES ... 44
3 USO DE ELISA E ANTICORPOS POLICLONAIS DO TIPO IGY NA DETECÇÃO DE CITOCININAS EM PLÂNTULAS DE GÉRBERA. ... 46
3.1 INTRODUÇÃO ... 48
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ... 51
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 53
3.4 CONCLUSÕES ... 55
15
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
O desenvolvimento vegetal é influenciado por diversos fatores, dentre os quais, destaca-se o balanço hormonal, pois regula todas as fases do desenvolvimento de uma planta. Atualmente predominam cinco classes de fitorreguladores, sendo cada uma delas responsável pela indução, ou controle, de respostas fisiológicas específicas em plantas (KENDE & ZEEVAART, 1997). Por conta disso, o uso de fitorreguladores em cultura de tecidos de plantas tornou-se rotina para controlar as diversas respostas organogênicas.
Para induzir a diferenciação de raízes adventícias utilizam-se balanços exógenos de fitorreguladores favoráveis às auxinas e para induzir a formação da parte aérea utilizam-se balanços favoráveis às citocininas (SKOOG & MILLER, 1957). Entretanto, essas tendências de resposta podem variar de acordo com o material genético, com as condições ambientais, ou mesmo com a época do ano em que se obtêm os propágulos destinados aos cultivos in vitro. Isso, provavelmente, ocorre em função do balanço hormonal endógeno presente no momento do estabelecimento das culturas in vitro. A dosagem do teor endógeno de hormônios tem sido, portanto, motivo para o desenvolvimento de protocolos direcionados aos processos organogênicos, uma vez que, o balanço hormonal é de extrema importância e, na maioria das vezes, não é considerado devido a elevada complexidade das metodologias adotadas na determinação dos teores de auxina e citocininas.
PITELLI (2006) destacou que a dosagem de hormônios vegetais “integra as principais abordagens para o entendimento do papel do balanço hormonal no crescimento e desenvolvimento das plantas”. Portanto, torna-se necessário o desenvolvimento de novas metodologias para a dosagem de hormônios vegetais, atualmente limitadas ao uso de tecnologias que dependem de mão de obra especializada e de reagentes e equipamentos onerosos. Nas metodologias adotadas predominam-se a separação das moléculas em cromatografia líquida, marcação radioativa e a detecção dos hormônios com o uso de anticorpos. Dentre estes métodos, os ensaios imunoenzimáticos (ELISA) têm sido considerados como sendo os mais promissores e de fácil aplicação. Por outro lado, o uso depende da produção de anticorpos com alta especificidade às moléculas hormonais. Até o presente, tais anticorpos são exclusivamente produzidos na Europa e Estados Unidos da América, representando uma tecnologia cara, a despeito da simplicidade de sua utilização.
Segundo VOLLER et. al. (1978), o ELISA é um método que permite detectar ou quantificar moléculas com baixo peso molecular, e atualmente vem sendo utilizado para detectar microorganismos (POUSSIN et al. 1997; YUKI et al., 2000; KOZLOVA et al., 2001; MOURA et al., 2001; YORINORI et al., 2003; FAJARDO et al., 2003; RADAELLI et al., 2006) e várias moléculas com baixo peso molecular (MAZZAFERA & VITÓRIA, 1998; SHIMOI et al. 2002;
YAKOVLEVA et al. 2003;
MAKROVA et al. 2003; CANTO-CANCHÉ et al., 2005; HINTEMANN et al. 2006; CHEN et al. 2008; ZHU et al., 2008). Sendo assim, a partir do potencial a ser adotado na quantificação de hormônios vegetais, esse método torna-se bastante promissor, uma vez que apresenta algumas vantagens quando se compara com outras metodologias utilizadas na quantificação de hormônios vegetais, como a redução de custos, rapidez e facilidade de manuseio. Acrescenta-se a isto, o fato de que, o grau de precisão e a viabilidade do ELISA dependem de variáveis exógenas, de especificidade e sensibilidade dos anticorpos utilizados, que são facilmente ajustáveis (MALDINEY et al., 1986).Na quantificação de moléculas de auxina e de citocininas com o teste ELISA é necessário o uso de anticorpos que sejam capazes de reconhecer essas moléculas. No entanto, não existem anticorpos comercializados para todas as moléculas hormonais. Além disso, os
2 anticorpos disponíveis apresentam custos elevados, ocasionando uma limitação na aplicação do ELISA com esta finalidade. Por conta disso, torna-se essencial o desenvolvimento de metodologias para obtenção de anticorpos contra moléculas hormonais de modo a viabilizar a utilização independente do ELISA nas práticas rotineiras que envolvam a determinação dos níveis endógenos de auxina e citocininas.
A maior limitação na produção de anticorpos contra hormônios vegetais está vinculada às características moleculares de tais hormônios, os quais são genericamente denominados de haptenos, assim como as demais moléculas que não são capazes de provocar a produção de anticorpos. Tais moléculas são consideradas antígenos incompletos, isto é, não são capazes de induzir a formação de anticorpos isoladamente, mas são passíveis de interagir com anticorpos anti-haptênicos. Os organismos superiores somente geram anticorpos a partir da estimulação por antígenos completos, tais como quando estes hormônios de baixo peso molecular encontram-se conjugados com moléculas carreadoras de maior complexidade estrutural (KABAT, 1968).
Na quantificação de moléculas com baixo peso molecular SHIMOI et al. (2002), determinaram as concentrações de um hapteno excretado na urina de seres humanos que estava associado com algumas doenças, como câncer e diabete, em ELISA e em HPLC. Os autores concluíram que os resultados obtidos no teste ELISA apresentaram boa correlação com os dados obtidos em HPLC, e ainda sugeriram que o teste ELISA pode ser adotado na determinação de moléculas haptênicas em urina sem nenhum tratamento prévio. Esses resultados sugerem ser possível determinar moléculas com baixo peso molecular em amostras brutas somente com o teste ELISA, dispensando a separação das moléculas em HPLC o que reduz o tempo e os custos dessas análises.
MIKROVA et al. (2003), similarmente, determinaram a presença de resíduos de inseticidas utilizando ELISA, cromatografia líquida ou gasosa. Os resultados indicaram que o ELISA pode ser utilizado como um método conveniente, confiável e rápido para determinar resíduos de carbofuran em alimentos, mesmo utilizando amostras brutas.
Deste modo, o teste ELISA apresenta potencial de uso na detecção e determinação de moléculas com baixo peso molecular, sendo uma ferramenta bastante promissora para a dosagem de hormônios vegetais. Sua aplicação pode simplificar as dosagens de hormônios vegetais endógenos, as quais podem ser realizadas sem a prévia fragmentação das amostras vegetais em HPLC.
Esta tese foi realizada com a intenção de produzir, purificar e caracterizar anticorpos contra o Ácido Indolacético (AIA), Zeatina (Z) e 2-Isopenteniladenina (2ip). Para tanto, foram feitos estudos comparativos nos quais aves e mamíferos foram utilizados como fontes geradoras de anticorpos anti-haptênicos com especificidades e sensibilidades distintas. Do mesmo modo, definiu-se um protocolo para a aplicação do método de ELISA para a detecção e quantificação de moléculas de auxina e citocininas.
3
4
2. OBTENÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS CONTRA MOLÉCULAS DE AUXINA E CITOCININAS.
RESUMO
Os hormônios vegetais são moléculas orgânicas, com baixo peso molecular que interferem no crescimento e no desenvolvimento das plantas. Apesar da aplicação de fitorreguladores em tecidos vegetais, para estimular ou inibir respostas fisiológicas, o que desencadeia os eventos fisiológicos é o balanço hormonal endógeno nos tecidos. Esse fato nem sempre é considerado, uma vez que as metodologias que predominam na sua determinação apresentam limitações técnicas e econômicas, inviabilizando a sua aplicação como prática de rotina. O teste ELISA, por sua vez, permite a detecção de moléculas com baixo peso molecular, sendo, portanto, limitado unicamente pela obtenção de anticorpos com alta especificidade e sensibilidade às moléculas de interesse. Nesse estudo, propôs-se definir metodologias para a obtenção de anticorpos anti-AIA, anti-zeatina e anti-2ip em coelhos ou em galinhas. Para induzir a resposta imunológica nos animais, os hormônios vegetais foram conjugados com proteínas, BSA ou OVA. Após a imunização, a cada semana, foram coletadas amostras de sangue nos coelhos ou ovos das galinhas e, posteriormente, através do teste de imunodifusão dupla, avaliou-se a capacidade dos anticorpos a reconhecerem as moléculas dos hormônios quando conjugados às proteínas carreadoras. Além do teste de imunodifusão dupla, os anticorpos foram caracterizados quanto à pureza através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e quanto à sensibilidade e especificidade pelo teste ELISA. Os anticorpos obtidos, tanto em coelhos quanto em galinhas, foram capazes de reconhecerem as moléculas hormonais. O teste SDS-PAGE, entretanto, evidenciou que os anticorpos obtidos em coelhos apresentaram grande quantidade de proteínas interferentes capazes de diminuírem sua sensibilidade. Por outro lado, os anticorpos obtidos em gemas de ovos de galinhas apresentaram excelente grau de pureza, sugerindo o potencial de uso bem sucedido na dosagem de hormônios vegetais. O teste ELISA indicou que os anticorpos obtidos contra a zeatina e o 2ip podem ser utilizados na detecção desses hormônios. A produção de anticorpos contra moléculas hormonais foi possível tanto em coelhos quanto em galinhas. A qualidade do anticorpo depende da molécula hormonal de interesse assim como do animal utilizado na sua obtenção. Os resultados obtidos indicaram que a obtenção de anticorpos contra moléculas hormonais consiste em uma ferramenta bastante promissora para ser adotada como uma metodologia simples, com baixo custo e confiável na detecção de moléculas de hormônios vegetais.
5
PRODUCTION OF ANTIBODIES POLICLONAL AGAINST AUXIN AND CYTOKININS.
ABSTRACT
Plant hormones are organic molecules with low molecular weight and interfere in plant growth and development. Despite of the application of growth regulators in plants, for stimulate and inhibit responses physiological, the plant growth an development depend of hormonal level endogenous in tissue. That fact always is not considered, since the methods that predominate in determination present economic and technical limitations. The test ELISA permit the detection of molecules with low molecular weight, being, therefore, limited only by the obtaining of antibodies with high specificity and sensibility to the molecules of interest. In that study, proposed the production of antibodies against AIA, zeatin and 2ip from rabbits and/or from egg yolk of chicken. For it stimulate the immunological response in animal, the plant hormones were conjugated with proteins, BSA or OVA. After immunization, to each week, were collected samples of serum in rabbits or eggs of chicken, subsequently, through the test of the test of precipitation of double diffusion, evaluated itself the capacity of the antibodies it will recognize the molecules of the hormones when conjugated to the proteins carriers. Beyond the test of the test of precipitation of double diffusion, the antibodies were characterized in SDS-PAGE and ELISA. The antibodies obtained from rabbits and eggs yolks of chicken were capable of will recognize the hormonal molecules, however, the test SDS-PAGE showed up that the antibodies obtained from rabbits presented others proteins in serum. The antibodies obtained in eggs yolks of chicken presented excellent rank of purity, suggesting the potential of use well happened in the determination of plant hormones. The test ELISA indicated that the antibodies obtained against the zeatin and the 2ip can be utilized in the detection of those molecules. The production of antibodies against plant hormones was possible so much in rabbits how much in eggs yolks of chicken. The quality of the antibody depends on the hormone molecule of interest as well as of the animal utilized in production. The results obtained indicated that the production of antibodies against plant hormones consists of a promising enough tool for to be adopted like a simple method, with low cost and sensible in determination of plant hormones.
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2.1 INTRODUÇÃO
A maioria dos trabalhos com a dosagem de hormônios vegetais com anticorpos não deixa explícito todas as etapas realizadas. Alguns descrevem apenas o uso de anticorpos para a dosagem em ELISA (PERES et al. 1997; MECIER et al. 2003; SUZUKI et al. 2004), outros apenas a produção dos anticorpos, e poucos relatam todas as etapas, envolvendo desde a produção de anticorpos até a determinação das moléculas em tecidos vegetais. Entretanto, para a produção de anticorpos para duas citocininas, SZÉKÁC et al. (2000) realizaram todas as etapas. O diferencial em relação aos demais trabalhos é o enfoque de alguns fatores que influenciam na validação do teste ELISA com o uso de anticorpos. Dessa forma, fica mais fácil para entender as divergências dos resultados da dosagem de hormônios vegetais com o uso de anticorpos, e até mesmo se entender e se superar as principais dificuldades durante a reprodução dos testes. A maioria dos trabalhos apresenta apenas os resultados obtidos e não registram os fatores que interferem de forma negativa, ou mesmo as dificuldades encontradas durante a produção de anticorpos e a efetivação dos testes imunológicos.
Apesar da definição das concentrações ótimas do anticorpo e do antígeno para o uso no ensaio imunoenzimático (ELISA), a maioria dos autores não descreve os procedimentos realizados, apenas comentando que as concentrações analíticas foram determinadas indiretamente através da competição das diferentes concentrações do antígeno com os anticorpos. SZÉKÁC et al. (2000), para obter o IC50 observaram variações na diluição do soro quando compararam anticorpos obtidos em animais imunizados com conjugados contendo diferentes proteínas carreadoras.
Outra fonte de variação que foi estudada foi a concentração do antígeno, que variou ente 1,0, 2,5 e 5,0 µg.ml−1. O título variou entre as concentrações do antígeno na placa e quanto a proteína carreadora, BSA ou OVA. O limite de detecção foi influenciado por todos os fatores. Os autores ainda verificaram que o período de incubação influenciou na absorbância. Sugeriram que a incubação durante 45 minutos é suficiente, uma vez que apresenta ótimos sinais nos ensaios. Incubações a partir de uma hora resultam IC50 com altos valores, o que gera perda na sensibilidade. Além disso, ainda relataram que os anticorpos foram capazes de determinar zeatina e 2ip em tomate e fumo na escala de ng.mg-1 de massa fresca de tecido vegetal.
Desta forma, fica evidente que além de todos os cuidados e o uso de metodologias apropriadas para a obtenção de anticorpos, a qualidade desses, também depende da forma e das condições que são utilizados, podendo limitar o uso de anticorpos produzidos em outros locais, mesmo quando adota a mesma metodologia. Sendo assim, toda vez que for utilizar anticorpos para a detectar moléculas ou organismos, deve se realizar todas as etapas de ajuste da técnica ELISA.
Isso apesar de ser evidente, não é encontrado na maioria dos trabalhos, e como existem vários fatores que interferem nos resultados, não fica claro como os valores foram obtidos, dificultando a reprodução dos testes. Isso indica que apesar dos anticorpos serem utilizados como uma ferramenta na quantificação de hormônios vegetais, todas as etapas devem ser ajustadas de acordo com as condições de trabalhos e, para cada lote do anticorpo utilizado, pois cada um apresenta características específicas.
A comparação dos resultados dos níveis hormonais endógenos fica restrita apenas nas condições semelhantes de trabalho, pois, mesmo quantificando os níveis endógenos, torna-se complicado se ter a certeza que os valores obtidos são os reais daquelas moléculas presentes nos tecidos. Uma vez que de acordo com o ajuste da metodologia da quantificação de moléculas, pode ocorrer ampla variação nos limites de determinação (SZÉKÁC et al. 2000).
7 Uma das dificuldades para comparar resultados com a dosagem de hormônios vegetais é a forma com que os dados são expressos. Existe uma ampla variação na forma de se expressar as unidades nos valores encontrados. No trabalho de PERES et al. (1997), a curva padrão foi expressa em fmoles e as quantidades determinadas em micromoles.kg-1 de massa fresca. MALDINEY et al. (1986) apresentaram os valores em ng.g-1 massa fresca. SZÉKÁC et al. (2000), na curva padrão, utilizaram as concentrações dos hormônios da concentração de ng.ml-1 da solução utilizada e ng.g-1 massa fresca. PENGELLY (1977) detectou auxina (AIA) na faixa de ng.g-1 de tecido vegetal. Uniformizando as unidades, PERES et al. (1997) e SZÉKÁC et al. (2000) determinaram hormônios na faixa de nmoles.g-1 de massa fresca, e PENGELLY (1977) fmol.g-1 de massa fresca. PERES et al. (1997) determinaram auxina e citocininas, PENGELLY (1977) apenas AIA e SZÉKÁC et al. (2000) duas citocininas. WEILER & WIECZOREK (1981) obtiveram alta sensibilidade e especificidade para a determinação de giberelina. A detecção foi de 2-5 fmoles (pg). Já a determinação de AIA variou entre 1-200 pmoles com radioimunoensaio. Os trabalhos de PERES et al. (1997) e SZÉKÁC et al. (2000) foram com ELISA, sugerindo ter havido uma variação na sensibilidade dos anticorpos de acordo a técnica utilizada para a determinação. Deve se ressaltar que antes da determinação dos hormônios a maioria dos trabalhos utiliza HPLC para separar as moléculas e posteriormente quantificá-las através do ELISA. SZÉKÁC et al. (2000), na quantificação de citocininas não deixaram explicito se as amostras foram previamente separadas em HPLC. Apenas referem-se à utilização de amostras de folhas de plântulas in
vitro para preparar o extrato das amostras vegetais em diferentes diluições. O método
utilizado no preparo das amostras, sem dúvida, pode influenciar na eficiência da extração das moléculas.
Os autores atribuem a diluição como um fator importante, particularmente para o monitoramento de zeatina, em que os níveis endógenos são diferentes dos níveis de detecção pelo sistema ELISA, podendo haver desta forma, a estimativa de forma equivocada dos níveis destas moléculas.
Estas variações podem ser diante das características dos anticorpos, e outro fato é que a partir dos anticorpos purificados, torna-se possível manipular as concentrações utilizadas do antígeno e do anticorpo, determinando em níveis diferentes. SZÉKÁC et al. (2000) verificaram que o limite de detecção do ensaio variou de acordo com a diluição. Por outro lado, esses fatos demonstram a necessidade da titulação dos anticorpos, bem como o ajuste das concentrações do antígeno e do anticorpo, nas diferentes condições de uso nos ensaios a serem realizados.
2.1.2. Anticorpos
Os anticorpos pertencem a uma família de glicoproteínas relacionadas estruturalmente, chamadas imunoglobulinas (Ig), presentes no soro sanguíneo de todos os animais, e no caso das aves podem ser transferidas às gemas. Tais proteínas são produzidas naturalmente pelo sistema imune dos vertebrados após a indução da reação com antígenos, e possui a capacidade de reconhecer substâncias e organismos estranhos para sua posterior eliminação (MARANHÃO & BRÍGIDO, 2001).
Na maioria dos animais superiores, cinco classes distintas de moléculas de imunoglobulinas são conhecidas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, diferenciando uma das outras em tamanho, carga, composição de aminoácidos e conteúdo de carboidratos (NUNES, 2005), e ainda varia o momento em que ocorre o pico na produção de cada uma. Além destas imunoglobulinas ainda existe IgY, produzidas nas aves. O Y têm origem de “yolk” (gema), local que predominam estas imunoglobulinas.
8 Diante da capacidade do sistema imune em produzir anticorpos contra moléculas ou organismos estranhos, torna-se possível induzir a produção de proteínas que são capazes de reconhecer diferentes substâncias e até mesmos microorganismos. A capacidade de reconhecer “corpos” estranhos tem sido utilizada em vários setores, tanto para detectar a presença quanto para quantificar determinadas partículas. Neste sentido, anticorpos vêm sendo utilizados como uma ferramenta para a dosagem de diferentes hormônios vegetais. Os principais hormônios que são quantificados com o uso de anticorpos são algumas citocininas, auxina, giberelina e ácido abscísico.
As imunoglobulinas podem ser obtidas tanto em mamíferos, tais como coelhos, camundongos e cabras, quanto em aves, onde as galinhas poedeiras são as mais utilizadas. BRENNER (1981) relatou que na produção de anticorpos contra hormônios vegetais, predominava o uso de coelhos para a obtenção de anti-soro, o mesmo sendo observado até os dias atuais. Apesar disso, dadas as dificuldades da obtenção de “bons anticorpos” para hormônios vegetais, comercialmente existe somente anticorpos monoclonais anti-AIA, produzidos em camundongos, disponíveis comercialmente (SIGMA®).
Apesar da existência de vários trabalhos científicos direcionados à produção de anticorpos e seu uso na determinação de hormônios vegetais, atualmente, estes produtos não estão disponíveis no mercado. A SIGMA® comercializa somente anticorpos monoclonais anti-AIA, obtidos a partir da estimulação com AIA conjugado à OVA. Uma das aplicações é o uso em ELISA, para detecções em concentrações na faixa de 1-2 µg ml-1 do mesmo hapteno conjugado a um carreador distinto (AIA-BSA). É digno de nota o fato de que o produto não se encontra disponível para pronta entrega, sendo necessário um período de três meses para que os anticorpos sejam produzidos em cultivos de hibridomas. Além do custo elevado dos anticorpos em solução (U$ 1.380,50/200 µl), existem limitações ao uso dos monoclonais por conta da baixa sensibilidade, decorrente da grande especificidade para o hapteno, que pode gerar falsos negativos e subestimar a concentração endógena de fitormônios.
Existem relatos da produção de anticorpos contra hormônios vegetais tanto em mamíferos (MALDINEY et al. 1986) quanto em aves (REDIG et al. 1996), entretanto, não há comparação da qualidade de anticorpos obtidos em espécies diferentes.
2.1.3. Produção de anticorpos
Para a produção de anticorpos específicos à determinadas moléculas é necessário que a molécula apresente capacidade de induzir a resposta imune, imunogênica, e o organismo seja capaz de reconhecê-la como um corpo estranho, e em seguida produzir proteínas específicas para o posterior isolamento. Entre as diversas moléculas na natureza, encontram-se moléculas que são capazes de provocar uma resposta imune, que induz a produção de anticorpos e outras que não são capazes de provocar a produção de anticorpos.
As moléculas que são reconhecidas pelo sistema imune e induzem a produção de anticorpos são denominadas de antígenos completos. Entre os diversos fatores que limitam a indução de produção de anticorpos, é o peso molecular da molécula de interesse. Moléculas com baixo peso molecular, quase sempre, não apresentam capacidade de induzir a resposta imune e são denominadas de haptenos, ou antígenos incompletos. Entretanto, uma alternativa para a produção de anticorpos para os haptenos é a sua conjugação com moléculas que apresentam alto peso molecular, tais como proteínas e polissacarídeos, as quais são denominadas de carreadoras. Entre estas, a conjugação de hormônios com BSA e OVA predomina na literatura.
Sendo assim, o antígeno utilizado para provocar a produção de anticorpos é o conjugado do hapteno (hormônio) com o carreador (proteína na maioria das vezes). Existem várias técnicas para a produção do conjugado (antígeno), variando o método de conjugação, o
9 local da molécula que vai ligar ao carreador, e até mesmo variações na capacidade de provocar a produção de anticorpos e também na qualidade do anticorpo obtido, a sensibilidade e a especificidade às moléculas em estudo.
A produção de anticorpos é ativada nos animais após a inoculação do antígeno. As substâncias com peso moléculas menor que 1000 Da, como os hormônios vegetais, não possuem a capacidade de provocar a produção de anticorpos e são denominadas de haptenos. Por outro lado, macromoléculas como as proteínas e polissacarídeos, são altamente imunogênicas, e estimulam fortemente a resposta imune. Dessa forma, para a produção de anticorpos contra hormônios vegetais torna-se necessário a conjugação dos haptenos com um carreador, formando um complexo com capacidade de provocar a produção de anticorpos.
Outro fator indispensável para a produção de anticorpos é a capacidade do animal imunizado em reconhecer o antígeno e produzir proteínas com alta afinidade e especificidade ao antígeno. Os mamíferos são tradicionalmente mais utilizados na obtenção de soro, uma vez que possuem esses requisitos. Por outro lado, existem registros que as galinhas são excelentes alternativas, e que podem produzir anticorpos com melhor qualidade que os mamíferos.
Em relação à especificidade dos anticorpos, quando se deseja obter anticorpos de melhor qualidade é conveniente se imunizar animais mais distantes filogenéticamente que possível, em relação à fonte do antígeno. Essa estratégia geralmente apresenta resultados satisfatórios. Como exemplo, para produzir anticorpos para uma proteína humana é mais indicado usar coelho, cabra, camundongos do que macaco. No entanto, geralmente, as aves são mais eficientes para produzir anticorpos contra moléculas que apresentam baixa capacidade de provocar a produção de anticorpos em mamíferos (SIGMA®).
Poucos estudos comparam diretamente a produção e a qualidade de anticorpos produzidos em aves com outras espécies. Entre os poucos que existem, alguns indicam que anticorpos produzidos em galinhas apresentam especificidade e afinidade no mínimo iguais aos produzidos em coelhos, camundongos e outros mamíferos.
As aves apresentam as vantagens de maior facilidade na coleta e o maior rendimento dos anticorpos. Enquanto nos mamíferos é necessário realizar a sangria para coletar o soro, nas aves isso não é necessário. Além disso, nos mamíferos, como coelhos, para a coleta de 15-20 ml de soro é necessário um período, de no mínimo, duas semanas. Nas aves, após 15 dias da imunização é possível obter um ovo a cada dia, contendo em torno de 100 mg de anticorpos (LOSSO et al. 1998 citado por MUNENE, 2004), permitindo dessa forma, obter um rendimento acumulado superior ao obtido em coelhos. Sendo assim, apesar da produção de anticorpos predominar em mamíferos, nas aves, na maioria das vezes, encontram-se vantagens, tais como obtenção de maior quantidade de IgY; menor custo; purificação relativamente simples; e maior facilidade de manejo dos animais (LOSSO, 1993).
O rendimento do volume de soro obtido varia conforme a espécie. Nas aves quando trabalha com o soro obtêm-se cerca de 1-2 ml de soro e com os ovos pode obter-se 15 ml de gema. Em coelhos obtêm-se cerca de 25,0 ml e em ovelha, cerca de 200 ml (SIGMA, 2006). Quando se trabalha com aves o rendimento geral pode ser superior a estas espécies, uma vez que é comum obter um ovo por dia. Desta forma no período que é necessário para coletar 200 ml de soro em ovelhas é possível obter um volume maior de gemas. Entretanto, na produção de anticorpos, além do rendimento, o mais importante é a qualidade dos anticorpos obtidos.
Alguns imunologistas consideram que as IgY são mais específicas que as IgG, porém, nem sempre isso ocorre, uma vez que depende do antígeno e das condições do estudo. Além disso, a resposta quanto à produção de anticorpos varia muito entre os animais. MUNENE (2004) verificou uma variação significativa na produção de anticorpos para ß-cyclocitral em aves imunizadas com o hapteno conjugado a um carreador.
Embora alguns pesquisadores insistam em afirmar que as IgG são mais específicas que as IgY, a produção de anticorpos em aves permanece sendo uma opção favorável devida a
10 grande quantidade de anticorpos obtida, ao custo de produção reduzido, bem como às características de resistência a variações térmicas, ausência de correlação com receptores bacterianos existentes em mamíferos e elevada resistência às variações de pH (FREIRE et al, 2004). WOOLEY & LANDON (1995) demonstraram que anticorpos obtidos em galinhas e ovelhas apresentaram afinidades semelhantes, considerando as duas espécies promissoras para a produção de anticorpos em grande escala. Apesar disso, evidenciaram amplas variações entre animais da mesma espécie, sugerindo a necessidade da utilização de vários indivíduos para a produção de anticorpos de boa qualidade.
BOLLEN et al. (1996) compararam a produção de anticorpos em coelhos e galinhas imunizados com antígenos preparados com vários tipos de adjuvantes e verificaram que o tipo de adjuvante interfere na resposta e varia entre as espécies. Entretanto, em geral, o título dos anticorpos obtidos em coelhos foi entre 1,5-2,0 vezes superior ao título dos anticorpos obtidos em galinhas. No entanto, os anticorpos produzidos em galinhas apresentaram melhor afinidade (especificidade). Nas galinhas, ainda compararam a produção de anticorpos no soro das aves e nas gemas e relataram que existe diferença na qualidade dos anticorpos.
Em relação à produção de anticorpos para hormônios vegetais, não existem resultados prévios na literatura comparando aves com outras espécies, sendo que predomina a produção em coelhos (PENGELLY, 1977; WEILER, 1980; WEILER, 1981; WEILER & WIECZOREK, 1981; MALDINEY et al. 1986). Nesses trabalhos, a sensibilidade da determinação das moléculas hormonais em tecidos vegetais com o uso de anticorpos varia na escala de nanograma a fentomol. Esta variação provavelmente ocorre devido à especificidade e sensibilidade dos anticorpos, que dependem da qualidade dos anticorpos, origem e processamento do tecido vegetal, método de extração e das condições nas quais as plantas foram mantidas antes da obtenção das amostras.
Assim, a qualidade dos anticorpos depende desde a metodologia utilizada para a produção do conjugado do hapteno com o carreador para imunizar os animais, material genético utilizado (espécie, raça ou linhagem), tipo de imunização adotada, época da coleta do soro e até da purificação dos anticorpos. Apesar de existirem diversos trabalhos sobre a produção de anticorpos contra hormônios vegetais, ocorrem variações metodológicas, principalmente relativas à produção dos conjugados, processos de imunização e estratégia utilizada na purificação dos anticorpos.
2.1.4 Obtenção de conjugados de haptenos com carreadores
Durante as últimas décadas, vários procedimentos utilizando diferentes reagentes têm sido descritos para a preparação de conjugados hapteno-carreador (PAUILLAC et al. 1998). As variações no método de conjugação do hapteno com o carreador podem gerar antígenos com diferentes capacidades de induzir resposta imune, alguns sendo mais eficientes que os outros, ou até mesmo quanto a qualidade do anticorpo produzido, que apresentam diferenças na qualidade.
Na produção de anticorpos contra AIA em coelhos, PENGELLY (1977), conjugou a molécula de auxina com BSA na presença de Formaldeído, WEILER (1981) conjugou na presença de Dimetilformamida e MALDINEY et al. (1986) na presença de Carbodiimida. A SIGMA® comercializa anticorpos monoclonais para AIA, gerados em camundongos, utilizando o conjugado AIA-OVA como o antígeno. Para outras moléculas das classes hormonais encontram-se diferentes metodologias. As variações nos métodos de conjugação estão relacionadas com o tipo de moléculas dos haptenos utilizados, o local onde deseja ligar o hapteno no carreador e com a capacidade de resposta imunológica da espécie animal selecionada para a produção de anticorpos.
11 Para a produção de anticorpos para citocininas, SZÉKÁC et al. (2000), imunizaram coelhos com conjugado preparado com 20 mg de Zeatina ou 2ip dissolvidos em 4 ml de Metanol, adicionado, em seguida, de 10 ml de Periodato de Sódio, gota a gota. Posteriormente adicionaram, em solução, a proteína carreadora, BSA ou OVA, dissolvidas em água, na concentração de 115 mg da proteína em 5 ml de água. Após a mistura das soluções, proteína e hapteno, o pH foi ajustado a 9,2, permaneceu durante 1 h em temperatura ambiente. Após incubação, adicionaram Borohidrato de Sódio e mantiveram, por mais 45 minutos, em temperatura ambiente, sob agitação. Ao término do segundo período de reação, o pH foi ajustado para 6,5 e o material foi mantido em repouso durante duas horas adicionais. O conjugado foi separado do excesso de haptenos não conjugados através de diálise em água durante dois dias, com três trocas diárias da água.
MALDINEY et al. (1986) dissolveram 1 mg de OVA em 500 µl de PBS e adicionaram 20 µl de Glutaraldeído, gota a gota, sob forte agitação. Após 3h de incubação, adicionaram 25 µl de Lisina (2M) e mantiveram por mais 1 h para em seguida ser dializada em PBS. Todas as reações foram realizadas no escuro e temperatura ambiente. Para a solução do hapteno, dissolveram 2 mg de Zeatina em 200 µl de Metanol, adicionaram 1 ml de Iodato de Sódio (0,01 M) e deixaram incubada durante 20 minutos. Em seguida adicionaram 50 µl de Etilenoglicol, retiraram 120 µl desta solução para ser misturada com 10 mg de OVA dissolvidas em 3 ml de água e 50 µl de Carbonato de Potássio (1%). Após 1 h adicionaram 120 µl de NaBH4 (2mg.ml-1) e incubaram por mais uma hora. O pH foi ajustado à 5,0 com
Ácido Acético e depois de duas horas a solução foi dializada com água. O conjugado foi armazenado a -18°C.
Para a obtenção de conjugados de citocininas, que são capazes de induzir a produção de anticorpos, cada trabalho utilizou metodologias específicas. Apesar disso, todos obtiveram sucesso na produção de anticorpos. Sendo trabalhos distintos, não se pode estabelecer uma comparação fidedigna da qualidade dos anticorpos que, provavelmente, variaram em função das metodologias utilizadas. Como resultado dessas variações, existem distorções nos resultados que levaram a divergências quanto a sensibilidade e especificidade dos anticorpos produzidos pelos diferentes grupos de pesquisas.
Apesar da existência de poucos trabalhos quanto à produção de anticorpos para giberelina, WEILER & WIECZOREK (1981) conjugaram GA3 com BSA. O processo
utilizado foi diferente dos demais métodos utilizados para a conjugação de auxina e citocininas, indicando não existir uma padronização na metodologia de conjugação de haptenos destinados à produção de anticorpos.
2.1.5 Imunização
A imunização varia de acordo com o animal. Em coelhos, a imunização com conjugados, geralmente, se faz através da inoculação de vários pontos, com cerca de 100 µl, no dorso do animal. Em aves, igualmente, pode-se inocular vários pontos no músculo peitoral. Após a imunização, o organismo começa a produzir anticorpos, ou imunoglobulinas que são receptores presentes na membrana (linfócitos B) e as proteínas de secreção que são os anticorpos. Durante esse processo ocorre a produção de diversos anticorpos e existe uma variação no tempo para cada classe (Figura 1).
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Figura 1. Comportamento da produção de anticorpos após a imunização dos animais. Fonte: Carlos Sinogas – material didático.
A reação antígeno-anticorpo é não-covalente e ocorre devido ao encaixe físico e às forças de atração (pontes de Hidrogênio, forças eletrostáticas, força de van der Waals e de hidrofobicidade). Quanto mais intensa é a interação antígeno-anticorpo, maior será a afinidade e, por conseguinte a especificidade dos anticorpos. A sensibilidade não está diretamente relacionada à especificidade, mas à capacidade de interação, independentemente do reconhecimento específico de um antígeno.
Em termos práticos, a especificidade refere-se à perfeita identificação de um fragmento do antígeno (epítopo) e a sensibilidade à capacidade de reconhecimento geral de diferentes epítopos presentes numa preparação antigênica. Assim, quanto maior for a sensibilidade, menor será a especificidade, e vice e versa. A afinidade refere-se à força de ligação entre o antígeno e o anticorpo, a especificidade diz respeito que cada anticorpo reconhecerá apenas um antígeno, o que interfere na reação cruzada, enquanto a sensibilidade e a quantidade de moléculas que são necessárias para ser reconhecida pelo anticorpo.
Na produção de anticorpos em aves, após a imunização os anticorpos predominam no soro, em seguida, cerca de duas semanas, nas gemas encontra-se maior quantidade de anticorpos.
O título dos anticorpos aumenta com os reforços. MUNENE (2004) utilizou reforços no intervalo de 15 dias para a produção de anticorpos. WOOLEY & LANDON (1995), BOLLEN et al. (1996) a cada mês fizeram um reforço com inoculação do antígeno distribuído entre quatro e seis pontos. Já HANSEN et al. (1998) utilizaram intervalos de três semanas. Como os anticorpos são transferidos às gemas, torna-se mais viável a coleta dos ovos do que o soro das aves. Enquanto coleta-se cerca de 1-2 ml de soro, pode-se obter até 15 ml em cada ovo.
WEILER (1981) imunizou coelhos adultos, com 12-16 semanas de idade, com uma emulsão do conjugado obtido com adjuvante completo de Freund na relação 1:1 (o mesmo utilizado para imunizar aves). O autor concluiu que o adjuvante foi capaz de induzir maior
13 resposta imune e ainda apresentar a característica de liberar lentamente o antígeno. Na imunização de animais a mistura do conjugado com adjuvante aumenta a resposta imune, favorecendo a produção de anticorpos, e ainda retarda a liberação do antígeno no organismo do animal, garantindo, dessa forma a produção de anticorpos por um período mais prolongado. O adjuvante de Freund é o mais utilizado, sendo composto por água, óleo e lisado de bactérias. Na primeira imunização geralmente se utiliza adjuvante completo e nos reforços o incompleto. Essa estratégia demonstra-se mais eficiente que as demais adotadas na imunização de animais (BOLLEN et al., 1996).
2.1.6 Extração e purificação
A obtenção dos anticorpos consiste no isolamento de proteínas no soro do animal ou em gemas de ovos. A obtenção de amostras contendo anticorpos varia de acordo com os animais em estudo. Nos mamíferos retira-se sangue dos animais para obter soro contendo os anticorpos para o uso nos ensaios imunoenzimáticos, enquanto nas aves, os anticorpos devem ser purificados a partir das gemas, uma vez que os lipídios estão presentes em grande quantidade nas gemas, dificultando, ou até mesmo, limitando o seu uso direto em ensaios imunoenzimáticos. A presença de lipídios exige a purificação das IgY. Esse fato não acontece quando trabalha com soro de animais, que podem ser utilizados, mesmo sem a prévia purificação de anticorpos, em teste ELISA.
Para a escolha do método para a purificação do anticorpo deve se levar em consideração a estrutura do anticorpo para obter alta eficiência no processo. Para a concentração das imunoglobulinas existem várias formas, entre elas, a precipitação com solução salina (Sulfato de Amônia ou de Sódio), filtração em Sephadex ou biogel, centrifugação, cromatografia em DEAE-celulose ou pela combinação desses métodos (KABAT, 1968). Na purificação dos anticorpos produzidos em mamíferos na maioria das vezes predomina a precipitação do soro com solução saturada de Sulfato de Amônia, seguida de centrifugação, e posterior dissolução do precipitado. MUNENE (2004), relata que a purificação de IgY é simples. Após a purificação dos anticorpos deve-se realizar testes para verificar se são capazes de reconhecer o antígeno e determinar a sensibilidade dos mesmos, ou seja, qual a quantidade mínima do antígeno que o anticorpo consegue reconhecer.
Para isolar IgY das gemas a maioria dos métodos utilizam Sulfato de Amônio ou PEG. Nos trabalhos disponíveis na literatura predomina a metodologia, às vezes com adaptações, descrita por AKITA & NAKAI (1992). Conforme MUNENE (2004), a técnica consiste na diluição da gema, com água ácida (pH 2,5), na relação de 1: 10, seguido do ajuste do pH para 5,0. A solução é mantida durante uma noite a 4°C, e posteriormente centrifugada a 10.000 x g durante 20 minutos. No sobrenadante, separado do precipitado, se adiciona 19% de Sulfato de Amônio e se mantém mais uma noite a 4°C. O precipitado contendo IgY, obtido após a segunda centrifugação da solução durante 20 minutos a 10.000 x g, é dissolvido em PBS ou solução salina, para posterior armazenamento e uso.
HANSEN (1998) utilizou os mesmos procedimentos, no entanto, com algumas modificações, principalmente em relação ao tempo de incubação da solução. Ao invés de uma noite, manteve a suspensão incubada durante 6 h a 4°C antes de retirar o sobrenadante para centrifugar durante 15 minutos a 10.000 x g. Tanto para IgG quanto para IgY, se pode realizar uma diálise para retirar excesso de sal presente nas preparações de anticorpo, em função do processo de purificação.
Os anticorpos apresentam duas cadeias, uma pesada e uma leve. Quando as proteínas são desnaturadas ocorre a fragmentação das cadeias, formando duas bandas, uma pesada e uma leve. Com esse método torna-se possível a separação das duas partes e a revelação da presença de outras proteínas nas amostras.
14 A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) é amplamente utilizada com a finalidade de se caracterizar preparações protéicas de origem animal e vegetal. Com esta técnica torna-se bastante viável se avaliar a pureza dos preparados de anticorpos. O princípio do método consiste na capacidade de separação de proteínas, conforme sua massa molecular, através da indução do deslocamento com a aplicação de um campo elétrico (LEHNINGER et al. 1995).
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2.2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido nas instalações e infra-estruturas disponíveis da parceria entre LCTV-DFITO-IA, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Ricardo Motta Miranda e o Laboratório de Imunologia-IB, sob a responsabilidade do prof. Dr. Ronald Bastos Freire, ambos da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
2.2.1 Conjugação das moléculas hormonais (haptenos) com proteínas (carreadores) 2.2.1.1 Conjugação de AIA-BSA com Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida (EDPC)
O conjugado AIA-BSA foi preparado com a mistura de uma solução de BSA (SIGMA®) na concentração de 31,74 µM e outra de AIA (SIGMA®) com 1.015,68 µM,
totalizando no final, um volume de 10 mL, conforme MALDINEY et al. (1986) com algumas modificações. A conjugação do AIA com o BSA ocorreu na presença de Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida (EDPC) (SIGMA®).
Para a obtenção do conjugado AIA-BSA, preparou-se uma solução com 20 mg de BSA dissolvidas em 2 mL de tampão PBS (pH 7,2) e o pH elevado para 8,3 com Hidróxido de Sódio (VETEC®). A solução do AIA foi obtida após dissolver 2 mg de AIA em 1,2 mL de água bidestilada e 2,4 mL de Dimetilformamida (VETEC®). A solução de AIA foi adicionada, gota a gota, à solução de BSA, sob agitação e temperatura ambiente. O pH foi ajustado à 8,3 com NaOH (VETEC®) e o volume completado para 10 mL com água destilada. Em seguida, 21 mg de EDPC foram divididas em quatro partes iguais, e cada parte foi adicionada em intervalos de duas horas à solução de AIA-BSA, que foi mantida sob agitação durante 8 horas, no escuro e à 4°C.
O conjugado foi submetido a diálise contra 300 ml de água, à 4°C, com duas trocas diárias durante 72 horas (Figura 2). O conjugado resultante foi distribuído em alíquotas de 1000 µL e congelado a - 20 0C para uso posterior.
As concentrações do hapteno e do carreador foram usadas numa proporção de 32:1, respectivamente, esperando-se que 32 moléculas de hapteno conjugassem à cada molécula de proteína.
Figura 2. Diálise de conjugado contra água destilada à 4 ºC com duas trocas diárias durante 72 horas.
16 Os espectros das soluções de AIA, BSA e do conjugado foram obtidos para determinar os comprimentos de onda máxima (λ máx). Colocou-se 1,0 mL do conjugado (AIA-BSA),
diluído 4 vezes, em uma cubeta de quartzo com um passo ótico de 1 cm. Para ter o controle, utilizou-se água bidestilada para zerar o aparelho. Em seguida foi realizada uma leitura da densidade ótica entre os comprimentos de onda 208 e 280 nm. O mesmo procedimento foi adotado para as soluções de AIA e BSA.
Para o AIA preparou-se uma solução, na concentração de 1 M, usando Dimetilformamida e água, na relação 1:1, como solvente. A absorbância do BSA foi obtida a partir de solução na concentração de 31,74µM, equivalente a concentração da molécula no conjugado. Todas as observações foram realizadas à temperatura ambiente em espectrofotômetro UV e visível.
2.2.1.2 Conjugação de AIA-OVA com Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida (EDPC)
O conjugado AIA-OVA foi preparado com a mistura de uma solução de OVA (SIGMA®), na concentração de 31,74 µM, com uma de AIA (SIGMA®), na concentração de 1.015,68 µM, totalizando no final, um volume de 10 mL.
O AIA e OVA foram conjugados na presença de Hidrocloreto de N-N-Dimetilaminopropil-N-Etil-Carbodiimida (EDPC) (SIGMA®). Para a obtenção do conjugado, 14,28 mg de OVA foram dissolvidas em 2 mL de tampão TBE pH (8,3). A solução de AIA foi obtida após dissolver 2 mg de AIA em 1,2 mL de água bidestilada e 2,4 mL de Dimetilformamida. A solução de AIA foi adicionada, gota à gota, a solução de OVA. A mistura foi mantida sob agitação, em temperatura ambiente, o pH foi determinado e o volume completado à 10 mL com água bidestilada. Em seguida, 21 mg de EDPC foram divididas em quatro partes iguais, e cada parte foi adicionada em intervalos de duas horas à solução de AIA-OVA, que foi mantida sob agitação durante 8 horas, no escuro e à 4 0C.
As concentrações de hapteno e de carreador foram usadas numa proporção de 32:1, respectivamente, esperando-se que 32 moléculas do hapteno conjugassem com cada molécula do carreador (OVA).
A solução foi submetida à diálise à 4 0C contra 300 ml de água com duas trocas diárias durante 72 horas. O conjugado resultante foi distribuído em alíquotas de 1000 µL e congelado a - 20 0C para uso posterior.
Os espectros das soluções de AIA, OVA e do conjugado AIA-OVA foram obtidos para a determinar os λ máx. Colocou-se 1 mL do conjugado (AIA-OVA), diluído 4 vezes, em
uma cubeta de quartzo com um passo ótico de 1 cm. Para obter o controle, utilizou-se o valor da leitura de água bidestilada. Em seguida foi realizada uma leitura da densidade ótica entre 208 e 280 nm. O mesmo procedimento foi adotado para as soluções de AIA e OVA.
Para o AIA foi preparado uma solução, na concentração de 1M, dissolvido em Dimetilformamida e água bidestilada (1:1). O espectro UV da OVA foi obtido empregando-se concentrações equivalentes à concentração desta molécula no conjugado (31,74µM). Todas as leituras foram realizadas à temperatura ambiente em espectrofotômetro UV e visível.
2.2.1.3 Conjugação de AIA-KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin - hemocianina) com Hidrocloreto de N-N-dimetilaminopropil-N-etil-carbodiimida (EDPC)
O conjugado KLH-AIA foi preparado com a mistura de uma solução de KLH (SIGMA®) (31,74 µM) com uma de AIA (SIGMA®) (1.015,68 µM), e o volume completado à 10 mL. O AIA e o KLH foram conjugados na presença de Hidrocloreto de N-N-Dimetilaminopropil-N-Etil-Carbodiimida (EDPC). Para a obtenção do conjugado, 142,83 mg
