Dissertação de Mestrado
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Ramo Tecnologia Química e Alimentar
Trabalho Efetuado sob a orientação do
Professor Doutor José Maria Marques Oliveira
e
Mestre Sofia Oliveira
Sandra Cristina Martins Fernandes
IMPLEMENTAÇÃO DE NOVAS
METODOLOGIAS DE ENSAIO
Outubro de 2015
Universidade do Minho
Escola de Engenharia
ii
DECLARAÇÃO
Nome: Sandra Cristina Martins Fernandes
Título da dissertação: Implementação de Novas Metodologias de Ensaio Orientador:
Professor Doutor José Maria Marques Oliveira Mestre Sofia Oliveira
Ano de conclusão: 2015
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica Ramo Tecnologia Química e Alimentar
DE ACORDO COM A LEGISLAÇÃO EM VIGOR, NÃO É PERMITIDA A REPRODUÇÃO DE QUALQUER PARTE DESTA TESE/TRABALHO.
Universidade do Minho, _____/_____/_________ Assinatura:
v
Agradecimentos
A realização deste projeto foi possível devido a um conjunto de pessoas que, direta e indiretamente, me ajudaram ao longo destes meses, tanto a nível pessoal, como a nível profissional, e de maneira alguma podia passar sem lhes mostrar todo o meu respeito, admiração e agradecimento.
Em primeiro lugar, agradeço ao meu Orientador na Universidade, Professor Doutor José Maria Oliveira, pela disponibilidade, pela grande ajuda e enorme paciência prestada durante a realização e desenvolvimento do projeto, bem como nos meses seguintes, ajudando no desenvolvimento da dissertação. Agradeço também aos técnicos auxiliares dos laboratórios da Universidade do Minho por toda paciência e ajuda.
Agradeço à minha Orientadora na empresa, Mestre Sofia Oliveira, por toda a disponibilidade, auxílio e ensinamentos, bem como a todos os trabalhadores da RNM, principalmente à Teresa Pinto.
Agradeço imenso aos meus amigos, os manos e as manas, pelo companheirismo e cumplicidade, em especial à Diane, por me ter aturado e ouvido durante todos os meses e como não poderia deixar de ser, ao meu Ricardo, agradeço por tudo.
Por último, mas sempre em primeiro, agradeço à minha FAMÍLIA! Aos meus Pais, José e Ema, por tudo o que proporcionaram ao longo da vida, porque sem eles, não estaria aqui nem tinha chegado onde cheguei. E, como não poderia deixar de ser, ao meu irmão, Eduardo. UM MUITO OBRIGADA!!!
vii Resumo:
O crescimento e desenvolvimento da empresa RNM nos últimos anos exigiu o aumento do número de procedimentos de análise dos produtos, que acompanhasse o aumento de produtos comercializados. Posto isto, este projeto teve como principal objetivo a implementação de um novo procedimento de análise, a determinação da pureza do ácido fosfórico comercial, bem como o controlo da qualidade da produção e das primas. Para além dos produtos e das matérias--primas diariamente analisados, os produtos que exigiram uma análise mais detalhada foram o ácido fosfórico comercial e a glicerina vegetal USP.
De forma a analisar uma solução de ácido fosfórico que chegou à empresa e que se apresentava em dois estados, estado sólido e estado líquido, procedeu-se à análise das massas volúmicas de uma amostra de cada fase, que permitiu determinar as respetivas concentrações. A glicerina USP, após sofrer uma contaminação nas instalações da empresa, foi analisada por HPLC, através da análise do índice de refração e da massa volúmica. O método tritrimétrico para a análise da concentração das soluções de ácido fosfórico implementado na rotina laboratorial utiliza como titulante uma solução de hidróxido de sódio de 0.1 mol/L e como indicador, uma solução indicadora de timolftaleína. A sua implementação exigiu uma validação, tendo sido analisados os parâmetros dos limiares analíticos, da seletividade/especificidade, da sensibilidade, da precisão e da exatidão do método.
Após a análise da massa volúmica das amostras de ácido fosfórico confirmou-se que a amostra em estado líquido apresentava um teor de ácido fosfórico de 81.21 %, enquanto a amostra sólida, apresentava uma concentração de 88.98 % em ácido fosfórico. Uma vez que a temperatura de congelamento aumenta com o teor de ácido fosfórico na amostra, as duas fases presentes no produto devem-se ao fato da temperatura de transporte não ter sido mantida acima do ponto de congelamento do produto. A análise às amostras de glicerina contaminada e decantada, obtida após a remoção do contaminante, permitiu afirmar que a primeira, por conter um teor de glicerol de 96.12 % não poderia ser classificada como USP. No entanto, a análise da amostra decantada mostrou que esta podia ser classificada como produto USP, uma vez que apresentava uma pureza de 99.78 %. O produto encontrava-se em conformidade com as especificações do cliente.
O método para determinar a pureza de uma solução de ácido fosfórico foi implementado com sucesso, uma vez que foi validado para todos os parâmetros estudados.
ix Abstract:
The growth and development of the company RNM over the last years demand an increase in the number of procedures of analysis of the products which matched the increase of marketed products. Therefore, this project had as main objective the implementation of a new procedure for analysis and the determination of the purity of the commercial phosphoric acid, as well the control of the quality of production and of the raw materials. In addition to products and raw materials daily analyzed, the products that demand a more detailed analysis were the commercial phosphoric acid and the glycerin USP.
In order to analyse a solution of phosphoric acid that arrived to the company and presented itself in two states, solid state and liquid state, it was done an analysis of the densities of a sample of each fase that allowed the determination of their concentrations. The glycerin USP, after suffering a contamination, was analyzed by HPLC, through analysis of the index of refraction and density. The tritrimetric method of analysis of the concentration of the phosphoric acid solutions implemented in laboratory routine use as titrant a 0.1 mol/L sodium hydroxide solution and as an indicator a thymolphtalein indicator solution. Its implementation demanded a validation, having been analyzed the parameters of the analytical thresholds, selectivity/specificity, sensitivity, the accuracy and precision of the method.
After the density analyzes of samples of phosphoric acid has confirmed that the sample in liquid state presented as phosphoric acid content of 81.21 %, while the solid sample, after the thawed and analyzed, showed a concentration of 88.21 % in phosphoric acid. Since the freezing point increases with the phosphoric acid content of the sample, the two phases present in the product are due to the fact that the temperature of transport wasn’t above of the freezing point of the product. The analysis of samples of glycerin contaminated and decanted, obtained after the removal of the contaminant, allowed to say that the first, because it contain a content of glycerol of 96.12 % could not be classified as USP. However, the analysis of the sample decanted showed that this could be classified as product USP, once it presented a purity of 99.78 %. The product was in accordance with customer specifications.
The method for determining the purity of a phosphoric acid solution has been successfully implemented, once was validated for all the studied parameters.
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Índice
Agradecimentos ... iii
Resumo ... vii
Abstract: ... ix
Lista de Figuras ... xiii
Lista de Tabelas ... xv
Lista de Abreviaturas, Siglas e Acrónimos... xvii
Capítulo I - Introdução... 1
Motivação e Objetivos ... 1
Apresentação da Empresa ... 2
Capítulo II - Revisão Bibliográfica ... 3
Indústria Química ... 3
3.1. Química Analítica ... 3
3.2. Análise Química como um Processo Integral ... 9
Controlo da Qualidade ... 11
4.1. Controlo da Qualidade em Análises Químicas ... 11
4.2. Controlo da Qualidade na Implementação e Validação de Métodos de Ensaio ... 13
4.3. Estimativas da incerteza das medições ... 31
Capítulo III - Matérias-Primas e Produtos ... 35
Descrição das Matérias-Primas e Produtos Comercializados na Empresa ... 35
5.1. Ácido Fosfórico ... 35
5.2. Glicerina USP Vegetal ... 36
5.3. Coagulante/Floculante ... 37
5.4. Diluentes ... 37
xii
5.6. Hipoclorito de sódio ... 38
5.7. Peróxido de Hidrogénio ... 38
5.8. Produtos de Detergência ... 38
Capítulo IV - Metodologia ... 41
Controlo da Qualidade das Matérias-Primas e da Produção ... 41
6.1. Ácido Fosfórico Comercial ... 41
6.2. Glicerina USP Vegetal ... 41
Controlo da Qualidade na Implementação de Métodos de Ensaio ... 42
Capítulo V - Apresentação e Discussão De Resultados ... 47
Controlo da Qualidade dos Produtos e Matérias-Primas... 47
Ácido Fosfórico ... 47
Glicerina USP Vegetal ... 48
Controlo da Qualidade na Implementação e Validação de Métodos de Ensaio ... 52
9.1. Determinação da Concentração do Ácido Fosfórico Comercial ... 52
Capítulo VI - Conclusões ... 63
Bibliografia ... 65
Anexos ... 67
Anexo I: Ácido Fosfórico Comercial ... 69
Anexo II: Glicerina USP ... 72
Anexo III: Implementação do Novo Método de Análise do Ácido Fosfórico... 76
Anexo IV: Procedimentos Experimentais Realizados na Empresa ... 82
Anexo V: Observações Experimentais Realizadas Durante o Projeto ... 88
xiii
Lista de Figuras
Figura 1: Logótipo da empresa RNM- Produtos Químicos... 2 Figura 2: Curva de titulação de uma titulação ácido-base, mostrando o volume de titulante, NaOH (VNaOH), sendo HCl o titulado. ... 6
Figura 3: Processo Cíclico de Análise Química... 9 Figura 4: Exemplo de Curva de Calibração obtida por HPLC, representando a área do pico cromatográfica (A) em função da concentração mássica do analito (C) (CatLab, 2009). ... 24
xv
Lista de Tabelas
Tabela 1: Massa volúmica, ρH3PO4, e concentração, CH3PO4, das amostras em estudo, Líquido e
Descongelado, e respetivas incertezas determinadas com 95 % de confiança ... 47 Tabela 2: Massa volúmica, ρglicerina, associadas às amostras analisadas e respetiva incerteza
determinada com um nível de confiança de 95 % ... 48 Tabela 3: Índice de refração, n, a 19.5 ºC, da amostra original, contaminada e decantada ... 49 Tabela 4: Concentração, Camostra, da amostra original, contaminada e decantada e respetivas
incertezas determinadas com um nível de confiança de 95 % ... 50 Tabela 5: Conteúdo de glicerol, Cglicerol, de cada amostra analisada, e pureza associada, P... 51 Tabela 6: Registo do teor de glicerol determinado em cada amostra por HPLC, Cglicerol, e pureza
associada, P ... 52 Tabela 7: Concentração média da solução de NaOH, CNaOH obtida através da padronização com
biftalato de sódio, C8H5KO4 ... 52
Tabela 8: Volume de NaOH, VNaOH, obtido durante a determinação da concentração de uma
amostra de ácido fosfórico, CH3PO4, e respetivas incertezas determinadas com um nível de confiança
de 95 %, utilizando como indicadores alaranjado de metilo e timolftaleína, e utilizando como ponto final da titulação a viragem do indicador e a viragem do indicador e medição do pH da solução53 Tabela 9: Volume de NaOH, VNaOH, obtido na determinação da concentração de uma amostra de
ácido fosfórico, CH3PO4, e respetivas incertezas determinadas com 95 % de confiança utilizando
como indicadores alaranjado de metilo e fenolftaleína e controlando o pH da solução final ... 54 Tabela 10: Volume de NaOH, VNaOH, obtido aquando da determinação da concentração de ácido
fosfórico, CH3PO4, e respetivas incertezas determinadas com 95 % de confiança, utilizando o
indicador timolftaleína ... 55 Tabela 11: Registo dos limites de deteção, LD, e quantificação do método, LQ, bem como do parâmetro calculado necessários à sua análise, como o coeficiente de variação, CV ... 56
xvi
Tabela 12: Concentração de ácido fosfórico calculada a partir do volume de titulante utilizado, CH3PO4, concentração real das soluções de ácido fosfórico preparadas, CH3PO4 real e do valor da taxa
de recuperação, TR, para cada uma das amostra preparadas para o estudo ... 57 Tabela 13: Registo dos valores calculados, para cada concentração em estudo, em condições de repetibilidade ... 59 Tabela 14: Registo da diferença absoluta entre os valores obtidos em cada ensaio para cada uma das concentrações em estudo, Csolução... 60
Tabela 15: Estudo da precisão intermédia do método, variando o dia de análise ... 60 Tabela 16: Registo dos valores obtidos para cada análise das amostras em estudo ... 61
xvii
Lista de Abreviaturas, Siglas e Acrónimos
: Unidade de Reação α: Risco α : Unidade de Reação β: Risco β CA: Concentração do Analito CQ: Controlo da Qualidade
CQI: Controlo de Qualidade Interno CV : Coeficiente de Variação
CA: Concentração Material do Titulado
CT: Concentração Material do Titulante
DPR : Desvio-padrão Relativo
DPRr : Desvio-padrão Relativo da equação de Horwitz En : Erro Normalizado
ER : Erro Relativo
F : Teste F de Snedecor/Fisher HO : Valor de HORRAT
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) IPAC: Instituto Português de Acreditação
IPQ: Intituto Português da Qualidade
IRNM: Instituto de Medições e Materiais de Referência
xviii Aplicada)
K : Sensibilifdade; Fator de Expansão Ki
: Constante de Dissociação
LD : Limite de Deteção LQ : Limite de Quantificação MM : Massa Molar
MRC: Materiais de Referência Certificados MRI: Materiais de Referência Internos
NIST: National Institute for Standards and Technology (Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia) n : Número de ensaios; Quantidade de matéria
nA: Quantidade de Matéria do Titulado
nT: Quantidade de Matéria do Titulante
P : Pureza de uma Amostra
PG : Teste PG de análise da variância
r : Limite de Repetibilidade; Coeficiente de Correlação r2: Coeficiente de Determinação
TR : Taxa de Recuperação
USP: United States Pharmacopeia VA: Volume do Analito
VT: Volume do Titulante
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Capítulo I - Introdução
Motivação e Objetivos
A realização deste projeto desenvolvido em ambiente empresarial fez parte da conclusão do Mestrado Integrado em Engenharia Biológica e resultou da parceria entre a empresa RNM- Produtos Químicos com a Universidade do Minho.
Devido ao elevado crescimento da empresa RNM nos últimos anos, e ao aumento da produção, tornou-se necessário desenvolver e implementar novas metodologias de análise na rotina laboratorial que permitissem avaliar a qualidade dos produtos.
O projeto desenvolvido teve como principal objetivo a implementação de novos métodos de análise de produtos. Além disso, passou também pela familiarização com a rotina laboratorial da empresa, que envolvia o controlo da qualidade da produção e das matérias-primas.
O desenvolvimento do novo método exige a realização da pesquisa bibliográfica e a sua validação, isto é, a realização de um estudo que permita assegurar a eficiência do método em questão. Assim sendo, é essencial assegurar a obtenção de resultados fidedignos, exigindo ao laboratório o cumprimento de requisitos de competências técnicas na realização de ensaios e/ou calibrações de métodos normalizados, métodos não normalizados e métodos desenvolvidos pelo próprio laboratório.
O controlo da qualidade da matéria-prima e da produção permite confirmar que as características destes correspondem efetivamente à sua descrição e que os requisitos dos clientes são cumpridos. Além dos produtos diariamente analisados, um dos objetivos deste projeto era resolver alguns problemas pontuais relacionados com um lote de ácido fosfórico e um lote de glicerina USP.
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Apresentação da Empresa
A RNM- Produtos Químicos é uma empresa dedicada à produção e comercialização de produtos químicos e integra atualmente um grupo de empresas vocacionadas para a distribuição desses produtos. Esta encontra-se sediada em Vila Nova de Famalicão e foi fundada no ano de 1986. O logótipo da empresa encontra-se apresentado na Figura 1.
Figura 1: Logótipo da empresa RNM- Produtos Químicos.
A empresa possui um Sistema de Gestão Integrado da Qualidade, Ambiente e Segurança, certificado pelas normas ISO 9001, ISO 14001 e OSHAS 18001, no âmbito da importação, produção e comercialização de produtos químicos industriais.
Os produtos químicos produzidos na empresa são dirigidos a várias áreas, como a indústria têxtil, a indústria do papel e cartão, a área da alimentação humana e animal, da farmacêutica e cosmética, da construção civil e madeiras, a área do meio ambiente e do tratamento de águas, entre muitas outras.
A estratégia empresarial da RNM baseia-se em alianças estratégicas com fornecedores e clientes, no respeito pelo Meio Ambiente e Segurança dos trabalhadores e na qualidade total dos produtos.
Esta dispõe de vários serviços, como por exemplo, a armazenagem e o transporte de mercadorias, a formulação de misturas, a utilização de embalagens à medida e a realização de análises químicas que comprovem a conformidade dos produtos, visando sempre o desenvolvimento de novos produtos adaptados à necessidade dos clientes(RNM, 2009).
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Capítulo II - Revisão Bibliográfica
Indústria Química
A evolução da indústria química conhecida como moderna teve início durante a Revolução Industrial, através do desenvolvimento de produtos químicos requisitados por diversas indústrias, como a manufatura de vidro, que utiliza sílica e carbonato de sódio, e a indústria têxtil, que utiliza pó branqueador no algodão.
O crescimento e o desenvolvimento dos produtos petroquímicos, na década de 1950, desencadearam um crescimento notável desta indústria, levando ao aumento exponencial da procura dos polímeros sintéticos, como o polietileno, o polipropileno e o poliéster.
Atualmente, a indústria química enquadra diversos sectores de produção industrial, onde os produtos originados apresentam as propriedades específicas para determinados processos, sendo produzidos a partir de matérias-primas em estado bruto. Esta indústria beneficia da utilização dos últimos avanços na tecnologia, nomeadamente, na área eletrónica e de engenharia.
Os produtos químicos gerados podem ser utilizados em diferentes setores, como no tratamento de efluentes e na análise de matérias-primas ou dos produtos finalizados, sendo as áreas de maior crescimento a petroquímica e a farmacêutica (Heaton, 1994).
3.1. Química Analítica
O desenvolvimento da indústria química em diversas áreas como, por exemplo, a manufatura de produtos químicos, farmacêuticos, alimentares e tintas exige a confirmação da conformidade destes com um conjunto de parâmetros, sendo essencial a utilização da química analítica.
A química analítica corresponde à área da química responsável pela caracterização da composição qualitativa e quantitativa dos componentes de uma amostra. O seu propósito reside na melhoria de métodos estabelecidos, na extensão de métodos a novos tipos de amostras e no desenvolvimento de novos métodos para a medição dos fenómenos químicos(Harvey, 2000).
A química analítica engloba a análise química qualitativa que consiste na identificação das espécies que constituem uma amostra e a análise quantitativa, que permite quantificar as espécies presentes na amostra (Harvey, 2000). Normalmente, a análise qualitativa é realizada
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anteriormente à análise quantitativa, uma vez que só se pode escolher um método para a análise quantitativa do elemento de interesse depois de se conhecer a composição qualitativa da substância (Alexéev, 1983; Khopkar, 2004).
Os métodos de análise quantitativa englobam os métodos químicos, que envolvem reações químicas e compreendem os métodos gravimétricos e volumétricos, e os métodos físicos, onde a maioria são métodos instrumentais (Khopkar, 2004).
São várias as etapas a seguir para se proceder à análise quantitativa de um produto, sendo os mais importantes os seguintes (Khopkar, 2004):
1. Amostragem, que deve ser representativa;
2. Seleção dos constituintes de interesse na amostra, através de processos separação selecionados tendo em conta a precisão e exatidão desejada;
3. Identificação dos constituintes de interesse, onde as propriedades físicas ou químicas podem ser utilizadas na análise quantitativa ou qualitativa, ou ambas;
4. Cálculo e interpretação dos dados.
3.1.1. Métodos Químicos
As equações estequiométricas são, normalmente, a base dos métodos químicos, que englobam os métodos gravimétricos e os métodos volumétricos (Khopkar, 2004).
1) Métodos Gravimétricos
Os métodos gravimétricos compreendem todos os métodos que permitem quantificar um analito que resulta de uma reação entre o componente presente na amostra e excesso de reagente. A sua quantificação pode ser realizada através da medição do seu peso, calculado a partir da sua fórmula química e da massa atómica dos elementos que o constituem (Khopkar, 2004).
A separação do produto pode ser realizada através de gravimetria por precipitação, gravimetria por volatilização e gravimetria particulada, sendo os mais importantes os dois primeiros (Harvey, 2000; Khopkar, 2004).
A gravimetria por precipitação corresponde ao método de medição do peso de um analito presente numa solução, onde após a adição de um agente precipitante à solução, este é convertido num precipitado pouco solúvel e, de seguida, filtrado(Harvey, 2000; Khopkar, 2004).
5 A gravimetria por volatilização engloba os métodos que permitem determinar o peso de um analito, que se encontra sob uma forma que o permita separar imediatamente da amostra, utilizando energia química ou térmica. Os produtos voláteis, bem como os resíduos, resultantes da reação de decomposição podem ser pesados. Esta técnica só deve ser utilizada se o analito for a única substância volátil presente na amostra.
A gravimetria particulada é utilizada quando se pretende separar o analito da amostra e este se apresenta numa forma que permite uma rápida separação. A sua massa pode ser determinada diretamente numa balança. Caso o analito se encontre em estado sólido pode fazer-se uma filtração com vista à sua remoção da amostra. Outro método que pode ser utilizado é a extração líquida ou sólida (Harvey, 2000).
2) Métodos Volumétricos
Os métodos volumétricos envolvem a realização de titulações, permitindo determinar a concentração de uma amostra. Este processo ocorre através da adição controlada de uma solução de concentração conhecida, o titulante, à solução que está a ser analisada, o titulado.
A reação está completa quando a quantidade de titulante adicionada ao titulado é suficiente para neutralizar completamente o analito. Este ponto é denominado de ponto de equivalência (Harvey, 2000). O volume de titulante utilizado permite calcular a concentração da amostra.
Na prática, o ponto final da titulação é identificado por uma mudança no sistema, normalmente por uma mudança na cor do indicador sendo denominado de ponto final da titulação. A diferença entre o ponto de equivalência e o ponto final da titulação é designado erro da titulação, uma vez que o ponto final só é atingido após o ponto de equivalência(Harvey, 2000; Khopkar, 2004).
A reação de uma titulação deve ser rápida, o que permitirá detetar facilmente o ponto de equivalência e deverá ser completa, sem que ocorram reações secundárias. Para que uma titulação seja precisa é necessário proceder-se ao cálculo do volume exato de titulado necessário para se atingir o ponto de equivalência.
As curvas de titulação consistem em gráficos que mostram o progresso de uma titulação à medida que se adiciona um titulante à solução de concentração desconhecida. Esta pode ser determinada através da medição do pH, por exemplo, suspendendo um elétrodo na solução que contém o titulado e monitorizando a variação do pH à medida que se adiciona o titulante(Harvey,
6
2000). A curva de titulação deve apresentar uma forma sigmoide, sendo que o eixo das abcissas corresponda ao volume do titulante utilizado e o eixo das ordenadas corresponda ao pH da solução, ou outra alteração observável, como a temperatura(Pinto, 2005).
A Figura 2 mostra um exemplo de uma curva de titulação, onde se verifica a variação do pH do titulado à medida que se adiciona o titulante, sendo o titulado ácido clorídrico (HCl) e o titulante hidróxido de sódio (NaOH).
Figura 2: Curva de titulação de uma titulação ácido-base, mostrando o volume de titulante, NaOH (VNaOH), sendo HCl o titulado.
Existem diversas formas de titulação, entre as quais a titulação direta, a titulação indireta e a titulação de deslocamento.
Na titulação direta, a espécie a ser determinada reage diretamente com a solução-padrão. Na titulação indireta, também conhecida como back titration, a adição de um reagente ao titulado após a reação dá origem ao excesso de reagente, sendo este determinado por uma titulação (Harvey, 2000). É uma técnica cuja utilização é vantajosa quando o ponto final da titulação é difícil de ser observado.
A titulação de deslocamento ocorre quando o titulado desloca uma espécie, normalmente presente num complexo, e a quantidade de espécie deslocada é determinada por titulação(Pinto, 2005).
Os métodos volumétricos podem ser organizados com base em vários aspetos, como o tipo de equilíbrio, a natureza dos reagentes, as reações que desencadeiam, a classe de padrões primários e de indicadores e a definição do peso equivalente.
pH
VNaOH/mL
7 Assim sendo, é possível obter quatro classes de métodos volumétricos tendo em conta as reações químicas que desencadeiam: a volumetria ácido-base, a volumetria de precipitação, volumetria complexométrica e a volumetria de oxidação-redução(Harvey, 2000).
A volumetria ácido-base é utilizada para determinar a concentração de um ácido ou de uma base presente numa solução, titulando-a com uma base ou um ácido, respetivamente, de concentração conhecida (Khopkar, 2004).
A volumetria de precipitação tem como base uma reação entre o titulante e o titulado, que origina um precipitado insolúvel. O ponto final da titulação é assinalado quando se observa que a adição de titulante não origina mais precipitado. Outra forma de determinar o ponto final da titulação é através da formação de um complexo colorido.
A volumetria complexométrica consiste numa titulação onde se forma um complexo suficientemente estável, devido a uma reação entre um ião metálico e um agente ligante.
A volumetria de oxidação-redução envolve a reações de oxidação-redução, onde ocorre a transferência de eletrões entre as espécies químicas presentes, ou seja, entre o titulante e o titulado(Harvey, 2000).
3) Cálculo da Concentração do Titulado
Após a realização das técnicas de titulação é necessário proceder-se ao tratamento dos resultados obtidos.
Em química, uma solução corresponde a uma mistura homogénea composta por duas ou mais substâncias. De forma a determinar a quantidade dos compostos presentes na solução procede-se ao cálculo da concentração destes compostos através do volume de titulante utilizado durante a titulação.
Para o cálculo da concentração do titulado é necessário conhecer o tipo de reação, uma vez que a cada tipo de reação se encontram associadas unidades de reação específicas ( e ), a equação da reação e, caso seja necessário, acertar a equação, para que o número de moles do titulante (nT) utilizado seja igual ao número de moles do titulado (nA)(Harvey, 2009).
Sabendo que:
T = T T
Sendo a unidade de reação associada à espécie e tendo em conta o tipo de reação, CT a Equação 1
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concentração material do titulante e VT o volume de titulante.
Uma vez que no ponto de equivalência T = A , a concentração do titulado é obtida da seguinte forma:
T = A ⟺ T T = A A ⟺ A= � �T�AT
3.1.2. Métodos Instrumentais
O desenvolvimento de métodos instrumentais de análise apresenta relevantes avanços, tanto na montagem de sistemas analíticos de maior robustez e menor dimensão, como no desenvolvimento de software de operação e de tratamento de dados (Vaz Jr., 2010).
Os métodos instrumentais correspondem aos métodos onde é necessário proceder-se a uma operação de calibração, utilizando-se para tal uma amostra de composição conhecida como referência, denominada como solução-padrão. Desta resulta uma curva de calibração que permite analisar quantitativamente as amostras (IPAC, 2011).
Estes métodos são métodos rápidos, seguros e sensíveis, sendo largamente utilizados na indústria.
Os principais métodos instrumentais de análise quantitativa são: eletroanalíticos, óticos e de separação(Denadai, 2011; Vaz Jr., 2010).
Os métodos instrumentais eletroanalíticos baseiam-se nas reações de oxidação-redução onde, através da aplicação de um potencial elétrico às espécies eletroativas de uma amostra, é possível medir a corrente elétrica, da resistência ou da tensão, em função da concentração de uma determinada espécie presente. É possível obter-se da mesma forma o valor do potencial do analito, comparando-o com o potencial de um eletrodo de referência. Para tal podem utilizar-se métodos potenciométricos, de coulometria, de condutimetria e voltametria(Denadai, 2011; Vaz Jr., 2010). Os métodos instrumentais óticos compreendem os métodos óticos de absorção da luz e emissão de luz. Os métodos de absorção compreendem a espectrofotometria, os métodos de espectroscopia de absorção atómica e turbidimetria. Já os métodos óticos de emissão de luz englobam a espectroscopia de emissão, a fotometria de chama e a fluorimetria. Estes métodos têm como base a quantidade de energia radiante ou de um determinado comprimento de onda absorvida ou emitida pela amostra em análise, respetivamente, permitindo a sua quantificação
9 (Denadai, 2011; Vaz Jr., 2010).
Os métodos de separação são utilizados na separação dos componentes de uma amostra, tendo em conta as suas propriedades, como por exemplo, a solubilidade, o tamanho, a carga e a afinidade das espécies, permitindo a sua quantificação e identificação. Estas técnicas compreendem a separação por adição ou criação de fases, como por exemplo, a destilação, a evaporação e a secagem; a separação por membranas, como por exemplo a filtração e a osmose inversa; a separação por agente sólido; e a separação por campo externo ou gradiente, como a centrifugação e a eletroforese. (Denadai, 2011; Tavares, 2012; Vaz Jr., 2010).
Os equipamentos utilizados na análise química possuem ou encontram-se normalmente conectados a dispositivos que detetam e armazenam os dados obtidos, permitindo a sua posterior análise.
3.2. Análise Química como um Processo Integral
A análise química de um material pode ser descrita através de uma cadeia de decisões, ações e procedimentos, que se encontram representados na Figura 3 (Van Zoonen et al., 1998).
Numa primeira etapa deve definir-se o problema e selecionar-se o método adequado tendo em conta os objetivos definidos. Esta é uma etapa complexa da análise dos produtos químicos,
Definição do Problema de Análise Amostragem, Estratégia e Técnicas Tratamento das Amostras Análise (Separação e Deteção) Processamento dos Dados e Armazenamento Interpretação e Avaliação dos Dados
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que deve ser efetuada apenas por uma pessoa experiente (Khopkar, 2004). A sua escolha deve ter como base o problema apresentado pelo cliente, a natureza da amostra, o tipo de análise (quantitativa/qualitativa), a exatidão e precisão do método e no tempo de análise/custos(Marques, 2010).
A etapa mais difícil do ciclo é normalmente a amostragem, o design do plano de amostragem e a seleção e utilização das técnicas e das instalações para a obtenção, transporte e armazenamento das amostras(Van Zoonen et al., 1998). A amostragem consiste na recolha de uma pequena porção de um material que represente toda a amostra que se pretende analisar (Costa, 2014; Marques, 2010).Geralmente, esta etapa representa a fonte de maiores erros associados análise química de uma amostra.
Um erro consiste na incerteza estimada correspondente a uma medida ou experiência. Esta nunca pode ser completamente eliminada, optando-se pela sua minimização. As análises químicas são afetadas por dois tipos de erros: os erros sistemáticos e os erros aleatórios. Os primeiros encontram-se associados à exatidão dos resultados e correspondem aos erros instrumentais, aos erros do método e aos erros pessoais. A sua origem pode ser identificada e corrigida. Os erros aleatórios afetam a precisão dos resultados, não sendo possível identificar a sua origem. Estes podem ser minimizados através da realização de réplicas (Costa, 2014).
Na etapa do tratamento das amostras, elas deverão ser tratadas para que se obtenha no final dos processos uma amostra homogénea. Estas deverão ser tratadas de forma diferente, tendo como base a presença de resíduos e o estado físico da amostra(Pereira, 2001). Nesta etapa deve constar a definição de réplicas, para aumentar o grau de confiança, e a eliminação de interferências, que podem exigir técnicas sofisticadas de separação(Marques, 2010). Caso a preparação das amostras não ocorra de forma cuidadosa, nem os instrumentos de controlo analítico mais avançados e qualificados e as técnicas computacionais mais sofisticadas podem evitar que os resultados sejam questionáveis(Van Zoonen et al., 1998).
Na etapa de análise das amostras devem efetuar-se as medições, incluindo a calibração do equipamento, caso se utilize.
O último passo, nomeadamente a interpretação e avaliação dos resultados da análise, deve fornecer a resposta ao problema inicial, que é normalmente definido por um cliente do laboratório. A não ser que a interpretação e avaliação dos dados obtidos apresentem uma base estatística sólida, não é possível afirmar com clareza o quão significantes são os resultados. Assim sendo,
11 após o cálculo dos resultados, deve estimar-se a sua confiança, através da determinação dos erros, seguida da validação dos métodos, dos instrumentos e dos procedimentos laboratoriais que se utilizaram (Marques, 2010; Van Zoonen, et al. 1998).
Caso a resposta não vá de encontro ao desejado, deve proceder-se às alterações necessárias e o ciclo repetido novamente. Por vezes, pode originar o desenvolvimento de novos métodos ou a alteração de parte do procedimento, de modo a atingir melhores resultados(Van Zoonen et al., 1998).
Controlo da Qualidade
O controlo da qualidade num laboratório analítico tem como objetivo fornecer resultados que se encontrem em conformidade com as especificações do cliente e garantam a confiança entre o cliente, e quem usa os resultados, e o fornecedor (Crosby et al., 1995).
Segundo o IPQ- Instituto Português da Qualidade, a qualidade consiste no conjunto de atributos e características de uma entidade ou produto que determinam a sua aptidão para satisfazer necessidades e expectativas da sociedade (Decreto-Lei N.º 140/2004). Os produtos que apresentem características que vão de encontro aos parâmetros definidos para a “qualidade” são designados de produtos conforme. Por sua vez, os produtos cujas especificações não respeitem os parâmetros de qualidade, são definidos como produtos não-conforme.
Para que um fornecedor possa garantir que os produtos comercializados são produtos conforme é necessário recorrer a técnicas operacionais e atividades que permitam obter informação sobre os requisitos dos produtos, ou seja, é necessário proceder-se ao controlo da qualidade.
4.1. Controlo da Qualidade em Análises Químicas
O controlo da qualidade (CQ) permite minimizar os erros que ocorrem durante as várias etapas de confeção e controlar a sua ocorrência. Assim sendo, torna-se necessário avaliar periodicamente a exatidão dos resultados obtidos, através de ações de controlo externo ou interno (IPAC, 2011).
12
4.1.1. Controlo da Qualidade Externo
O controlo de qualidade externo é realizado pelo laboratório em questão e os resultados obtidos confrontados com valores de referência. Este pode ser efetuado de duas formas: através da utilização de Materiais de Referência Certificados ou através de ensaios interlaboratoriais.
A utilização dos MRC nos ensaios permitem controlar a exatidão do ensaio e verificar a rastreabilidade das medições efetuadas. Estes materiais devem ser adquiridos apenas quando são produzidos por entidades de reconhecida credibilidade, como o Instituto de Medições e Materiais de Referência (IRMM) e o National Institute for Standards and Technology (NIST).
A participação do laboratório em ensaios interlaboratoriais permite que este evolua tecnicamente, uma vez que irá utilizar diferentes amostras sem conhecimento do valor correto, testando a sua capacidade de superação. Os ensaios mais indicados são os ensaios de aptidão, sendo o seu objetivo a avaliação comportamental do laboratório.
Os resultados do seu desempenho, apesar da utilização dos materiais certificados e da participação nos ensaios, devem ser analisados avaliando os desvios segundo um critério adequado, procedendo à realização de um diagnóstico e identificação das causas dos desvios inaceitáveis e definindo e implementando ações corretivas, com posterior confirmação da sua eficácia.
Caso não seja possível utilizar MRC ou participar em ensaios, o laboratório deve utilizar padrões internacionais ou nacionais e comparar os seus métodos com métodos de referência (IPAC, 2011).
4.1.2. Controlo da Qualidade Interno
O controlo da qualidade interno (CQI) deve ser efetuado através da utilização de Materiais de Referência Internos, de técnicas complementares de CQ dos resultados e de tratamento estatístico dos dados.
Os MRI que podem ser utilizados pelo laboratório são: amostras de controlo;
padrões de matriz, ajustada com a matriz das amostras; padrões semelhantes;
13 A utilização dos MRI permite controlar a exatidão e precisão ao longo do tempo.
As técnicas complementares de CQI devem ser selecionadas com base na complexidade e dificuldade dos métodos utilizados e nas fontes de erro que se pretendem controlar.
As técnicas compreendem:
a análise de brancos em paralelo com as amostras; a realização de análises em replicado;
a repetição de análises em replicado, caso os resultados obtidos não tenham sido satisfatórios;
a participação em ensaios de recuperação e a fortificação das amostras; a execução de métodos de adição de padrão;
a comparação de resultados obtidos por diferentes métodos;
a correlação de resultados de características diferentes da mesma amostra.
A realização de brancos é indispensável quando se realizam ensaios onde a gama de concentrações das amostras é baixa. Esta técnica encontra-se associada a uma verificação periódica do Limite de Quantificação.
A realização de réplicas, ou seja, de ensaios sobre as tomas da amostra realizados em separado, é de elevada importância na química clássica e instrumental, uma vez que permitem obter resultados mais exatos.
Os dados obtidos devem ser analisados e comparados com as especificações predefinidas. Caso os parâmetros avaliados não apresentem concordância com os pré-definidos, devem ser executadas ações para corrigir o problema e evitar a apresentação de dados incorretos.
Os resultados obtidos através das ações de controlo de qualidade devem ser apresentados de forma clara, eficiente e de fácil perceção, através de cartas de controlo. O tipo de carta de controlo deve ser selecionado com base nas características que se pretendem verificar (IPAC, 2011).
4.2. Controlo da Qualidade na Implementação e Validação de Métodos de Ensaio
De forma a validar um método interno de ensaio é necessário realizar estudos de validação antes de o colocar em rotina, durante a sua implementação e sempre que ocorra alguma alteração significativa do mesmo.
14
Assim sendo, torna-se necessário avaliar alguns dos parâmetros do método, sendo os requisitos mínimos a considerar os seguintes:
Exatidão; Precisão;
Gama de trabalho/linearidade;
Limiares analíticos: limite de deteção e limite de quantificação; Sensibilidade;
Seletividade/Especificidade; Robustez.
No caso das análises quantitativas torna-se necessário avaliar todos os requisitos acima apresentados.
Para efetuar o processo de validação de um método é necessário estudar os parâmetros selecionados, através da avaliação direta e da avaliação indireta (RELACRE, 2000).
4.2.1. Avaliação Direta
A avaliação direta dos parâmetros característicos de um método corresponde à análise da sua exatidão.
1) Exatidão
A exatidão de um método é definida como a concordância entre o valor real ou de referência do analito na amostra e o valor obtido pelo processo analítico, podendo ser calculada através do erro absoluto e relativo ou através de testes de significância, como o teste “t” de Student (Brito et al., 2003; Brito et al., 2002; Huber, 2007; Junior et al., 2001). O estudo deste parâmetro pode ser realizado três formas: através do uso de material de referência certificado (MRC), da realização de ensaios interlaboratoriais e da realização de testes comparativos(Brito et al., 2003; RELACRE, 2000).
a. Materiais de Referência Certificados
15 encontram sujeitos a padrões internacionais(Brito et al., 2003). Um MRC apresenta um valor de concentração, ou outra grandeza, para cada parâmetro e uma incerteza associada. O uso correto do MRC permite avaliar o desempenho do laboratório, uma vez que, caso os valores obtidos não se encontrem dentro do intervalo da incerteza indicado para o valor certificado, o laboratório deve procurar as causas e tentar eliminá-las(INMNQ, 2003).
De forma a avaliar os resultados obtidos utilizando o MRC deve proceder-se à comparação dos valores obtidos através da execução do método que se pretende validar, com os valores obtidos, para as mesmas amostras, por um método de referência. As conclusões retiradas da comparação permitem avaliar a exatidão dos resultados, bem como o erro a estes associado (Brito et al., 2003; INMNQ, 2003).
A avaliação dos resultados obtidos pode ser realizada a partir de vários processos, entre os quais se destacam (RELACRE, 2000):
Determinação do erro relativo;
Realização do teste de hipótese, teste t;
Determinação do fator de desempenho, Z-score; Determinação do erro normalizado.
Determinação do Erro Relativo
O erro relativo, ER, de um método permite avaliar a sua exatidão e pode ser determinada através da Equação 3, sendo reportada em percentagem.
% =
� x − �
� ×
Onde, Xexp corresponde ao valor obtido experimentalmente (ou a média aritmética de
valores obtidos) e Xv corresponde ao valor certificado do MRC.
O erro relativo está relacionado com a existência de erros sistemáticos.
É da responsabilidade do Laboratório definir a exatidão do método, tendo como base dados bibliográficos e valores certificados. Caso não existam, este parâmetro deve ser definido sob um critério de bom senso.
Caso o valor ER tenha sido revelado como igual ou inferior a 5 %, os dados obtidos pelo Equação 3
16
método são meramente indicativos (RELACRE, 2000). Realização do teste de hipótese, teste t de Student
O teste de hipótese permite ao laboratório averiguar a ocorrência de erros sistemáticos durante a execução do procedimento.
Este pode ser calculado através da Equação 4:
= (� x − � ). √ � x
Onde,
: número de amostras analisadas;
X x : desvio-padrão associado ao valor � x .
O valor t, em módulo, é calculado é posteriormente comparado com o valor tabelado, ttab, interpretando-se a relação da seguinte forma:
Caso 1: |t| ≤ ttab, a ocorrência de erros sistemáticos não é comprovada
estatisticamente, logo o ensaio é considerado satisfatório;
Caso 2: |t| > ttab a ocorrência de erros sistemáticos durante o procedimento ficou
estatisticamente comprovada, logo o ensaio não é considerado satisfatório (RELACRE, 2000). Determinação do fator de desempenho, Z-score
A determinação do fator de desempenho consiste noutro método de avaliação da exatidão de um ensaio.
O seu cálculo procede-se a partir da Equação 5:
=
�
exp− �
Onde, corresponde à unidade de desvio, que pode ser a incerteza associada ao MRC ou desvio-padrão. (RELACRE, 2000)
Equação 4
17 Os resultados são interpretados utilizando a seguinte escala de pontuação:
Caso 1: |Z| ≤ 2, satisfatório Caso 2: 2 ˂ |Z| ≤ 3, questionável Caso 3: |Z| > 3, incorreto
Determinação do Erro Normalizado
Para avaliar o desempenho do método procede-se ao cálculo da incerteza do resultado obtido pelo ensaio e o valor verdadeiro deve encontrar-se dentro do intervalo de incerteza do valor experimental. Caso contrário, utiliza-se o erro normalizado, En, para avaliar o desempenho. O seu cálculo é realizado através da Equação 6.
= � x − �
√ x +
Onde, x corresponde à incerteza associada ao valor obtido experimentalmente e corresponde à incerteza associada ao valor � .
Se o erro normalizado, em módulo, for igual ou inferior a 1, a incerteza associada ao valor experimental encontra-se bem determinada.
Caso os valores obtidos durante a avaliação de desempenho não sejam satisfatórios, deverá ser implementado um plano de ações corretivas, de forma a procurar as causas dos erros, determinar a sua correção e reavaliar o método.
b. Ensaios interlaboratoriais (RELACRE, 2000)
Os ensaios interlaboratoriais consistem em ensaios realizados no mesmo material ou item, por dois ou mais laboratórios, sendo as condições da sua realização pré-definidas e os dados avaliados por uma entidade. O tipo de ensaio realizado tem como base os objetivos desejados.
Caso o laboratório pretende avaliar a repetibilidade e a reprodutibilidade de um método (parâmetros associados à precisão) e apresentar em simultâneo que este possui uma precisão compatível com outros laboratórios, este deve efetuar em ensaio de normalização.
18
Caso queira evidenciar a exatidão dos seus resultados, o laboratório deverá efetuar um ensaio de aptidão.
O desempenho dos laboratórios é avaliado através da determinação do fator de desempenho, pelas entidades organizadoras, ou através do erro normalizado (procedimentos descritos no ponto anterior).
Ensaio de Normalização
Um ensaio de normalização apresenta como objetivo o estudo das características de um método de análise, especificamente a reprodutibilidade e a repetibilidade. Neste tipo de ensaio não é necessário proceder-se à comparação com as características de um método certificado e todos os laboratórios participantes devem utilizar o método em causa.
Ensaio de Aptidão
Um ensaio de aptidão é executado quando se pretende avaliar o desempenho de um grupo de laboratórios, com base na exatidão e precisão dos resultados dos seus ensaios.
É da responsabilidade de cada laboratório definir qual o método a utilizar, tendo no entanto de utilizar MRC.
c. Testes comparativos
A comparação dos valores obtidos através da execução de um método interno com os valores obtidos, para as mesmas amostras, por um método de referência permite avaliar a exatidão dos resultados, bem como a precisão a estes associada (Brito et al., 2003; INMNQ, 2003).
A exatidão do método interno relativamente ao método de referência pode ser avaliada através de vários critérios, mais precisamente, através do:
Teste de hipótese: teste t das médias;
Tese de hipótese: teste t das diferenças (amostras emparelhadas); Teste de regressão linear entre dois métodos de ensaio.
19
4.2.2. Avaliação Indireta
A avaliação indireta de um método corresponde à determinação dos parâmetros característicos deste e engloba a determinação da precisão, a quantificação, a seletividade/especificidade e a robustez (RELACRE, 2000).
1) Precisão
A precisão de um método permite avaliar a dispersão dos resultados obtidos entre vários ensaios independente sob uma amostra, sendo normalmente expressa como o desvio-padrão, variância ou o coeficiente de variação (Brito, et al., 2003).
A precisão é um parâmetro que pode ser considerado a diferentes níveis, tais como, ao nível da (Brito et al., 2003; INMNQ, 2003):
Repetibilidade, que expressa o grau de concordância entre os valores obtidos nas mesmas condições de medição, num curto espaço de tempo;
Precisão intermediária, que expressa a variabilidade das medições efetuadas, no mesmo laboratório ou em laboratórios diferentes, utilizando o mesmo método e definindo exatamente as condições a variar;
Reprodutibilidade, que expressa a precisão entre os resultados obtidos através da variação das condições de medição.
Normalmente, estes parâmetros são expressos através do desvio-padrão e do coeficiente de variação.
O coeficiente de variação, também conhecido como desvio padrão relativo (DPR) é expresso em percentagem e é calculado através da Equação 7.
% = ̅ ×i
Onde, i corresponde ao desvio-padrão de repetibilidade e ̅ corresponde à média dos valores considerados.
20
a. Repetibilidade
A repetibilidade pode ser determinada através da análise de padrões, material de referência ou adição a branco, com variação das concentrações na gama de trabalho. São exigidos testes pelo menos a 7 réplicas para proceder-se ao cálculo do desvio-padrão de cada concentração. Este parâmetro deve ser determinado sob as mesmas condições de medição, como por exemplo, o mesmo procedimento, o mesmo analista, o mesmo instrumento usado sob as mesmas condições e o mesmo local(INMNQ, 2003).
A repetibilidade pode ser determinada através de um ensaio interlaboratorial ou a partir de ensaio efetuados no próprio laboratório.
O limite de repetibilidade, r, corresponde ao limite superior do intervalo de valores onde se deve situar a diferença absoluta entre dois resultados de ensaio, obtidos sob condições de repetibilidade, com um nível de confiança de 95 %. Assim sendo, a diferença entre os valores obtidos para cada ensaio deve ser inferior ao limite de repetibilidade.
Este é calculado a partir da Equação 8, com um nível de confiança de 95 % (RELACRE, 2000).
= √ i = . √ i = . √ i
Onde,
i : desvio padrão de repetibilidade; √ i : variância de repetibilidade. b. Precisão Intermédia
A precisão intermédia é determinada através da análise a uma amostra, podendo ocorrer no mesmo laboratório ou em diferentes laboratórios. Esta é determinada através da comparação dos resultados obtidos utilizando o mesmo método e variando as condições de análise, como o analista, os equipamentos e o tempo (Huber, 2007; INMNQ, 2003).
Este parâmetro é reconhecido como o mais representativo da variabilidade de resultados, sendo por isso, o mais aconselhado a utilizar.
A determinação da precisão intermédia exige a realização de um número de ensaios, n, Equação 8
21 sobre a amostra nas condições anteriormente definidas. De seguida, os dados devem ser tratados, tendo em conta o ensaio e o tipo de aplicação do estudo.
Assim sendo, este parâmetro pode ser determinado: Através de cartas de controlo de amplitudes; Através da Equação 9. i = √ − ∑ ∑ − ̅� = = Onde,
i : desvio padrão de precisão intermédia;
: número de amostras analisadas durante o ensaio (não confundir com t de Student);
: número de ensaios efetuados por amostra; : número da amostra, que vai de 1 a ;
: número do resultado obtido para a amostra j, que vai de 1 a ; : resultado individual, , para a mostra de 1 a ;
�
̅ : média aritmética dos resultados da amostra , de 1 a . É recomendado que o valor − seja igual ou superior a 15.
Através da realização de n medições (n ≥ 15), sobre a mesma amostra, amostras supostamente idênticas ou padrões (RELACRE, 2000).
c. Reprodutibilidade
Ao nível da reprodutibilidade, o objetivo da sua determinação prende-se com a verificação do desempenho dos métodos realizados em diferentes laboratórios e com condições variadas de medição, através da comparação dos resultados obtidos com os dados determinados em diferentes laboratórios (Huber, 2007; INMNQ, 2003).
O limite de reprodutibilidade, R, corresponde ao valor abaixo do qual se deve encontrar a diferença absoluta entre dois resultados de ensaio, obtidos segundo condições de reprodutibilidade, com um nível de confiança de 95 %. O limite de reprodutibilidade é Equação 9
22
calculado através da Equação 8 e o coeficiente de variação, CV, através da Equação 7 (RELACRE, 2000).
d. Aceitabilidade das características de precisão do método
Quando a precisão de um método não pode ser comparada com um método de referência podem calcular-se valores teóricos de reprodutibilidade e de repetibilidade, através da equação de Horwitz (Equação 10).
� = − . [ ] Onde,
� : desvio-padrão relativo da equação de Horwitz; : concentração mássica de interesse;
[ ] : unidades em C se encontra expresso.
A partir do valor do desvio padrão relativo de Horwitz é possível calcular o valor de HORRAT. Assim, o valor de HORRAT, HO, é revelado a partir da razão entre o coeficiente de variação do método, para uma determinada concentração, e o valor do desvio padrão de Horwitz.
Caso os valores de HORRAT sejam menores ou iguais a 2, os valores da precisão podem ser considerados satisfatórios (CGA, 2010).
e. Comparação da precisão entre métodos (RELACRE, 2000)
A comparação da precisão entre métodos pode ser realizada através do teste F.
O teste F baseia-se no cálculo do valor do teste PG, que permite verificar se existem diferenças significativas entre as variâncias dos dois métodos. O valor PG expressa a razão entre a variância dos dois métodos, devendo estas ser colocadas de forma a PG ser maior ou igual a 1. Posteriormente, este valor deve ser comparado com o valor de F de Snedecor/Fisher, tendo em conta os graus de liberdade.
Caso o valor de PG seja igual ou inferior a valor de F, os dois métodos não apresentam diferenças significativas entre si.
23 2) Quantificação
A quantificação corresponde ao cálculo de vários parâmetros, entre os quais (RELACRE, 2000):
Curvas de calibração Limiares analíticos; Sensibilidade. a. Curvas de Calibração
A calibração consiste num processo onde a resposta de um sistema de medida está relacionada com uma concentração ou uma quantidade de substância conhecida. Para a sua determinação é necessário proceder-se à preparação de soluções-padrão de acordo com o definido no método de ensaio e efetuar a sua leitura (Santos, 2001).
Relativamente aos métodos instrumentais, os dados obtidos permitem construir um gráfico analítico que deve apresentar dados estatísticos de intersecção, da equação da regressão linear, o coeficiente de correlação ou de determinação e a concentração estimada das soluções-padrão.
O gráfico deve ser construído utilizando-se, no mínimo, cinco valores de concentração e um branco, distribuídos equitativamente na gama de concentrações, de maneira a apresentar adequadamente a relação entre a concentração e a resposta (Brito et al., 2003).
A forma algébrica da equação de uma reta é a que se apresenta na Equação 11 (Nunes, 2010).
= + Onde,
: resposta medida; : concentração do analito; : declive da curva de calibração; : ordenada na origem.
Para avaliar a calibração analítica deve proceder-se ao cálculo do coeficiente de correlação, r, que deve variar entre -1 (declive negativo da reta) e 1 (declive positivo da reta). Equação 11
24
Para a obtenção de bons resultados por interpolação, o coeficiente de correlação deve ser superior a 0,995 (RELACRE, 2000).
A Figura 4 apresenta um exemplo de uma curva de calibração obtida por HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Figura 4: Exemplo de Curva de Calibração obtida por HPLC, representando a área do pico cromatográfica (A) em função da concentração mássica do analito (C) (CatLab, 2009).
A calibração deve ser efetuada, preferencialmente, aquando a realização da análise à amostra, uma vez que as condições serão as mesmas e os resultados obtidos mais exatos.
Por norma e como se verifica na Figura 4 a curva calibração apresenta no eixo vertical (eixo yy) a resposta do equipamento e no eixo horizontal (eixo xx) a variação da concentração das soluções-padrão utilizadas. O ponto (x1, y1) corresponde normalmente ao branco, ou seja,
à solução que contém todos os reagentes, exceto o analito de interesse (RELACRE, 2000). Gama de trabalho
Este parâmetro é definido como o intervalo entre a concentração inferior e a concentração superior determinadas, para as quais foi demonstrado que o procedimento apresenta um nível aceitável de precisão, exatidão e linearidade. Normalmente, este parâmetro é expresso nas mesmas unidades dos valores obtidos (Huber, 2007).
A gama de trabalho pode ser avaliada pelo teste de homogeneidade das variâncias, no caso da utilização de metodologia que envolvem o traçado de curvas de calibração (RELACRE, 2000).
A
C /(g/L) A = a �
25 O teste de homogeneidade de variâncias compreende a realização de dez pontos de calibração distribuindo-se equitativamente na gama de concentrações. Dez réplicas independentes deverão ser analisadas relativamente à primeira e à última solução-padrão. Posteriormente são determinadas as variâncias associadas à primeira e última solução-- padrão, que permitirão examinar a possibilidade de existirem diferenças significativas entre elas. Para tal, procede-se ao cálculo do valor teste PG.
Os valores PG obtidos são comparados com valores tabelados da distribuição F de Snedecor/Fisher, para n-1 graus de liberdade onde, caso o valor de PG seja inferior ao valor tabelado, a gama de trabalho está bem ajustada e a diferença de variâncias não são significativas; caso o valor PG seja superior ao valor de F, existem diferenças significativas de variâncias e a gama de trabalho deve ser reduzida até que se obtenha PG ≤ F.
Para métodos que não envolvem a determinação de curva de calibração, a gama de trabalho deverá ser anteriormente definida e poderá ser função de fatores como a quantidade de amostra disponível, boa visualização de pontos de viragem e volumes gastos, no caso de volumetrias (RELACRE, 2000).
No caso da gama de trabalho já se encontrar definida com base na bibliografia, torna-se desnecessário analisá-la.
Linearidade (RELACRE, 2000)
Os coeficientes de correlação são bons indicadores de correlação, o que não significa que a curva seja linear. Para estudar esse parâmetro deve proceder-se ao cálculo da função de calibração linear e da função de calibração não linear, bem como os desvios-padrão residuais. Posteriormente procede-se ao cálculo das variâncias e do valor teste PG.
Comparando o valor PG com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor/Fisher e caso o valor PG seja inferior ao valor F, a função de calibração é linear; caso contrário, a função de calibração é não linear.
Na prática, a análise da linearidade da reta de calibração deverá ser sempre realizada através da sua representação gráfica complementando com a análise do coeficiente de correlação.
26
b. Limiares Analíticos Limite de Deteção
O limite de deteção (LD) consiste no teor mínimo medido, ou seja, na menor concentração do analito medida, mas não necessariamente quantificada, sob condições experimentais estabelecidas, a partir do qual é possível detetar a presença do analito com uma certeza estatística razoável.
Este parâmetro é normalmente definido pelos analistas aquando o desenvolvimento de novos métodos ou modificação dos métodos já existentes, em termos do desvio-padrão das medições dos brancos, uma vez que este não reflete as mesmas condições a que o analito estará sujeito durante a análise. Tal deve-se ao facto de este ser constituído por todos os reagentes, exceto a o analito. O limite analisado desta forma permite avaliar as mudanças que ocorrem durante o desenvolvimento do método, podendo também ser utilizado na comparação entre instrumentos (Brito et al., 2003).
Na prática, este parâmetro pode ser determinado através do declive da curva de calibração do método (sinal/ruído), do desvio-padrão da resposta e do coeficiente angular (sensibilidade do aparelho; declive da curva de calibração) associados aos procedimentos, ou por métodos estatísticos (Brito et al., 2003; Huber, 2007). No caso de métodos não instrumentais, como os métodos titrimétricos, é possível determinar o limite de deteção visualmente, através da viragem do indicador utilizado, onde o limite de deteção corresponde ao menor valor detetado que produz esse efeito (ANVISA, 2003).
A utilização dos métodos estatísticos requer o conhecimento de dois conceitos: erros do tipo I e erros do tipo II.
Os erros do tipo I consistem na probabilidade de, não existindo um componente na amostra, este ser reportado como presente durante a análise. A este tipo de erro encontra-se associado um risco, denominado risco .
Os erros do tipo II consistem na probabilidade de ser reportado pela análise a ausência de um componente, quando na verdade este se encontra presente na amostra. A este erro encontra-se associado um risco do tipo .
Estes dois tipos de erro devem ser minimizados, optando-se pelas recomendações da IUPAC, onde os riscos α e β devem ser inferiores 5 %. Estas diretivas permitem uma correta análise dos limiares analíticos (RELACRE, 2000).
27 Para o desenvolvimento de métodos quantitativos, o limiar de deteção é calculado da seguinte forma:
i. Geral (Equação 12)
LD = X0 + K �0
Onde,
X0 : média aritmética do valor medido durante a análise de uma série de
brancos ou padrões vestígio, entre 10 e 20 ensaios, preparados de forma independente e lidos ao longo de vários dias, em condições semelhantes;
�0 : desvio-padrão associado a X0;
K : valor calculado através do gráfico da distribuição normal, definindo o nível de confiança.
Caso a lei da probabilidade de X0 seja suficientemente conhecida e definindo um
nível de confiança de cerca de 99.5 %, o valor de K será ≅ 3.3.
ii. Método que envolve a utilização de uma calibração linear (Equação 13)
LD = [ . � ⁄ ] Onde,
⁄ : desvio-padrão residual da curva de calibração; : declive da curva de calibração.
Limite de Quantificação
O limite de quantificação (LQ) consiste na menor concentração do analito medida na amostra, com um nível de veracidade e precisão aceitáveis, sob as condições experimentais definidas no procedimento (Brito et al., 2003; RELACRE, 2000).
Este parâmetro é particularmente utilizado na determinação das impurezas ou da degradação dos produtos e é utilizado com frequência e preferencialmente nos relatórios de ensaio (Huber, 2007; RELACRE, 2000).
Na análise quantitativa, o limite de quantificação calcula-se da seguinte forma (RELACRE, Equação 12
28
2000):
i. Geral (Equação 14)
LQ = X0 +10 �0
Onde,
X0 : média aritmética do valor medido durante a análise de uma série de
brancos ou padrões vestígio, entre 10 e 20 ensaios, preparados de forma independente e lidos ao longo de vários dias, em condições semelhantes;
�0 : desvio-padrão associado a X0;
10 : coeficiente de variação recomendado pelo IUPAC.
ii. Solução- padrão vestígio ou branco fortificado (RELACRE, 2000)
Para determinar o LQ pode utilizar-se um conjunto de soluções-padrão vestígio ou brancos fortificados, elaborados de forma independente e testados em condições de precisão intermédia. Sobre estes serão realizados estudos de exatidão e de precisão.
A estimativa do LQ adotada é a concentração do analito presente na amostra, onde a precisão e exatidão se encontrem em níveis aceitáveis (inferiores ou iguais a 10 %).
iii. Método que envolve a utilização de uma calibração linear (Equação 15) (RELACRE, 2000)
LQ = [ � ⁄ ]
Onde,
⁄ : desvio-padrão residual da curva de calibração; : declive da curva de calibração.
c. Sensibilidade
A determinação da sensibilidade de um método permite verificar a capacidade deste Equação 14
29 distinguir pequenas diferenças de concentração de um analito (RELACRE, 2000).
Nos métodos sensíveis, uma pequena variação da concentração do analito emite uma grande variação no valor medido (Brito et al., 2003).
Para o caso de métodos de análise instrumentais, a sensibilidade pode ser definida como a razão entre a adição do valor lido, ∆L, e a variação da concentração, ∆C correspondente. Caso o método envolva uma curva de calibração, este parâmetro pode ser determinado através da primeira derivada da curva de calibração no ponto que corresponde a essa zona de concentração. Se a curva se verificar linear, a sensibilidade corresponde ao declive da reta de calibração, constante ao longo da gama de trabalho (RELACRE, 2000).
Para um método volumétrico, a sensibilidade, , é determinada pela relação entre a estequiometria do titulante e do titulado, no ponto de equivalência- Equação 16 (Harvey, 2009).
T = × A , Onde é obtido da seguinte forma:
T = A
⇔ A = T × T ⇔ T = �� × A, Ou seja, =�
� .
A sensibilidade do método volumétrico pode ser aperfeiçoada reduzindo a concentração do titulante, que se verifica ser inversamente proporcional ao .
Para titulações dipróticas, este parâmetro pode ser melhorado através da realização da titulação no segundo ponto de equivalência, que resultará num valor de correspondente a
= �
� (Harvey, 2009).
3) Seletividade/Especificidade
Pode classificar-se um método como sendo seletivo quando este apresenta a capacidade de identificar e distinguir um determinado analito numa amostra complexa, sem interferência Equação 16
