Maisa da Silva Araújo
EFEITOS DA QUANTIDADE DE ALIMENTO E DA DENSIDADE LARVAL
NA BIOLOGIA DO VETOR DA MALÁRIA - Anopheles darlingi
(DIPTERA: CULICIDAE).
Porto Velho 2008
EFEITOS DA QUANTIDADE DE ALIMENTO E DA DENSIDADE LARVAL
NA BIOLOGIA DO VETOR DA MALÁRIA - Anopheles darlingi
(DIPTERA: CULICIDAE).
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Rondônia, para obtenção do título de Mestre, pelo programa de Pós-graduação em Biologia Experimental – Área de concentração: Entomologia.
Orientador: Alexandre de Almeida e Silva
Porto Velho 2008
Catalogação Biblioteca Central / UNIR
A5861i Araújo, Maisa da Silva
Efeitos da quantidade de Alimento e da densidade Larval na Biologia do Vetor da Malária – Anopheles darlingi (DIPTERA: CULICIDAE)./ Maisa da Silva Araújo. Orientador Alexandre de Almeida e Silva. – Porto Velho, 2008.
86f.
Dissertação apresentada à Fundação Universidade Federal de Rondônia para obtenção do título de Mestre em Biologia
Experimental
1.Entomologia 2. Malária I.Título
CDU : 595.7
Efeitos da quantidade de alimento e da densidade larval na biologia do vetor da malária - Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Rondônia, para obtenção do título de Mestre, pelo programa de Pós-graduação em Biologia Experimental – Área de concentração: Entomologia.
Aprovado em ___/___/____
Que em todos os momentos, sempre
Me deram força através de seu amor.
À minha tia Maria das Graças (In memorian) que
demonstrou grande fé e coragem diante da sua doença. À
minha amiga Reginéia Aparecida (In memorian) pelo seu
exemplo de determinação.
E ao meu grande incentivador e amigo, M.R.
Merci d’avoir enchanté ma vie.
AGRADECIMENTOS
Foram muitos, os que me ajudaram a concluir este trabalho. Meus sinceros agradecimentos...
À Deus, pelas benções que recebo todos os dias.
Ao meu amigo e companheiro de estudo Roberto, o qual me apresentou o Max, que me ensinou a identificar os culicineos e a gostar de entomologia médica.
Ao responsável pelo laboratório de entomologia do IPEPATRO, Luiz Herman Soares Gil, por ter me aceitado como estagiaria e confiar no meu trabalho, além de me incentivar a continuar nesta área de Entomologia Médica.
Ao Dr. Alexandre de Almeida e Silva pelas orientações e apoio para execução deste trabalho.
Ao Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais – IPEPATRO, por todo apoio financeiro e logístico para a realização deste trabalho.
Ao Diretor Geral do IPEPATRO, professor Luiz Hildebrando Pereira da Silva. Ao Diretor Científico, Dr. Rodrigo Stábeli.
À Diretora de Assuntos Acadêmicos do IPEPATRO, Dra Vera Engracia Oliveira.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pela bolsa de mestrado.
Ao Professor Salomão David Ferreira que sempre se mostrou solícito em todos os momentos de dúvidas que sugiram no decorrer deste trabalho.
Aos demais colegas e amigos do IPEPATRO/CEPEM, Aline, Gleysa, Kayena, Ângela, Rosineide, Joana, Vânia, Marlene, Giovanni, Enéias, Sr. Raimundo, Paulo, Beto, Andreilson, Siliane, Rose, Sr. Pedro, Márcio, Sr. Messias, Kiki e demais funcionários por toda ajuda e colaboração.
Aos professores do mestrado, Vera Engracia, Maria Manuela Moura, Rodrigo Stábeli, Gehard Underlich, Rubiani Pagotto, Gilson Silva, profº Hildebrando Pereira da Silva, Paulo Nogueira, Juan Miguel, Valdir Facundo, Ana Escobar e Izaldina Jardim pelos ensinamentos.
Aos companheiros do mestrado, Reginéia (in memorian), Elaine, Cléia, Rudson, André, Soraya, Helen, Taísa, Davi, Sheila e Socorro.
Às minhas amigas que compreenderam a minha ausência em alguns momentos, Ângela, Franqueneide e Crisbele.
À Joana D’Arc e a minha amiga Franqueneide, pela simpatia e compreensão nas correções.
“Para mim, sábio não é aquele que proclama palavras de sabedoria, mas sim aquele que
demonstra sabedoria em seus atos”.
(São Gregório)
FIGURA 1 - Distribuição das áreas de risco da malária no mundo...16
FIGURA 2 - Casos de malaria no Brasil...17
FIGURA 3 - Distribuição da malária no Brasil -2006...18
FIGURA 4 - Mapa do Estado de Rondônia...19
FIGURA 5 - Ciclo biológico do Plasmodium sp. ...22
FIGURA 6 - Distribuição das espécies de Anopheles no globo terrestre...24
FIGURA 7 - Ciclo de vida do Anopheles...28
FIGURA 8. Diagrama da asa de An. darlingi...43
FIGURA 9 - Curva da sobrevivência larval de Anopheles darlingi submetidos a crescentes concentrações de alimento...48
FIGURA 10 - Proporção de fêmeas de Anopheles darlingi picando a cada dia, cujas larvas foram submetidas a crescente concentração de alimento...50
FIGURA 11 - Longevidade e tamanho da asa dos adultos cujas larvas foram submetidas a crescentes concentrações de alimento...51
FIGURA 12 - Longevidade e tamanho da asa de machos e fêmeas obtidos de larvas submetidas a crescente concentração de alimento...52
FIGURA 13 - Curva de sobrevivência larval de Anopheles darlingi em alta concentração de alimento em crescente densidade...56
FIGURA 14 - Proporção de fêmeas de An. darlingi picando a cada dia...58
TABELA 1 - Parâmetros biológicos avaliados...38 TABELA 2 - Concentrações de alimento (mg) oferecidas às larvas de Anopheles
darlingi. ...38
TABELA 3 - Tabela de sobrevivência com estádios medianos em intervalos de 24h para as larvas de Anopheles darlingi submetidos a crescente concentração de alimento...43 TABELA 4 - Duração e sobrevivência dos estádios larvais de Anopheles darlingi
submetidos a crescente concentração de alimento. ...47
TABELA 5 - Alguns aspectos comportamentais e biológicos de fêmeas de Anopheles
darlingi alimentadas diariamente com sangue humano, obtidas de larvas
submetidas a crescentes concentrações de alimento. ...49 TABELA 6 - Tabela de sobrevivência com estádios medianos em intervalos de 24h para as larvas de Anopheles darlingi submetidos a alta e baixa concentração de alimento em crescente densidade larval...53 TABELA 7 - Duração dos estádios larvais (%) de Anopheles darlingi submetidas a alta e baixa de concentração de alimento em crescente densidade...54 TABELA 8 - Sobrevivência larval (%) de Anopheles darligi submetidas a alta e baixa
concentração de alimento em crescente densidade...55 TABELA 9 - Alguns aspectos comportamentais e biológicos de fêmeas de Anopheles
darlingi alimentadas diariamente com sangue humano, cujas larvas foram
submetidas a alta e baixa concentração de alimento em crescente
densidades...57 TABELA 10 - Longevidade e tamanho da asa dos adultos de Anopheles darlingi cujas
larvas foram submetidas à alta e baixa concentração de alimento em crescente densidade...59
Ae. - Aedes
AM - Amazonas
An. - Anopheles
ANOVA - Análise de Variância CO2 - Dióxido de carbono
CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CEPEM - Centro de Pesquisa em Medicina Tropical F1 - primeira geração
HRB - Hour Biting Rate
IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis IPEPATRO - Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais
MS - Ministério da Saúde
P. - Plasmodium
RO - Rondônia
SIVEP - Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica da Malária WHO - World Health Organization
p. RESUMO
SUMMARY/ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO...15
1.1. MALÁRIA...15
1.2. MODO DE TRANSMISSÃO DA MALÁRIA...20
1.3. VETORES DA MALÁRIA...23
1.4. CICLO DE VIDA DO VETOR...27
1.5. FATORES QUE AFETAM O DESENVOLVIMENTO LARVAL...29
1.6. ALIMENTAÇÃO E DENSIDADE LARVAL...31
2. OBJETIVOS...36
2.1. OBJETIVO GERAL...36
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...36
3. MATERIAL E MÉTODOS...37
3.1. COLONIZAÇÃO DE Anopheles darlingi...37
3.2. EFEITO DA QUANTIDADE DE ALIMENTO NO ESTÁGIO LARVAL...38
3.3. DENSIDADE LARVAL...39
3.4. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS BIOLÓGICOS DO VETOR...40
3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA...43
3.6. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS...43
4. RESULTADOS...45
4.1. EFEITO DA QUANTIDADE DE ALIMENTO...45
4.2. EFEITO DA DENSIDADE LARVAL...52
5. DISCUSSÃO...60
5.1. EFEITOS DA QUANTIDADE DE ALIMENTO E DENSIDADE LARVAL NO DESENVOLVIMENTO LARVAL...60
5.2. EFEITOS DA QUANTIDADE DE ALIMENTO E DA DENSIDADE LARVAL NO ESTÁGIO ADULTO...65
Maisa da Silva Araújo
Resumo: A incidência de malária na Amazônia, assim como em outras regiões tropicais, sofre variações com as estações do ano, principalmente devido à variação do número de criadouros. As mudanças climáticas alteram as características físico-químicas dos criadouros, podendo alterar, consequentemente, a disponibilidade de alimento para os estádios imaturos dos vetores, causando alterações biológicas nos adultos, i.e., na capacidade vetorial. Na Amazônia o principal vetor é o Anopheles
darlingi, sendo responsável por 99% dos casos de malária na região. Apesar da sua
importância na transmissão da doença, o conhecimento sobre a biologia e ecologia da forma larval é ainda limitado. Estudos com adultos têm sido realizados com freqüência, no entanto, há uma necessidade do conhecimento dos fatores que afetam a biologia do vetor, a fim de possibilitar medidas de controle mais efetivas. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos da quantidade de alimento e densidade larval na biologia do vetor Anopheles darlingi em condições laboratoriais. As larvas foram divididas em três grupos cada um com cem indivíduos/bacias, e receberam três diferentes concentrações de alimento que variavam entre 3 e 6 mg/larva, com três repetições cada à temperaturas de 28 ºC, 80% de umidade e fotoperíodo de 12h. Três densidades foram testadas com e sem restrição de alimento sob as mesmas condições e repetições da quantidade de alimento larval. Amostras de adultos de cada tratamento foram acompanhadas para observação da longevidade, tamanho da asa e freqüência de picadas para a determinação da capacidade vetorial. O tempo de desenvolvimento e a sobrevivência larval apresentaram diferenças significativas com o aumento da concentração de alimento e densidade larval. Os efeitos nos adultos foram mais observados quando havia uma variação na quantidade de alimento. A densidade apenas afetou o tamanho da asa e a longevidade, apresentando alterações na capacidade vetorial. Enquanto que, o aumento da concentração de alimento larval causou aumento positivo na longevidade, freqüência de picadas, duração do repasto sanguíneo e tamanho da asa e, assim, apresentou maior capacidade vetorial. Houve correlação positiva entre a freqüência de picadas, o tamanho da asa e a longevidade. As fêmeas apresentaram maior longevidade que os machos apesar de apresentarem menor tamanho da asa. De forma geral, observou-se um aumento na produção de larvas e adultos com o aumento da disponibilidade de alimento e a diminuição da densidade larval, produzindo adultos maiores com mais tempo de vida, o que contribui para o aumento da taxa de oviposição e a freqüência de picadas, fatores importantes para o aumento da transmissão da malária.
Palavras-chaves: Anopheles darlingi. desenvolvimento larval. viabilidade dos adultos. capacidade vetorial.
Maisa da Silva Araújo
Abstract: The incidence of malaria in the Amazon and in other tropical regions undergoes changes within the seasons along the year, mainly due to the variation in the number mosquito breeding sites and also their physicochemical characteristics. Thus, altering the availability of food for the immature stages of vectors, causing biological changes in adults, e.g., the vectorial capacity. Anopheles darlingi is the main malaria vector in the Amazon, accounting for 99% of the mosquitoes captured in the region. Despite its importance in the transmission of the disease, current knowledge about the biology and ecology of larvae is still limited. Studies with adults have been performed frequently, however, there is a need for more data of the factors that affect the biology of the vector, to provide more effective control measures. The objective of this study was to investigate the effects of the quantity of food and larval density in the biology of the vector Anopheles darlingi in laboratory conditions. The larvae were divided into three groups each with one hundred individuals/basin, and received three different concentrations of food that ranged between 3 and 6 mg/larva, with three repetitions each to temperatures of 28 °C, 80% humidity and pho toperiod of 12h. Three densities were tested with and without restriction of food under the same conditions and number of repetitions larval food. Samples of adults in each treatment were followed for observation of longevity, wing length and frequency of bites for determining the vectorial capacity. Duration of development and larval survival had significant differences with the increase of concentration of food and larval density. The effects in adults were apparently most related to variation in the quantity of food. The density only affected the wing lenght and longevity, changing the vectorial capacity. Meanwhile, the increase in concentration of larval food caused positive increase in longevity, frequency of bites, blood meal duration and wing length, leading to higher vectorial capacity. There was a positive correlation between the frequency of bites, the size of the wing and longevity. The females had greater longevity than males but smaller size of the wing. Overall, there was an increase in the survival of larvae and adults with increased availability of food and the reduction of larval density, producing larger mosquitoes with extended lifespan, possibly contributing to higher fecundity and bite frequency, important factors to the increased transmission of malaria.
1. INTRODUÇÃO
1.1. MALÁRIA
A malária é um dos mais sérios e graves problemas de saúde pública no mundo enfrentado pela humanidade. Em todo o mundo, aproximadamente 400 milhões de pessoas são infectados pela doença e entre 1 a 1,5 milhões morrem todos os anos. Aproximadamente 40% (2,4 bilhões) da população vive em áreas de risco, principalmente os habitantes dos países tropicais e subtropicais (WHO, 2007).
A transmissão ocorre em países da América Central, América do Sul, América do Norte (México), África sub-saariana, Índia, Sudeste da Ásia, Oriente Médio e Oceania (Figura 1). Entretanto, mais de 90% dos casos ocorrem em países da África, onde a malária por Plasmodium falciparum, conhecida pela sua gravidade, provoca cerca de 1 a 2 milhões de mortes de crianças menores de 5 anos (WHO, 2007).
Figura 1: Distribuição das áreas de risco da malária no mundo em 2007. Fonte: http://rbm.who.int
O Brasil tem o maior número de casos de malária das Américas, com aproximadamente 40% do total de casos do continente e ocupa o terceiro lugar em incidência da doença no mundo (WHO, 2007).
Desde 1970, quando cerca de 52.000 casos foram relatados no Brasil, a malária vem aumentando gradativamente. Entre 1990 a 1999 o número de casos ultrapassou 500.000, sendo que no último ano foram 610.000 casos notificados no Brasil (Ministério da Saúde, 2003). O número de casos de malária diminuiu consideravelmente em 2001 e 2002, talvez por causa da intensificação dos programas de controle, mas o registro da doença voltou a crescer no período de 2003 a 2005 (Figura 2).
Figura 2. Casos de malaria no Brasil, segundo espécies de Plasmodium, 1970-2005. Fonte: Sivep-Malária, Ministério da Saúde 2005.
Aproximadamente 99,7% dos casos de malária no Brasil ocorrem na Amazônia. A área endêmica da região Amazônica é composta pelos estados do Acre, Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima e parte do Mato Grosso, Maranhão e Tocantins (Figura 3), que juntas registram cerca 500 mil casos ao ano (WHO, 2007). A região Amazônica apresenta características favoráveis à manutenção de doenças transmitidas por vetores, dadas as condições naturais e modificações antrópicas, ocorridas nas últimas décadas. A doença acomete principalmente populações que vivem em condições insatisfatórias de saúde e moradia. Devido a ocupação desordenada de terras, a exploração manual de minérios, a projetos de assentamento e colonização agrária e a intensa migração da zona rural para a periferia de cidades amazônicas.
Figura 3. Distribuição da malária no Brasil em 2006 Fonte: Sivep- Malária, Sinan/SVS/MS
Várias epidemias de malária foram registradas no estado de Rondônia, sempre relacionadas com as grandes migrações para o estado. A começar pelos primeiros exploradores que navegavam pelos rios Madeira e Mamoré, os nordestinos que vieram para trabalhar na extração da borracha, durante a construção da Estrada de Ferro Madeira-Mamoré e construção da BR-364 (CASTRO et al., 2005).
O maior número de casos de malária registrado no estado nos últimos anos foi de 278.408, em 1988, quando a população atingiu 1.019.200 habitantes. Este número
representou mais de 50% de todos os casos de malária do Brasil naquele ano. A partir de então, apesar de apresentar oscilações nos dados epidemiológicos, a transmissão da malária no estado permanece sempre alta. Em 2006, atingiu 100.273 casos da doença (SIVEP-MS, 2007).
O estado de Rondônia, localiza-se ao Norte do Brasil, tem fronteiras com a Bolívia, Acre, Amazonas e Mato Grosso ao nível de 63º de longitude oeste e 8º de latitude sul. Apresenta clima tropical, com períodos de chuvas (outubro – maio) e períodos de seca (junho – setembro). Possui áreas de Planície Amazônica, do Vale do Guaporé e áreas de relevo a Chapada dos Parecis na região centro-sul. Os principais rios são Rio Madeira, Mamoré, Guaporé, Jamari e Machado (Figura 4) (LIMA, 1997).
Figura 4. Mapa do Estado de Rondônia, com destaque para a capital de Porto Velho. Fonte: www.guianet.com.br/ro/maparo.gif
Desde a década de 1980 a capital de Rondônia, Porto Velho, ocupa freqüentemente o primeiro lugar em termos de números de casos de malária no país, tendo perdido nos últimos dois anos para Manaus (AM) e Cruzeiro do Sul (AC) (SIVEP malária, 2007). Dos casos de malária na capital, 80% incide em áreas ribeirinhas ou associadas a estas (ALVES et al., 2002; COURA et al., 2006).
1.2. MODO DE TRANSMISSÃO DA MALÁRIA
A malária é uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero
Plasmodium. A transmissão é realizada por mosquitos do gênero Anopheles, como
observado desde o fim do século XIX por Ronald Ross.
Existem cerca de 120 espécies de plasmódios, dos quais apenas quatro espécies infectam atualmente o homem:
• Plasmodium falciparum (Welch, 1897);
• Plasmodium malarie (Laveram, 1881);
• Plasmodium vivax (Grassi & Feletti, 1890);
• Plasmodium ovale (Stephens, 1922);
Ainda pode ocorre a infecção mista com P. falciparum e P. vivax ou P. vivax e P.
malariae. O P. vivax causa uma doença mais branda, a terçã benigna, que, no entanto,
tem o inconveniente de retornar após ter sido aparentemente curada. Isso porque nas células do fígado do homem infectado podem permanecer algumas formas em hibernação. O P. falciparum é responsável por uma forma muito grave de malária, chamada de terçã maligna. Das mortes anuais devidas a malária, mais de 95% são causadas pelo P. falciparum. O P. malariae é conhecido como forma quartã, sendo a única espécie que pode ser encontrada em chipanzés na África e em alguns macacos na Amazônia. No Brasil, as infecções causadas por esse parasita são relativamente raras, sua parasitemia é moderada, acomete predominantemente as hemácias maduras e é a mais persistente forma de malária. A malária por P. ovale é restrita ao continente
africano, podendo ocasionalmente ser diagnosticada no Brasil. São infecções muito benignas, com febre moderada, de forma terçã.
Nas quatro espécies de Plasmodium que acometem o homem, o ciclo de vida é essencialmente o mesmo. É um protozoário que necessita obrigatoriamente de dois hospedeiros para completar seu ciclo: um invertebrado (o mosquito) e um vertebrado (o homem). Apresentando uma fase sexuada exógena (esporogonia) com a multiplicação dos parasitas nos mosquitos Anopheles e duas fases assexuada endógena (esquizogonia) com a multiplicação no hospedeiro humano. Subdivide-se em esquizogonia tecidual, que ocorre nas células do parênquima hepático e esquizogonia eritrocítica, onde ocorre o desenvolvimento do parasita nos glóbulos vermelhos (Figura 5).
Figura 5. Ciclo biológico do Plasmodium sp.
1.3. VETORES DA MALÁRIA
Os transmissores da malária são insetos da ordem Diptera, da família Culicidae e do gênero Anopheles. As espécies do gênero Anopheles apresentam uma ampla distribuição geográfica e podem ser encontradas em ambientes diversos, desde desertos às florestas tropicais (Figura 6) (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994). Existem cerca de 400 espécies de Anopheles descritas no mundo, mas somente 60 são vetores da malária em condições naturais, das quais 30 têm maior importância epidemiológica (FORATTINI, 2002; DEPINAY et al., 2004). No Brasil, existem nove espécies que são consideradas vetores da malária:
• Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi (Root, 1926);
• Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis (Lynch-Arribalzaga, 1878);
• Anopheles (Nyssorhynchus) aquasalis (Curry, 1832);
• Anopheles (Nyssorhynchus) braziliensis (Chagas, 1907);
• Anopheles (Nyssorhynchus) nuneztovari (Galbadon, 1940);
• Anopheles (Nyssorhynchus) oswaldoi (Peryassú, 1922);
• Anopheles (Nyssorhynchus) triannulatus (Neiva & Pinto, 1922);
• Anopheles (Kerteszia) cruzii (Dvar Kanab,1908);
Figura 6. Distribuição global de vetores dominantes de malária - 2005. Fonte: http://rbm.who.int/wmr2005/html/map2.html
Estão descritas na região amazônica 33 espécies de anofelinos (DEANE, 1986; TADEI et al., 1998), porém, apenas sete estão relacionadas com a transmissão de malária (os sete primeiros na lista dos vetores no Brasil), sendo o An. darlingi considerado como a espécie mais importante (TADEI & THATCHER, 2000; KISZEWSKI et al. 2004). Cada região do mundo tem sua fauna específica de Anopheles e a epidemiologia da malária depende da composição dessa fauna (CAMARGO, 2003).
O An. darlingi é o principal vetor na região norte, em quase todos os estados é considerado o vetor primário. Em Rondônia é o principal, em algumas áreas o único, responsável pela alta incidência de malária em áreas periurbanas da capital, Porto Velho, podendo ser encontrado nas capturas em números superiores a 90% (GIL et al., 2007). Esta espécie tem hábitos crepusculares, que podem se estender durante toda à
noite, dependendo da região e das condições climáticas (TADEI & THATCHER 2000; GIL et al., 2003). É altamente antropofílico e sua presença é predominante no peridomicílio, embora apresente característica endofílica, sendo muitas vezes a única espécie a invadir o intradomicílio, mesmo em baixa densidade (TADEI et al., 1998; FORATTINI, 2002; GIL et al. 2007). Além disso, é altamente competente em transmitir o parasita ao seu hospedeiro (TADEI & THATCHER, 2000).
O Anopheles darlingi é altamente susceptível aos plasmódios humanos, sendo o único anofelíneo brasileiro no qual foram detectadas infecções naturais pelos três plasmódios que causam malária humana – P. vivax, P. falciparum e P. malariae (KLEIN et al. 1991a, b e c; RUBIO-PALIS 2000, FLORES-MENDOZA et al., 2004, PÓVOA et al., 2006). A presença desse mosquito esta sempre relacionada à presença humana. Tanto que, na Amazônia, a população do An. darlingi apresentou tendência de menor densidade em florestas virgens do que em áreas que sofreram intervenções humanas (TADEI & THATCHER, 2000). É o anofelino que mais rapidamente se beneficia das alterações que o homem produz no ambiente, como: a substituição da floresta por plantações, habitações precárias, pastagens, garimpos, entre outras atividades (TADEI et al., 1998; TADEI, 1999).
A incidência de malária na Amazônia, assim como em outras regiões tropicais, sofre variações com as estações do ano (FORATTINI, 2002; TADA et al., 2007; MAGRI et al., 2007). Pois a densidade do principal vetor da região esta relacionada a sazonalidade da região, acompanhando o nível das águas dos rios e os períodos de chuvas e secas (DEANE, 1986; TADEI, 1997).
O aumento na pluviosidade resulta em uma elevação no número de mosquitos viáveis, ocasionando alto índice de casos de malária. Por outro lado, quando as chuvas são muito fortes, podem arrastar as larvas desses mosquitos para locais inadequados, destruindo criadouros, que conseqüentemente provoca um alto índice de mortalidade larval e diminuição na densidade vetorial, o que resulta num declínio da incidência de malária. Portanto, o período de maior densidade de mosquitos coincide com a estabilização dos seus criadouros, logo após a estação de chuva e início da estação seca (DEANE, 1986; TADEI, 1997; MAGRI et al., 2007).
exemplo disso é observado na Fazenda Urupá na cidade de Porto Velho/RO, onde a formação de um criadouro permanente possibilita que a densidade vetorial e o índice de malária sejam altos durante a estação da seca (GIL et al., 2003).
Embora seja o principal vetor da região amazônica, é surpreendente que se tenha sido feito poucos estudos da ecologia de sua forma imatura (HARBACH et al., 1993; MANGUIN et al., 1996; REJMANKOVA et al., 2000; ACHEE et al., 2006). Pois os estudos da dinâmica populacional desse vetor estão diretamente relacionados aos estudos da bioecologia de suas larvas (GIMNIG et al., 2001; DEPINAY et al., 2004; PFAEHLER et al., 2006). Existe uma considerável lacuna em nossos conhecimentos sobre a densidade sazonal, freqüência de picadas, longevidade dos adultos e preferência por horário de picadas dos mosquitos An. darlingi em Rondônia (GIL et al., 2003), que podem ser explicadas pelas variações da qualidade do meio aquático, onde ocorre o desenvolvimento larval.
Desde o conhecimento do agente transmissor da malária e a elucidação do ciclo completo do parasita, o vetor vem sendo um dos alvo para o controle da doença (COX, 1993). Mas, como muitas espécies vetoras têm apresentado resistência contra os inseticidas utilizados, a outra opção seria as formas imaturas, pela eliminação de seus criadouros e uso de larvicidas. Atualmente o controle da malária engloba três linhas: diagnóstico precoce e pronto atendimento, controle larval e dos vetores (LOIOLA et al., 2002).
Dentre as principais dificuldades encontradas para o controle da malária existe insuficiente conhecimento sobre a bioecologia dos vetores e suas formas imaturas. Sendo necessário dessa forma estudar os hábitos e costumes dos adultos e larvas do vetor, antes de tomar a decisão de estratégias de controle (LEÃO, 1997; TADEI & THATCHER, 2000).
1.4. CICLO DE VIDA DO VETOR
O An. darlingi tem como criadouros, grandes volumes de água como represas, lagos, lagoas e remansos de rios, prefere águas profundas, límpidas, parcialmente sombreadas, calmas e não muito ricas de matéria orgânica e raramente usam águas poluídas para sua reprodução. A vegetação flutuante dos rios contribui para sua dispersão e transporte (DEANE, 1986; CHARLWOOD, 1996).
A existência desses criadouros tem relação com vários fatores relacionados a atividade humana, como a criação de barragens, agricultura por canais abertos, escavação para construção de estradas, desmatamento de florestas, degradação do meio ambiente pelos garimpeiros e outros. Além de está relacionado ao índice pluviométrico anual elevado da região amazônica, onde ocorre constante cheia dos rios formando imensos lagos artificiais que proporcionam a formação de novos criadouros além da manutenção dos criadouros permanentes dos mosquitos (DEANE, 1948; TADEI et al., 1998; GIL et al., 2003, 2007).
O desenvolvimento do Anopheles é dividido em duas fases: aquática, que compreende três estágios imaturos - ovo, larva e pupa – e área, que compreende o estágio adulto (Figura 7). Os ovos são postos isoladamente e medem cerca 0,5 milímetro de comprimento, em suas laterais encontram-se os flutuantes que facilitam a sua permanência na superfície da água. O estágio larvário compreende quatro estádios de vida livre e apresentam grande mobilidade, apresentam um aspecto vermiforme e coloração esbranquiçada podendo variar conforme o habitat em que vivem e o tipo de alimento. Neste estágio, elas permanecem a maior parte do tempo na superfície para a respiração do ar atmosférico, pois não possuem sifão respiratório e para a alimentação das partículas presentes na superfície.
Figura 7. Ciclo de vida do Anopheles. Fonte: Rey, 2001.
A fase pupal corresponde ao período de transição em que ocorrem grandes transformações que resultam na formação do adulto e, conseqüentemente, a mudança do meio aquático para o meio terrestre. É durante essa fase que não ocorre alimentação (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; LASSITER et al., 1995; MUTUKU et al., 2006). As pupas apresentam aspecto de vírgula e são bastante móveis quando perturbadas, mas estão quase sempre paradas em contato com a superfície da água (FORATTINI, 2002).
Quando adultos, medem em geral menos de um centímetro de envergadura, apresentam corpo delgado e pernas longas (FORATTINI, 2002; KOENRAADT et al., 2003). As fêmeas após emergirem dispersam dos criadouros em que no estágio imaturo se desenvolveu. A fêmea fecundada, geralmente uma única vez, inicia um ciclo que é mantido durante o resto de sua vida entre a obtenção do repasto sanguíneo e a oviposição em ambientes aquáticos (FORATTINI, 2002; DEPINAY et al., 2004).
Os mosquitos adultos, basicamente, devem adquirir água e substâncias alimentares energéticas, geralmente constituídas por carboidratos em suficiente quantidade para possibilitar o desempenho de algumas funções primordiais a sua existência, como o vôo, a dispersão e as múltiplas atividades biológicas, com exceção à maturação dos ovos (CLEMENTS, 1992).
O metabolismo energético da grande maioria dos mosquitos adultos, machos e fêmeas, depende da ingestão de carboidratos, normalmente provenientes de seivas de flores e frutos (FORATTINI, 2002).
O repasto sangüíneo das fêmeas está relacionado primordialmente com o desenvolvimento dos ovos (FORATTINI, 2002). O sangue dos vertebrados é rico em aminoácidos e esses nutrientes são convertidos em substâncias protéicas integrantes do vitelo (CABRINI & ANDRADE, 2006). Entretanto, o repasto sanguíneo pode também contribuir para aumentar a sua longevidade, refletindo diretamente na dinâmica de transmissão de doenças (GARY & FOSTER, 2001).
A expectativa de vida das fêmeas é um fator muito importante para que a espécie seja um bom vetor, pois é preciso que haja um tempo suficiente para o ciclo esporogônico se complete, além de aumentar a oportunidade de o mosquito entrar em contato com o hospedeiro (FORATTINI, 2002).
A estratégia usada pelas fêmeas dos mosquitos para encontrar as fontes sangüíneas é decorrente de vários estímulos, como a presença de CO2, umidade, ácido
láctico e visão (CABRINI & ANDRADE, 2006).
1.5. FATORES QUE AFETAM O DESENVOLVIMENTO LARVAL
Dentro do habitat larval, as formas imaturas dos anofelíneos estão sujeitas a vários fatores ambientais que interferem no seu desenvolvimento e sobrevivência, como temperatura, salinidade da água, pH, luz, densidade, predadores e alimentação (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994). Atualmente, esses fatores estão sendo objetos de estudo para muitos pesquisadores para a observação dos efeitos que podem causar na biologia do vetor da malária. (KOENRAADT et al., 2003; TOWNSEND et. al., 2003; BAYOH & LINDSAY, 2004; KAUFMAN et. al., 2006). Os principais fatores são: nutrição (MERRIT et al., 1992; CLEMENTS, 1992), densidade larval (SCHNEIDER et al., 2000), temperatura (CLEMENTS, 1992; ATKINSON, 1994; BAYOH & LINDSAY,
predadores (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; DEPINAY et al., 2004). A nutrição larval é um importante fator no desenvolvimento e na sobrevivência larval. Podendo ser avaliado de duas formas, quanto a sua qualidade nutricional como na quantidade de alimento disponível (GIMNIG et al., 2002). Apresenta um papel muito importante no processo de pupação, assim como na emersão dos adultos (DEPINAY et al., 2004).
A densidade larval pode provocar a competição por espaço ou por alimento entre as larvas (LEÓNARD & JULIANO, 1995). Em algumas espécies, a alta densidade pode até mesmo levar ao canibalismo entre larvas consideradas não predadoras (SEIFERT & BARRERA, 1981).
A temperatura é um crítico regulador de crescimento e desenvolvimento de cada estádio imaturo dos mosquitos, determinando o final de um estádio e o início do próximo e regular o período do ciclo gonotrófico das fêmeas adultas (DEPINAY et al., 2004). O fato dos insetos, em geral, serem animais de sangue frio faz com que a temperatura de seu corpo varie com a temperatura do meio em que se encontram, dentro de certos limites (LARA, 1992). Compreende-se por “temperatura ótima” para o desenvolvimento larval, aquela em que ocorre baixo índice de mortalidade larval e baixa perda de fertilidade nos adultos resultantes, não sendo necessariamente a temperatura de desenvolvimento larval mais rápido (CONSOLI & LOUREÇO-DE-OLIVEIRA, 1994).
A iluminação solar pode ser favorável ou não para o desenvolvimento de algumas espécies de mosquitos. No caso do An. darlingi suas larvas preferem criadouros parcialmente sombreados (DEANE et al., 1948; GRIECO et al., 2007). A luz também pode interferir na disponibilidade de alimento, pois existe uma relação entre a vegetação aquática, dependente de luz solar, com a microcamada da superfície dos habitats larvais de anofélinos, onde estão disponíveis suas fortes alimentares (KAUFMAN et al., 2006).
Os predadores podem ocorrer em qualquer fase da vida dos mosquitos, mas incide de modo mais significativo sobre as formas imaturas. Os predadores de larvas de mosquitos são comumente invertebrados como insetos, hidras, tubelários e em alguns casos vertebrados, principalmente peixes (FORATTINI, 2002). Em algumas espécies, a
duração do tempo de desenvolvimento e a sobrevivência das formas imaturas dos mosquitos são altamente afetadas pela presença de predadores (KNIGHT et al. 2004). Muitos dos predadores larvais são estudados para servirem como controle biológico (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994).
Para muitos pesquisadores a temperatura é o principal fator determinante do desenvolvimento e sobrevivência larval e a disponibilidade de alimento seria o segundo fator (BAYOH & LINDSAY, 2004; FONTANARROSA et al., 2000; TUN-LIN et al., 2000; DEPINAY et al., 2004). No entanto, a disponibilidade de fontes alimentares em condições naturais pareceu ser mais importante que a temperatura para o desenvolvimento e sobrevivência de larvas de Ae. aegypti (TUN-LIN et al., 2000). Segundo Deane et al. (1984), dependendo da densidade larval, o fator crítico pode ser a quantidade de alimento por larva ou por volume de água.
1.6. ALIMENTAÇÃO E DENSIDADE LARVAL
Desde o início do século XX tem sido dada atenção ao estudo da alimentação das larvas de Culicidae, sua investigação tinha como objetivo descobrir algum meio ou agente que pudesse reduzir ou eliminar o alimento natural das larvas, ou seja, a medida de controle das larvas poderia ser dar pelo controle de seu alimento (HINMAN, 1930). Esses estudos trouxeram vários dados sobre a biologia larval, que hoje são utilizadas por vários pesquisadores que estão trabalhando nessa área.
A maioria das larvas de mosquitos alimenta-se indistintamente de micro plâncton presente em seus habitats, constituído de algas, rotíferos, bactérias, esporos de fungos, ou quaisquer partículas de matéria orgânica (THIERY et al., 1991; WALKER et al., 1991; VÁZQUEZ- MATÍNEZ et al., 2002). De acordo com Merrit et al. (1992), as bactérias têm sido consideradas os mais importantes microorganismos na alimentação larval de mosquitos e o crescimento das formas imaturas pode ocorrer apenas com bactérias, como fonte alimentar.
das formas imaturas, a proteína é de fundamental importância para o seu desenvolvimento, principalmente durante o processo de pupação (GIGLIOLI, 1947; CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994).
Muitos trabalhos abordam as necessidades nutricionais das larvas de mosquitos, onde descrevem como essenciais cerca de 10 aminoácidos (arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, feninalanina, treonina, tripitopano e valina), a importância dos lipídios para atingir a fase pupal, a presença ou não de carboidratos, ainda contraditória, para a diminuição do tempo de cada estádio larval, e algumas vitaminas ditas como essenciais (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; HINMAN, 1930; MERRIT et al, 1992; SCRIBER & SLANSKY, 1981; FREIRE & FARIA, 1947).
Atualmente, a alimentação larval de culicídeos tem sido objeto de estudos no sentido de detectar possíveis adaptações, tanto para criação em laboratório, como para experimentos e também estudos de possíveis larvicidas para o controle do vetor, já que não apresentam seletividade qualitativa das partículas ingeridas. (FORATTINI, 2002). Além, também, da obtenção de dados sobre o efeito da qualidade e quantidade de alimentos ingeridos no crescimento, desenvolvimento e reprodução dos insetos em geral (PANIZZI & PARRA, 1991).
A performance de qualquer espécie de animal depende, entre outros fatores, da qualidade e quantidade de alimento ingerido. Nos insetos, a alimentação dos imaturos pode afetar vários aspectos da fase adulta. Se a alimentação não for adequada, o adulto poderá emergir, se conseguir atingir esta fase, mais tarde que o normal, com o tamanho reduzido e sem nutrientes estocados. Isto poderá afetar a relação do vetor com seus hospedeiros, além de prejudicá-los na produção de feromônios, afetando a competição por parceiros sexuais e a produção de óvulos nas fêmeas (GULLAN & CRANSTON, 1999).
É importante se conhecer a influência da dieta sobre o tempo para o desenvolvimento, a porcentagem de imaturos que atinge a fase adulta e o tamanho com que o adulto emerge. Quanto melhor a dieta, menor será o tempo para o desenvolvimento, maior será a porcentagem de imaturos que atingirá a fase adulta, e
maior será o número de adultos que emergirá com tamanho normal. Entretanto, é preciso salientar que, quando há forte competição pelo alimento, ou este não é adequado, os imaturos podem pupar mais cedo que o normal e terão, portanto, um ciclo de vida menor, sem que isto signifique que a alimentação tenha sido adequada (PANIZZI & PARRA, 1991).
Várias investigações têm apresentado a relação da quantidade de alimento com o desenvolvimento larval e produção de adultos. Wallace & Merrit (1999) em experimentos com An. quadrimaculatus em condições laboratoriais demonstraram que a sobrevivência das larvas foi positivamente significativa com o aumento da quantidade de alimento oferecido. Enquanto que estudos com An. maculipennis demonstram que a insuficiência de alimento somente retardou o desenvolvimento larval e diminuiu a percentagem de sobreviventes, os quais chegavam a atingir pelo menos o 4º estádio larval (HINMAN, 1930). Outros trabalhos, também demonstraram que a quantidade de alimento oferecido às formas imaturas de Culicidae, além de afetar a sobrevivência larval também estão diretamente relacionadas ao tempo de desenvolvimento larval (MERRIT et al., 1992; TUN-LIN et al., 2000; DOMINIC AMALRAJ et al., 2005), a fecundidade, a maturação sexual, a sobrevivência dos adultos (DOMINIC AMALRAJ & DAS, 1996), a porcentagem de emersão de adultos, assim como o tamanho corpóreo dos adultos (MERRIT et al., 1992).
De acordo com Nelson (1986), o tamanho corpóreo de várias espécies de Culicidae possui base genética, mas o tamanho alcançado por algumas espécies pode variar conforme a variação dos fatores ambientais. Um aumento no tamanho corpóreo dos mosquitos aumenta a probabilidade de sobrevivência e do sucesso no repasto sanguíneo e, em algumas espécies, é observado o aumento de paridade e da capacidade vetorial (KITTAWEE et al., 1992). Esse fator, que é influenciado pela quantidade de alimento, tem atraído à atenção dos pesquisadores interessados na relação de tamanho corpóreo com a capacidade vetorial de Culicidae (WALLACE & MERRIT, 1999), determinada pelo aumento da sobrevivência de adultos e pelo aumento do número de repastos sangüíneos para o desenvolvimento dos ovos (GIMNIG et al., 2002). Manoukis et al. (2006) observaram que o tamanho corpóreo de
(mais velhas) e que, conseqüentemente, a capacidade vetorial não está relacionada ao tamanho dos adultos. No entanto, no trabalho de Tun-Lin et al. (2000) com Ae. aegypti, adultos maiores apresentaram maior capacidade vetorial. O tamanho das fêmeas adultas de Culicidae pode ser um determinante fator da capacidade vetorial (SCHNEIDER et al., 2004).
A quantidade de alimento larval pode sofrer limitações quando ocorre o aumento da densidade larval, possivelmente durante as estações secas quando o nível da água diminui (SATTLER et al., 2005), favorecendo a competição por alimento entre as larvas (DEPINAY et al., 2004). A redução de alimento causada pela competição afeta diretamente a taxa de crescimento e sobrevivência larval, impedindo que estas larvas consigam atingir as formas adultas. Distúrbio comportamental devido ao contato físico pode reduzir a taxa de crescimento e possibilidade de se alimentar (DEANE et al., 1984)
Vários trabalhos sobre a densidade larval têm demonstrado que esse fator também interfere no tamanho do vetor (GIMNIG et al., 2002; MANOUKIS et al., 2006). Em condições de competição por espaço e alimento causado pelo aumento da densidade, ocorre uma redução no tamanho dos mosquitos adultos (DYE, 1984).
A densidade larval, além de afetar o tamanho da forma adulta dos mosquitos também apresentou direta relação com o tempo de desenvolvimento (TUN-LIN et al., 2000), sobrevivência (BRIEGEL, 1990; TUN-LIN et al., 2000; GAMA et al., 2005), emersão de adultos (NEKRASOVA, 2004) e a fecundidade (GIMNIG et al., 2002).
O tamanho do habitat, a considerável flutuação da população de mosquitos e os efeitos da densidade podem ser observados sazonalmente, particularmente no final da estação chuvosa ou início da estação seca, quando a população de mosquito aumenta e o habitat torna-se seco, sugerindo que a densidade pode ter um importante papel na regulação da população de An. gambiae (GIMNIG et al., 2002).
A incidência de malária em Rondônia, assim como em outras regiões tropicais, sofre variações com as estações do ano, principalmente, devido à variação do número de criadouros. As mudanças climáticas alteram as características físico-químicas dos criadouros (PIYARATNE et al., 2005), podendo alterar, consequentemente, a
disponibilidade de alimento para os estádios imaturos dos vetores, causando alterações biológicas nos adultos, e.g., na capacidade vetorial. Apesar da importância do An.
darlingi na transmissão da doença, o conhecimento sobre a biologia e ecologia da
forma larval é ainda limitado. Estudos com adultos têm sido realizados com freqüência. No entanto, há uma necessidade do conhecimento dos fatores que afetam a biologia do vetor, a fim de compreender seu comportamento biológico.
O estudo da biologia das larvas possibilita observar fatores que interferem na biologia do vetor, tais como longevidade, capacidade vetorial, tamanho do adulto e dispersão (WALLACE & MERRIT, 1999). Considerando que, a quantidade de alimento disponível no habitat larval e a densidade larval estão submetidas a variações, o conhecimento do efeito biológico no vetor devido a variação desses fatores poderão contribuir para o estudo da bioecologia do vetor tão necessária para medidas de controle mais eficazes no estado de Rondônia, assim como em outras localidades. Além de estabelecer a quantidade de alimento e a densidade larval para a colonização de mosquitos viáveis, com desenvolvimento larval mais rápido, homogêneo, com taxas de sobrevivência elevada e de produzir adultos viáveis sobre condições laboratoriais.
2.1. OBJETIVO GERAL
• Avaliar os efeitos da quantidade de alimento e da densidade larval na biologia do vetor Anopheles darlingi.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar a sobrevivência larval e dos adultos, tempo de desenvolvimento larval, longevidade, capacidade vetorial e tamanho dos adultos submetidos a diferentes concentrações de alimento larval;
• Determinar a sobrevivência larval e dos adultos, tempo de desenvolvimento larval, longevidade, capacidade vetorial e tamanho dos adultos submetidos a três diferentes densidades larvais com e sem restrição de alimento.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. COLONIZAÇÃO DE Anopheles darlingi
As larvas e adultos F1 de An. darlingi foram obtidos através da oviposição em
laboratório por mosquitos coletados no campo. As capturas foram realizadas no peridomiciliar na Vila Candelária (08o47'17,8"S, 63o55'00,5" W), Porto Velho - Rondônia, entre as 18:00 e 21:00h, através de atração humana, que consiste na exposição dos membros inferiores, protegidos apenas por uma meia preta, para atrair os mosquitos os quais serão capturados com auxílio do aspirador manual antes que a picada e a subseqüente sucção seja realizada.
Todos os mosquitos capturados foram transferidos para gaiolas de 4,5 cm de diâmetro e 10 cm de altura e encaminhados para o laboratório de Entomologia do Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais (IPEPATRO) – Porto Velho/ RO.
No laboratório, os mosquitos foram alimentados com sangue de coelho por 15 minutos e após 72 horas somente An. darlingi foram submetidos a oviposição induzida, que consiste na remoção de uma das asas das fêmeas anestesiadas por acetato de etila em um tubo mortífero, com o auxílio de uma pinça entomológica e uma lupa (LANZARO et al., 1988).
A colonização foi realizada em uma estufa entomológica, à temperatura de 28º C, umidade 80% e fotoperíodo de 12h (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994). Após dois dias da eclosão, as larvas foram transferidas para bacias plásticas de 5 cm de altura e 400 cm2 com um 1L de água destilada. No estágio de pupa, foram transferidas para recipientes de 50ml e foram mantidas em gaiolas de captura de campo até a emergência dos adultos, os quais permaneceram nesse mesmo local durante todo o seu tempo de vida.
As larvas e adultos F1 foram divididos em grupos amostrais para a avaliação de
Tabela 1. Parâmetros biológicos avaliados.
Parâmetros Biológicos Tamanho da amostra
1. Duração do desenvolvimento larval 100 larvas 2. Longevidade dos adultos 5 machos/ 5 fêmeas 3. Capacidade vetorial 5 mosquitos Foram feitas 6 repetições
3.2. EFEITO DA QUANTIDADE DE ALIMENTO NO ESTÁGIO LARVAL
Uma amostra de 300 larvas de 1º estádio foi dividida igualmente em três grupos. Cada grupo recebeu três diferentes concentrações (Tabela 2) de alimento TetraMin
Tropical Flakes. Estabelecida de acordo com a quantidade de alimento consumido
pelas larvas da família Culicidae que varia de 3 a 6 mg/ larva (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994). Foram feitas seis repetições para cada concentração.
Tabela 2. Concentrações de alimento (mg) oferecidas às larvas de Anopheles darlingi.
Concentração de alimento Estádio Baixa (0,2mg/larva/dia) Média (0,4mg/larva/dia) Alta (0,6mg/larva/dia) 1º 0,18 0,35 0,6 2º 2,5 5 10 3º 5 10 15 4º 10 15 30
A quantidade corresponde a 100 larvas. Nos dois primeiros estádios, a quantidade é oferecida apenas uma vez ao dia, no 3º estádio, dividido em duas vezes e no último, em três vezes.
A composição básica do TetraMin Tropical Flakes abrange as necessidade nutricionais para o estágio larval de An. darlingi. Composto de arroz integral, extrato de levedura, farelo de aveia, farinha de algas marinhas, farinha de camarão, farinha de peixe, farinha de soja, glúten de trigo, lecitina de soja, leveduras, óleos de peixes refinados, óleo de soja degomado, proteína de batata, sorbitol, vitamina C, premix vitamínico.
A cada período de 12 horas, foi realizada inspeção nos recipientes para a contagem das larvas vivas e remoção das larvas mortas, realimentação e, se necessário, a limpeza das bacias evitando dessa maneira a poluição da superfície da água. Os dados referentes às mortes e ecdises foram anotados em boletins de inspeções para o acompanhamento do desenvolvimento larval. As exúvias serviram como indicadores da mudança de estádio (BERGO et al., 1990; CHAPMAN, 1998).
3.3. DENSIDADE LARVAL
Para avaliar os efeitos da densidade larval na biologia do vetor três grupos de 35 (0,083 larvas/cm2), 70 (0,17 larvas/cm2) e 150 (0,34 larvas/cm2) larvas de 1º estádio foram criadas em bacias plásticas com área de 400 cm2 contendo 1L de água destilada. A determinação das densidades foi baseada em dados de campo de Gimnig et al., 2002. Foram feitas seis repetições, em duas situações experimentais distintas: com e sem restrição de alimento, isto é, baixa e alta (Tabela 2).
Da mesma maneira do experimento anterior, a cada período de 12 horas foi realizada uma inspeção nos recipientes para avaliar os parâmetros biológicos do vetor (Tabela 1).
3.4.1. Duração do desenvolvimento larval, índice de mortalidade e longevidade dos adultos.
Para avaliar a duração dos estágios de desenvolvimento do mosquito, foi utilizada uma adaptação da teoria básica de Forattini et al. (1977) que calcula a duração média de cada estádio de triatomíneos, lançando mão da variável estádio mediano dos insetos no tempo e aplicado por Bergo et al. (1990) a larva de An. darlingi. O estádio mediano da colônia, Ei, em cada inspeção i, realizada a intervalos de 12 horas,
corresponde à mediana da distribuição de freqüências do número de indivíduos existentes nos vários estádios. Os estádios 1 a 4 correspondem aos 4 estádio larvais, o 5 ao da fase de pupa e o 6 corresponde ao adulto recém-emergido. O Ei, foi estimado
por meio da fórmula abaixo:
Estádio mediano da colônia (Ei)
A taxa de sobrevivência de cada estádio larval (sj), e a taxa de sobrevivência total (S) e índice de mortalidade (IM) foram estimados por meio das fórmulas abaixo listadas (BERGO et al.,1990).
Ei = (<LI) + (0,5n – fa) x (hI)
nº I
• < LI: menor limite inferior
• n: nº de larvas total
• hI: tamanho do intervalo
Taxa de sobrevivência de cada estádio (sj)
Taxa de sobrevivência total (S)
Para determinar a longevidade dos adultos, uma amostra de 5 fêmeas e 5 machos de cada tratamento e densidade foram alimentadas diariamente com solução açucarada (sacarose 20%) e, a cada três dias, as fêmeas foram alimentadas com sangue humano não infectado.
3.4.2. Capacidade Vetorial
A capacidade vetorial foi calculada de acordo com a seguinte fórmula (MACDONALD, 1957; GARRETT-JONES, 1964; REISEN, 1989; FREIRER, 1989, FORATTINI, 1992):
sj= 1- † no estádio j
nº de sobreviventes no inicio do estádio j
(S)= s1+ s2+ ....+ s5
S1: nº de larvas no inicio do estádio 1
S2: nº de larvas no início do estádio 5
C= ma2pn -logep
• m: densidade de mosquito por humano
• a: média de picadas
• p: sobrevivência diária
• n: duração do período de incubação do
(GARY & FOSTER, 2001; ALMEIDA et al., 2005). Para determinar a sobrevivência diária (p) uma mostra de 5 fêmeas de cada tratamento e densidade receberam apenas sangue humano por 10 minutos durante 10 dias para o cálculo da seguinte fórmula:
O período de incubação do parasita foi de 16 dias a 28ºC, de acordo com o dados do desenvolvimento do P. falciparum em An. darlingi (KLEIN et al., 1991b).
3.4.3. Tamanho da asa
Uma das asas do mosquito foi removida, montada em lâmina e medida usando um microscópio binocular equipado com uma ocular micrométrica (acurácia de 0,01 mm). A medição das asas é feita a partir da álula até a extremidade da asa, não considerando a franja (Figura 8) (HARBACH & KNIGHT, 1980). O tamanho da asa é um parâmetro de estimativa do tamanho do mosquito (LOUNIBOS et al., 1995; CHARLWOOD, 1996).
p = d√P • d: nº de dias do estudo
Figura 8. Diagrama da asa de An. darlingi apresentando a localização da álula à extremidade da asa (x). Fonte: Charlwood, 1996.
3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados coletados foram devidamente registrados em microcomputador, utilizando o programa Microsoft Excel. O efeito da quantidade de alimento na biologia do vetor foi analisado com a Análise de Variância (ANOVA) um fator. O efeito da restrição de alimento e densidade na biologia do vetor também foi analisado com a ANOVA um fator, porque os dados não eram paramétricos, já que não foi possível a utilização da ANOVA de dois fatores. De acordo com Zar (1999) não há análise de dois fatores não paramétricos confiável. Os testes de correlação utilizados foram Pearson, para dados paramétricos e Sperman, para dados não paramétricos. A análise foi feita utilizando-se o programa SigmaStat for Windows Version 2.03 (SPSS Inc., 1992-1997).
3.6. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O presente projeto foi submetido à análise e aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Centro de Pesquisa de Medicina Tropical de Rondônia (CEPEM-RO), sendo aprovado para a realização com o número 056/2007.
A equipe de campo era composta por pesquisadores da área de entomologia que conhecem o objetivo e os procedimentos da pesquisa. De cada indivíduo participante foram obtidos o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, assinado pelo mesmo.
Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) para a obtenção da licença, nº 14077-1, para a coleta de Culicidae em campo.
4. RESULTADOS
4.1. EFEITO DA QUANTIDADE DE ALIMENTO
4.1.1. Tempo de desenvolvimento e sobrevivência larval
O tempo de desenvolvimento do 1° estádio larval ao estádio de pupa foi afetado pela quantidade de alimento disponível (F=77,98; P<0,001), diminuindo com o aumento da concentração de alimento, durando entre 44 a 38 dias, respectivamente (Tabela 3; Figura 9).
Analisando a duração de cada estádio larval (Tabela 4), observa-se que em geral o 1° e o 4° são os que apresentaram maior duração, tendo diferenças significativas nos grupos submetidos a baixa e média concentração de alimento. Os grupos submetidos a alta concentração não apresentaram diferenças significativas. O 2º e o 3º estádios não apresentaram diferenças significativas. Apenas o último estádio apresentou diferença entre os quatro primeiros, por se tratar do estádio de pupa. Entre os tratamentos, apenas o 2º e o 5º estádio apresentaram diferenças significativas (H=63,4; P<0,001).
Anopheles darlingi submetidos a crescentes concentrações de alimento.
Tempo Baixa(a) lx(a) dx(ns) Média(b) lx(b) dx(ns) Alta(c) Lx(c) dx(ns)
0 1,00 100 3 1,00 100 0 1,00 100 1 1 1,00 97 1 1,01 100 0 1,01 99 0 2 1,03 96 2 1,06 100 3 1,14 99 1 3 1,08 94 1 1,28 97 1 1,32 98 1 4 1,21 93 2 1,33 96 3 1,34 97 1 5 1,41 91 4 1,34 93 1 1,37 96 1 6 1,36 87 6 1,36 92 6 1,47 95 0 7 1,47 81 4 1,42 86 2 1,79 95 1 8 1,61 77 2 1,60 84 2 2,16 94 0 9 1,73 75 2 1,87 82 1 2,34 94 1 10 1,84 73 2 2,06 81 2 2,58 93 0 11 1,90 71 2 2,18 79 2 2,64 93 1 12 1,94 69 4 2,25 77 2 2,72 92 0 13 2,03 65 1 2,33 75 0 2,88 92 0 14 2,16 64 1 2,40 75 1 3,06 92 0 15 2,32 63 1 2,49 74 0 3,22 92 1 16 2,46 62 1 2,59 74 3 3,41 91 0 17 2,62 61 1 2,70 71 1 3,59 91 1 18 2,74 60 1 2,87 70 2 3,75 90 2 19 2,86 59 2 3,03 68 1 4,04 88 1 20 3,01 57 2 3,17 67 2 4,25 87 1 21 3,16 55 4 3,40 65 3 4,36 86 1 22 3,18 51 2 3,6 62 1 4,44 85 0 23 3,26 49 1 3,70 61 1 4,48 85 0 24 3,40 48 2 3,85 60 2 4,55 85 0 25 3,50 46 2 4,11 58 3 4,70 85 0 26 3,53 44 2 4,41 55 1 4,73 85 0 27 3,60 42 3 4,53 54 1 4,78 85 2 28 3,81 39 1 4,61 53 3 4,80 83 0 29 3,88 38 2 4,72 50 2 4,85 83 1 30 4,02 36 1 4,80 48 1 4,88 82 0 31 4,16 35 1 4,87 47 0 4,89 82 2 32 4,27 34 2 4,90 47 2 4,91 80 0 33 4,41 32 2 4,94 45 0 4,92 80 2 34 4,50 30 4 4,94 45 0 4,95 78 2 35 4,52 26 2 4,94 45 0 4,97 76 0 36 4,63 24 1 4,95 45 0 4,97 76 2 37 4,65 23 2 4,97 45 0 4,99 74 1 38 4,71 21 0 4,97 45 0 5,00 73 17 39 4,84 21 1 5,00 44 10 40 4,87 20 8 41 4,88 12 5 42 4,92 7 0 43 4,96 7 0 44 5,00 7 6
One Way Repeated Measures Analysis of Variance. Letras entre parênteses diferentes indicam diferenças significativas (P<0,05), ns indica que não houve diferença significativa. Concentração baixa: 0,2mg/larva/dia, média: 0,4mg/larva/dia e alta: 0,6mg/larva/dia; lx: número de indivíduos no início do tempo; dx: mortes ocorridas no intervalo. As numerações de 1-4 representam os 4 estádios larvais e o 5 é a fase de pupa.
Assim como foi observado na duração do estágio larval, a disponibilidade de alimento afetou significativamente a sobrevivência larval (F= 129,89; P< 0,001) aumentando com o aumento da concentração de alimento (Tabela 3).
Na análise da sobrevivência em cada estádio larval, observou-se diferenças significativas entre todos os estádios, assim como entre as concentrações (H=76,4; P<0,001), aumentando com o aumento da concentração de alimento, sendo que, no último estádio, o valor é bem inferior ao tratamento de baixa concentração de alimento (Tabela 4).
Tabela 4. Duração e sobrevivência dos estádios larvais de Anopheles darlingi submetidos a
crescentes concentrações de alimento.
Duração dos estádios (dias) Sobrevivência (%) Concentração de alimento Concentração de alimento Estádios Baixa Média Alta Baixa Média Alta L1 11,5a1 12a2 8,5a2 67,5a1 84a2 96,5a3 L2 7,2b1 7,5a1 6b1 55b1 68,5b2 94,5b3 L3 11b1 6,7a1-2 5,5b2 38,5c1 57,5c2 89c3 L4 8,5b1 13b2 8,7a3 21,5d1 42d2 77d3 L5 1,9c1 1,8c1 1,8c1 13e 1 33e 2 52,5e 3 One way Anova on ranks (Kruskal-Wallis) e Student-Newman-Keuls (comparações); n=6; Letras diferentes indicam diferenças significativas (P<0,05) para uma mesma coluna. Números diferentes indicam diferenças significativas (P<0,05) para uma mesma linha. L1 – L4 correspondem aos quatros estádios larvais e o L5 ao estádio de pupa; Concentração baixa: 0,2mg/larva/dia, média: 0,4mg/larva/dia e alta: 0,6mg/larva/dia
Quanto ao número de mortes a cada dia (dx), não houve diferenças significativas (F=1,47;P=0,24), mas, quanto ao total do número de mortes, observa-se um elevado aumento com a diminuição da concentração de alimento disponível. Em geral, os estádios mais afetados foram os dois últimos estádios, havendo um alto número de mortes nos grupos submetidos a baixa concentração de alimento (Tabela 3).
diminuição em todos os tratamentos. No entanto, a diminuição é menor com o crescente aumento na concentração de alimento (Figura 9).
0 20 40 60 80 100 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 Dias S o b re v iv ê n c ia baixa média alta L1 L2 L3 L4 L5 L1 L1 L2 L2 L3 L3 L4 L4 L5 L5
Figura 9. Curva de sobrevivência larval de Anopheles darlingi com média de duração dos estádios em
intervalos de 24 h submetidos a crescentes concentrações de alimento. L1 – L4 correspondem aos quatros estádios larvais e o L5 ao estádio de pupa. Concentração baixa: 0,2mg/larva/dia, média: 0,4mg/larva/dia e alta: 0,6mg/larva/dia.
4.1.2. Capacidade vetorial
A capacidade vetorial, C (número de novos casos de malária por dia) de
An.darlingi, cujas larvas foram submetidas a menor concentração de alimento,
apresentou o menor valor, C=1,5, enquanto que, aquelas submetidas a média e alta concentrações de alimento apresentaram um aumento na sua capacidade vetorial, C=12 e C=52, respectivamente. Corroborado pelos outros fatores que interferem na capacidade vetorial, pois o grupo submetido a maior concentração de alimento
apresentou maior sobrevivência de adultos (H=19,60; P= <0,001) apesar de ter se alimentado apenas de sangue humano, maior freqüência de picadas (H=6,77; P= 0,034) com tendência a maior duração do repasto sanguíneo, além de ter apresentado maior tamanho de asa (H= 24,95; P<0,001) (Tabela 5).
Tabela 5. Alguns aspectos comportamentais e biológicos de fêmeas de Anopheles darlingi
alimentadas diariamente com sangue humano, obtidas de larvas submetidas a crescentes concentrações de alimento. Concentração de alimento Freqüência de picadas (dias) Duração do
repasto (min) ns Sobrevivência (%)
Tamanho da asa (mm)
Baixa 0,8ab 3 20a 2,5a
Média 1bc 2,8 40a 2,7b
Alta 1,2c 3,6 60b 2,8b
One way Anova on ranks (Kruskal-Wallis) e Dunn's method (comparações); n=25 (T1) e n=30(T2 e 3); Letras diferentes indicam diferenças significativas (P<0,05) para uma mesma coluna. ns indica que não houve diferenças significativas. Concentração baixa: 0,2mg/larva/dia, média: 0,4mg/larva/dia e alta: 0,6mg/larva/dia.
O tamanho da asa apresentou correlação positiva com relação à duração de picadas (R= 0,23; P=0,03) e com a freqüência de picadas (R= 0,24; P=0,02).
Nas fêmeas adultas obtidas das larvas submetidas aos três tratamentos, a freqüência de picadas tendeu a diminuir com o tempo, apresentando picos a cada três dias no tratamento com maior concentração de alimento e freqüência de picadas estáveis nos demais tratamentos (Figura 10).
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dias P ro p o rç ã o d e m o s q u it o s p ic a n d o baixa média alta
Figura 10. Proporção de fêmeas de Anopheles darlingi picando a cada dia, cujas larvas foram
submetidas a crescentes concentrações de alimento.
One Way Repeated mesures Analysis of Variance. ns: indica que não houve diferenças significativas (P>0,05). Concentração baixa: 0,2mg/larva/dia, média: 0,4mg/larva/dia e alta: 0,6mg/larva/dia.
4.1.3. Tamanho e longevidade
As larvas submetidas à maior concentração de alimento resultaram em adultos com maior longevidade e maior tamanho da asa, havendo uma relação marginalmente positiva entre estes dois caracteres (R= 0,14; P= 0,04). Houve diferenças significativas entre o grupo submetido à alta concentração e os dois grupos de menores concentrações em relação ao tamanho da asa (H=21,64; P<0,001) e o grupo de baixa concentração apresentou diferenças significativa entre os grupos de maiores concentrações em relação à longevidade (H=6,86; P=0,03) (Figura 11).
Figura 11. Longevidade e tamanho da asa dos adultos cujas larvas foram submetidas a crescentes
concentrações de alimento.
One way Anova on ranks (Kruskal-Wallis) e Dunn's method (comparações); n=38(T1) e n=80(T2 e 3); Letras diferentes indicam diferenças significativas (P<0,05) para um dado parâmetro. Concentração baixa: 3mg/larva, média: 4,5mg/larva e alta: 6mg/larva.
Em geral, as fêmeas vivem mais tempo que os machos (H=12,17; P<0.001). No entanto, no grupo cujas larvas foram submetidas a baixa concentração de alimento, não houve diferenças significativas quanto à longevidade entre machos e fêmeas (Figura 12). Já na análise do tamanho da asa, em geral, os machos são maiores que as fêmeas (H=11,54; P<0,001). Mas, não ocorreu diferenças de tamanho da asa entre machos e fêmeas em nenhuma concentração de alimento. Embora, observou-se que os machos tendem a serem maiores que as fêmeas (Figura 12).
