CÁC KĨ THUẬT SẮC KÍ TRONG HÓA HỌC PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI NHÓM SINH VIÊN HUẾ THỰC HIỆN

Chương1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÍ

I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:

Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc người

Nga Michael C.Txvet. Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải

quyết vấn đề tách các chất có tính chất giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn

khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên phát hiện này đã bị lãng

quên nhiều năm.

Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý

thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloit

từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo dược phẩm. Do có công trong việc phát triển lý

thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được nhận giải thưởng Nobel về hoá

học.

Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quả

tách rất cao. Cột mao quản và các detectơ sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ

nhạy của phương pháp người ta có thể phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cở

ppm và ppb. Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng dụng được nhiều trong

thực tế.

Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả

tách đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance lipuid chromatography- HPLC):

Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường

khả năng của phương pháp.

Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng.

Đó là kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng

hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện mao quản (CEC)... Phương pháp có độ

chính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp hơn.

II. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

1. ĐỊNH NGHĨA - PHÂN LOẠI

1.1 Định nghĩa:

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích

trên hai pha: một pha thường đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha

tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái

lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

1.2 Phân loại các phương pháp tách sắc ký

1.2.1 Phân loại theo hệ pha

Phương pháp đầu tiên được nhiều người quan tâm, đây là phương pháp phân loại

đơn giản theo hệ pha tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gì?

Sơ đồ phân loại các phương pháp sắc ký

1.2.2 Phân loại theo cơ chế tách

1.2.2.1 Sắc ký hấp thụ:

Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố chất phân tích giữa pha

hệ pha

Cơ chế

chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau khi cho pha động chứa

chất phân tích tiếp xúa với chúng. Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tử

chất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di chuyển

với tốc độ khác nhau.

1.2.2.2 Sắc ký phân bố lỏng - lỏng

Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ

sắc ký phân bố lỏng - lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động

cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết,

còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới

lỏng hay rắn.

Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ở

chỗ: sắc ký phân bố lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn,

phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững,

hiện tương trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.

1.2.2.3 Sắc ký ion ( trao đổi ion)

Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích

trong pha động.Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả năng

trao đổi anion gọi lá anionit. Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ

yếu là liên kết tĩnh điện , phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của

dung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích. Ví dụ: phản ứng trao đổi

ion giữa cationit acid mạnh và Ca

2+

có thể viết như sau:

2R-SO

3

H + Ca

2+

= (R-SO

3

)Ca + 2H

+

Phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl

-

:

R-N(CH

3

)

3

OH + Cl

-

= R-N(CH

3

)

3

Cl + OH

-1.2.2.4 Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở)

Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong

lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kých thước cở phân tử. Các phân tử chất phân tích

có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tuỳ theo kých thước của chúng. Các chất

phân tích có kých thước lớn không thể đi vào sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giải

nhanh còn các phân tử chất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị

rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kich thước nhỏ đi ra sau và ngược lại. Thời

gian lưu của các chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử của chúng. Tuy nhiên chất

phân tích có thể có tương tác khác với pha tĩnh. Như vậy một phép sắc ký có thể tách

theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta không xét ở đây.

1.2.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ

1.2.3.1 Phân tích tiền lưu

Các cấu tử A, B, C có

ái lực với pha tĩnh là A < B<

C. Cho hỗn hợp chất phân

tích liên tục đi qua cột, chất

phân tích có ái lực với pha

tĩnh thấp nhất đi trước, tiếp

theo là chất có ái lực yếu

hơn. Tuy nhiên do chúng ta

cho liên tục chất phân tích

vào nên đi sau A là A + B và

A+B+C. Chỉ có một phần

chất tinh khiết A đi trước

1.2.3.2 Phân tích thế đẩy

Trong sắc ký này,

chúng ta cũng nạp lượng

nhỏ hỗn hợp chất phân

tích A, B, C vào cột sau

đó cho chất D là chất đẩy

liên tục đi qua cột.

Ái lực hấp thụ là

A <B < C < D. Do D đẩy

C, C lại đẩy B, B lại đẩy

A nên sắc đồ có dạng::

1.2.3.3 Phân tích rửa giải:

C B A Nồng độ t. V

Hình 1: Sắc đồ phân tích tiền lưu

A B A A B _C

Hình 2: Sắc đồ phân tích thế đẩy

(phần đậm là phần hai cấu tử xen kẽ)

D

t, V

Nồng độ

pha động . Thứ tự ái lực hấp thụ là E < A < B < C. Một câu hỏi đặt ra làm sao E có ái

lực hấp thụ yếu nhất với pha tĩnh lại có thể rửa giải A, B, C ? Để trả lời câu hỏi này

chúng ta hình dung là sự tranh chấp những trung tâm hoạt đông ở pha tĩnh không phải

chỉ có một cấu tử chất phân tích tương tác với cấu tử chất rửa giải mà ở đây có thể có

nhiều cấu tử rửa giải tham gia (câu tử có thể là ion hoặc phân tử).

Giả sử có chất tan C(phân tử hoặc ion) đã hấp thụ vào pha tĩnh, để phân bố C trở

lại pha động phải cần tới nhiều cấu tử rửa giải E. Quy luật ưu thế số đông xem ra có tác

dụng.

Vì

vậy khi rửa

giải người

ta thường

chất

rửa

giải

có

nồng độ lớn

hơn

chất

phân

tích

rất nhiều.

Tóm lại một phép sắc ký nhìn theo cách phân loại nào cũng có thể liên quan đến

một hay nhiều cách phân loại khác, thí dụ ở sắc ký lỏng- rắn chỉ đơn giản là pha tĩnh là

chất rắn, pha động là chất lỏng theo cách phân loại theo liên kết pha nhưng theo cách

phân loại theo cơ chế thì lỏng rắn ở đây có thể là hấp phụ,trao đổi ion. Tuỳ theo pha tĩnh

sử dụng, sắc ký lớp mỏng có thể là sắc ký trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, rây phân tử.

Ngược lại sắc ký hấp phụ xét về mặt tương tác pha có thể thuộc loại sắc ký - rắn hay

lỏng- rắn.

Sắc ký rửa giải có ứng dụn

Quá t

rình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức

tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra

khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet,

tiến hành như sau:

Hòa tan các sắc tố thực vật trong êt dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột

đã nhồi bột CaCO

3

. Tiếp theo, cho liên tục êt dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời

gian nhất định sắ tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt. sau này người ta biết được

đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chất

Chiều cao (h)

Diện tích (S)

Thời gian (t)

Hình 3: Sắc đồ phân tích rửa

giải

màu nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ông gọi đó là

“Chromatography”. Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma” là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ

đó còn giữ đến ngày nay.

Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha

tĩnh một cách bất kỳ không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy

nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau. Các

chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có ái

lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn.

Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân

bố lại, các chất được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích

ở pha tĩnh chúng không di chuyển còn khi ở pha động chúng di chuyển. Vì vậy các chất

phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian ở

pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn.

Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên

có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau mỗi lần hấp thụ và giải

hấp các chất phân tích di chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau.

Tiếp tục chop ha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự kkhacs

biệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn,

vunhf chất của từng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời

gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình tách sắc ký.

g nhiều trong lĩnh vực phân tích do hiệu quả tách cao

2. QUÁ TRÌNH TÁCH SẮC KÝ VÀ CÁC LOẠI LỰC LIÊN KẾT TRONG

HỆ SẮC KÝ

2.1 Quá trình tách sắc ký

Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet, tiến hành như sau:

Hòa tan các sắc tố thực vật trong ete dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO3. Tiếp theo, cho liên tục ete dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắc

tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt. sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chất màu nên khi tách chúng tạo thành

Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh một cách bất kỳ không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau. Các chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn.

Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại, các chất được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích ở pha tĩnh chúng không di chuyển còn khi ở pha động chúng di chuyển. Vì vậy các chất phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian ở pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn. Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau.

Hình 4 :Quá trình tách A và B trong cột tách sắc ký

.

Tiếp tục cho pha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự khác biệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vùng chất của từng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình tách sắc ký

2.2 Các loại lực liên kết trong hệ sắc ký

Trong hệ sắc ký có ba thành phân chủ yếu tác quyết định sự tồn tại của hệ, chất

phân tích, pha tĩnh, pha động tạo nên sự phân bố cần thiết, giúp cho sự di chuyển các

chất phân tích dọc theo chiều dài cột với tốc độ khác nhau. Chúng ta thường nói chất

phân tích phân bố giữa hai pha, tuy nhiên đây la cân bằng động chất phân tích luôn thay

đổi pha liên kết (trừ một số trường hợp đặc biệt nó chỉ ở một pha trong suôt quá trình

phân tích) vấn đề là tại sao chất phân tích được giữ trong pha tĩnh? Hơn nữa ba thành

phần này tương tác như thế nào với nhau, bằngc lực liên kết nào mà kết quả các chất

phân tích lại phân bố vào pha tĩnh ở mức độ khác nhau? Câu trả là do bản chất các của

các thành phân trong hệ sắc ký. Chất phân tích có thể là ion, phân tử trung hoá hay chất

phân cực, đối tượng liên kết của nó cũng có thể là ion, phân tử, chất phân cực. Như vậy

tuy thuộc vào độ lớn của điện tích kich thước phân tử, độ phân cực mà chúng tương tác

với

nhau theo các lực liên kết khác nhau. Người ta chia các lực liên kết thành bốn loại:

2.2.1 lực liên kết ion

Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion. Đó là các phần tử có khả

năng phân ly tạo thành các ion, tạo nên trung tâm hoạt động ion chung tham gia liên kết

với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết

ion. Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh cần có các trung tâm

cation trên bề mặt, và ngược lại để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch pha

tĩnh cần có các ctrung tâm anion cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt

động là các ion, chúng tham gia tương tác với chất phân tích và pha tỉnh. Chúng có khả

năng phân li trong dung dịch tạo thành các cation và anion.

Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta có thể dùng pha động là

dung dịch HCl loãng. Các phương pháp sắc ký thường gặp có sự tham gia của các liên

kết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion.

2.2.2 Lực phân cực

Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử

trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực, chúng có thể là các lưỡng cực điện cố

định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do cảm ứng. Các trung tâm phân cực của chất

này liên kết với trung tâm phân cực của chất khác bằng lực liên kết phân cực. Sự phân

cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ.

Tuy nhiên, sự chênh lệch này là yếu tố quan trọng để có độ bền liên kết khác nhau, đó là

điều cần thiết để phân chia chúng trong các phép tách sắc ký.

khác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về độ phân cực, từ đó lực liên kết với pha tĩnh

khác nhau. Là nguyên nhân chênh lệch thời gian lưu trong quá trình sắc ký

2.2.3 Lực Van- de- Van (lực phân tán)

Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới phân

tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực hay cố định.

Tương tác phân tán điển hình là mạch hidrocacbon nó là tương tác phân tử .

Thí dụ n-heptan là chất lỏng chứ không phải là chất khí sự tương tác giữa các

phân tử n-heptan là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các

hidrocacbon người ta dùng hidrocacbon khác làm pha tĩnh.

2.2.4 Lực tương tác đặc biệt

Lực tương tác đặc biệt là lực tương tác tạo thành do các liên kết hydro, liên kết

cho nhận mà có.Sự hình thành liên kết giữ nguyên tử hidro và các nguyên tử có độ âm

điện cao như O, N, F... gọi là liên kết hidro. Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi

là đám mây electron chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm điện lớn hơn. Như vậy các

nguyên tử có độ âm điện cao hơn, liên kết hidro càng bền chặt.

3. MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ

3.1 Hệ số phân bố K

D

và cách xác định

Cấu tử A phân bố giửa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập

A

s

←→

A

m (1)

hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng chất phân tích giữa hai pha

K

D

=

] [ ] [ m s A A

(2)

Trong đó : [A

m

] là nồng độ chất phân tích trong pha động

[A

s

] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

Cân bằng phân bố trong pha khí gọi là cân bằng động đó là cân bằng giữa lỏng -

lỏng, khí-lỏng, rắn-lỏng. Giả sử chất phân tích được phân bố ở phần nào đó của cột, đĩa

thứ n. Nhưng do pha động di chuyển, chất phân tích lại đi xuống đĩa thứ (n+1) và ở đây

lại thiết lập cân bằng mới của cả đĩa thứ n và n+1.

Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng,

hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán trong pha

động. Hệ số phân bố K

D

có thể được xác định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng

độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh sau khi đã đạt

cân bằng. Một cách gần đúng K

D

được xác định theo công thức sau:

(

1

)

1 . . D M M V K M m − =

(3)

Trong đó: M là lượng chất ban đầu tính bằng mg

M

1

là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc mg

V là thể tích pha động ml

m là lượng chât hấp thụ, gam

3.2 Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất phân tích và KD

Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động. Gọi f

A

là phần thời gian

A ở pha động:

[ ]

[ ]

[ ] [ ]

. . . m m A m m s s A V f A V A V = +

(4)

chia cả tử và mẩu cho [A]

m

. V

m

ta có:

1

1 A S D m f V K V = +

(5)

Trong đó k

’A

là hệ số dung tích.Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động là:

u

A

= u.f

A

= u / (1+k

’A

) (7)

U là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Từ biểu thức (6) và (7) ta có nhận xét: Khi

K

D

hoặc f

A

càng lớn ; thời gian chất phân tích trong pha động càng ít, nói cách khác là

chất phân tích di chuyển càng chậm, ngược lại khi f

A

càng nhỏ, chất phân tích di chuyển

càng nhanh.

3.3 Thời gian lưu t

R

, thời gian lưu hiệu chỉnh t’

R

Thời gian lưu t

R

là thời gian lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá

trị cực đại.

(8)

L/u là thời gian mà cấu tử không lưu giữ trên cột còn gọi là thời gian chết

(9)

thời gian lưu hiệu chỉnh t

’

là thời gian lưu không tính thời gian chết

A A

k

f

_'

1

1

+

=

u

k

L

u

L

t

A A R

)

1

( +

=

=

)

1

(

.

1

' A m m s D m R

t

k

V

V

K

t

t

A



=

+











+

=

3.4 Thể tích lưu V

m

, thể tích lưu hiệu chỉnh V

’m

Thể tích lưu V

R

là thể tích của dung dịch rửa giải từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột

cho đến khi pic đạt cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động ml/phút,thể tích lưu V

R

được tính theo công thức:V

RA

= t

RA

F; V

m

= t

m

F

V

RA

= V

m

(1 + k’) (11)

Thể tích lưu hiệu chỉnh V

R

’ là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột

V

R

’ = V

R

– V

m

= V

m

k

A

’ = K

DA

V

S

Thể tích lưu riêng V

g

là thể tích riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải

để rửa chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh

RA' DA g S V K V V = =

(12)

3.5 Hệ số tách α (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối)

Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc

ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và tỷ số của hệ số phân bố của hai chất:

một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn.

Điều kiện để hai chất tách khỏi nhau là α ≠ 1

_' DB § B A DA k k K K = = α

≠ 1 (13)

Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động

phải khác nhau. Mặt khác tỷ số thể tích lưu của hai chất, t’

RA

/ t’

RB

cũng chính là tỷ số

của hệ số phân bố.

Vậy có thể tóm tắt là:

_{' '}' _'' DB § RB RA RB RA B A DA V V t t k k K K = = = = α

(14)

3.6 Đĩa lý thuyết và xác định số đĩa lý thuyết bằng thực nghiệm

3.6.1 Khái niệm đĩa lý thuyết:

Đĩa lý thuyết là phần

nào đó của cột mà ở đó cân

bằng được thiết lập. Theo

quan niệm của Martin và

Synge, cân bằng được thiết

lập nhanh chóng, tức thời.

Tuy nhiên điều này gặp khó

khăn khi giải thích hiện tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện tương pic sắc ký không cân

đối. Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng đĩa được cân bằng khi

đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại và tác

giả đã đưa ra thuyết tốc độ.

Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cân

bằng phân bố chất phân tích.

Gọi n là số đĩa lý thuyết,

σ

là độ lệch chuẩn;

σ

~

n

. Đối với cột sắc ký n càng

lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, t

R

~ n, nên ta có thể vết:

n n t_R = σ

hay

2       = σ R t n

Mặt khác:

w = 4σ hay

4 W = σ

Số đĩa lý thuyết có thể viết lại là:

(15)

3.6.2 Đĩa lý thuyết có tính thời gian không lưu giữ, n

ef

(16)

Vì từ (8) ta có t

m

= t

R

/(1+k

’

). Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu lực được tính:

(16)

Từ (15) và (16) ta có:

(17)

3.7 Sắc đồ.

(

)

( )

2 2 2 ' 2 ' ef 2 2 2 16 16 16 R m R m t t n t t k w W W − = = =

(

)

(

)

2 2 2 ef 16 2 2 . 2 1 1 R t k k n n w _{k k} = = + + f f

n

L

H =

(

)

(

)

2 2 ' 2 e f 2 ' 1 1 6 _{R m} k L w H H k t t + = = −

...liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu

này được gọi là “ pic” sắc ký.Để tính toán hàm lượng chất phân tích, tính diện tích pic

sắc ký là chính xác nhất.Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các thiết

bị tÍnh diện tích của pic sắc ký một cách tự động

Hình 6: Sắc đồ hai cấu tử A&B

3.8 Độ phân giải và cách làm tăng độ phân giải:

3.8.1 Độ phân giải

Độ phân giải nói lên mức độ tách cấu tủ khỏi nhau trong một phép tách sắc ký.

Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân

giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu, t

RA

, t

RB

và rộng pic W

A

,

W

B

.

Độ phân giải R được tính theo công thức:

(18)

Trong đó: t

RB

– t

RA

= ∆t

R

là sự chênh lệch thời gian lưu(cũng có thể dùng thể tích lưu

V

RA

- V

RB

)của hai cấu tử A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộng

pic, đo bằng giây hoặc mililít, nói lên khả năng tách của cột.

Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: t

R

~ n, chiều rộng pic tỷ lệ với

n

Vì vậy R~

n n

hay R~

L

3.8.2 Cách làm tăng độ phân giải

RB RBV t . ' ' _, RB RB V t RA RAV t , ' ' RA ¶ ,VRA t h S, A W ¦ WB V t, m

t

0 t

(

)

B

W

2

+

−

=

A RA RB

W

t

t

R

Cách thứ nhất: Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột. Trong phương pháp này có các

biện pháp: Tăng chiều dài cột, sử dụng chất nhồi có kých thước hạt nhỏ hơn, đồng đều

hơn, thay đổi pha tĩnh và cuối cùng là giảm đường kinh cột

Cách thứ hai: Dưa trên cách vận hành cột: đó là tôi ưu hoá tôc độ pha động, giảm

lượng mẫu, giảm nhiệt độ cột (GC) và cuối cùng là thay đổi thành phần pha động (LC)

3.9 Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter

Thuyết được các tác giả Lapidus và Amundsion đưa ra năm 1952, sau này được

Van Deemter phát triển.

Theo thuyết này các yếu tố: đường kýnh hạt nhồi, kỷ thuật nạp cột và các yếu tố

tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnh

hưởng rất nhiều tới sự giản rộng vùng chất phân tích hay độ rộng của pic trong sắc đồ.

Đại lượng đặc trưng cho độ giản rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết

H, được hình thành do ba thành phần H

1

,H

2

, H

3

.

H = H

1

+ H

2

+ H

3

(19)

H

1

là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho sự đồng đều của cột nhồi, đường

kính của hạt nhồi, khả năng nạp cột

H

1

= 2λd

p

(20)

Trong đó λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt thì λ= 1,5; d

p

là đường kính hạt nhồi

H

2

là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự khuếch tán

của chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch

tán của chất phất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu diển

bằng phương trình:

H

2

= B/u trong đó B= 2γD

m

Là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số

đường đi của nó. Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của chất phân tích không quá

khúc khuỷu, γ = 1; D

m

là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, như vậy

H

2

có thể viết lại là:

H

2

= 2γD

m

/u (21)

H

3

là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng là yếu tố phụ thuộc vào

Trong đó C

s

là hệ số dặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng của chất phân tích trong

pha tĩnh, phụ thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ khi tốc độ dòng F≥1ml/phút, C

s

≈0

C

s

= K.d

f2

/D

s

(23)

Trong đó: K- hệ số

D

s

- hệ số khuếch tán chất phân tích trong pha tĩnh

d

f2

- chiều dày pha tĩnh

C

m

là hằng số chuyển khối của chất phân tích trong pha động, phụ thuộc vào pha động,

được xác định theo biểu thức:

C

m

= βd

p2

/D

m

(24)

β là hệ số thực nghiệm có giá trị từ 0,5- 1

D

m

là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.

Tổng hợp lại H có biểu thức tổng quát là:

H = 2λd

p

+ 2γD

m

/u + (Kd

f2

/D

s

+ βd

f2

/D

m

)u (25)

Phương trình trên được

viết tắt là:

H = A+B/u +Cu (26)

Trong thực tế có thể

tính gần đúng H= 3-4d

p

Để xét cực tiểu chiều

cao của đĩa lý thuyết lấy đạo

hàm của phương trình

Van Deemter ta có:

H

’

_{= -B/u}

2

_+C

Tại cực tiểu H

’

_{=0 => u}

tư

=

C B H min H u B Cu s cm u, / A tu u

III. BÀI TẬP

Bài 1:

Trên sắc ký đồ người ta thu được 3 pic ở 0,84 phút và 10,60 phút và 11,08 phút

tương ứng với các hợp chất A,B và C. Hợp chất A không lưu giữ bởi pha tĩnh lỏng. Các

pic của các hợp chất B và C có dạng đường Gauss có chiều rộng tương ứng 0,56 và 0,59

phút. Chiều cao cột sắc ký bằng 28,3cm. .

1. Tính số đĩa lý thuyết (n) của cột sắc ký và chiều cao đĩa lý thuyết (H) của pic B,C.

2. Tính giá trị trung bình T và σ của cột.

3. Tính chỉ số lưu giữ của chất B,C.

4. Thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 12,3ml. Thể

tích của pha động bằng 17,6ml. Hãy tính hệ số phân bố B,C.

Giải:

1. Tính n và H:

+ Đối với pic B:

2 2 B 10, 60 16 16 5733 W 0,56 RB B t n =   =   =    

+ Đối với pic C

2 2 C 11, 08 16 16 5643 W 0,59 RC C t n =   =   =    

Vậy số đĩa lý thuyết của cột tương đương 5688 đĩa lý thuyết.

+ Chiều cao đĩa lý thuyết:

3 28,3 _{4,975.10 ( )} 5688 L H cm n − = = =

2. Tính σ và T:

Từ

2 2 3 2 2 . 5688.(4,975.10 ) 0,375( ) n n H cm H σ σ − = ⇒ = = =

Ta có:

.RB 10,6.0,375 _{0,141( )} 28,3 B t T phut L σ = = = RC . 11, 08.0,375 _{0,147( )} 28,3 C t T phut L σ = = = 0,141 0,147+

Ta có:

0,84 0, 079 10, 6 m B RB t R t = = =

0,84 0, 076 11,08 m C RC t R t = = =

4. Hệ số phân bố B,C:

Ta có:

(1 ) 17,6(1 0, 079) 16, 68 . . 0, 079.12,3 m m B B B m B S B S V V R R k V k V R V − − = ⇒ = = = + (1 ) 17,6(1 0, 076) 17, 40 . . 0, 076.12,3 m m C C C m C S C S V V R R k V k V R V − − = ⇒ = = = +

Bài 2

Tính số đĩa lý thuyết hiệu lực n

ef

và H

ef

của hệ sắc ký có tính chất sau:

280 ; 300 ;

A B

R R

t = s t = s W_A=14 ;s W_B =15 .s

Thời gian chết là t

m

=10s, cột có chiều dài là

3,2m.

Giải:

Theo lý thuyết ta có số đĩa lý thuyết hiệu lực n

ef

là:

(

)

2 2 1 ' ' + = k k n

; với k’ là tỷ số dung tích.

2

16

_











−

=

W

t

t

n

R M ef 2 280 16 6400 14 A n = _ _ =   2 300 16 6400 15 B n =   =  

Từ đó ta có:

Đối với pic A:

' 280 10 27;

10 R M M t t k t  ₋   ₋  = =_ _=   2 27 6400 5951, 07 27 1 A ef n = _ _ = +  

Đối với pic B:

' 300 10 29; 10 R M M t t k t  ₋   ₋  = =_ _=   2 29 6400 5980, 4 29 1 B ef n = _ _ = +  

Vậy,

n =_ef 5065, 7

;

300 0, 053 5965, 7

ef

H = =

.

Bài 3

Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào

(lúc đó của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút). Pic

của chất X có dạng đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s. Độ dài của cột là

40,2cm.

1. Tính số đĩa lý thuyết trong cột.

2. Tính H của cột.

3. Tính T và σ của cột.

4. Tính chỉ số lưu giữ của chất X.

5. Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của

chất mang của cột bằng 9,9ml. Thể tích của pha động bằng 12,3ml. Hãy tính hệ số phân

bố X.

6. Tiêu chuẩn phân chia X và Y là bao nhiêu nếu yếu tố phân chia đối với X và Y bằng

1,011.

Giải:

1. Số đĩa lý thuyết (n):

22130 2 , 24 60 . 15 16 W 16 2 2 X =       =       = RX X t n

2. Tính H:

Ta có

1,82.10 ( ) 22130 2 , 40 3 _cm n L H H L n − = = = ⇒ =

3. Tính σ và T:

Từ

. 2 22130.(1,82.10 3)2 0,27( ) 2 2 cm H n H n= σ ⇒σ = = − =

Ta có:

0,101( ) 2 , 40 27 , 0 . 15 ._R phut L t T =σ = =

4. Chỉ số lưu giữ của chất X:

Ta có:

0,088 15 32 , 1 = = = R m t t R

Ta có:

12,9 9 , 9 . 088 , 0 ) 088 , 0 1 ( 3 , 12 . ) 1 ( . = − = − = ⇒ + = S m X S m m V R R V k V k V V R

6. Tiêu chuẩn phân chia (R

s

):

Ta có:

) 0,4 011 , 1 1 1 ( 4 22130 ) 1 1 ( 4 − = − = = α n R_S

với

α

là yếu tố phân chia.

Bài 4:

Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau đây:

- Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh: 25,2 cm.

- Tốc độ dòng: 0,312 ml/phút.

- Thể tích pha động (V

m

): 1,40 ml.

- Thể tích pha tĩnh (V

s

): 0,168 ml.

Sau khi cho qua cột một hỗn hợp chứa 4 cấu tử A,B,C và D thu được một sắc ký đồ

cung cấp các dữ kiện sau:

Cấu tử

Thời gian lưu giữ,phút

Chiều rộng chân pic,phút

Không lưu giữ bởi cột

1,2

A

4,7

0,48

B

8,8

0,92

C

12,5

1,34

D

13,8

1,44

Hãy tính:

1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic,giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều

cao đĩa lý thuyết của cột.

2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.

3. Độ phân giải R

S

, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D.

4. Chiều dài cột nếu muốn đạt được độ phân giải 1,5 đối với 2 cấu tử C,D.

Giải

1. Sử dụng phương trình :

_{16( )}2 w R t n =

tính được số đĩa lý thuyết

A: n = 1534

B: n = 1463

C: n = 1392

D: n = 1469

n

= 1500

25, 2 0, 017 1500 tb L H cm n = = = 2 2 2 2 . 1500.(0, 017) 0, 66( ) n n H cm H σ σ = ⇒ = = =

2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.

Áp dụng công thức

' R m X m t t k t −

=

ta tính được hệ số chứa của từng cấu tử :

k’

A

= 2,9 ; k’

B

= 6,3; k’

C

= 9,4 k’

D

= 10.

Từ công thức

' X S X M K V k V =

ta tính được hệ số phân bố của từng cấu tử :

K

A

= 24; K

B

= 53; K

C

= 78; K

D

= 87;

3. Độ phân giải R

S

, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D.

C D 2 _0,94 w w 87 _1,12 78 R s D C t R K K α ∆ = = + = = =

4.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5 đối với 2

cấu tử C,D;k’ và α không thay đổi khi n và L tăng.

Gọi n

1

,n

2

là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có:

,1 1 2 ,2 2 2 0,94 1500 ₃₈₀₀ 1,50 s s R n n R = n ⇔ = n ⇒ =

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5:

L

2

= H.n

2

= 0,017. 3800 = 65 cm.

Bài 5:

Cho hệ sắc ký có tính chất sau:

280 ; 300 ; A B R R t = s t = s W_A =14 ;s W_B =15 .s

Cột có

chiều dài là 3,2m. Thay đổi chiều dài từ 320 cm lên 400 cm. Tính độ phân giải?

Giải:

400 280. 350( ) 320 RA t = = s

300.400 375( ) 320 RB t = = s 2 2 A 280 16. 16 6400 W 14 RA A t n =   =   =    

2 2 B 300 16. 16 6400 W 15 RB B t n =   =   =    

Ta có:

n 16.t W W . 16 2 R 2 = ⇒       = tR n 2 A 16.(350) W 15, 65( ) 8000 s = =

2 B 16.(375) W 16,77( ) 8000 s = =

(

)

2. 375 350 1,54 15,65 16,77 R= − = +

Bài 6

Trong sắc ký khí tốc độ di chuyển của pha động có thể đo được trực tiếp, nếu đưa

vào một lượng nào đó của chất tan tương tự như metan,nó không được giữ bởi pha tĩnh.

Trong cột mao quản có chiều dài 50m; thời gian lưu trữ của metan bằng 71,5s;còn thời

gian giữ của n-heptadecan là 12,6 phút. Hãy cho biết:

a. Tốc độ di chuyển của pha động bằng bao nhiêu?

b. Tốc độ di chuyển của dải n-heptadecan bằng bao nhiêu?

Giải

a. Ta có L = 50 m = 5000 cm.

T

R

= 71,5 s

Vậy tốc độ di chuyển của pha động là:

5000 _{69,93 /} 71,5 R L F cm s t = = =

b. Đối với n-heptadecan: t

R

= 12,6 phút = 756 s.

Vậy tốc độ di chuyển của dải là:

5000

6, 61 / 756

F = = cm s

.

Bài 7

Một cột sắc ký mao quản dài 30m, chạy một chất chuẩn ở hai tôc độ pha động

khác nhau, cho các số liệu sau:

Tốc độ (cm/s)

Số đĩa lý thuyết

0,5

150 000

120 000

Xác định vận tốc tối ưu,chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu và số đĩa lý thuyết ở vận

tốc tối ưu đó,cho A=0.

Giải

TN

2

H

2

= 3000/120000 = 0,025 cm.

Ta có phương trình:

0, 02 0,5 0,5 0, 025 1 B C B C = + = +

Giải phương trình ta được : C= 0,02 s ; B = 0,005 cm

2

/s.

U tối ưu = (B/C)

1/2

= 0,5 cm/s

H

min

= 2(B.C)

1/2

= 0,02 cm.

Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là:

3000

150000 0,02

n = =

.

Bài 8 Một cột dài 360 cm dùng để tách propan và butan bằng phương pháp sắc ký khí.

Dùng thước người ta đo được khoảng cách từ lúc bơm mẫu đến đỉnh của pic sắc ký lần

lượt là 152,5 mm và 415,5 mm,bề rộng chân các pic lần lượt là 13,5 mm và 33,8 mm.

Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với mỗi chất.

Giải

Sử dụng phương trình :

_{16( )}2 w R t n =

tính được số đĩa lý thuyết

n(propan) = 2042

n(butan) = 2416

Chiều cao đĩa lý thuyết

H L n

=

ta được

H(propan) = 0,176 cm

H(butan) = 0,149 cm.

Bài 9 Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng

phương pháp sắc ký lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm. Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu

của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5 và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05

phút. Hãy tính:

1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều

cao đĩa lý thuyết của cột.

3. Hãy tính chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5.

Giải

Ký hiệu A : metyl xiclohexan

B: metyl xiclohexen

C: toluen.

1. Sử dụng phương trình :

_{16( )}2 w R t n =

tính được số đĩa lý thuyết

A: n = 2902

B: n = 3025

C: n =2645

n

tb

= 2900

420 0, 015 2900 tb L H cm n = = = 2 2 2 2 . 2900.(0, 015) 0,81( ) n n H cm H σ σ = ⇒ = = =

2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl

xiclohexen và toluen

, A B , A B 2 1,16 w w 2 2, 70 w w R s A B R s B C t R t R − − ∆ = = + ∆ = = +

3.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5.

Vì R

s,A-B

= 2,70>1,5 nên chỉ cần tính chiều dài để độ phân giải giữa A-B đạt yêu

cầu 1,5.

Gọi n

1

,n

2

là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có:

,1 1 2 ,2 2 2 1,16 2900 ₄₈₀₀ 1,50 s s R n n R = n ⇔ = n ⇒ =

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5:

L

2

= H.n

2

= 0,015. 4800 = 73 cm.

Bài 10:

Một phép sắc ký khí sử dụng cột dài 36 m, chạy chất chuẩn ở 3 thí nghiệm với

tốc độ pha động khác nhau cho các pic có thời gian lưu và độ rộng pic như sau:

Thí nghiệm

u (cm/s)

t

R

(s)

w (s)

1

10

300

20

2

20

250

16

3

30

150

10

Xác định vận tốc tối ưu, số đĩa lý thuyết cho cột vận hành ở vận tốc tối ưu đó

Giải :

Theo phương trình Van-Deemter, muốn xác định được vận tốc tối ưu, H

min

và số

đĩa lý thuyết ta cần xác định các hệ số A, B, C. Muốn vậy ta xác định số đĩa lý thuyết và

chiều cao đĩa lý thuyết cho từng thí nghiệm :

Ta có : L=36 m = 3600 cm

TN 1:

3600 20 300 16 2 1  =      = n 1,00( ) 3600 3600 1 cm H = =

TN 2:

3906 16 250 16 2 2  =      = n 0,92( ) 3906 3600 2 cm H = =

TN 3:

3600 10 150 16 2 3  =      = n 1,00( ) 3600 3600 3 cm H = =

Thay các số liệu vào phương trình trên ta có hệ phương trình sau:

C B A 10 10 00 , 1 = + +

(1)

C B A 20 20 92 , 0 = + +

(2)

A B 30C 30 00 , 1 = + +

(3)

Giải hệ gồm 3 phương trình (1), (2) và (3) ta được:

A= 0,36 (cm), B = 4,8 (cm

2

/s) và C = 0,016 (s)

Vận tốc tối ưu, H

min

và số đĩa lý thuyết được tính là :

)

/

(

32

,

17

016

,

0

8

,

4

s

cm

C

B

u

_toiuu

=

=

=

)

(

914

,

0

016

,

0

.

8

,

4

2

36

,

0

.

2

min

A

B

C

cm

H

=

+

=

+

=

3939 914 , 0 3600 = = = H L n

2.TS-Nguyễn Đình Lâm- Cơ sở lý thuyết và ứng dụng của sắc ký-Bài giảng.

3.TS- Nguyễn Bá Hoài Anh-Đại cương về sắc ký –Bài giảng.

4.KS-Phan Hiền Lương- Phương pháp sắc ký lỏng HPLC.

5. Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng. Phạm Hùng Việt–

NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

Chương 2. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.1. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên 2 pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Quá trình sắc ký khác cơ bản với quá trình tách khác ở 2 điểm:

- Sự phân bố chất phân tích lên 2 pha lặp đi lặp lại nhiều lần (hàng ngàn lần, thậm chí hàng triệu lần).

- Pha động đi qua pha tĩnh.

1.2. VÀI NÉT VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Ban đầu, phương pháp được thực hiện ở áp suất thường vì chất nhồi cột có kích thước lớn. Cơ chế tách là sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố nhưng do tốc độ phát triển nhanh của phương pháp, các chất nhồi cột khác nhau ngày càng được cải tiến, hiệu quả tách của cột ngày càng được nâng cao.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký lỏng – lỏng, sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn.

Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích và được sử dụng nhiều trong lĩnh vực kiểm nghiệm, đặc biệt là trong kiểm nghiệm thuốc và hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần (cho phép định tính và định lượng).

1.3. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC

Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động. Do các chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau.

Hình: Minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký.

Như vậy có thể nói HPLC là một sắc ký cổ điển đi kèm với một detectơ nhạy để phát hiện chất phân tích sau khi tách ra khỏi cột trong quá trình chạy sắc ký.

Với những tiến bộ kỹ thuật về cột tách và detectơ đã chuyển phương pháp phân tích này có một tốc độ nhanh và chính xác nhờ hệ thống bơm cao áp khoảng 300 atm nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài ml/phút. Vì vậy người ta gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Ưu điểm của phương pháp này là lượng mẫu phân tích rất ít chỉ cần khoảng 20µL/1 lần phân tích và mẫu chỉ cần hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ trong quá trình phân tích.

1.4. CÁC GIAI ĐOẠN CHẠY SẮC KÝ HPLC * Giai đoạn tách:

- Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất cao (200 ÷ 500 atm). Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch (thường là hòa tan trong dung môi làm pha động). Phương pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường).

- Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau).

- Kỹ thuật chạy sắc ký:

+ Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi).

+ Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục). Građient có thể là từng bậc hoặc liên tục tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn.

* Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích:

- Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là detectơ. - Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như : thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic, hệ số phân giải, hệ số đối xứng…

+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tính chất này để phân tích định tính.

+ Độ lớn pic được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích.

1.5. CỘT TÁCH TRONG HPLC

Cột tách là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký, bao gồm các vấn đề: các loại cột tách, chất liệu làm cột, kích thước cột, kích thước hạt nhồi, cách nạp cột,…

Hỗn hợp các chất tan có thể được tách hoàn toàn ra khỏi nhau hay không được xác định bởi hiệu quả của cột tách và bởi độ chọn lọc của hệ pha. Do vậy điều quan trọng là phải chế tạo được các cột tách có hiệu quả.

* Cột tách trong HPLC có 3 loại:

+ Cột thường. + Cột mao quản.

+ Cột kích thước nhỏ (cột micro).

* Chất liệu làm cột: là thép đặc biệt, nếu làm bằng thủy tinh thì phải bọc thép ở ngoài vì

phép sắc ký này được thực hiện ở áp suất rất cao. * Kích thước cột: Loại cột tách Đường kính (mm) Chiều dài (cm) Tốc độ chảy (mL/phút) Số đĩa lý thuyết Cột thường 4,0 ÷ 4,6 15 ÷ 30 1 ÷ 2 40.000 ÷ 60.000 Cột mao quản 4,0 ÷ 4,6 4 ÷ 13 2 ÷ 4 40.000 ÷ 60.000 Cột micro 1,0 ÷ 2,0 15 ÷ 100 0,03 ÷ 1 1.000.000

- Trong đó cột có đường kính 4.6mm được dùng nhiều nhất, chiếm 44,5%;cột đường kính 4,0 mm là 16,7%

- Cột mao quản có thời gian phân tích rất ngắn, dễ thay đổi tốc độ chảy từ cột quy ước sang cột mao quản. Tuy nhiên có những bất tiện là phải trang bị thể tích cột phụ, thể tích cuvet của detector phải nhỏ, việc nhận và xử lý tín hiệu phải nhanh.

- Cột micro tiết kiệm dung môi pha động.

- Kích thước của cột phụ thuộc vào chất nhồi: hạt nhồi nhỏ thì kích thước cột nhỏ, hạt

nhồi lớn thì kích thước cột lớn sao cho đủ số đĩa lý thuyết để thực hiện phép tách hoàn toàn.

Hình: Cột sắc ký. * Kích thước hạt nhồi:

- Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể là chất rắn hoặc chất lỏng:

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành chất nhồi hay cột sắc ký (các hạt chất nhồi trong pha tĩnh rắn có d = 3 ÷ 10 µm, phổ biến nhất hiện nay là 3 ÷ 7 µm).

+ Pha tĩnh lỏng thì được giữ trong cột sắc ký nhờ vào hạt chất mang trơ. Màng mỏng thường dùng là các loại dầu như silicon có bề dày d = 1÷3 µm, loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn.

Như vậy tùy thuộc vào pha tĩnh mà ta có phương pháp sắc ký lỏng - lỏng (pha tĩnh lỏng) hoặc lỏng - rắn (pha tĩnh rắn).

- Hạt chất nhồi có đường kính 30 µm thích hợp cho cột tách có đường kính trong 2 mm. Khi sử dụng chất nhồi có đường kính nhỏ hơn 10 µm, đường kính trong cột tách khoảng 3 ÷ 4 mm sẽ cho hiệu suất tách và độ lặp lại tốt. Như vậy kích thước hạt dùng trong HPLC nhỏ hơn so với sắc ký khí.

có, vì các hạt có kích thước lớn gây nhiễu loạn đáng kể sự đồng nhất quá trình nhồi, trong khi đó các hạt quá nhỏ lại làm giảm sự thấm ướt...

Hình: Hạt nhồi trong HPLC. * Cách nhồi cột:

- Trước khi nhồi, cột tách làm bằng thép không gỉ được làm sạch bằng HNO3 50%, rửa

bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng axeton, clorofom rồi lại bằng axeton và cuối cùng làm khô bằng khí N2 hoặc không khí nóng.

- Các phần gá lắp ở đầu và cuối cột tách với các bộ phận khác cũng rất quan trọng và làm thể tích chết ít nhất. Ở các đầu cột tách phải sử dụng các màng lọc bằng thép không gỉ, thủy tinh xốp ép, teflon xốp. Bông thủy tinh thường được dùng để ngăn các hạt nhỏ. Lỗ xốp của vật liệu làm ngăn phải nhỏ hơn kích thước các hạt nhồi ít nhất là 5 lần.

- Trong thực tế có 2 cách nhồi: nhồi khô và nhồi ướt (huyền phù). Việc lựa chọn cách nhồi cột tách phụ thuộc vào kích thước của chất nhồi:

+ Các chất nhồi có đường kính lớn hơn 20µm thường được nhồi khô, từng phần nhỏ chất nhồi được thêm vào cột (khoảng 0,5 ml hoặc ít hơn), vừa rót vừa gõ hoặc rung. Trong một số trường hợp có thể nối với bơm sắc ký và luyện cột ở tốc độ dòng cao và áp suất cao trong 10 phút. Cột nhồi được coi là tốt (đường kính hạt chất nhồi 30÷40 µm) ở tốc độ rửa giải 3 cm/s và chiều cao đĩa lý thuyết của cột tách khoảng 1 mm.

+ Với kích thước hạt chất nhồi khoảng 10µm hoặc 5µm người ta hay sử dụng phương pháp nhồi ướt. Trong quá trình nhồi cột, huyền phù phải bền vững, không có sự sa lắng. Huyền phù bền vững khi :

• Giữa các tiểu phân và chất lỏng huyền phù có tỷ trọng như nhau (phương pháp cân bằng tỉ trọng).

• Độ nhớt của môi trường huyền phù lớn đến mức tốc độ sa lắng của các tiểu phân là cực tiểu (phương pháp độ nhớt cao).

đioxan... hay hỗn hợp của chúng, các chất lỏng có độ nhớt cao như parafin, xiclohexano. * Ngoài ra, người ta còn sử dụng cột bảo vệ đặt trước cột phân tích để giảm thiểu sự hấp phụ bất thuận nghịch của chất tan đối với pha tĩnh và sự tắc nghẽn cột chính. Cột bảo vệ nói chung giống cột phân tích nhưng được chế tạo từ những vật liệu rẻ hơn với ý nghĩa là cột chấp nhận hi sinh để bảo vệ tuổi thọ của cột phân tích.

1.6. CÁC LOẠI PHA TĨNH THƯỜNG DÙNG TRONG HPLC 1.6.1. Nguyên tắc chọn pha tĩnh trong HPLC

Chọn pha tĩnh trong HPLC sao cho:

- Cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại phải được thiết lập nhanh.

- Pha tĩnh có dung lượng lớn để hấp phụ một lượng lớn chất phân tích. - Khoảng áp suất làm việc tương đối rộng.

1.6.2. Các loại pha tĩnh trong HPLC

* Pha tĩnh hấp phụ pha thường :

- Loại pha tĩnh này được chế tạo từ: silicagen, polime (polistiren…).

- Silicagen có cấu tạo đặc biệt, xốp, bề mặt gồ ghề, có những mao quản cho nên diện tích bề mặt của silicagen lớn, trên bề mặt của nó còn có các nhóm silanol cũng có thể tham gia các liên kết với chất phân tích. Silicagen có tính axit, pH = 3 ÷ 5 nên hấp phụ tốt các chất có tính bazơ hơn là các hợp chất có tính axit. Vì những đặc tính trên mà Silicagel thường được sử dụng để tách, phân li các hợp chất thuộc họ rượu, phenol, andehit, axit hữu cơ, lipit, amin,….). Trên bề mặt của nó có chứa nhóm –OH là nhóm phân cực. Các nhóm –OH có thể tương tác rất mạnh với các phân tử có chứa nhóm chức. Độ lớn của sự tương tác phụ thuộc vào kiểu và số các nhóm chức trong các phân tử chất tan.

Khi gặp những hỗn hợp phức tạp thì ta hoạt hóa nhóm –OH bằng một số nhóm phân cực: -C3H6CN, -(CH3)2-O-CH2-CH(OH)-CH2(OH), -C3H6NH2… Nhóm này là những nhóm ưa

nước vì dễ tạo cầu liên kết hiđro với các phân tử nước nên làm giảm hoạt tính sắc ký pha tĩnh. - Sự lưu giữ của các chất tan trong các hệ xảy ra là do tương tác giữa các phân tử chất tan và các vị trí hoạt động trên bề mặt của chất rắn. Vì các phân tử dung môi có thể tương tác với các vị trí này, sự hấp phụ có thể coi như là quá trình cạnh tranh giữa các phân tử chất tan và

O O O

OH OH OH OH