Universidade Federal de São Paulo Campus Baixada Santista
PPG em Biodiversidade e Ecologia Marinha e Costeira
EFEITOS BIOLÓGICOS DA ORFENADRINA SOB DIFERENTES CENÁRIOS DE ACIDIFICAÇÃO OCEÂNICA
Mariana Gonçalves de Souza
Dissertação apresentada, como exigência para a obtenção do título de Mestre junto ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Ecologia Marinha e Costeira da Universidade Federal de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Augusto Cesar Coorientador: Prof. Dr. Fabio Hermes Pusceddu
Santos 2020
AGRADECIMENTOS
Definitivamente, a parte mais difícil de escrever de toda a minha dissertação. Difícil começar, difícil expressar em palavras toda minha gratidão por cada
pessoa que esteve ao meu lado nos dois anos mais desafiadores da minha vida.
Eu sabia desde o início que a experiência de fazer um mestrado seria
desafiadora. Com vinte quatro anos, recém-formada, trabalhando em três escolas ao mesmo tempo, quando tudo pareceu se acalmar, surge a maior PANDEMIA do século. Não poderia iniciar esse texto de outra forma a não ser agradecendo a Deus pela oportunidade de concluir esta experiência com saúde em meio ao cenário caótico que estamos vivendo.
Aos meus familiares Luiz Fernando (pai), Ana Karina (mãe), Rafael, Gabi, vóva e toda minha família, obrigada pela força e pelo suporte emocional. Essa conquista não é minha. É nossa por vocês sempre.
Obrigada aos meus coordenadores Lucas, Cissa, Ana e Ávila e aos gestores das instituições que eu leciono pela paciência e por confiarem em meu trabalho.
Obrigada ao meu orientador Prof. Augusto, aos professores Fábio, Ítalo e Lorena, bem como aos meus colegas Letícia Leite, Amandinha, Matheus, Aline, Monique e Helô por todo o suporte e conhecimento compartilhado. Vocês me ensinaram muito e eu os levarei para sempre em meu coração com um sentimento de eterna gratidão.
Gratidão eterna a todos os meus amigos, em especial a minha amiga Nathalia Daud por não me deixar desistir. Por me agüentar chorando, sorrindo e estar sempre ao meu lado. Para sempre juntas, minha irmã.
Ao meu namorado Rodrigo, que entrou na minha vida na reta final, mas que não deixou de estar ao meu lado um minuto se quer. Incentivando-me e me dando suporte, me acolhendo. Obrigada por tudo amor.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelos recursos do projeto (#2017/07353-7).
E por último, mas não menos importante gratidão eterna a cada um dos meus alunos dos anos de 2019 e 2020. Por casa abraço, cada palavra de consolo, cada piada e por serem tão compreensivos quando eu estive sobrecarregada. Obrigada ao meu terceirão por me agüentar tendo crises de choro/emoção em algumas aulas. Por me acolherem, nesse ano tão difícil. Preocuparam-se com a saúde mental dos professores e mostrarem que “a base vem forte”. Vocês são os seres humanos mais lindos e empáticos que já conheci. Gratidão eterna. Sou apaixonada por vocês. Obrigada Deus. Por tudo.
Resumo
O aumento das emissões de gás carbônico atmosférico proveniente de atividades antrópicas desde a Revolução Industrial teve como consequência uma maior participação de águas superficiais no processo de sequestro de dióxido de carbono, a fim de amenizar o efeito estufa. A principal consequência do aumento de captura de gás carbônico pelos oceanos é um fenômeno denominado acidificação oceânica. Alguns poluentes presentes na água, como por exemplo fármacos e produtos de cuidados pessoais (FPCPs) podem sofrer alterações na sua mobilidade e biodisponibilidade por conta da diminuição do pH do meio. Atualmente a quantidade de dados sobre os efeitos e o risco ambiental de FPCPs em organismos marinhos ainda é escassa. Diante deste cenário o presente estudo teve como objetivo analisar a ocorrência, o comportamento e a biodisponibilidade do fármaco orfenadrina frente a diferentes cenários de acidificação oceânica. O fármaco orfenadrina, empregado como relaxante muscular e amplamente consumido foi observado em todos os pontos de amostragem das áreas de influência dos emissários submarinos de Santos e Guarujá - SP, com concentrações que variaram <LOQ a 2,14 ng/L a em água e de >LOQ a 0,5 ng/g em sedimentos. Os resultados do ensaio de toxicidade com água empregando ouriços do mar (Echinometra lucunter) nos diferentes pHs 8,0; 7,6; 7,3 apresentaram valores de CEO de 0,05mg/L e o EpH50 foi estabelecido em 7,30. Quanto aos ensaios com mexilhões Perna perna foram observados efeitos em concentrações ambientalmente relevantes, com CEO de 200 ng/g.Os resultados dos ensaios feitos para a avaliação do desenvolvimento embriolarval em água indicaram que tanto o processo de acidificação quanto o aumento da concentração afetam o desenvolvimento dos embriões de ouriço do mar. Já nos ensaios com P. perna foi possível verificar ainda que a presença do fármaco de caráter básico reduziu os efeitos da acidificação oceânica. Os resultados da análise de bioacumulação detectaram a presença da orfenadrina em todos os tecidos analisados. A análise dos ensaios de citotoxicidade nesta ocasião refutou a hipótese inicial do estudo, visto que a presença do fármaco de caráter básico reduziu os efeitos da acidificação oceânica. Neste sentido, fica evidente necessidade de se aprofundar os estudos sobre toxicologia relacionada a fármacos sob cenários de acidificação em ambiente marinho.
Abstract
The increase in the emission of atmospheric carbon dioxide from anthropic activities since the Industrial Revolution increased the process of carbon dioxide absorption by the ocean in order to mitigate the greenhouse effect.The main consequence of this process is a phenomenon called ocean acidification. Among the various pollutants that may change due to lower water pH, drugs and personal care products (FPCP) are of major concern. Currently the amount of data on the effects and environmental risk of FPCP on marine organisms is still thin. Given this scenario the present study aims to analyze the occurrence, behavior and bioavailability of the drug orphenadrine against different scenarios of ocean acidification. The drug orphenadrine, used as a muscle relaxant and widely consumed was observed in all sampling points of the influence areas of the outfalls of Santos and Guarujá - SP, with concentrations ranging <LOQ to 2.14 ng / L a in water and > LOQ at 0.5 ng / g in sediments. The results of the water toxicity test using sea urchins (Echinometra lucunter) at different pH 8.0; 7.6; 7.3 had CEO values of 0.05mg / L and EpH50 was set at 7.30. As for assays with Perna pernamussels effects were observed at environmentally relevant concentrations, with CEO of 200 ng / g. Test results for the evaluation of embryolarval development in water indicated that both the acidification process and the increase in concentration affect the development of sea urchin embryos. In the tests with P. perna, it was possible to verify that the presence of the basic drug reduced the effects of ocean acidification.The results of the bioaccumulation analysis detected the presence of orphenadrine in all tissues analyze. The analysis of the cytotoxicity tests refuted the initial hypothesis of the study, since the presence of the basic drug reduced the effects of ocean acidification. In this sense, the need to deepen the studies on drug related toxicology under marine acidification scenarios is evident.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química da orfenadrina (Fonte: HSDB – TOXNET)...17 Figura 2. Localização do ponto de coleta de água e sedimento na praia Itaguaré (Bertioga- SP) (Fonte: Google Earth)………..……….…………..22 Figura 3. Localização dos cinco pontos de coleta de sedimentos no entorno do EmissárioSubmarino de Santos (ESS) e sua posição na América do Sul (Fonte: Google Earth)...23
Figura 4. Localização dos dois pontos de coleta no município do Guarujá-SP (Fonte: Google Earth)...24
Figura 5. Localização da área de coleta dos mexilhões Perna perna para a avaliação da bioacumulação (Fonte: Google Earth)...24
Figura 6. Larvas Pluteus de E. lucunter com desenvolvimento embriolarval normal (a) e com alterações morfológicas e/ou retardo no desenvolvimento (b)...29
Figura 7. Obtenção de gametas masculinos de Echinometra lucunter...30 Figura 8. Representação do esquema de injeção de CO2 em ensaios. (Fonte: Software Apex Fusion)...33
Figura 9. Médias e erro-padrão dos resultados de desenvolvimento embriolarval comE. lucunter em água após 42 horas de exposição a orfenadrina nos diferentes pH. *Indica diferença significativa das concentrações de cada tratamento em relação ao seu respectivo controle, dentro de cada pH testado. Letras diferentes indicam diferença significativa entre as concentrações (controle; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 e 0,8 mg/L) entre diferentes tratamentos de pH...40
Figura 10. Médias e desvio-padrão dos resultados da comparação entre os controles dos ensaios de desenvolvimento embriolarval com E. lucunter em água após 42 horas de exposição...41
Figura 11. Médias e erro-padrão dos resultados de desenvolvimento embriolarval com E. lucunter em sedimentos após 42 horas de exposição á orfenadrina nos diferentes pH...41
Figura 12. Médias e desvio-padrão dos resultados da comparação entre os controles dos ensaios de desenvolvimento embriolarval com E. lucunter em sedimentos após 42 horas de exposição...42
Figura 13. Médias e erro-padrão dos resultados de citotoxicidade em hemócitos do bivalve P. perna em água após 96 horas de exposição à orfenadrina nos diferentes pH...43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Coordenadas geográficas dos sete pontos de coleta de água e sedimentos no entorno dos Emissários submarinos de Santos e Guarujá (SP)...23
Tabela 2. Parâmetros de operação MRM no modo de ionização positiva, limites de detecção e quantificação e tempo de retenção...26
Tabela 3. Caracterização do sedimento utilizado nos testes (de acordo com a escala de Wentworth (1922)...38
Tabela 4. Concentrações de orfenadrina detectadas na análise química em água (ng/L) (Pontos 1-5 pertencem a Santos-SP e pontos G1; G2 pertence ao emissário do Guarujá)...39
Tabela 5. Concentrações de orfenadrina detectadas na análise química em sedimentos (ng/g) (Pontos 1-5 pertencem a Santos-SP e pontos G1; G2 pertence ao emissário do Guarujá)...39
Tabela 6. Resultados do sistema de carbonatos em ensaios na matriz água com P. perna expostos a orfenadrina sob pH 8,0...44
Tabela 7. Resultados do sistema de carbonatos em ensaios na matriz água com P. perna expostos a orfenadrina sob pH 7,6...44
Tabela 8. Resultados do sistema de carbonatos em ensaios na matriz água com P. perna expostos a orfenadrina sob pH 7,3...45
Tabela 9. Resultado dos ensaios de bioacumulação dos organismos coletados no entorno da baía de Santos...46
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µg – Micrograma µL – Microlitro µm – Micrômetro AO - Acidificação oceânica AT – Alcalinidade Total
CCS – Carbon Capture and Storage
CETESB- Companhia Ambiental do Estado de São Paulo CENO – Concentração de Efeito Não Observado
CEO – Concentração de Efeito Observado CO2 – Dióxido de carbono
DNA- Ácido Desoxirribonucleico DMSO – Dimetilsulfóxido
EPC - Estação de pré- condicionamento EFS – Extração em fase sólida
ESS – Emissário Submarino de Santos ESG – Emissário Submarino do Guarujá ETA – Estação de Tratamento de Água ETE – Estação de Tratamento de Esgoto
FPCP – Fármacos e Produtos de Cuidados Pessoais G – Grama KCl – Cloreto de Potássio L – Litro LQ – Limite de quantificação mg – Miligrama mL – Mililitro
MRM – Monitoramento de múltiplas reações ng – Nanograma
ORF – orfenadrina
12 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 13 1.2 Objetivo geral...19 1.3 Objetivos específicos...19 2. MATERIAL E MÉTODOS...20 2.1 Área de estudo ... 20 2.2 Coleta de amostras ... 21 2.3 Análise química ... 25 2.3.1 Caracterização de sedimentos ... 26 2.4 Marcação do sedimento...27 2.5 Avaliação da toxicidade...28 2.5.1 Ensaios embriolarvais...28 2.5.2.1 Obtenção de gametas...29
2.5.2.2 Ensaio embriolarval em água...30
2.5.2.3 Ensaio embriolarval em sedimentos...31
2.5.3 Ensaio do tempo de retenção do corante vermelho neutro...31
2.6 Coleta de organismos...33
2.7 Sistema de injeção de gás carbônico...33
2.8 Alcalinidade...35
2.9 Bioacumulação...35
2.10 Análise de Dados...36
3. RESULTADOS ... 38
3.1 Caracterização dos sedimentos ... 38
3.2 Análises químicas das amostras de água e sedimentos...38
3.3 Ensaios de toxicidade para avaliação de efeito crônico (embriolarval) com o ouriço do mar da espécie Echinometra lucunter em diferentes tratamentos de pH...39
3.3.1 Matriz água...39
3.3.2 Matriz sedimento...41
3.4 Resultados dos ensaios de citoxicidade em mexilhão...42
3.5 Bioacumulação...45
4. DISCUSSÃO ... 46
5. CONCLUSÃO ... 54
13 1. INTRODUÇÃO
O crescimento populacional global em grande escala é uma realidade que tem acarretado uma série de problemas entre os quais estão a desestabilização de ecossistemas costeiros e a perda da biodiversidade (GEO 6, 2019). A biodiversidade, considerada um fator-chave por assegurar o fornecimento de diversos os tipos de serviços ecossistêmicos, tem sido pressionada por alguns fatores entre os quais se destacam as mudanças climáticas, a superexploração de recursos, a perda de habitats, a introdução de espécies exóticas e a poluição química (Backhaus, Snape, & Lazorchak, 2016).
O fenômeno das alterações nos padrões climáticos globais foi alvo de diversos estudos nas últimas décadas visando compreender de que forma o meio ambiente e a biodiversidade seriam impactados com estas mudanças em longo prazo (Vinagre et al., 2016; Passarelli et al., 2017). Desde o período da Revolução Industrial tem sido reportado um crescente aumento da emissão de gases de efeito estufa na atmosfera oriundo das atividades antrópicas, como a queima de combustíveis fósseis.
Estima-se que 30% do dióxido de carbono presente na atmosfera têm sido absorvidos pelos oceanos desde o século passado (Sabine et al., 2004; Gomes et al., 2005). A principal consequência do aumento de captura de gás carbônico pelos oceanos é a diminuição do pH das águas superficiais, tornando-as mais ácidas.
Os oceanos caracterizam-se por possuírem um pH superficial naturalmente alcalino. Quimicamente falando, essa escala numérica, a qual possui natureza logarítmica, é utilizada para especificar a acidez ou basicidade de uma solução aquosa. A escala de pH usualmente varia entre 0 e 14, sendo que o valor 7 representa um meio neutro, valores abaixo de 7 meios ácidos e acima de 7 meios básicos ou alcalino (Zapp, Nardini e Sandiogo, 2005).
Uma redução de 0,1 no valor de pH inicial, que a princípio pode parecer uma pequena variação, pode na verdade representar bruscas mudanças em um determinado ambiente. Segundo estudos realizados por importantes órgãos ambientais, a estimativa é que até o fim do século XXI o pH dos oceanos, que atualmente é de cerca de 8,1, tenha uma redução de 0,3 unidades em sua escala (IPCC, 2000).
14 Quando o CO2 atmosférico entra em contato com a água, ocorre uma reação química que tem como produto a formação do ácido carbônico. Este, por sua vez, é uma molécula instável que logo passa por um processo de dissociação, o qual origina íons de bicarbonato e íons H+. Os íons bicarbonato também reagem com outras moléculas presentes nas águas superficiais, o que faz com que sejam produzidos íons carbonato simultaneamente à liberação de hidrogênio em sua forma iônica na coluna d'água (Orr et al., 2005; Ragagnin, 2017).
Sabe-se que o aumento de íons H+ na água confere ao meio características ácidas. Em condições normais, este sistema funciona em perfeito equilíbrio, pois existem estratégias que limitam as reações químicas que acontecem e desta forma reduzem a disponibilidade de íons H+. No entanto, com o aumento das emissões de gases de efeito estufa na atmosfera e ampliação da participação dos oceanos na captura deste gás, o processo acaba acontecendo de forma acelerada (Orr et al., 2005; Ragagnin, 2017).
Mudanças drásticas na estrutura de ecossistemas marinhos podem ser ocasionadas em resposta às alterações nos parâmetros físico químicos da água, provenientes do aumento da concentração de dióxido de carbono (CO2) no meio, o qual influencia diretamente a química do carbonato nos oceanos (Orr et al., 2005). Variações na temperatura, pH e nos níveis de oxigênio dissolvido, bem como a disponibilidade de nutrientes, são exemplos de parâmetros que podem sofrer alterações e desta forma, deixar os ecossistemas instáveis e vulneráveis (Passarelli et al., 2017).
Os íons carbonato desempenham um importante papel na vida de alguns organismos da biota marinha. Isto porque essa molécula possui afinidade com íons de cálcio presentes no meio. Ao se conectarem por meio de uma ligação iônica, estes elementos formam o carbonato de cálcio, substância fundamental para organismos calcificadores. O aumento de íons H+ no meio faz com que os íons carbonato liguem-se a eles ao invés de liguem-se ligar aos íons de cálcio, tornando estes ânions menos disponíveis para a formação de carbonato de cálcio (Souza et al., 2019).
Os organismos calcificadores podem ser prejudicados em diferentes aspectos: fisiologicamente, reprodutivamente e até mesmo geograficamente. O fluxo de matéria e energia no ecossistema é automaticamente influenciado, visto que estes seres ocupam um importante nível trófico na cadeia alimentar, sendo classificados na
15 maioria dos casos como consumidores primários. Grupos de organismos calcificadores como moluscos e crustáceos são uma importante fonte de renda principalmente em regiões costeiras. Logo, um desequilíbrio ecológico também desencadearia automaticamente um grande impacto econômico (Duarte et al., 2016). Os efeitos da acidificação oceânica devem ser analisados em diversas escalas de complexidade ecológica. Isto porque não só aspectos como a fisiologia e a reprodução da biota podem ser afetadas, como também as relações ecológicas e a dinâmica das comunidades (Pörtner, 2008).
Segundo Rossoll et al., (2012) os efeitos podem trazer consequência desde a base da cadeia alimentar, visto que podem alterar a composição química de produtores primários. Essas alterações imediatamente podem ocasionar a perda de valor nutricional dos níveis tróficos próximos ao topo, impactando drasticamente o fluxo energético ao longo da cadeia alimentar.
O uso de estruturas geológicas marinhas no processo de captura e armazenamento de dióxido de carbono (CCS) como estratégia de mitigação do aquecimento global foi proposto no Protocolo de Londres, cuja pauta era a prevenção da contaminação marinha. Apesar das vantagens indiscutíveis da estratégia, ocasionalmente podem acontecer escapes de CO2, contribuindo para o processo de acidificação dos oceanos (IPCC, 2005).
No Brasil, as atividades da indústria petrolífera em altas profundidades oceânicas aderem uma técnica denominada de injeção de CO2. A técnica consiste no aumento da pressão de retirada do petróleo dos poços por meio da injeção de CO2 capturado da atmosfera, tornando o sistema de extração mais eficaz (IPCC, 2007). Em contrapartida, vazamentos de CO2 durante o processo podem eventualmente acontecer e mudanças na mobilidade de poluentes presentes na água e em sedimentos marinhos podem advir destes vazamentos, aumentando a tendência de determinados compostos de bioacumularem em tecidos de organismos pertencentes à biota marinha (Ardelan et al., 2009).
Alguns estudos como o de Harvey et al., (2013) reportaram que a acidificação oceânica não é um processo que ocorre de forma isolada no meio. Simultaneamente a este processo, temos também outros fenômenos acontecendo como o aumento da temperatura das águas e aumento na concentração de poluentes na água.
16 Dentre os diversos poluentes que podem sofrer alterações por conta da diminuição do pH das águas, os fármacos e produtos de cuidados pessoais (FPCP) são de grande preocupação. O elevado consumo de FPCP vem crescendo continuamente à medida que novas tecnologias são desenvolvidas, a fim de melhorar a qualidade de vida da população. No entanto, as substâncias presentes nestes produtos são programadas para serem biologicamente ativas e quando em contato com ecossistemas aquáticos, através do despejo de efluentes domésticos, podem sofrer modificações (Mulroy, 2001).
No Brasil, estudos indicam que aproximadamente oitenta milhões de pessoas praticam a automedicação, isto é, fazem o uso de medicamentos sem prescrição médica. A carência de informações e instrução da população, somado ao fácil acesso a medicamentos devido à ausência da obrigatoriedade de receita médica, tem como consequência o uso irracional e inapropriado destas substâncias (Lima et al., 2008).
O fármaco orfenadrina (CASRN: 83-98-7), obtida pela Sigma-Aldrich, tem destacado na mídia por ser amplamente empregado para diminuir sintomas como rigidez muscular, principalmente como consequência da prática de exercícios físicos. Além disso, vem sendo utilizado também no tratamento da Doença de Parkinson graças a suas propriedades anticolinérgicas, reduzindo assim tremores conseqüentes da doença (Gjerden&Slørdal,1998).
Sabe-se que o fármaco sofre biotransformação hepática e é predominantemente excretado via renal (Lutz et al., 1983). Sua fórmula molecular é C18H23NO e a massa molar 269.38g mol-1 (Figura 1). O composto possui o (log Kow ≥ 3) e meia vida biológica de 13 a 20 horas.
17 Figura 1. Estrutura química da orfenadrina (Fonte: HSDB - TOXNET).
Um estudo realizado por Silva et al., (2011) em dez escolas do município de Fortaleza, sendo cinco mantidas por iniciativa pública e cinco privadas, destacou que de 126 adolescentes do sexo feminino que se automedicaram em situação de cólica, 60,3% fizeram uso do medicamento contendo citrato de orfenadrina em sua composição. Os autores destacaram ainda que simultaneamente ao período da coleta de dados, as mídias realizavam o marketing do medicamento, popularmente conhecido como Dorflex®.
Entre os idosos, o quadro do excesso de automedicação é ainda mais grave do que o reportado para jovens visto que estes estão mais sujeitos a disfunções em órgãos e sistemas do corpo humano (Rosenfeld, 2003).
Embora a orfenadrina seja amplamente utilizada pela população, existem poucos estudos sobre a ocorrência dessa substância em ambientes costeiros. Ao analisar amostras coletadas em 32 pontos diferentes ao longo da costa do Mar Báltico e 11 pontos em mar aberto Björlenius et al., (2018) encontraram a orfenadrina em 35% das amostras analisadas. Os pontos de coleta foram espalhados desde o GreatBelt, um dos três estreitos dinamarqueses localizados no Sudoeste, até o Golfo de Bótnia, localizado ao norte.
Em Roma, um estudo realizado por Troiano et al., (2016) analisou amostras de água coletadas ao longo do rio Tiber a fim de identificar quais fármacos, drogas e metabolitos seriam encontrados, visando compreender os padrões de consumo destas substâncias em grandes centros urbanos, com enfoque em Perugia, região central da Itália. As amostras foram coletadas por sete dias contínuos a fim de analisar variações nas concentrações encontradas ao longo da semana em todos os pontos. Dentre as substâncias encontradas a orfenadrina foi um dos fármacos com
18 propriedades psicoativas que apresentou concentrações constantes nas amostras coletadas ao longo da semana, ao contrário de drogas ilícitas como cocaína e heroína que tiveram um aumento nas concentrações das amostras coletadas no final de semana.
Atualmente a quantidade de dados sobre os efeitos e o risco ambiental de FPCP em organismos marinhos ainda é escassa (Gaw et al., 2014; Pusceddu et al., 2018), especialmente no que se refere a orfenadrina. A fim de se compreender e avaliar os efeitos biológicos da poluição tem-se utilizado cada vez mais os ensaios de toxicidade. Estes podem ser empregados para avaliar efeitos em diferentes níveis de organização biológica, diferentes matrizes ambientais e também as consequências de eventuais misturas e interação entre substâncias (Cesar et al., 2002; Newman & Unger, 2003; Choueri et al., 2009).
A partir da análise química das amostras de água do mar e sedimento coletados nos municípios de Santos e Guarujá, foi possível detectar a ocorrência da orfenadrina em todos os pontos de coleta deste trabalho. No entanto, comportamento e a mobilidade do fármaco frente a diferentes cenários de acidificação oceânica, assim como as consequências de interações entre substâncias em ecossistemas aquáticos ainda são desconhecidos, justificando a realização do estudo.
Diante deste contexto, o presente estudo parte da hipótese que a acidificação dos oceanos modificará o potencial tóxico da orfenadrina graças à reação ácido-base em meio aquoso.
19 1.2 OBJETIVOS
O presente estudo tem como objetivo avaliar os potenciais impactos ambientais relacionados à acidificação de água e sedimentos marinhos a partir da avaliação da biodisponibilidade e toxicidade da orfenadrina sobre organismos marinhos em diferentes níveis de organização biológica.
1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar concentrações ambientais da orfenadrina encontrada em amostras de água e sedimentos da área de influência dos Emissários Submarinos de Santos (ESS) e Guarujá, Estado de São Paulo;
Analisar os efeitos citotóxicos subletais em água e sedimentos marinhos contaminados com diferentes concentrações de orfenadrina em laboratório sobre o desenvolvimento embriolarval de ouriços-do-mar Echinometra lucunter.
Determinar os efeitos cito-genotóxicos a partir da estabilidade da membrana lisossomal em mexilhões da espécie P.perna frente a diferentes concentrações de orfenadrina (20, 200 e 2000 ng/L) e valores de pH (8,0; 7,6 e 7,3) por meio da injeção de CO2.
20 2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Área de estudo
A Baía de Santos, localizada no Estado de São Paulo, foi a área escolhida para a realização do presente estudo não apenas por abrigar o maior porto da América Latina, como também por possuir um alto potencial turístico.
O Estuário dos municípios de Santos e de São Vicente, inserido na Região Metropolitana da Baixada Santista no Estado de São Paulo, é um dos mais importantes exemplos brasileiros de degradação ambiental causada como consequência do alto volume de poluição hídrica e atmosférica de origem industrial e portuária em ambientes costeiros (Lamparelli et al., 2001).
Na região, além de estar inserido o maior porto da América Latina (Porto de Santos), localiza-se também um dos maiores pólos industriais do país, o do município de Cubatão. Este se caracteriza por ser um ponto economicamente estratégico, visto que abriga centenas de indústrias químicas desde a década de cinquenta, quando se estabeleceu na região.
O grave quadro de degradação ambiental da região pode ter consequências severas não só na área social e como também na saúde pública. Este cenário torna-se mais grave pois a cidade de Santos não possui ETE (Estação de Tratamento de Esgoto) e sim EPC (Estação de Pré- Condicionamento) cujo o efluente é lançado ao mar através de um emissário submarino, onde o único tratamento é a retenção de partículas sólidas por meio de grades e esporadicamente a desinfecção com adição de cloro (CETESB, 2017). Estima-se que a eficiência e uma EPC seja de aproximadamente 20% o que faz com que o município de Santos seja responsável por lançar uma elevada carga orgânica no mar (CETESB, 2008).
Avanços tecnológicos contribuem cada vez mais para reduzir contaminação dos ambientes aquáticos por compostos xenobióticos (Oliveira e Von Sperling, 2005). Os esgotos domésticos, em sua maioria, são submetidos a tratamentos convencionais, os quais não são capazes de remover resíduos de fármacos do ambiente (Santos et al., 2010).
21 Na região do Estuário Santos- São Vicente Abessa et al., (2002) em seu estudo avaliaram na última década a qualidade de sedimentos deste sistema tão impactado por ações antrópicas. Uma série de compostos com alto potencial poluidor, como metais, detergentes e PAHs foram encontrados em diferentes pontos de coleta.
Um estudo de revisão de literatura publicado por Sousa et al., (2014) reportou que entre a década de 90 até o ano de 2011, foram divulgados cerca de 51 estudos na área de ecotoxicologia nesta região.No entanto, é possível observar a escassez de estudos sobre os poluentes emergentes da categoria FPCP (Cortez et al., 2018; Pusceddu et al., 2018).
Estudos recentes como o publicado por Roveri et al., (2020) reportaram a presença de 16 FPCPs ao analisar amostras coletadas em quatro praias urbanizadas do município de Guarujá, localizado na Baixada Santista. Apesar do objetivo principal do trabalho ter sido identificar e quantificar estes poluentes, a avaliação do potencial tóxico de algumas das substâncias encontradas á biota marinha foi analisada. Dos 16 compostos encontrados, cinco foram classificados como perigosos, podendo oferecer riscos moderados á severos a organismos como algas, crustáceos e peixes.
Esta ausência de dados que poderiam contribuir de forma decisiva não apenas para a regulamentação de diversos produtos e fármacos como também para a elaboração de medidas de mitigação de impactos antrópicos torna a região um lugar adequado para a realização do presente estudo.
2.2 Coleta de amostras
As amostras de sedimento e água utilizadas não só nos controles, como também nos ensaios ecotoxicológicos, foram coletadas na Praia de Itaguaré, área localizada no município de Bertioga-SP, distante de grandes centros urbanos e de áreas com atividades antrópicas sendo considerada, portanto uma área de referência em qualidade ambiental (CETESB, 2017). A área localiza-se no Parque Estadual Restinga de Bertioga, criado por meio do Decreto Estadual n° 56.500 em 2010 (Figura 2).
22 Figura 2 – Localização do ponto de coleta de água e sedimento na praia Itaguaré (Bertioga- SP) (Fonte: Google Maps).
A água coletada foi armazenada em galões de 50 litros e posteriormente filtrada com malha (45µm) visando eliminar plâncton e possíveis dejetos.
Para a determinação das concentrações ambientais da orfenadrina, foi realizada uma amostragem de água e sedimentos em março de 2018, em 5 pontos no entorno do lançamento do esgoto do Emissário Submarino de Santos (ESS), SP (Figura 3) e dois pontos no entorno do emissário submarino do Guarujá-SP (ESG), na praia da Enseada (Figura 4). Baseado nos critérios adotados pela Companhia Ambiental do Estado de São Paulo (CETESB, 2007) foi realizada a pré-seleção dos pontos de coleta no município de Santos, tendo em vista a pluma de dispersão do efluente. As coordenadas geográficas dos sete pontos de coleta foram apresentadas na tabela 1.
23 Tabela 1. Coordenadas geográficas dos sete pontos de coleta de água e sedimentos no entorno dos Emissários submarinos de Santos e Guarujá (SP).
Figura 3. Localização dos cinco pontos de coleta de sedimentos no entorno do Emissário Submarino de Santos (ESS) e sua posição na América do Sul (Fonte: Google Earth).
Locais de amostragem Latitude Longitude
Ponto 1 24°00’04’’S 46°21’01’’W Ponto 2 23°59’99’’S 46°21’66’’W Ponto 3 23°59’85’’S 46°20’’77’’W Ponto 4 24º00’28’’S 46°21’15’’W Ponto 5 23°59’’76’’S 46°19’22’’W Ponto G1 24°01’39’’S 46°13’27’’W Ponto G2 24°01’34’’S 46°13’21’’W
24 Figura 4. Localização dos dois pontos de coleta no município do Guarujá-SP (Fonte: Google Earth).
As amostras de água foram coletadas com auxílio de uma garrafa van Dorn, enquanto os sedimentos foram coletados com auxílio de uma draga do tipo van Veen e acondicionados em sacos plásticos. As amostras foram mantidas em caixas térmicas com gelo durante o transporte até o laboratório de ecotoxicologia da Universidade Santa Cecília (UNISANTA) em Santos/SP. Em laboratório, as amostras de água foram congeladas a -18ºC, enquanto os sedimentos foram mantidos a temperatura de 4º C até a realização das análises.
A coleta de mexilhões da espécie P. perna utilizados para avaliação da bioacumulação foi realizada em quatro pontos de amostragem no entorno da Baia de Santos como mostra a Figura 5.
25 Figura 5. Localização da área de coleta dos mexilhões P. perna para a avaliação da bioacumulação (Fonte: Google Earth).
2.3 Análise química
Os procedimentos realizados para a análise química da água, do sedimento e dos tecidos foram conduzidos no Laboratório do CEMSA (Centro de Espectrometria de Massas Aplicada, IPEN) sob coordenação do Prof. MSc. Daniel Temponi Lebre. Os processos de extração das amostras de água coletadas na área de influência dos emissários, bem como o das amostras utilizadas nos ensaios de toxicidade, foram realizados tendo como base o procedimento feito por Pereira et al. (2016) em seu estudo. As amostras de sedimento marcado e do entorno do ESS (1g peso/seco) foram homogeneizadas e processadas pelo método de extração ácida, através da adição de 10 mL de acetonitrila às amostras. Após esta etapa, as amostras foram mantidas sob ultrassompor 30 minutos. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas por cinco minutos (2500 rpm) e o sobrenadante separado. Os sólidos resultantes da centrifugação foram ressuspensos em 10 mL de tampão fosfato (pH 2,0). O processo extrativo foi repetido três vezes e em seguida foram adicionados 10 mL de acetonitrila às amostras, as quais foram centrifugadas e o sobrenadante separado.
O sobrenadante acumulado foi misturado e centrifugado por 5 minutos a 2500 rpm. Após este procedimento, 25 mL do sobrenadante centrifugado foram adicionados a 250 mL de água Milli- Q®. Em seguida foi realizada a etapa de clean-up (Extração em fase sólida - EFS). A EFS foi executada utilizando cartucho Chromabond HR-X (3 mL, 200mg, Macherey-Nagel, Duren, Alemanha) de acordo com Willer et al. (2010). As colunas foram pré-condicionadas com 2 mL de acetonitrila; 2 mL de metanol; 2 mL de água Milli- Q®. Para etapa de percolação das amostras nos cartuchos foram utilizados 25 mL do extrato e 250 mL de água Milli-Q®. A seguir a este procedimento, os cartuchos foram mantidos por cinco minutos sob secagem a vácuo. A eluição foi realizada utilizando 3 mL de metanol e 3 mL de acetona:metanol (1:1). Posteriormente o eluato foi levado à secura total sob nitrogênio a fim de eliminar o solvente orgânico proveniente da etapa de EFS. Em seguida foi retomado com 500µL de Metanol: H2O (7:3) e injetado no sistema LC-MS/MS em modo de operação MRM
26 (MultipleReactionMonitoring), com fonte de íons ESI no modo positivo. Os parâmetros MRM estão descritos na tabela 1.
As condições utilizadas para separação foram: coluna Agilent Eclipse XDB-C18 3,0 x 75 mm, 3.5 μm; fase móvel A = 5mM Acetato de Amônio; fase móvel B = Metanol; Temperatura da coluna 25°C; vazão: 0,4 mL/min; volume de injeção: 10 µL; tempo de corrida: 2,5 min; solução para lavagem de agulha: Acetonitrila:água (60:40) (v/v).
Tabela 2. Parâmetros de operação MRM no modo de ionização positiva,limites de detecção e quantificação e tempo de retenção.
Composto Q1 Q3 DP CE CXP LOD (ng/L) LOQ (ng/L) TR (min) Orfenadrina 270,2 181,1 16 19 4 0,9 3,4 4,4 165 53 4
Q1 (first quadrupole); Q3 (last quadrupole); DP (Declustering Potential); CE (Collision Energy); CXP (Collision Exit Potential); LD (Limite de detecção: Sinal/ruído = 3); LQ (Limite de quantificação: Sinal/ruído = 10); TR (Tempo de retenção); MIM (Multiple Ion Monitoring). Em Q3, a célula superior indica o íon quantificador e a inferior o íon qualificador.
2.3.1 Caracterização de sedimentos
O sedimento coletado para realização dos ensaios ecotoxicológicos foi coletado na praia de Itaguaré, no município de Bertioga- SP. O local foi selecionado pertencer à uma Unidade de Conservação (UC) e estar relativamente distante dos grandes centros urbanos.
27 2.3.2 Granulometria
Uma porção de 30g do sedimento foi seca em estufa a 60ºC por 72 horas (Mudroch&MacKnight, 1994), em seguida, o material foi peneirado em agitador RO-TAP utilizando-se jogo de peneiras, seguindo intervalos de meio Ø (phi) na escala de Wentworth. As porções retidas foram pesadas e posteriormente estimadas as classificações granulométricas de Shepard para obtenção dos teores de areia e lama.
2.3.3 Matéria orgânica
A determinação da matéria orgânica (MO) foi realizada pelo método de Goldin (1987), as amostras foram previamente secas em estufa a 105 ºC por 24 h. Em seguida, as amostras foram acondicionadas em cadinhos de cerâmica e levadas a mufla para incineração a uma temperatura de 550 ºC por 3 h. O cadinho foi acondicionado em dessecador e pesado logo em seguida. O teor de MO foi aferido pela razão entre a perda de massa do resíduo incinerado, considerando-se o material perdido pela queima no intervalo de variação da temperatura de 105 ºC a 550 °C, conforme a fórmula:
MO (%) = (P - (T - C) x 100/P
Onde: P = peso da amostra (g) depois de aquecida a 105 ºC; C = tara do cadinho (g); e T = peso da cinza + cadinho (g).
2.4 Marcação de sedimento
O protocolo adotado para o preparo, equilíbrio e mistura do sedimento com o composto foi embasado no manual técnico da USEPA (2001). O sedimento marcado (spiked-sediment) empregado nos ensaios foi caracterizado quanto à umidade, granulometria, matéria orgânica e carbonatos.
A contaminação do sedimento foi realizada com auxílio de um equipamento denominado jar-rolling, que se encontra em procedimento de proteção da propriedade intelectual através do Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI), sob número
28 de registro BR1020160258235. O referido equipamento consiste em uma máquina que gira em dois eixos diferentes de forma simultânea. Esta técnica é considerada a mais eficaz para homogeneização dos compostos em grandes volumes do sedimento (USEPA, 2001).
A marcação iniciou com adição de 100 g de sedimento seco nos frascos do jar-rolling (1 litro). Em seguida foi adicionado a este sedimento 50 mL de solução estoque de orfenadrina nas concentrações desejadas. Para a obtenção destas concentrações, foram feitas diluições da solução estoque inicial. Em seguida, os frascos contendo a mistura de sedimento e solução dos compostos foram agitados por 15 minutos. Encerrado o procedimento de mistura, os frascos foram armazenados por sete dias sob refrigeração em ambiente com temperatura controlada (4±2°C) e sem iluminação a fim de se estabelecer o equilíbrio químico entre as substâncias-teste, o sedimento e a água intersticial (Francis et al., 1984).
2.5 Avaliação da toxicidade
Os efeitos crônicos da orfenadrina foram avaliados através de ensaios preliminares, em nível de indivíduo, observando o desenvolvimento embriolarval de ouriços-do-mar da espécie Echinometra lucunter e, a nível subindivíduo, por meio da avaliação do estresse celular (estabilidade da membrana lisossomal) em mexilhões Perna perna.
2.5.1 Ensaio embriolarval
O ensaio embriolarval com a espécie E. lucunter foi realizado de acordo com as normas estabelecidas por USEPA (1995), com adaptações referentes à temperatura e tempo de exposição pela NBR 15350 (ABNT, 2012). O teste compreendeu a exposição de embriões de ouriço do mar à diferentes concentrações de orfenadrina por um período de 42 horas. Foram feitas quatro réplicas por concentração tanto na matriz água quanto no sedimento, expostas aos pHs 8,0; 7,6 e 7,3. Ao término da exposição, avaliou- se o número de larvas com desenvolvimento normal e anômalo. Posteriormente, o conteúdo de cada réplica foi analisado em microscópio óptico com uma lâmina de Sedgwick-Rafter®. Os primeiros 100 embriões foram contados e seu grau de desenvolvimento foi
29 analisado. Os embriões que atingiram estágio de larva pluteus bem desenvolvido foram considerados normais enquanto aqueles apresentando alteração morfológica e/ou retardo no desenvolvimento foram considerados afetados (Figura 6).
Figura 6. Larvas pluteus de E. lucunter com desenvolvimento embriolarval normal (a) com alterações morfológicas e/ou retardo (b).
2.5.2.1 Obtenção de gametas
Para a obtenção dos gametas, os ouriços do mar da espécie E. lucunter foram estimulados por injeção de cloreto de potássio (KCl) 0,5 mol. Na diferenciação dos gametas, nota-se que os óvulos da fêmea presumem uma cor alaranjada e do macho caracteriza-se por apresentar coloração branca (Figura 7). Os óvulos da fêmea foram obtidos posteriormente à injeção de KCl de modo que foi necessário voltar a superfície aboral de cada indivíduo para baixo em um recipiente menor que o seu diâmetro, com água reconstituída. Após os óvulos decantarem no recipiente, foi retirado o sobrenadante e o restante da solução filtrada em malha 350µm para a remoção de quaisquer dejetos que pudessem estar junto com os óvulos. Após o procedimento, a solução foi avolumada com água reconstituída até 600 mL.
30 Figura 7. Obtenção de gametas masculinos de E. lucunter (Fonte: Arquivo pessoal).
Os espermatozóides foram obtidos com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e acomodados em um béquer de 30 mL envolto com gelo visando à conservação do material. Para a próxima fase, foi preparada uma solução de 0,5 mL de espermatozóide avolumada para 25 mL utilizando água reconstituída. Essa solução foi agitada para evitar a formação de grânulos.
Após essa etapa, foi adicionado de 1,2 mL a 2 mL da solução de espermatozóides no recipiente com os ovócitos, com leve agitação durante 2 horas para fertilização. Após este período, foram retiradas três sub-amostras de 10 µL desta solução para observação em câmara de Sedgwick-Rafter® para verificar a porcentagem de fertilização dos ovócitos, a qual, pelos critérios de aceitabilidade do ensaio, deve ser de no mínimo 80% fertilizados.
2.5.2.2 Ensaio embriolarval em água
Após a execução de testes preliminares, as concentrações estabelecidas de orfenadrina para o ensaio realizado em água foram de 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 e 1,6 mg/L além dos controles de água e solvente (DMSO), todos com quatro réplicas. As soluções foram acomodadas em béqueres 25 mL, adicionando cerca de 600 embriões por béqueres mantidos em caixas com o sistema de injeção de CO2 simulando pHs 7,6 e 7,3 e sem a injeção de CO2na caixa com o pH controle 8,0. Além disso, a temperatura foi controlada em 26°C (± 2 ºC) e foto período de 16h/8h
(luz-31 escuro) por 42 horas. Além dessas soluções com as concentrações do fármaco, foi utilizado um controle com água do mar e um controle com o solvente DMSO a fim de verificar a possível influencia deste sobre o teste. O controle de água do mar foi preparado com a água reconstituída.
Após o período de exposição, o ensaio foi encerrado adicionando em todas as réplicas 1 mL de formol tamponado com bórax até atingir o pH 7.
2.5.2.3 Ensaio embriolarval em sedimento
O método escolhido para o ensaio embriolarval foi o de interface proposto por Anderson et al. (1996) e adaptado por Cesar et al., (2004), o qual consiste em béqueres de 30mL contendo cinco gramas de sedimento marcado e 20 mL de água de diluição, com uma rede de plâncton logo acima do sedimento portando 600 embriões por béquer.
As concentrações utilizadas foram 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1; 1 ug/g além dos controles de água e solvente (DMSO), todos com quatro réplicas em três tratamentos de pH diferentes: 8,0; 7,6 e 7,3, procedimento semelhante ao realizado na matriz água.
2.5.3 Ensaio do tempo de retenção do corante vermelho neutro.
O método utilizado para avaliação da citotoxicidade em mexilhões foi o de análise do tempo de retenção do corante Vermelho Neutro (TRCVN) em lisossomos de hemócitos, que seguiu os procedimentos descritos por Lowe et al., (1995). Os experimentos foram realizados no Laboratório de Ecotoxicologia da Universidade Santa Cecília – Unisanta em Santos/SP.
O ensaio para avaliação do TRCVN é embasado no princípio de que os lisossomos de células saudáveis conseguem reter o corante vermelho neutro por certo período de tempo, enquanto que danos na integridade e estabilidade da membrana lisossomal causados pelo acúmulo de xenobióticos diminuem o tempo de retenção do corante, o que induz o vazamento de componentes do lisossomo para o citosol de forma mais ágil (Dailianis et al., 2003).
32 Para realização dos experimentos em água, organismos da espécie P. perna (n= 10) foram expostos à 2 L de água do mar contendo diferentes concentrações de orfenadrina (10, 100 e 1000 ng/L). Nos experimentos os organismos foram expostos por um período de 96 horas, utilizando cinco réplicas por concentração, incluindo o controle, sem alimentação, com fotoperíodo de 16 h luz, temperatura controlada de 20ºC ± 2ºC e salinidade de 30 o/o em três tratamentos de pH diferentes: 8,0; 7,6 e 7,3.
A solução fisiológica foi preparada 24 horas antes do experimento. Esta solução classificada como salina foi utilizada para diluir a hemolinfa dos mexilhões da espécie P. perna. Foram pesados 4,77 g de HEPES; 25,48 g de cloreto de sódio; 13,06 g de sulfato de magnésio; 0,75 g de cloreto de potássio; 1,47 g de cloreto de cálcio, e adicionado em um litro de água destilada, em um balão de vidro volumétrico. O pH da solução salina foi ajustado para 7,36 usando um pH-metro e, quando necessário, ajustado utilizando NaOH ou HCl. Isto foi feito imediatamente antes de cada uso da solução fisiológica.
O vermelho neutro (NR) foi preparado como uma solução-estoque no solvente DMSO. Foram pesados 28,8 mg de NR (mantido em refrigerador) e disposto em um frasco de vidro âmbar, adicionando 1 mL de DMSO com auxílio de uma pipeta. O NR foi dissolvido no DMSO com uma suave agitação. Utilizando uma micropipeta, foi introduzido 5 mL de solução fisiológica em um frasco escuro. Em seguida foram pipetados 10 µL de solução-estoque.
Após a exposição dos organismos ao fármaco foram retiradas amostras da hemolinfa de todos os mexilhões expostos. Com o auxílio de uma seringa hipodérmica de 1 mL contendo 0,3 mL de solução fisiológica, coletou-se 0,5 mL de hemolinfa do músculo adutor posterior.
Foram pipetados cerca de 40 µL desta solução de células (hemolinfa + solução fisiológica) sobre a superfície de uma lâmina. Em seguida, foram pipetados 40 µL de solução de trabalho de vermelho neutro sobre a camada de hemócitos de cada lâmina, dentro da câmara úmida e à prova de luz.
Após 15 minutos de incubação na câmara o corante penetrou nas células. As lâminas foram sistematicamente examinadas em microscópio a cada 15 minutos na primeira hora e a cada 30 minutos na segunda hora, até 120 minutos.
33 As células foram examinadas com lentes com 400X ou 500X de aumento. Cada lâmina foi examinada e reposta em 1 minuto.
As células foram examinadas tanto para anormalidades estruturais como para o tempo de retenção do vermelho neutro. A cada contagem as condições foram anotadas em uma tabela. O tempo de retenção do NR pelos lisossomos foi obtido pela estimativa da proporção de células exibindo “vazamento” dos lisossomos para o citosol e/ou exibindo anormalidades no tamanho e cor dos lisossomos. A forma das células pode também modificar-se como consequência do impacto causado por contaminantes.
O “end point” foi tomado quando 50% ou mais das células exibiram anomalias estruturais ou perda de material. O valor usado para o cálculo do tempo de retenção corresponde ao último período anotado em que não houve evidência de estresse.
2.6 Coleta dos Organismos
Os ouriços-do-mar E. lucunter que foram utilizados nos ensaios de toxicidade para avaliação de efeito crônico, foram coletados por meio de mergulho livre na costa da Ilha das Palmas no Guarujá-SP. Os indivíduos adultos de P. perna foram adquiridos em uma fazenda de aquicultura localizado na praia da Cocanha (Caraguatatuba, SP). Os organismos foram transportados em caixa térmica. Em laboratório os organismos foram mantidos em tanques com água do mar e aeração até o momento da realização dos ensaios.
2.7 Sistema de injeção de CO2
Os ensaios de toxicidade foram realizados em laboratório e o método utilizado para a execução dos testes foi adaptado a partir de Kita et al. (2013) por meio de um equipamento que consiste em um sistema de injeção de CO2 automático com o objetivo de expor diferentes organismos marinhos a valores de pH pré-determinados. O sistema compõe-se por uma série de caixas, onde o gás carbônico pode ser injetado sob condições controladas, de forma independente, em cada uma das caixas.
34 O controle da quantidade de gás carbônico liberado é feito por meio de medidas de pH da água do mar em cada uma das caixas, de modo que a redução do pH é consequência do aumento da concentração de CO2. As caixas possuem eletrodos que se conectam á pHmetros os quais registram continuamente o potencial hidrogeniônico da água. Estes sensores são conectados a um computador através de uma interface.
As caixas possuem ainda válvulas solenóides conectadas ao computador além de uma fonte de injeção automática de CO2, o que permitirá a entrada do gás. Dentro destas caixas, foram colocados béqueres para o alojamento dos organismos possibilitando realizar a exposição em diferentes concentrações mantendo o pH. O software responsável por auxiliar no monitoramento é o ApexFusion (Figura 8).
Quando se detecta um valor de pH 0,01 superior ao estipulado, a válvula solenóide inicia a injeção de CO2 através de mangueiras posicionadas nas caixas e ao atingir o valor de pH pré-determinado a válvula solenóide é fechada e a injeção de CO2 interrompida imediatamente. Deste modo, o pH pode ser mantido e controlado durante a execução do experimento.
Os tratamentos de pH representam uma variedade de diferentes cenários de acidificação: O pH atual de áreas costeiras (pH 8,0) foi simulado em caixas sem a inserção de injeções de CO2, apenas com aeradores sendo utilizado como controle do trabalho.
O cenário de acidificação oceânica prospectado para o final do século XXI (pH 7,6) (IPCC, 2014) e um cenário ainda mais crítico associado a um possível vazamento proveniente da atividade de CCS (pH 7,3) também foram simulados no trabalho.
35 Figura 8. Representação do esquema de injeção de CO2 em ensaios. (Fonte: Software Apex Fusion).
2.8 Alcalinidade
Ao final do tempo de exposição dos testes de toxicidade foram coletados aproximadamente 100 ml de água de cada uma das concentrações para a determinação dos parâmetros do sistema ácido carbônico (Alcalinidade Total - AT). A alcalinidade total foi medida através do equipamento de titulação automática (Hanna HI 901) utilizando um eletrodo de vidro combinado, calibrado em escala NBS. Os valores de pH e alcalinidade total foram usados para calcular a especiação do sistema carbonato, utilizando o programa CO2SYS (Pierrot et al., 2006), com a constante dissociação de Mehrbach et al. (1973), recolocado por Dickson& Millero (1987).
2.9 Bioacumulação
Os testes de bioacumulação dos compostos foram realizados através da biomassa total dos mexilhões. Os tecidos foram conduzidos no Laboratório do CEMSA (Centro de Espectrometria de Massas Aplicada, IPEN) sob coordenação do Prof. MSc. Daniel Temponi Lebre. Os processos de extração das amostras foram realizados tendo como base o procedimento feito por Pereira et al. (2016) em seu estudo. As amostras de foram homogeneizadas e processadas pelo método de extração ácida, através da adição de 10 mL de acetonitrila às amostras. Após esta etapa, as amostras foram mantidas sob ultrassom por 30 minutos. Posteriormente,
36 as amostras foram centrifugadas por cinco minutos (2500 rpm) e o sobrenadante separado. Os sólidos resultantes da centrifugação foram ressuspensos em 10 mL de tampão fosfato (pH 2,0). O processo extrativo foi repetido três vezes e em seguida foram adicionados 10 mL de acetonitrila às amostras, as quais foram centrifugadas e o sobrenadante separado.
O sobrenadante acumulado foi misturado e centrifugado por 5 minutos a 2500 rpm. Após este procedimento, 25 mL do sobrenadante centrifugado foram adicionados a 250 mL de água Milli- Q®. Em seguida foi realizada a etapa de clean-up (Extração em fase sólida - EFS). A EFS foi executada utilizando cartucho Chromabond HR-X (3 mL, 200mg, Macherey-Nagel, Duren, Alemanha) de acordo com Willer et al. (2010). As colunas foram pré-condicionadas com 2 mL de acetonitrila; 2 mL de metanol; 2 mL de água Milli- Q®. Para etapa de percolação das amostras nos cartuchos foram utilizados 25 mL do extrato e 250 mL de água Milli-Q®. A seguir a este procedimento, os cartuchos foram mantidos por cinco minutos sob secagem a vácuo. A eluição foi realizada utilizando 3 mL de metanol e 3 mL de acetona:metanol (1:1). Posteriormente o eluato foi levado à secura total sob nitrogênio a fim de eliminar o solvente orgânico proveniente da etapa de EFS. Em seguida foi retomado com 500µL de Metanol: H2O (7:3) e injetado no sistema LC-MS/MS em modo de operação MRM (MultipleReactionMonitoring), com fonte de íons ESI no modo positivo. As condições utilizadas para separação foram: coluna Agilent Eclipse XDB-C18 3,0 x 75 mm, 3.5 μm; fase móvel A = 5mM Acetato de Amônio; fase móvel B = Metanol; Temperatura da coluna 25°C; vazão: 0,4 mL/min; volume de injeção: 10 µL; tempo de corrida: 2,5 min; solução para lavagem de agulha: Acetonitrila:água (60:40) (v/v).
2.10 Análise dos dados
A análise dos resultados dos ensaios de toxicidade para avaliação de efeitos com E. lucunter seguiram os procedimentos adotados pela USEPA (2002). As análises estatísticas para avaliação dos efeitos crônicos foram realizadas a partir do software TOXSTAT 3.5 (WEST & GULLEY, 1996) para determinação da CENO (Concentração de Efeito Não Observado) e CEO (Concentração de Efeito Observado). Para o estabelecimento da CENO e da CEO, os dados foram
Chi-37 square e Barttlett, respectivamente. Posteriormente, os dados foram submetidos ao método de análise de variância (ANOVA – p < 0,05) por meio do método de Dunnett. As diferenças significativas entre as concentrações de orfenadrina entre os
diferentes tratamentos de pH foram testadas com análise multivariada por permutação (PERMANOVA).
A determinação da concentração pontual de pH que causou inibição no
desenvolvimento embriolarval em 50% (EpH50) dos embriões de E. Lucunter, assim como a alteração na estabilidade da membrana lisossômica de mexilhões P. perna expostos foram calculados através do método de interpolação linear (Norberg-King, 1988).
38 3. RESULTADOS
3.1 Caracterização dos sedimentos
Os resultados obtidos através da análise dos sedimentos, coletados na praia de Itaguaré (Bertioga-SP), indicaram 21,49% de umidade e 0,64% de matéria orgânica. No que diz respeito a composição granulométrica, os resultados encontrados foram de 77% de areia muito fina e 18,4% de areia fina, como mostrado na tabela 3.
Tabela 3. Caracterização do sedimento utilizado nos testes (de acordo com a escala de Wentworth (1922).
3.2 Análises químicas das amostras de água e sedimento
A partir da análise química das amostras de água do mar e sedimento coletados nos municípios de Santos e Guarujá, foi possível detectar a ocorrência da orfenadrina em todos os pontos de coleta. O valor das concentrações variou entre <LOQ a 2,14 ng/L na matriz água como apresentadona tabela 4 e <LOQ a 0,50 ng/g em sedimentos, como apresentadona tabela 5.
Granulometria (mm) Massa (g) Porcentagem (%) Nome do material
Massa inicial 100,88 - - Maior que 2,0 - - - 2,0 a 1,0 - - - 1,0 a 0,5 1,48 1,5 Areia Grossa 0,5 a 0,25 1,92 1,9 Areia Média 0,25 a 0,125 18,54 18,4 Areia Fina
0,125 a 0,063 77,65 77,0 Areia muito fina
Menor que 0,063 0,28 0,3 Silte/Argila
39 Tabela 4. Concentrações de orfenadrina detectadas na análise química em água (ng/L);(Pontos 1-5 pertence a Santos-SP e pontos G1; G2 pertence ao emissário do Guarujá).
Composto Concentrações (ng/L)
1 2 3 4 5 G1 G2
Orfenadrina 0,153 0,16 0,221 <LOQ 0,153 2,14 0,734
Tabela 5. Concentrações de orfenadrina detectadas na análise química em
sedimentos (ng/g) (Pontos 1-5 pertencem a Santos-SP e pontos G1; G2 pertence ao emissário do Guarujá).
Composto Concentrações(ng/g)
1 2 3 4 5 G1 G2
Orfenadrina 0,08 <LOQ 0,11 0,50 <LOQ <LOQ <LOQ
3.3 Ensaio de toxicidade para avaliação de efeito crônico (embriolarval) com o ouriço do mar da espécie Echinometra lucunter em diferentes tratamentos de pH.
3.3.1 Matriz água
A fim de avaliar o efeito crônico da orfenadrina no desenvolvimento embriolarval do ouriço do mar foram realizados ensaios de toxicidade em três tratamentos de pH diferentes: 8,0; 7,6; 7,3. Em todos tratamentos de pH foi possível observar o efeito das concentrações testadas, quando comparadas aos seus respectivos controles, sobre o desenvolvimento dos organismos, como mostra a figura 9. O valor da concentração de efeito observado (CEO) foi de 0,05 mg/L. Ao comparar os tratamentos de pH 8,0 e 7,6 foi possível observar diferença significativa
40 entre as concentrações 0,2, 0,4 e 0,8 mg/L. Cotejando os tratamentos de pH 8,0 e 7,3 foi possível verificar diferença significativa entre todas as concentrações testadas. A concentração 0,2 mg/L apresentou diferença significativa entre todos os tratamentos de pH testados.
Figura 9 - Médias e erro-padrão dos resultados de desenvolvimento
embriolarval com E. lucunter em água após 42 horas de exposição a orfenadrina nos diferentes pH. *Indica diferença significativa das concentrações de cada tratamento em relação ao seu respectivo controle, dentro de cada pH testado. Letras diferentes indicam diferença significativa entre as concentrações (controle; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 e 0,8 mg/L) entre diferentes tratamentos de pH. *Diferença significativa em relação ao controle (ANOVA – p ≤ 0,05)
Visando melhorar a interpretação dos efeitos causados exclusivamente pela acidificação, isto é, pela mudança de pH da água, foi determinado o valor do EpH50, o qual demonstra que valor de pH é responsável por causar 50% de efeito no
desenvolvimento dos embriões expostos. Os resultados das médias e desvio-padrão dos ensaios nos diferentes tratamentos de pH estão ilustrados na figura 10.
41 Figura 10. Médias e desvio-padrão dos resultados da comparação entre os
controles dos ensaios de desenvolvimento embriolarval com E. lucunter em água após 42 horas de exposição.
3.3.2 Matriz sedimento
Seguindo os mesmos padrões adotados na matriz água, os ensaios de toxicidade em sedimento também foram feitos com três tratamentos de pH diferentes: 8,1; 7,6; 7,3. Os resultados obtidos no tratamento com pH 8,0 apresentaram valores de CENO e CEO de 0,0001 e 0,001 µg/g respectivamente, como mostra a figura 11. Não foi possível calcular os valores de CENO e CEO nos outros dois tratamentos pois a acidificação por si só já causou efeito nos organismos, fato que impossibilitou maiores conclusões sobre o efeito das concentrações nestes pHs.
42 Figura 11 - Médias e erro-padrão dos resultados de desenvolvimento embriolarval com E. lucunter em sedimentos após 42 horas de exposição á orfenadrina nos diferentes pH. *Indica diferença significativa das concentrações de cada tratamento em relação ao seu respectivo controle, dentro de cada pH testado. Letras diferentes indicam diferença significativa entre as concentrações (controle; 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1 e 1 µg/g) entre diferentes tratamentos de pH. *Diferença significativa em relação ao controle (ANOVA – p ≤ 0,05)
Assim como na matriz água, foi determinado o valor do EpH50, o qual demonstra que a diminuição do pH é responsável por causar 50% de efeito no
desenvolvimento dos organismos expostos. Os resultados das médias e erro-padrão dos ensaios nos diferentes tratamentos de pH estão ilustrados na figura 12.
Figura 12: Médias e desvio-padrão dos resultados da comparação entre os controles dos ensaios de desenvolvimento embriolarval com E. lucunter em sedimentos após 42 horas de exposição.
43 3.4 Resultados dos ensaios de citotoxicidade em mexilhão.
Os resultados obtidos a partir dos ensaios de citotoxicidade com mexilhões da espécie P. perna expostos á orfenadrina sob diferentes cenários de acidificação estão demonstrados na Figura 13. A seguir às 96 horas de exposição, o tempo de retenção do corante vermelho neutro nos lisossomos diminuiu significativamente nas concentrações de 200 e 2000 ng/L quando comparados aos seus respectivos controles nos tratamentos de pH 8,0 e 7,6. Apenas o controle do tratamento 7,3 apresentou diferença significativa quando comparado aos demais tratamentos. A análise do pH 7,3 demonstrou que não houve diferença significativa entre as concentrações quando comparadas ao controle do tratamento. Além disso foi
possível observar a redução da toxicidade do fármaco conforme a diminuição do pH (Figura 13).
Figura 13 - Médias e erro-padrão dos resultados de citotoxicidade em hemócitos do bivalve P. perna em água após 96 horas de exposição a orfenadrina nos diferentes pH. *Indica diferença significativa das concentrações de cada tratamento em relação ao seu respectivo controle, dentro de cada pH testado. As letras diferentes indicam diferença significativa entre as concentrações (controle; 20; 200 e 2000 ng/L) entre diferentes tratamentos de pH. *Diferença significativa em relação ao controle (ANOVA – p ≤ 0,05)
44 Encerrados os ensaios de toxicidade com P. perna, foram medidos os valores de alcalinidade total (AT). Considerando a salinidade 30 e temperatura de 21ºC como parâmetros de referência, pôde-se calcular também os valores de carbono inorgânico total (CIT), bicarbonato (HCO3-), carbonato (CO32-), dióxido de carbono (CO2), pressão parcial de dióxido de carbono (ρCO2), índice de saturação de calcita (Ω Ca) e de aragonita (Ω Ara) com o auxílio do programa CO2SYS (PIERROT et al., 2006). Os resultados apontaram uma diminuição no valor dos íons de carbonato, calcita e aragonita simultaneamente ao aumento do CO2, íons de bicarbonato e da pressão parcial de CO2, como mostram as tabelas 6, 7 e 8.
Tabela 6. Resultados do sistema de carbonatos em ensaios na matriz água com P. perna expostos a orfenadrina sob pH 8,0.
Tratamento TA µmol/kg TIC µmol/L HCO3 -µmol/kg CO32+ µmol/kg CO2 µmol/kg ρCO2 µatm Ω Ca Ω Ara Controle 1407,1 1280,2 1189,6 78,0 12,5 384,6 1,88 1,22 20 1366,8 1241,8 1154,0 75,7 12,1 373,1 1,82 1,18 200 1349,4 1226,4 1140,2 74,1 12,1 367,4 1,78 1,16 2000 1359,9 1226,8 1136,8 78,3 11,7 362,9 1,86 1,21
Tabela 7. Resultados do sistema de carbonatos em ensaios na matriz água com P. perna expostos a orfenadrina sob pH 7,6.
Tratamento TA µmol/kg TIC µmol/L HCO3 -µmol/kg CO32+ µmol/kg CO2 µmol/kg ρCO2 µatm Ω Ca Ω Ara Controle 1422,8 1389,9 1319,2 36,9 33,9 1049,9 0,87 0,57 20 1431,0 1397,6 1326,3 37,3 34,0 1058,1 0,88 0,57 200 1382,4 1352,1 1283,7 35,0 33,4 1026,9 0,83 0,54 2000 1354,9 1324,6 1257,6 34,3 32,7 1006,1 0,81 0,53
45 Tabela 8. Resultados do sistema de carbonatos em ensaios na matriz água com P. perna expostos a orfenadrina sob pH 7,3.
Tratamento TA µmol/kg TIC µmol/ L HCO3 -µmol/ kg CO32+ µmol/ kg CO2 µmol/kg ρCO2 µatm Ω Ca Ω Ara Controle 1431,7 1473,1 1382,0 18,0 73,0 2236,7 0,43 0,28 20 1374,3 1413,0 1325,8 17,4 69,8 2150,6 0,42 0,27 200 1450,7 1492,6 1400,4 18,3 73,9 2269,0 0,44 0,29 2000 1458,0 1494,5 1402,9 19,8 71,7 2233,1 0,47 0,30 3.5 Bioacumulação
Foi realizada a coleta de mexilhões Perna perna (n = 4 organismos por ponto) para avaliação da bioacumulação em quatro pontos de amostragem no entorno da baía de Santos. A presença de orfenadrina foi detectada em todos os tecidos analisados, conforme a tabela 9.
Tabela 9. Resultado dos ensaios de bioacumulação dos organismos coletados no entorno da baía de Santos.
A média de valores encontrada foi de 4,28 ng/g. O ponto 2 destacou-se dos demais por apresentar um valor máximo de orfenadrina nos indivíduos, superior aos demais pontos.
Localização Média (ng/g) Máxima (ng/g) Mínima (ng/g)
Ponto 1 3,85 4,41 3,02
Ponto 2 4,93 6,92 3,54
Ponto 3 4,06 4,71 2,94
46 4. DISCUSSÃO
As inter-relações entre os recursos naturais, populações e desenvolvimento têm sido desde o século passado alvo de preocupação socioambiental e muitos estudos científicos em todo o planeta vem sendo desenvolvidos (Hogan, 1993). O crescimento populacional desenfreado teve como principal consequência a migração de populações para regiões costeiras, as quais abrigam uma infinidade de recursos. A má exploração destes recursos somada a ineficácia dos tratamentos de esgoto contribui para um cenário de impactos ambientais.
Este cenário sinaliza a necessidade de estudos que não se restrinjam a apenas quantificar e detectar poluentes emergentes, como os FPCP, nos ecossistemas aquáticos, como também compreender seus impactos em organismos não alvos e à vida marinha.
Stumpf et al., (1999) realizaram um dos primeiros estudos no Brasil em que foi reportada a presença de resíduos de fármacos e metabólitos tanto no esgoto, quanto em águas residuais tratadas e rios do Estado do Rio de Janeiro.
Alguns estudos como o de Montagner et al., (2014) no estado de São Paulo detectou presença de determinadas substâncias presentes em FPCPs em valores muito elevados no ambiente marinho.
Pereira et al., (2016) foram os primeiros a monitorar a área da Baía de Santos e determinar não só a presença, como as concentrações ambientais de fármacos e outros compostos orgânicos, como a cocaína, indicando que a preocupação não deve se limitar a matriz ambiental, como também à saúde pública e políticas sociais.
A quantificação da orfenadrina em água neste trabalho foi factível em seis das sete estações amostrais. No entanto, nos resultados obtidos nas análises de sedimento, a quantificação foi possível em apenas três dos sete pontos de coleta. Os pontos localizam-se na de influência do lançamento do esgoto do Emissário Submarino de Santos (ESS) e do Emissário Submarino do Guarujá-SP (ESG). De acordo com Baptistelli (2008) a área é marcada por uma intensa interação entre água do mar e os efluentes domésticos. Os efluentes caracterizam-se por ser menos
