IDENTIFICAÇÃO TAXONOMICA
DE CUPINS COHABITANTES
DE MONTÍCULOS DE SOLO NA REGIÃO DE CAMPINAS
COM BASE EM SEQUENCIAS DE DNA
João H. P. Giudice
Faculdade de Ciências Biológicas Centro de Ci6encias da Vida giulia-andrade@puccamp.edu.br
Edmilson Ricardo Gonçalves
Grupo de pesquisa: ecologia, biologia Molecular e Filogenia de cupins
Centro de Ciências da Vida erg@puc-campinas.edu.br
Resumo: A espécie Cornitermes cumulans é também
conhecida como cupim de montículo e já foi descrita como praga de cultura de cana-de-açúcar. Ninhos de
C. cumulans podem ser utilizados como habitat de
várias outras espécies, incluindo outras espécies de cupins e formigas. Uma vez que o gênero Cornitermes já foi descrito como praga de cana-de-açúcar por al-guns autores, sua presença no agroecossistema po-deria estar correlacionada com a ocorrência e distri-buição de outras espécies co-habitantes, também com potencial de praga. Assim, é fundamental conhecer as espécies que se associam a esse gênero para avaliar o potencial de risco que esses cupins podem trazer à agricultura. O presente trabalho teve como objetivo identificar, através de sequencias de DNA, as espé-cies de cupins que co-habitam ninhos epígeos na re-gião de Campinas. Para a identificação molecular fo-ram extraídos DNA de amostras de cupins provenien-tes de diferenprovenien-tes regiões no distrito de Campinas, se-guido de amplificação por PCR e sequenciamento do gene COII destas mesmas amostras. A identificação foi realizada por comparação de similaridade entre sequencias obtidas no presente trabalho e sequencias depositadas no GenBank. A identificação por DNA provou ser eficiente na classificação de espécies, em vários graus taxonomicos, desde que o banco de da-dos possua sequencias de DNA para comparação. Sendo assim, em alguns casos, este tipo de identifica-ção foi capaz jikde confirmar as espécies já classifica-das anteriormente pela taxonomia clássica como foi o caso para Procornitermes araujoi. Em outros casos, por exemplo Rynchotermes nasutissimos, este méto-do foi incapaz de identificar o gênero e espécie da amostra devido ao fato do banco de dados não possu-ir sequencias similares para comparação; num outro exemplo, onde a taxonomia clássica não conseguiu identificar a espécie do gênero Velocitermes, por comparação em banco de dados, as sequencias de
DNA obtiveram resultado positivo, sendo capazes de indicar a espécie em análise.
Palavras-chave: cupim, código de barra de DNA, taxo-nomia.
Área do Conhecimento: Ciências Biológicas Sub-área: Biologia Molecular
1. INTRODUÇÃO
A espécie Cornitermes cumulans é também conhecida como cupim de montículo. Embora fre-qüente nos pastos da região sudeste e centro-oeste de nosso pais, muitos aspectos da biologia dessa espécie permanecem obscuros, tais como compor-tamento e alimentação [1]. Os estudos sobre essa espécie, no que se refere ao seu potencial como pra-ga ainda é controverso [2,3]. Assim como a maioria das espécies do gênero Cornitermes, C. cumulans constrói ninhos epígeos e são consumidores de ser-rapilheiras [4]. Os ninhos de C. cumulans podem ser utilizados como habitat de várias outras espécies, incluindo outras espécies de cupins e formigas. Sen-do que já foi registrada a presença de duas a 14 es-pécies em um mesmo ninho [5,6.7].
Além das diferentes espécies de térmitas, ou-tros insetos têm sido encontrados como co-habitantes dos ninhos, em especial formigas, como o relatado na literatura [8,9} . Diversos fatores podem determinar a ocorrência ou não de co-habitantes, entre eles a ca-pacidade da espécie de construir ninhos; as caracte-rísticas do ninho; os mecanismos de defesa e a quan-tidade de soldados das colônias; as características de outras espécies presentes na área de estudo e, por fim, a densidade com que estas aparecem.
A identificação de espécie utilizando como princípio a comparação de sequencias de DNA teve início nos anos 1990 com o desenvolvimento da
téc-nica de PCR [10]. Desde então, esta téctéc-nica vem fa-cilitando e ajudando o trabalho de taxonomistas uma vez que espécimes danificadas, imaturas ou mesmo larvas e ovos são muito difíceis ou impossíveis de serem classificados até mesmo por um profissional experiente
(http://www.barcodeoflife.org/content/about/what-dna-barcoding). Mais tarde o DNA barcoding (Código de barra de DNA) foi introduzindo por Paul Hebert.
O presente trabalho apresenta uma primeira etapa na compreensão da Biologia das espécies de cupins cohabitantes de ninhos de Cornitermes
cumu-lans, abrindo possibilidades de novos estudos com
foco no controle e dispersão das espécies pragas.
2. Material e Métodos
Coleta de cupins e extração de DNA
Foram escolhidas 9 áreas aleatórias na região de Campinas que apresentavam pastos com ninhos epigeos (Figura 1 e Quadro 1).
Todas as áreas foram delimitada em uma fra-ção de 100 X 100 metros compreendida entre 4 pon-tos, cada qual georreferenciados (Quadro 1). Foram coletadas amostras de cupins de todos os cupinzeiros visíveis no interior dessa área selecionada.
Quadro 1: Informações das coletas: áreas de coleta, data das coletas , coordenadas geográficas e a indica-ção na Figura 1.
Figura 1 . Áreas de coletas de cupins de ninhos epigeos na região de Campinas, SP representados por pontos amarelos. (imagem:Google Earth)
Coleta e triagem
Primeiramente, os montículos (cupinzeiros)
foram georreferenciados, tendo seus pontos marcados e anotados, a data da coleta e o número do ninho foram postos a frente do monte para registro fotográfico (Figura 2). Os ninhos encontrados foram caracterizados quanto ao diâmetro e altura da porção epígea, medindo-se o diâmetro da porção superior, média e inferior (Figura 3).
Com uma picareta o ninho foi quebrado e os fragmen-tos tirados foram levados em sacos plásticos com identificação do ninho e da porção escolhida. O mate-rial coletado foi levado para laboratório para identifica-ção das espécies presentes de acordo com a poridentifica-ção no ninho de onde foram coletados. Em uma segunda triagem, o material foi separado, tendo uma parcela encaminhada para analise de DNA, outra com térmi-tas (cupins) e possíveis térmitérmi-tas co-habitantes (encon-trados no mesmo cupinzeiro) e uma ultima com não térmitas co-habitantes . Todos os dados obtidos foram registrados em planilha de Excel e identificados. O material foi armazenado a -20° em etanol 80%
Data Área de coleta Coorda
Indica-ção no Mapa 29/10/2012 Bela Aliança W47º08’115” S22º56’50” 1 09/01/2013 Viracopos W047º08’244” S23º02’345” 2 14/03/2013 Taquaral W047º02'958" S22º52'351" 3 14/03/2013 D. Pedro (Ros-si) W047º03'556" S22º50'911" 4 18/03/2013 Escola de Ca-detes (Circulo
Militar)
S22°52'305"
W047°04'787" 5 18/03/2013 Parque Ecólo-gico W047°00'938" S22°54'546" 6 21/03/2013 Balão Iguatemi W047°01'786" S22°53'767" 7 27/03/2013 San Conrado W046°58'336" S22°51'114" 8 15/01/2014 Trilha Joaquim Egídio S22°52'410'' 9
Identificação com base em características morfológicas
A identificação taxonômica com base em características morfológicas (identificação clássica) foi realizada com base em chave dicotômicas disponíveis na literatura pelo grupo da pesquisora Luciane Kern Junqueira da Pontifícia Universidade Católica de Campinas.
Extração e purificação de DNA
Apos a extração e purificação de DNA de cu-pins de acordo com protocolo descrito em literatura [11]. Após a purificação, todas amostras de DNA fo-ram mantidas sob refrigeração à 8ºC.
Para a avaliação da qualidade e quantidade de DNA, 5 mL de cada amostra extraída e purificada com os diferentes métodos foram submetidas à eletro-forese em gel de agarose 1 % em TAE 1X (Tris-acetate-EDTA) e corados com blue Green Loading dye (Figura 2) de acordo com as especificações do fabricante (LAB TRADE).
Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 1% com amos-tras de DNA de cupim
Escolha dos primers para amplificação das subu-nidades de citocromo oxidase.
Artigos descrevendo a amplificação dos genes CO1, CO2, CO3 em insetos foram avaliados em bus-ca dos melhores primers (iniciadores). De acordo com as descrições dos resultados nos artigos encontrados foram selecionados 5 primers. Os primers para ampli-ficação do gene mitocondrial COI, COI, HCO e LCO foram sintetizados de acordo com as sequências des-critas por Miura et al. (1998), Liu & Beckenbach (1992) e Folmer et al. (2007) respectivamente.
No presente trabalho o gene amplificado foi o gene CO2 (Citocromo oxidase subunidade 2) utilizan-do os primers P2 (2B-Lys) e P3 (1-C1-J-2773). As de amplificação por PCR foram efetuadas em volume final de 25 microlitros nas seguintes condições: 1 mi-nuto a 94o.C de desnaturação incial. Seguido por 5
ciclos de 1 minuto a 94oC, 1 minuto a 46o.C e 1 minu-to a 72o.C, 35 ciclos de de 1 minuto a 94oC, 1 minuto a 52oC e 1 minuto a 72o.C, seguidos de 3 minutos a 72o.C.
Escolha das amostras para sequenciamento de DNA
Utilizou-se amostras de todas as áreas e abrangendo famílias, gênero e espécies diferentes para se obter uma variedade maior de resultados e possibilitar a comparação entre eles.Uma vez escolhi-das as amostras para identificação molecular, seus respectivos DNAs foram utilizados para amplificar o gene mitocondrial COII. Os produtos dessas amplifi-cações foram purificadas com a enzima Exo-sap para remover qualquer remanescente de primer e/ou dNTPs do PCR e encaminhadas ao Laboratório Cen-tral de Tecnologias de Alto Desempenho (LACTAD) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
Os resultados do sequenciamento foram ana-lisados com o auxilio de três programas, BioEdit; Se-quence Scanner 2 e Gene Runner. Uma vez verifica-da a qualiverifica-dade verifica-das sequencias de DNA obtiverifica-das, essas foram submetidas a comparação com sequencias de-positadas no Genbank por Blastn (NCBI) para identifi-cação das espécies.
3. Resultados e discussões
Identificação Taxonômica
Das amostras de cupins coletadas em ninhos epigeos na região de Campinas, com base em carac-terísticas morfologicas, puderam ser identificadas al-gumas espécies e, em alguns casos, até gêneros, por ausencia de chave de classificação do grupo em questão (Quadro 2). A partir desses dados, as amos-tras foram selecionadas para análises de Biologia Mo-lecular, buscando a identificação da espécie ou a con-firmaçao dos dados de taxonomia clássica.
No presente trabalho, amostras de cupins das espécies Procornitermes araujoi e Cornitermes cumu-lans puderam ser identificadas com similaridade acima de 98% com sequencias de DNA depositadas no Genbank. Entretanto, amostras de espécies do gênero
Rynchotermes não puderam ser identificas
correta-mente, apresentando similaridade máxima de 89% com o gênero Embiratermes. O mesmo foi encontrado para a amostra 402 de Labiotermes longilabius. O
1 mi n [D igi te u ma ci- ta-çã o do do cu me nt
DNA dessa amostra apresentou 91% de similaridade com Embiratermes transandinus. Em ambos os casos, se deve ao fato de não haver, até o momento, ne-nhuma sequencia depositadas de gene mitocondrial
COII de espécies do gênero Rynchotermes ou
Labio-termes no Genbank.
A amostra 474, identificada por características morfo-lógicas como Cornitermes cumulans apresentou simi-laridade de 95% com sequencia dessa mesma espé-cie depositada no Genbank. Esse resultado é interes-sante, pois 5% de divergência pode significar uma espécie diferente dentro do gênero Cornitermes. He-bert et al (2003) trabalhando com espécies de borbo-letas, encontrou variação menor que 1%
entre indiví-duos de uma mesma espécie e variações entre 5 e 10% entre espécies de um mesmo gênero. O resulta-do encontraresulta-do com Cornitermes pode representar du-as espécies distintdu-as muito semelhante morfologica-mente ou uma mesma espécie com grande variação na sequencia do gene COII analisado. Outras amos-tras de Cornitermes cumulans precisam ser analisa-das para verificar essa dúvida.
A amostra 122 de velocitermes sp apresentou 91% de similaridade com a espécie Velocitermes velox. Esse valor é insuficiente para que a amostra seja classifica-da como Velocitermes velox. O valor está num nível aceitável para a confirmação do gênero, mas não para a espécie.
Em todos os casos, a correta identificação depende de um banco de sequencias consistente e baseado em uma correta identificação taxonômica clássica. Em outras palavras, quanto mais amostras corretamente classificadas forem depositadas no ban-co, maior o sucesso na classificação molecular de tra-balhos posteriores. É importante que espécies brasi-leiras de cupins também sejam analisadas e deposita-das nesse banco, permitindo a correta identificação das espécies de cupins por diferentes grupos de pes-quisa, passo essencial para a compreensão da biolo-gia desses insetos.
4. REFERÊNCIAS
[1] SANTOS et al. (2011). Comunicação sobrevivência de operários do cupim-de-montículo Cornitermes cumulans ( kollar , 1832 ) ( Isoptera : Termitidae ) alimentados, 151–154.
[2] VALÉRIO et al. (1998). Controle Químico e Mecânico de Cupins de Montículo ( Isoptera : Termitidae ) em Pastagens, 27 (1): 125–131. [3] WILCKEN, C.F. (1992). Anais da Sociedade
Entomológica do Brasil, 21: 329-338.
[4] CONSTANTINO, R. (1999). Papéis Avulsos de
Zoologia, v. 40: 387-448.
[5] DOMINGOS et al. (1996). Rev. Bras. Biol., v. 56: 717-723.
[6] DOMINGOS, et al. (1996). Rev. Bras. Biol., v. 56: 717-723.
[7] FLORENCIO et al. (2002). Acta Biologia Leopoldensia, v.24: 205-207.
[9] DIEHL et al.. (2005). Brazilian journal of biology =
Revista Brasileira de Biologia, 65(3), 431–7.
[10] ROSA, A. J. de M.; SONODA, K. C.. 2010.
Dispo-nível em:
<http://www.cpac.embrapa.br/noticias/artigosmidia/ publicados/217/>. Acesso em: 22 jul. 2010.
[11] DONNAN LABORATORIES. Disponível em: http://www.genomics.liv.ac.uk/animal/RESEARCH/I SOLATIO.PDF. Acesso em 19/01/2011.
[12] MIURA et al. (1998). Annals of Entomology
Socie-ty of America, 91: 515 – 523.
[13] LIU. H. & BECKENBACH, A.T. (1992). Molecular
and Phylogenetic Evolution, 1: 41 – 52.
[14] FOLMER et al. (1994). Molecular Marine Biology and Biotechnology , 3 , 294 – 299 .
Quadro 2: Comparação entre a taxonomia clássica e molecular de amostras de Cupins
Amostra
Identificação Taxonômica com base em características
morfológi-cas Identificação Molecular
% Similaridade com GenBank
Gênero Espécie Gênero Espécie
171 Rynchotermes nasutissimos Embiratermes transandi-nus 89% 474 Cornitermes cumulans Cornitermes sp 95% 165
Orthagnathoter-mes mirim Orthagnathotermes sp 92% 219 Procornitermes araujoi Procornitermes araujoi 98% 487 Cornitermes cumulans Cornitermes cumulans 99% 499 Cornitermes cumulans Cornitermes cumulans 98% 412 Labiotermes longilabius Embiratermes transandi-nus 91% 215 Procornitermes araujoi Procornitermes araujoi 99% 122 Velocitermes sp Velocitermes velox 91% 418 Cornitermes cumulans Cornitermes cumulans 99%
