UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA
JEFFERSON OLIVEIRA FREITAS
PROCESSO DE HIPOFISAÇÃO DE COLOSSOMA MACROPOMUM, NO CENTRO DE PESQUISAS ICTIOLÓGICAS RODOLPHO VON IHERING/DNOCS,
PENTECOSTE/CE
FORTALEZA 2018
JEFFERSON OLIVEIRA FREITAS
PROCESSO DE HIPOFISAÇÃO DE COLOSSOMA MACROPOMUM, NO CENTRO DE PESQUISAS ICTIOLÓGICAS RODOLPHO VON IHERING/DNOCS, PENTECOSTE/CE
Relatório de Estagio Supervisionado apresentado ao Curso de Engenharia de Pesca do Departamento de Engenharia de Pesca, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Engenheiro de Pesca.
Orientador: Prof. Dr. Aldeney Andrade Soares Filho.
Coorientador: Prof.a Dr.a Kelma Maria dos Santos Pires Cavalcante.
Orientador técnico: M.e Maria Socorro Chacon de Mesquita.
FORTALEZA 2018
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
F936p Freitas, Jefferson Oliveira.
Processo de hipofisação de Colossoma Macropomum, no centro de pesquisa ictiológicas Rodolpho Von Ihering/DNOCS, Pentecoste/Ce / Jefferson Oliveira Freitas. – 2018.
30 f. : il. color.
Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Curso de Engenharia de Pesca, Fortaleza, 2018.
Orientação: Prof. Dr. Aldeney Andrade Soares Filho.
Coorientação: Profa. Dra. Kelma Maria dos Santos Pires Cavalcante. 1. Tambaqui. 2. Reofilicos. 3. Reprodução Artificial. I. Título.
JEFFERSON OLIVEIRA FREITAS
PROCESSO DE HIPOFISAÇÃO DE COLOSSOMA MACROPOMUM, NO CENTRO DE PESQUISAS ICTIOLÓGICAS RODOLPHO VON IHERING/DNOCS, PENTECOSTE/CE
Relatório de Estagio Supervisionado apresentado ao Curso de Engenharia de Pesca do Departamento de Engenharia de Pesca, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Engenheiro de Pesca.
Aprovada em: _03_/_12__/_2018_.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dr. Aldeney Andrade Soares Filho (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof.a Dr.a Elenise Gonçalves de Oliveira
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. Rossi Lélis Muniz Souza
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A Deus por todos os momentos bons da minha vida em que graças a Ele sou verdadeiramente feliz.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de bolsa durante a graduação e, ao Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), pela bolsa para realização desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Aldeney Andrade Soares Filho, pela orientação, confiança, dedicação, seriedade e paciência.
A Prof.a Dr.a Kelma Maria dos Santos Pires Cavalcante, pela amizade, dedicação, apoio e principalmente pela paciência.
Aos membros da Banca Examinadora, Prof.a Dr.a Elenise Gonçalves de Oliveira e Prof. Dr. Rossi Lelís Muniz Souza, pelas sugestões que contribuíram para o enriquecimento deste trabalho.
A M.e Maria do Socorro Chacon de Mesquita e ao M.e Pedro Eymar pela oportunidade e atenção durante o estágio.
Aos funcionários do Centro de Pesquisas Ictiológicas Rodolpho von Ihering, pela paciência, atenção e ensinamentos práticos durante os dias de trabalho.
Aos meus pais, José de Arimateia Abreu de Freitas e Solange Maria de Oliveira Freitas e, aos meus irmãos Jessica Oliveira Freitas e Ary Oliveira Freitas, pelo amor, apoio incentivo e por estarem sempre comigo nos momentos mais felizes da minha vida e principalmente nos mais difíceis.
A minha grande amiga Rayssa Mendes Bezerra, pela amizade, ajuda e companheirismo nos últimos anos, tanto nos momentos felizes quanto nas horas de dificuldade.
Aos meus amigos Daniel Barroso de Alencar e Rebeca Larangeira de Lima que conviveram comigo boa parte da minha vida acadêmica e que contribuíram de forma significativa para a minha formação profissional. E por suas amizades que levarei para o resto da minha vida.
A Raylanne Ohana Nogueira Lima, por sempre estar ao meu lado dividindo as tristezas e multiplicando as alegrias não me deixando abater nos momentos de dificuldade.
“Lembre-se de olhar para as estrelas e não para baixo em seus pés. Tente identificar o sentido do que você vê e se pergunte sobre o que faz o universo existir. Seja curioso. E no entanto, por mais que a vida possa parecer difícil, há sempre algo que você pode fazer e ter sucesso. É importante você não desistir simplesmente.”
RESUMO
A aquicultura atualmente representa mais da metade da produção de peixes destinados à alimentação humana, permitindo o aumento do consumo per capita de peixes, que atingiu um novo máximo histórico de 20 kg, em 2014. A produção em cativeiro de peixes nativos brasileiros, ainda não é tão influente como a produção de peixes exóticos, devido à falta de pacotes tecnológicos que viabilizem a sua produção. Porém, a produção da espécie nativa tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier, 1816) vem ganhando uma atenção especial nos últimos anos devido as suas características zootécnicas. Um dos maiores problemas enfrentados na produção do tambaqui é a sua difícil reprodução em cativeiro. Por ser um peixe reofilíco, necessita subir o rio, nadando contra a correnteza para que ocorra a maturação das gônadas. Em cativeiro é difícil a simulação da corrente, sendo necessário a utilização de hormônios hipofisários para permitir o pleno desenvolvimento gonadal e, consequentemente, a produção em larga escala de alevinos. Assim, o estágio teve como objetivo acompanhar o processo de hipofisação para obtenção de juvenis de tambaqui. Foram observadas as diversas etapas do processo, desde a seleção das matrizes, o transporte das mesmas, o processo de biópsia ovariana, a aplicação da primeira e da segunda dose do hormônio hipofisário, bem como a contagem da hora-grau, acompanhamento do processo de extrusão e fertilização, além da incubação dos ovos e eclosão da larva e a estocagem em viveiros. Dessa forma, conhecer as etapas de hipofisação do tambaqui adotada pelo Centro de Pesquisas Ictiológicas Rodolpho von Ihering do DNOCS, foram de grande importância para o enriquecimento profissional e individual, pois mesclou os conhecimentos teóricos, obtidas durante o curso, com aqueles praticados no sistema de cultivo.
ABSTRACT
Aquaculture currently accounts for more than half of fish production for human consumption, allowing for an increase in per capita fish consumption, which reached a new record high of 20 kg by 2014. The captive production of Brazilian native fish has not yet is as influential as the production of exotic fish because of the lack of technological packages that make it viable. However, the production of the native species tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier, 1816) has been gaining special attention in recent years due to its zootechnical characteristics. One of the major problems faced in the production of tambaqui is its difficult reproduction in captivity. Because it is a rheophilic fish, it needs to rise the river, swimming against the current for the maturation of the gonads to occur. In captivity it is difficult to simulate the current, requiring the use of hypophyseal hormones to allow full gonadal development and, consequently, large-scale production of fingerlings. Thus, the aim of the stage was to follow the process of hypophysation to obtain tambaqui juveniles. The different stages of the process, from the selection of matrices, the transport of the matrices, the ovarian biopsy process, the application of the first and second doses of the hypohyseal hormone, as well as the time-degree count, follow-up of the extrusion and fertilization, as well as egg hatching and larval hatching and storage in ponds. In this way, to know the stages of hypophysation of tambaqui adopted by the Rodolpho von Ihering Ichthyology Research Center of the DNOCS, were of great importance for the professional and individual enrichment, because it merged the theoretical knowledge obtained during the course with those of the practice of the system of culture.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Imagem de satélite do Centro de Pesquisas Ictiológicas Rodolpho Von Ihering. ... 14
Figura 2 - Captura das matrizes. ... 17
Figura 3- Seleção das fêmeas por visualização do ventre abaulado e da papila urogenital. .... 17
Figura 4 - Chip utilizado para marcação dos reprodutores. ... 18
Figura 5 - Trator utilizado para transporte das matrizes. ... 19
Figura 6 - Bolsa de contenção das matrizes. ... 20
Figura 7 - Adição de solução serra para uma melhor visualização das células. ... 20
Figura 8 - Observação do núcleo das células. ... 21
Figura 9 - Aplicação da primeira dose ... 23
Figura 10 - Sutura feita para evitar a perda de ovos. ... 25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Peso e percentual de núcleos centralizados das fêmeas ... 21 Tabela 2 –Quantidade de hipófises utilizadas nas doses hormonais em machos e fêmeas. ... 23 Tabela 3 - Valores da Hora-Grau e tempo aproximado para ocorrência da ovulação após aplicação da segunda dose. ... 24
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 12
2 CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL DO ESTÁGIO ... 14
3 ACOMPANHAMENTO DO PROCESSO DE HIPOFISAÇÃO ... 16
3.1 Seleção dos peixes ... 16
3.2 Transporte das matrizes ... 18
3.3 Biópsia ovariana ... 19
3.4 Administração das doses hormonais ... 21
3.5 Hora-grau ... 24
3.6 Extrusão e fertilização ... 25
3.7 Incubação e eclosão ... 27
3.8 Estocagem das pós-larvas ... 27
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 29
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1 INTRODUÇÃO
Segundo a FAO (2018), o crescimento da aquicultura nos últimos anos vem permitindo o aumento do consumo per capita de peixes, que atingiu um novo máximo histórico de 20,5 kg em 2017. O incremento na ingestão desse tipo de proteína animal pode ser explicado pelo desenvolvimento da aquicultura, que atualmente responde por mais da metade de todos os peixes destinados a alimentação humana. O interesse pelo pescado vem aumentando devido ao seu valor nutricional que se destaca por possuir grandes quantidades de vitaminas lipossolúveis A e D, minerais como o cálcio, fósforo, ferro, cobre e selênio e pela divulgação de estudos que associam o seu consumo com melhorias para a saúde, como a redução do risco de Acidente Vascular Cerebral (AVC), Mal de Alzheimer, morte por doenças cardíacas e de depressão (SARTORI; AMANCIO, 2012).
A piscicultura continental é a área da aquicultura com a maior influência no Brasil, devido às condições naturais do país, a grande disponibilidade hídrica e seus diversos microclimas. A produção em cativeiro de peixes nativos brasileiros, ainda não é tão influente como a produção de peixes exóticos, devido à falta de pacotes tecnológicos que viabilizem a sua produção. Porém, a produção do peixe nativo tambaqui (Colossoma macropomum) vem ganhando uma atenção especial nos últimos anos devido as suas características zootécnicas como: facilidade na produção de alevinos, alta taxa de crescimento em cativeiro, rusticidade, resistência a elevadas temperaturas na água de cultivo e a eventuais quedas de oxigênio dissolvido na água, além de elevado valor comercial. Todos esses fatores favorecem a sua produção em cativeiro, motivando pesquisas em todas as áreas de conhecimento das espécies, assim, o tambaqui é o peixe nativo mais produzido no Brasil (BARÇANTE; SOUS, 2015).
O tambaqui é uma espécie originária da América do Sul, das Bacias dos rios Amazonas e Orinoco, e considerado por muitos como o segundo maior peixe de escamas de água doce da América do Sul, atrás apenas do pirarucu, Arapaima gigas. Devido a sua importância econômica, o mesmo é cultivado em diversas regiões do Brasil e do continente Sul-americano. Porém, estudos mostraram que, apesar dessa distribuição da espécie, é baixa ou moderada a diferenciação (distância genética) entre os indivíduos. É um peixe tropical, que vive em locais com temperaturas médias entre 25 e 34 °C. Além disso, é capaz de resistir a baixas concentrações de oxigênio dissolvido na água, devido a uma adaptação morfológica, que é o aumento do lábio inferior e o comportamento de nadar próximo a superfície para captar mais oxigênio. Essas simples estratégias podem contribuir para melhorar em até 30% o teor de oxigênio captado e distribuído por meio do sangue (FRACALOSSI; CYRINO, 2016).
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Em seu habitat natural o tambaqui realiza a piracema, processo em que os peixes migram rio a cima, em grandes cardumes ou em pares, quando o rio começa a encher e, desovam em condições ideais, sendo, portanto, um peixe reofílico (WOYNAROVICH; HORVATH, 1983). A sua reprodução acontece geralmente no período chuvoso e sua desova é influenciada por fatores ambientais como: temperatura, pH, fotoperiodo, pressão da massa de água, entre outros. Para que ocorra o sucesso da produção do tambaqui é importante à obtenção de uma grande quantidade de alevinos, pois a reprodução passa a ter um papel crucial para a manutenção de uma produção escalonada. Para superar esse problema na produção de peixes reofílicos criados em cativeiro, empregam-se os seguintes meios: o uso do hCG (gonadotrofina coriônica humana), GnRH (hormônio liberador de gonadotrofina), antidopaminérgicos (antagonista de dopamina) ou associação de GnRH com antidopamínicos (STREIT JR et al., 2002).
No Brasil, a hipofisação utilizando o extrato hipofisário da carpa comum,
Cyprinus carpio é a técnica de indução hormonal mais utilizada para a reprodução de
reofílicos, cerca de 40 espécies com grande valor econômico e ecológico para o Brasil são induzidos por essa técnica. Esse procedimento permite que machos e fêmeas completem seu ciclo reprodutivo em condições desejadas e controladas (AMARAL JÚNIOR, 2017). Segundo Pedroza Filho, Rodrigues e Rezende (2016), a produção de tambaqui em 2014 foi de 139 mil toneladas apresentando um crescimento de 57% em relação ao volume produzido em 2013.
Esse aumento na produção se dá principalmente pela facilidade de obtenção de juvenis produzidos pela hipofisação, já que a produção de tambaqui pela pesca comercial tem sofrido considerável redução em toda a Amazônia, devido ao grande esforço de pesca que vem diminuindo a abundância dessa espécie no ambiente natural (MORAIS; SULLIVAN, 2017).
Portanto, este trabalho visou acompanhar o processo de hipofisação de tambaqui,
Colossoma macropomum (Cuvier, 1816) cultivado no Centro de Pesquisas Ictiológicas
Rodolpho von Ihering do Departamento Nacional de Obras Contra a Seca (DNOCS), observando-se desde a seleção de matrizes até a estocagem dos alevinos em viveiros.
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2 CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL DO ESTÁGIO
O estágio supervisionado foi realizado no período de setembro e outubro de 2018 no Centro de Pesquisas Ictiológicas Rodolpho von Ihering (03º48’3.10”S; 039º16’6.01”W), de propriedade do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), localizado no município de Pentecoste-CE, distante aproximadamente 95 km de Fortaleza (Figura 1).
Figura 1- Imagem de satélite do Centro de Pesquisas Ictiológicas Rodolpho Von Ihering.
Fonte: Google (2018).
O Centro de Pesquisas Ictiológicas Rodolpho von Ihering foi inaugurado em 11 de fevereiro de 1985 pelo Engenheiro Agrônomo Raimundo Ademar Braga com o intuito de pesquisar e difundir conhecimentos na atividade de extensão nas áreas de aquicultura, tecnologia do pescado, hipofisação e nutrição, além do papel principal de desenvolvimento e distribuição de alevinos. O campus conta com uma extensão de 11,37 hectares, destinando-se ao manejo de reprodutores e alevinos de diferentes espécies como tilápia, Oreochromis
niloticus, carpas, Cyprimus carpio, tambaqui, Colossoma macropomum, pirapitinga, Piaractus brachypomus, pacu-aranha, Piaractus mesopotamicus, pirarucu, Arapaima gigas e
alguns híbridos como o tambacu.
O mesmo conta com 26 tanques de alvenaria destinados ao descanso de reprodutores, sendo dois tanques com capacidade de 66 m3 e 24 tanques com capacidade de 33 m3 e 48 viveiros destinados à reprodução de tilápia em hapas, cultivo de tambaqui, pacu,
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tilápia, pirarucu e outras espécies. Além de uma área administrativa com laboratórios de limnologia, aquicultura, genética molecular, tecnologia do pescado, salas do setor administrativo, auditório, restaurante, alojamento e fábrica de ração. A água de abastecimento é proveniente do acude Pereira de Miranda.
O açude Pereira de Miranda pode armazenar 360,00 hm3 de água, mas atualmente conta com apenas 5,43% da capacidade de armazenamento (19,55 hm3) devido à seca que castiga o Nordeste a seis anos, considerada a pior seca dos últimos cem anos. Segundo a FUNCEME (CEARÁ, 2018), em 2009 o município de Pentecoste apresentou uma quantidade de chuva anual de 1267 mm, quantidade 83% superior ao esperado para o mesmo ano, período em que o açude Pentecoste chegou a apresentar 100% da sua capacidade de armazenamento. Enquanto que em dezembro de 2017 apresentou 1,49% da sua capacidade de armazenamento com um volume de 5,36 hm3.
Atualmente o Centro de Pesquisa atua em situação de manutenção utilizando uma quantidade menor de viveiros e uma produção menor quando comparada a alguns anos atrás, devido à pouca quantidade de água que pode ser utilizada e a má qualidade da água, o que impossibilita o aumento da produção.
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3 ACOMPANHAMENTO DO PROCESSO DE HIPOFISAÇÃO 3.1 Seleção dos peixes
O Centro de Pesquisa possui dois planteis de tambaqui um mais velho com peixes entre 10 a 12 anos, com pesos variando entre 11 e 15 kg. Pela idade e manuseio constantes, esses peixes já estão com suas curvas de crescimento, atingindo a estabilidade. Já o plantel mais novo com pesos de 7 a 8 kg e idades variando de 6 a 7 anos são os mais adequados para o manuseio, e o mais utilizados para as pesquisas. Segundo Streit Jr et al. (2012), quanto maior o tamanho do reprodutor maior serão as dificuldades durante a captura, a manipulação dos peixes em laboratório e a quantidade de hormônio utilizada. Além disso, peixes com pesos menores que 6 kg apresentam a quantidade de ovócitos em torno de 12% do peso vivo, enquanto que peixes maiores apresentam de 4 a 5% do peso do animal.
Machos e fêmeas são mantidos separadamente, em viveiros escavados de 2.500 m2, com dimensões de 25 x 100 m, localizados paralelamente. A densidade de estocagem é aproximadamente um peixe/42 m2 devido à baixa qualidade da água de cultivo. Além do tambaqui são mantidos nos mesmos viveiros peixes, como pacú-caranha e pirapitinga. Na literatura existem relatos de planteis de matrizes com o peso superior a 3 kg, mantidos com uma densidade de estocagem de um peixe/10 m2, sendo essa superior a utilizada no DNOCS (STREIT JR et al., 2002).
Os peixes são alimentados com ração com 22% de proteína bruta sendo ofertado 1% da biomassa dividido em dois tratos por dia.
Para a captura das matrizes é utilizada uma rede de arrasto com dimensões de 50 x 3m, com abertura de malha de 4 cm, manuseada por três funcionários, os quais se posicionara em cada uma das duas extremidades e no meio da rede, permitindo, assim, a maior controle dos peixes (Figura 2).
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Figura 2 - Captura das matrizes.
Fonte: o Autor.
Após a captura de machos e fêmeas, os mesmos são selecionados com base na observação das características morfológicas que mostram os animais propícios ao procedimento de hipofisação. Nas fêmeas foram observadas características subjetivas como papila urogenital avermelhada e ventre abaulado, conforme se observa na Figura 3.
Segundo Woynarovich e Horvath (1983) o ventre das fêmeas torna-se macio e abaulado somente um pouco antes da desova.
Figura 3- Seleção das fêmeas por visualização do ventre abaulado e da papila urogenital.
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Figura 4 - Chip utilizado para marcação dos reprodutores.
Fonte: o Autor.
Após a captura, os peixes que apresentam um bom desenvolvimento gonadal são transportados até o laboratório de manejo reprodutivo. No Centro de Pesquisa em média são selecionados cinco peixes para posteriormente ser feita a seleção definitiva pela biopsia ovariana. Todas as fêmeas possuem chips (Figura 4) para um maior controle e evitar que as mesmas passassem pelo processo de hipofisação de forma descontrolada, pois é necessário um período de repouso para que as fêmeas possam ter condições de se preparar para outra desova. No geral uma fêmea pode passar por esse procedimento duas vezes ao ano no período chuvoso (janeiro a julho).
Quanto à seleção dos machos são observadas as seguintes características: animais saudáveis; não apresentar deformação ou ferimentos no corpo e; com uma leve pressão no abdômen, observar se ocorre à liberação de sémen. São capturados quatro machos, com essas características. Vale salientar que o importante neste procedimento, é que o mesmo seja realizado nas primeiras horas do dia, pois é necessário que os peixes fiquem em repouso por um período de 4 a 6 horas, antes da aplicação da primeira dose.
3.2 Transporte das matrizes
Após a seleção, os indivíduos são transportados por um trator com uma carroceria acoplada contendo uma caixa de fibra de vidro com água (Figura 5), onde os peixes são colocados durante o transporte. Em seguida, são separados de acordo com o sexo e colocados em tanques de manuseio feitos de alvenaria com dimensões de 4 x 1,30 m, revertidos de azulejos com renovação de água constante, com a finalidade de minimizar o stress. Segundo Melo (2013), a seleção e o transporte dos reprodutores apresentam uma influência muito
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importante no resultado da hipofisação, devendo o manuseio ser realizado de forma a causar o menor estresse possível as matrizes, e assim, evitando que o hipotálamo estimule a produção de dopamina que causa a interrupção da maturação.
Figura 5 - Trator utilizado para transporte das matrizes.
Fonte: o Autor.
3.3 Biópsia ovariana
A biópsia ovariana é realizada 6 horas após o transporte, o que permiti um tempo de descanso para as matrizes. Para a realização desse procedimento as fêmeas são retiradas dos tanques utilizando uma bolsa de contenção (Figura 6), e devidamente pesadas. No dia do acompanhamento as fêmeas capturadas apresentaram os seguintes pesos 8234. 7,5 kg, 8806. 11,5 kg, 0407. 7 kg, 8254. 7 kg e 8237. 5 kg. Posteriormente é realizada a coleta dos ovócitos para análise. Dentre as cinco fêmeas selecionadas somente a fêmea II pertencia ao plantel mais velho, as demais eram do plantel mais novo.
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Figura 6 - Bolsa de contenção das matrizes.
Fonte: o Autor.
Para a retirada dos ovócitos é utilizada uma seringa de 10 mL com uma mangueira de silicone acoplada um tipo de escalpe n°4, sendo esta introduzida no oviduto da fêmea. Após a retirada, os óvulos são colocados em placas de Petri e adicionada solução de Serra (Figura 7) para se obter uma melhor visualização das estruturas como o núcleo. O mesmo procedimento é realizado com todas as fêmeas para escolher dentre as cinco, apenas duas.
Figura 7 - Adição de solução serra para uma melhor visualização das células.
Fonte: o Autor.
Utilizando uma lupa, observa-se a posição do núcleo das células e as fêmeas que apresentassem a maior porcentagem de núcleo centralizado (Figura 8) são selecionadas para a indução. Os percentuais de núcleos centralizados obtidos na biopsia ovariana das fêmeas capturadas foram de 8234. 30; 8806. 15; 0407. 75; 8254. 80 e 8237. 30% (Tabela 1). Após ser realizada a biopsia ovariana foi constatado que as fêmeas 0407 e 8254 apresentavam as
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melhores características para a realização da indução hormonal, devolvendo-se as demais ao viveiro.
Figura 8 - Observação do núcleo das células.
Fonte: o Autor.
Tabela 1 - Peso e percentual de núcleos centralizados das fêmeas
FÊMEA CHIP N° PESO (KG) NÚCLEO CENTRALIZADO (%)
I 8234 7,5 30 II 8806 11,5 15 III 0407 7 75 IV 8254 7 80 V 8237 5 30 Fonte: o Autor.
3.4 Administração das doses hormonais
Com base nos pesos obtidos são calculadas as quantidades de extrato de hipófise a serem utilizadas na preparação do soro hipofisário. O cálculo é baseado no peso da fêmea vezes a quantidade de miligrama de hipófise para cada quilograma (5,5 mg) dividido por 1,5 que é o peso das hipófises utilizadas no procedimento. O cálculo do número de glândulas hipofisárias para as duas fêmeas é calculado da seguinte forma:
Fêmea III:
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Fêmea IV:
7,0 x 5,5 = 38,5 mg / 1,5 mg = 26 hipófise (2)
Para a primeira aplicação é ministrada apenas 10% da quantidade total de hipófise, o número de três hipófises para cada fêmea. O mesmo procedimento foi recomendado por Streit Jr et al. (2012). Já a segunda aplicação do soro hipofisário nas fêmeas é ministrada 15 horas após a primeira aplicação, utilizando o restante das hipófises totais (90%), 23 hipófises para cada fêmea. A primeira aplicação nas fêmeas selecionadas foi realizada as 16:20 enquanto que a segunda ocorreu as 7:20.
Segundo Zaniboni Filho e Weingartner (2007), a primeira dose nas fêmeas serve para estimular a migração da vesícula germinal e a segunda dose para induzir a quebra da vesícula germinal, ovulação e desova.
Os machos recebem uma dose única do hormônio, aplicado junto com a segunda dose nas fêmeas. Para o cálculo da quantidade de hipófise utilizada no soro hipofisário dos machos, é utilizado o peso dos peixes (6 kg) vezes a quantidade de peixes (quatro unidades) vezes quantidade de hipófise por kg (2 mg/kg), dividido por 1,5 que é o peso de cada hipófise. O cálculo do número de glândulas hipofisárias para os quatro machos é calculado utilizando a seguinte relação.
4 x 6,0 x 2,0 = 48 mg / 1,5 mg = 32 hipófise (3)
Para a aplicação da dose única nos machos foram utilizados 32 hipófise em 4 mL de soro fisiológico, sendo ministrada 1 mL em cada macho.
Na formulação do soro é necessário registrar o número de glândulas hipofisárias, as quais são maceradas utilizando um pistilo e gral e diluídas em 0,5 mL de soro fisiológico/kg de peso vivo dos peixes (0,75% de NaCl).
O extrato de hipófise é aplicado na base da nadadeira peitoral, com a agulha introduzida no sentido da cabeça para a cauda e com o peixe de lado (Figura 9). A agulha não deve ser muito longa e nem muito fina, para não lesionar algum órgão interno. Após as aplicações as fêmeas são colocadas em tanques diferentes e adicionados dois machos em cada tanque. Esse procedimento é realizado como uma forma de estimular a desova tanto dos machos como das fêmeas.
Antes da aplicação da segunda dose realiza-se nas fêmeas, uma sutura no orifício urogenital com a finalidade de evitar a perda dos ovos e a desova aconteça apenas no momento desejado (DALMASS et al., 2016).
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Figura 9 - Aplicação da primeira dose
Fonte: o Autor.
A quantidade de hipófise utilizada na aplicação da primeira e segunda doses das matrizes pode ser observada na Tabela 2.
Tabela 2 –Quantidade de hipófises utilizadas nas doses hormonais em machos e fêmeas.
Hipófise ( n°)
1° DOSE 2° DOSE TOTAL
FÊMEA III 3 23 26
FÊMEA IV 3 23 26
MACHO I a IV 8 32
Fonte: o Autor.
A partir do momento em que as matrizes são colocadas nos tanques de manuseio de reprodutores, a temperatura da água foi medida de hora em hora até que o somatório das temperaturas estivessem entre 240 e 270 horas-grau.
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3.5 Hora-grau
Após a aplicação da segunda dose existe um tempo necessário para que ocorra a desova, esse tempo vai depender da temperatura em que os peixes estão sendo mantidos. A temperatura tem influência inversamente proporcional na maturação dos gametas, assim, quanto maior a temperatura menor será o tempo necessário para ocorrer à desova (FAUSTINO et al. 2007).
A hora-grau consiste basicamente no somatório das temperaturas (°C) mensurada a cada hora na água dos tanques de reprodução, esse tempo é necessário para indicar o momento aproximado da ovulação das matrizes e extrusão do material genético.
A Tabela 3 mostra aos valores da hora-grau e tempo aproximado para ocorrência da ovulação após indução hormonal do tambaqui.
Tabela 3 - Valores da Hora-Grau e tempo aproximado para ocorrência da ovulação após aplicação da segunda dose.
HORA TEMPERATURA (°C) HORA GRAU
8:20 28,0 28 9:20 28,0 56 10:20 28,0 84 11:20 28,0 112 12:20 28,0 140 13:20 28,0 168 14:20 28,0 196 15:20 29,0 225 16:20 29,0 254 Média 28,2 - Fonte: o Autor.
No Centro de Pesquisa o tempo necessário entre a segunda dose e a ovulação foi de 9 horas, com a aplicação da segunda dose as 7:20 da manhã e a extrusão as 16:20 da tarde com a hora-grau em torno de 254. Leite (2013) trabalhando na determinação de doses inseminantes e embriogeneses na fertilização artificial de tambaqui obteve o mesmo intervalo de tempo entre a segunda dose e a ovulação e a quantidade de hora-grau de 243.
Quanto à temperatura média das águas dos tanques, esta foi de 28,2 °C (Tabela 3). Segundo Streit Jr et al. (2012) para o tambaqui a média é de 215 horas-grau/temperatura podendo variar de 200 a 300 horas-grau dependendo da qualidade dos reprodutores, com temperatura média de 28,05, valor próximo ao encontrado no presente trabalho.
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Uma hora antes da ovulação é possível observar algumas características comportamentais como: a fêmea mais agitada na presença dos machos e os machos perseguindo as fêmeas.
3.6 Extrusão e fertilização
A extrusão das matrizes foi realizada 9 horas após a aplicação da primeira dose, com 254 horas- grau. As fêmeas devem ser retiradas dos tanques e colocadas em uma espécie de colchão, nesse momento é retirada a sutura realizada para evitar a perda dos ovos, havendo a liberação de urina pela matriz (Figura 10). Concomitantemente, os recipientes utilizados para a coleta de ovos e o sêmen é retirado de perto da matriz evitando o contato da urina com o recipiente. Antes da extrusão a região ventral da fêmea deve ser seca com toalha macia para não ocorre à hidratação dos ovos.
Figura 10 - Sutura feita para evitar a perda de ovos.
Fonte: o Autor.
Os ovos são extrusados suavemente, por meio de uma massagem abdominal, ao qual foi possível a retirada de uma massa de ovos de 1067 g e 586g, representando cerca de aproximadamente 15% e 8% do peso vivo das fêmeas 0407 e 8254, respectivamente (Figura 11). Em seguida os machos são retirados dos tanques e feita uma massagem abdominal para a retirada de sêmen. Com o sêmen e os ovos no recipiente é realizada a fertilização a partir do método de extrusão a seco, o qual consiste em reunir os óvulos e o sêmen em um recipiente e
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misturá-los delicadamente utilizando uma colher de plástico para que o sêmen tenha o maior contato possível com os óvulos, adicionando-se a água logo em seguida.
Figura 11- Extrusão por massagem abdominal.
Fonte: o Autor.
Devido ao comportamento dos gametas a fertilização a seco é a melhor alternativa, pois amplia o tempo para o manejo dos gametas e aumenta a taxa de fecundação, por isso então a necessidade de secar o reprodutor antes da extrusão, para que seja evitado o contato dos óvulos e do sêmen com a água (ZANIBONI FILHO; WEINGARTNER, 2007).
Segundo Zaniboni Filho e Weingartner (2007), quanto ao comportamento dos gametas, as células espermáticas são imóveis no testículos devido a elevada concentração de potássio presente nas células, assim, quando entra em contato com a água o potássio é diluído e o esperma ativado. Já os óvulos depois de ser hidratados iniciam o fechamento da micrópila, que é o ponto de entrada do espermatozoide no óvulo. Tanto a mobilidade do sêmen com a abertura da micrópila do ovulo, permanecem por volta de um minuto após o contato com a água.
A água utilizada para a hidratação dos gametas era coletada da chuva, segundo o responsável pelo processo de hipofisação antes se utilizava a água das incubadoras, porém a taxa de fecundidade era baixa. Com a utilização da água da chuva ocorreu um aumento significativo na taxa de fecundidade.
Logo depois desse processo os ovos são transferidos para as incubadoras onde ocorre todo o desenvolvimento embrionário e o nascimento das larvas.
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3.7 Incubação e eclosão
Após a fecundação os ovos são distribuídos igualmente em quatro incubadoras de 200 L, previamente limpas, teladas e com vazão de 5 a 10 L/min, com a densidade de 2 g de ovos/L (Figura 12). Em média a fêmea de tambaqui libera uma concentração de 1.500 ovócitos/g (LEITE et al., 2013). As incubadoras utilizadas no Centro de Pesquisa são feitas de fibra de vidro, com o formato de funil, a entrada da água pela parte inferior e a saída pela parte superior, dessa forma, movimentando os ovos que não saiam pela parte superior devido a tela. Além disso, esse sistema realizava renovação da água gerando uma oxigenação de 5 mg/L suficiente para a sobrevivência dos indivíduos. É necessária o monitoramento da temperatura e do oxigênio dissolvido da água nas incubadoras para que não haja problemas na eclosão dos ovos.
De acordo com Dalmass et al. (2016), a incubação tem como objetivo garantir o desenvolvimento embrionário e a eclosão, e o sucesso dessa parte do procedimento depende exclusivamente da qualidade da água que deve apresentar parâmetros físicos e quimicos ideais a espécie de cultivo, como: temperatura ideal a espécie; pH entre 7 e 8; dureza e alcalinidade acima de 30 mg/L e oxigênio dissolvido acima de 5 mg/L. Os autores citam, ainda, que a vazão e a aeração dos ovos permitem a constante movimentação dos mesmos, impedindo que eles fiquem parados no fundo ou aderidos na borda da incubadora, assim, evitando que os ovos não fecundados se fixem aos fecundados. Ovos não fecundados apresentam rápido crescimento de fungos e bactérias, fatores prejudiciais ao ovos fecundados. Durante está pesquisa, a eclosão dos ovos demorou de 12 a 18 horas aproximadamente, período inversamente proporcional a temperatura da água, assim, quanto maior a temperatura da água menor será o tempo de eclosão das larvas. Após a eclosão as larvas ainda passaram dois dias nas incubadoras, somando assim um tempo total de 72 horas de incubação, podendo ser alimentadas com gema de ovo até o 3° ou 4° dia na própria incubadora para dar mais resistência às larvas, nesse período às larvas já estão bem desenvolvidas, com a boca aberta e sistema digestório completo.
3.8 Estocagem das pós-larvas
Antes do povoamento dos viveiros é necessário fazer a preparação do mesmo. Um dos primeiros procedimentos a ser realizado é a secagem do viveiro deixando todo o fundo do mesmo exposto ao sol para a decomposição da matéria orgânica. Posteriormente é feita a
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calagem utilizando cal virgem na quantidade de 200 kg/ ha, que além de ser responsável pela assepsia do viveiro e manutenção do pH, permite uma maior disponibilidade de nutrientes e fornecimento de cálcio para o zoôplancton, que é a alimentação natural nos primeiros dias de vida (FARIA et al, 2013).
Em seguida é feita a adubação por dois dias com esterco bovino na proporção de 2000 kg/ha e só depois é adicionado água no viveiro, esse período de preparação do viveiro leva em torno de 7 dias, sempre observando a transparência da água utilizando um disco de Secchi, assim, quando a transparência estiver na faixa de 30 a 60 cm, as pós-larvas podem ser adicionadas no viveiro, pois a água estará rica em alimento natural como rotíferos e cladóceros (FARIA et al, 2013)
A transferência das pós-larvas é realizada 3 dias após a eclosão, por sifonamento, retirando-se a parte da mangueira acoplada na torneira e, deixando-se acoplada a parte inferior, sendo a mesma colocada em um recipiente com uma tela, não permitindo a saída das larvas desse recipiente. Após a retirada total da água, abria-se a torneira fazendo uma limpeza nas incubadoras, retirando as pós-larvas que por ventura tenham ficadas aderidas na parede da incubadora. É importante ter cuidado para não ocorre a comatação da malha e danificação das pós-larvas. Em seguida as larvas são colocadas em um saco e transportadas para os viveiros previamente preparados, onde passam entorno de 30 dias para serem liberados para a venda.
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4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O processo de hipofisação é uma técnica que permite a reprodução de peixes reofilícos, espécies que necessitam de estímulos naturais, como subir o rio para ocorrer a maturação das gônadas, e que em ambientes de cativeiro necessitam de outros meios como a utilização de hormônios. Esse processo possibilitou o crescimento de 57% na produção do tambaqui no ano de 2014 quando comparado com 2013, esse aumento na produção se deu principalmente pela facilidade de obtenção de juvenis produzidos pelo método de hipofisação.
A técnica apresentou uma grande influência na produção do tambaqui nos sistemas de cultivos, deixando a espécie na primeira posição do peixe nativo mais consumido no Brasil, uma vez que a produção da pesca comercial apresentou um grande declínio no Estado do Amazonas, principal produtor, devido ao aumento do esforço de pesca.
Portanto, os conhecimentos adquiridos sobre a técnica de hipofisação adotada no Centro de Pesquisas Ictiológicas Rodolpho von Ihering do DNOCS, foram de grande importância para o enriquecimento profissional e individual, pois mesclou a parte teórica, obtida durante o curso, com a prática do sistema de cultivo.
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REFERÊNCIAS
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