UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
EULALIA VARGAS TAPIA
IDENTIFICAÇÃO DA FONTE BOTÂNICA, CARACTERIZAÇÃO
QUÍMICA E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DAS
PRÓPOLIS COLETADAS NO PERU
CAMPINAS 2018
EULALIA VARGAS TAPIA
IDENTIFICAÇÃO DA FONTE BOTÂNICA, CARACTERIZAÇÃO
QUÍMICA E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DAS
PRÓPOLIS COLETADAS NO PERU
Orientador: Prof. Dr. Yong Kun Park
Co-Orientadora: Prof.ª Dr.ª Gláucia M. Pastore
CAMPINAS 2018
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA EULALIA VARGAS TAPIA E ORIENTADA PELO PROF. DR. YONG KUN PARK E CO-ORIENTADA PELA PROF.ª DR.ª GLÁUCIA M. PASTORE.
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Vargas Tapia, Eulalia,
V426i VarIdentificação da fonte botânica, caracterização química e avaliação das atividades biológicas das própolis coletadas no Peru / Eulalia Vargas Tapia. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
VarOrientador: Yong Kun Park.
VarCoorientador: Glaucia Maria Pastore.
VarTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Engenharia de Alimentos.
Var1. Própolis. 2. Compostos bioativos. 3. Baccharis tricuneata. 4. Alnus acuminata. 5. Compostos fenólicos. I. Park, Yong Kun. II. Pastore, Glaucia Maria. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Botanical source identification, chemical characterization and
evaluation of the biological activities of the propolis collected in Peru
Palavras-chave em inglês: Propolis Bioactive compounds Baccharis tricuneata Alnus acuminata Phenolic compounds
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutora em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Glaucia Maria Pastore [Coorientador] Claudio Lima de Aguiar
Ruann Janser Soares de Castro Delia Rita Tapia Blácido
Juliano Lemos Bicas
Data de defesa: 31-01-2018
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-8216-2932 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/9027947480044028
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Glaucia Maria Pastore (Presidente da Banca) Co-orientadora - DCA/FEA/UNICAMP
Prof. Dr. Ruann Hanser Soares de Castro Membro Titular - DCA/FEA/UNICAMP
Prof. Dr. Claudio Lima de Aguiar Membro Titular- ESALQ/USP
Profa. Dra. Delia Rita Tapia Blácido Membro Tilular- FFCLRP/USP
Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas
Membro Titular- DCA/FEA/UNICAMP
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna
Dedico este trabalho a Deus primeiramente, e a meu Pai Eduardo Vargas por toda sua entrega, apoio, carinho e compreensão durante estes anos, aos meus filhos Danielly e Victor André e aos meus irmãos que me deram suporte e compreensão.
Ao meu bondoso Deus criador e sustentador de tudo que existe, que não me fez faltar o pão de cada dia, e me mostra sua mão em cada situação que tivemos que passar.
Ao meu pai Eduardo, por ter ficado ao meu lado nos momentos bons e ruins e não ter desistido de mim dando-me forças e intercedendo a Deus por mim através das suas orações.
Aos meus irmãos Eufemia, Eufrasia e Iver, por terem sido tão pacientes e compreensivos comigo, por terem cuidado economicamente, emocionalmente da minha família.
Aos meus filhos Danielly e Victor André por serem meus maiores tesouros e motivo do meu existir.
Ao Prof. Dr. Yong Kun Park, pela orientação, cuidado, atenção e por todo conhecimento compartilhado ao longo desses anos de estudo.
À Profa. Glaucia M. Pastore pelo apoio e orientação nessa fase importante de conclusão do trabalho.
À Profa. Hélia Harumi, pelo acompanhamento do meu trabalho, por todo o cuidado, carinho e apoio.
À equipe do Laboratório ThoMSon, ao Prof. Marcos Eberlin pela oportunidade de fazer as análises de identificação de compostos no seu laboratório, e às Profas. Ildenize Barbosa e Alexandra Sawaya por toda a colaboração, apoio e orientação do trabalho e por compartilhar toda essa bagagem de conhecimento sobre a própolis.
À equipe do LANUM e ao Prof. Mário Maróstica pela colaboração na parte de quantificação de compostos fenólicos. Meu especial agradecimento à Adriana Gadioli pela paciência, acompanhamento nas análises realizadas e à Profa. Cinthia Betim por sua orientação no tratamento e discussão dos resultados.
À Prof. Anderson Sant’ana e equipe do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, pela colaboração nos testes microbiológicos do trabalho, especial agradecimento à Rafaela e Leonardo.
Bioquímica, aos colegas do laboratório: Beatriz, Marília, Jéssika, Paula, Val, Viviane, Elaine, e alunos e estagiários. Muito obrigada pela companhia e acolhimento.
Aos apicultores peruanos pelo fornecimento de amostras de própolis, ao Sr. Fernando Oporto (Arequipa), à Melánia Torres (Tacna) e especialmente ao Sr. Santiago Carlo (Lambayeque) pela recepção que nos ofereceram nos dias de visita a seus apiários, pelo carinho e por acreditarem no meu trabalho.
“Por isso não temas, porque estou contigo; não te assustes, porque sou o teu Deus; Eu te fortaleço, ajudo e sustento com a mão direita da minha justiça”.
O presente trabalho teve o objetivo de identificar a principal fonte botânica das própolis peruana, assim como identificar e quantificar os compostos fenólicos presentes, nas própolis além de avaliar suas atividades biológicas: antioxidante e antimicrobiana. Foram coletadas própolis produzidas por Apis mellifera em três regiões do Peru: Tacna (Candarave e Tacna), Arequipa (La Joya e Majes) e Lambayeque (Andamarca). Para identificar as principais fontes botânicas das própolis peruanas foram investigadas treze plantas apícolas coletadas de três regiões do Peru. As amostras de própolis e plantas foram obtidas em novembro de 2013. Além disso, foram estudados quatro extratos etanólicos de própolis comerciais, adquiridos em supermercados de Lima - Peru, no período de 2015 e 2016. Os teores de compostos fenólicos e flavonoides em extratos etanólicos de própolis (EEP) foi feita pelos métodos espectrofotométricos e a atividade antioxidante foi realizada pelos testes de FRAP e ORAC e a capacidade antimicrobiana foi avaliada contra bactérias Gram (+): Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes, e bactérias Gram (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhimurium e Salmonella enteritidis, contra fungos Penicillium roqueforti, Penicillium paneum e levedura Saccharomyces cerevisiae. EASI-MS e ESI-MS/MS foram utilizadas para a identificação de compostos químicos presentes nos EEP e nos extratos etanólicos vegetais (EEV), assim como nas própolis comerciais (Ks). Os resultados mostraram teores de fenólicos e flavonoides entre 507,1 mg EAG mL-1 a 6603,8 mg EAG mL-1 e 0,47 mg EC mL-1 a 9,01 mg EC mL-1 respectivamente. As amostras de EEP das regiões estudadas apresentaram maiores concentrações em fenóis e flavonoides, no entanto, as amostras comerciais apresentaram valores inferiores, o mesmo comportamento foi observado para atividade antioxidante das própolis em comparação às amostras comerciais. Os resultados do ensaio da FRAP variaram entre 49,3 a 46,7 µmol ET mL-1. No entanto, todos os extratos etanólicos de própolis apresentaram alta capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC), sendo obtidos valores na faixa de 245,65 µmol ET mL-1 a 267,48 µmol ET mL-1. As própolis comerciais peruanas apresentaram baixa atividade antioxidante em ambos os ensaios. Os EEP (1 a 7) apresentaram maior atividade antioxidante em comparação com as amostras comerciais (Ks) em ambos os ensaios. A capacidade antimicrobiana, apresentou potente capacidade inibitória contra bactérias Gram (+) S. aureus (MIC 39,1 μg mL-1) e levemente
observada capacidade inibitória para a levedura. Os principais compostos identificados nos extratos etanólicos de própolis peruana foram: quercetina, caemferol, pinocembrina e artipilin C. Os compostos vanilina, isobutil cinnamato, ácido mirístico, tetradecanoato de metilo, α-santonina, artimisina, pinobanksin 3-O-acetato, acacetina, sakuranetina, ramnetina, quercetina 3,7-dimetil éter, 4,5- ácido di-O-cafeoilquinico, metil 3,4-dicafeoilquinico e ácido palmítico podem estar presentes nos EEP peruanos de acordo com os resultados obtidos. Pela análise de componentes principais (PCA) foi possível classificar as própolis peruanas em cinco grupos. Os principais marcadores químicos da própolis peruana são os íons m/z 245, m/z 255, m/z 261, m/z 283, m/z 299, m/z 313, m/z 329 e m/z 501. Pela fragmentação de massas foi possível confirmar a Baccharis tricuneata e Alnus acuminata como potenciais fontes botânicas das própolis da região de Lambayeque.
Palavras chaves: Própolis, compostos bioativos, Bacharia tricuneata, Alnus acuminata, compostos fenólicos.
ABSTRACT
In current studywe aimed to identify the main botanical source of peruvian propolis, as well as to identify and quantify the phenolic compounds present in the propolis besides evaluating its biological activities: antioxidant and antimicrobial. Propolis produced by Apis mellifera was collected in three regions of Peru: Tacna (Candarave and Tacna), Arequipa (La Joya and Majes) and Lambayeque (Andamarca). In order to identify the main botanical sources of peruvian propolis, thirteen bee plants collected from three regions of Peru. The samples of propolis and plants were obtained in November of 2013. In addition, four ethanolic extracts of commercial propolis, purchased in supermarkets of Lima - Peru, during the period of 2015 and 2016 were studied. The levels of phenolic compounds and flavonoids in ethanolic propolis (EEP) extracts were made by spectrophotometric methods and the antioxidant activity was performed by FRAP and ORAC tests and the antimicrobial capacity was evaluated against Gram (+) bacteria: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Listeria monocytogenes, and Gram (-) bacteria: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis, against fungi Penicillium roqueforti, Penicillium paneum and yeast Saccharomyces cerevisiae. EASI-MS and ESI-MS / MS were used for the identification of chemical compounds present in EEP and vegetal ethanolic extracts (EEV), as well as commercial propolis (Ks). The results showed phenolic and flavonoid contents between 507.1 mg GAE mL-1 to 6603.8 mg GAE mL-1 and 0.47 mg CE mL-1 to 9.01 mg CE mL-1 respectively. EEP samples investigated regions showed higher concentrations of phenols and flavonoids, however, the commercial samples showed lower values, the same behavior was observed for antioxidant activity of propolis in comparison with commercial samples. The FRAP assay results ranged from 49.3 to 46.7 μmol TE mL-1. However, all the ethanolic extracts of propolis presented a high capacity of absorption of oxygen radicals (ORAC), being obtained values in the range of 245.65 μmol ET mL-1 to 267.48 μmol TE mL-1. The commercial peruvian propolis presented low antioxidant activity in both trials. EEP (1 to 7) showed higher antioxidant activity compared to commercial samples (Ks) in both assays. The antimicrobial capacity showed a strong inhibitory capacity against Gram (+) S. aureus (MIC 39.1 μg mL-1) and slightly against Gram (-) and fungi (MIC between 625 μg mL-1 and 2500 μg mL-1), no inhibitory capacity was observed for yeast. The main compounds identified in the ethanolic extracts of Peruvian
propolis were: quercetin, kaempferol, pinocembrin and artipillin C. The compounds vanillin, isobutyl cinnamate, myristic acid, methyl tetradecanoate, α-santonin, artemisinin, pinobanksin-3-O-acetate, acacetin, sakuranetine, rhamnetin, quercetin 3,7-dimethyl ether, 4,5-di-O-caffeoylquinic acid, 3,4-dicapheoylquinic acid and palmitic acid may be present in Peruvian propolis according to the results obtained. For principal components analysis (PCA) was possible to classify the peruvian propolis into five groups. The main chemical markers of the peruvian propolis are m/z 245, m/z 255, m/z 261, m/z 283, m/z 299, m/z 313, m/z 329 and m/z 501. Mass fragmentation made possible the confirm of tricuneata Baccharis and Alnus acuminata as potential botanical sources of propolis of the Lambayeque region.
Keywords: Propolis, bioactive compounds, Baccharis tricuneata, Alnus acuminata, phenolic compounds.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Abelha Apis mellifera coletando a resina de folhas jovens de Baccharis
dracunculifolia (a). Abelha depositando resinas coletadas para selar fendas na colmeia (b) e (c).. ... 26 Figura 2. Apis mellifera coletando própolis a partir do alecrim do campo (Baccharis
dracunculifolia) à esquerda (a) e Apis mellifera coletando própolis a partir do rabo de bugio (Dalbergia ecastophyllum) à direita (b). ... 31 Figura 3. Locais de coleta das amostras de própolis das colmeias e de vegetais e compra de EEP comerciais. ... 58 Figura 4. Própolis bruta (a) e extratos etanólicos de própolis (b) de Tacna (EEP1, EEP2 e EEP3), Arequipa (EEP4 e EEP5), e Lambayeque (EEP6 e EEP7). ... 59 Figura 5. CCDAE-FR dos extratos etanólicos da própolis peruana. ... 60 Figura 6. Compostos fenólicos totais nos extratos etanólicos de própolis peruana (EEP), própolis comerciais (Ks) e extrato etanólico de plantas (EEV)... 61 Figura 7. Fenóis totais nos extratos etanólicos vegetal (EEV). ... 63 Figura 8. Flavonoides totais nos extratos etanólicos de própolis peruana (EEP), própolis comercial (K) e extrato etanólico de plantas (EEV). ... 63 Figura 9. Flavonoides totais nos extratos etanólicos de vegetais (EEV). ... 65 Figura 10. Resultados do ensaio FRAP para os extratos etanólicos de própolis peruana (EEP), própolis comercial (K) e extrato etanólico de plantas (EEV). ... 65 Figura 11. Resultados do ensaio ORAC para os extratos etanólicos de própolis peruana (EEP), própolis comercial (K) e extratos etanólicos de vegetais (EEV). ... 66 Figura 12. Resultados do ensaio FRAP para os extratos etanólicos de vegetais (EEV). ... 67 Figura 13. Resultados do ensaio ORAC para os extratos etanólicos de vegetal (EEV). ... 68 Figura 14. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de própolis peruana contra
Figura 15. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de própolis contra Salmonella typhimurium IAL 2431. ... 70 Figura 16. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de própolis contra Escherichia coli. ... 70 Figure 17. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis (EEP1) de Tacna. ... 75 Figura 18. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis (EEP2) de Tacna. ... 75 Figura 19. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis (EEP3) de Tacna- Candarave. ... 76 Figura 20. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis (EEP4) de Arequipa –La Joya. ... 76 Figura 21. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis (EEP5) de Arequipa Majes. ... 77 Figura 22. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis (EEP6) de Lambayeque-Andamarca. ... 77 Figura 23. Fingerprints obtidos por EASI -MS em modo negativo do extrato de própolis (EEP7) de Lambayeque- Andamarca. ... 78 Figura 24. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis comercial da marca Apisvol (K1). ... 83 Figura 25. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis comercial da marca Jalk (K2). ... 83 Figura 26. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis comercial da marca Madre Natura (K3). ... 84 Figura 27. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato de própolis comercial da marca Bionaturista (K4) ... 84 Figura 28. Fingerprints obtidos por EASI -MS em modo negativo do extrato etanólico de Asiakero (EEV1). ... 86
Figura 29. Fingerprints obtidos por EASI -MS em modo negativo do extrato etanólico de Eucalyptus (Myrtaceae) (EEV2). ... 86 Figura 30. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Baccharis phylicoides (Astearase) (EEV3). ... 87 Figura 31. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Gaultheria sp. (Ericaceae) (EEV4). ... 87 Figura 32. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo de extrato etanólico de Pseudogynoxys engleri (Asteraceae) (EEV5)... 88 Figura 33.Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Baccharis latifolia (Asteraceae) (EEV6). ... 88 Figura 34. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Olea europaea (Oleaceae) (EEV7). ... 89 Figura 35. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Leucaena leucocephala (Fabaceae) (EEV8). ... 89 Figura 36. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Lippia nodiflora (Verbenaceae) (EEV9). ... 90 Figura 37. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Ficus carica (Moraceae) (EEV10). ... 90 Figura 38. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Baccharis tricuneata (Astearaceae) (EEV11). ... 91 Figura 39. Fingerprints obtidos por EASI-MS em modo negativo do extrato etanólico de Alnus acuminate (Astearaceae) (EEV12). ... 91 Figura 40. Análise PCA de íons principais de EEP, EEV e EECC. ... 95
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação das própolis brasileira, de acordo com suas características
físico-químicas e localização ... 30
Tabela 2. Principais floras melliferas e poliníferas registradas no Perú ... 45
Tabela 3. Identificação de amostras utilizadas nestes estudo ... 49
Tabela 4. Plantas apícolas estudadas para identificar a fonte botânica da própolis ... 50
Tabela 5. Atividade antimicrobiana das própolis peruana ... 69
Tabela 6. Atividades antimicrobianas de própolis peruana (EEP, Ks) e EEV contra bactérias e fungos. ... 72
Tabela 7. Possíveis compostos identificados nas amostras de EEP e própolis comerciais. ... 80
LISTA DE ABREVIATURAS
AAPH: Dicloreto de 2,2’azobis (2-Amidinopropano) ADP: “Asociación de apicultores del Perú”
ANVISA: Agencia Nacional de Vigilância Sanitária CAPE: ácido fenil éster caféico
CENAGRO: Censo Nacional Agropecuário CFU: Unidades Formadoras de Colônia ATCC: American Type Culture Collection BHI: Brain Heart Infusion
CCDAE-FR: Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficiência em Fase Reversa
CLAE-FR: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
EAG: Equivalente de Ácido Gálico
EASI-MS: Espectrometria de Massa ambiente com Ionização por Sônic-Spray EEP: Extrato Etanólico da Própolis
EEV: Extrato Etanólico de Vegetais ET: Equivalente Trolox
ESI-MS/MS: Espectrometria de Massa em Tandem de Ionização por Eletropray FDA: Food and Drug Administration
FRAP: Poder antioxidante de redução férrica
FEPEAP: “Confederación Nacional de Apicultores” g: Força gravitacional
GC-MS: Gas Chromatography–Mass Spectrometry
HPLC-ESI-MS: High-Performance Liquid Chromatography Coupled to Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry
INIA: Instituto Nacional de Innovación Agraria Ks: Própolis comercial
MINAGRI: “Ministério de Agricultura e Riego”
MRSA: S. aureus resistente à meticilina/Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NCYC: National Collection of Yeast Cultures
NIRs: Near-infrared spectroscopy MIC: Capacidade Mínima Inibitória
ORAC: Capacidade antioxidante do radical de oxigênio PCA: Análise De Componentes Principais
PNDA: Plano Nacional de Desenvolvimento Apícola ADP: “Asociación de apicultores del Perú”
SONADAP: “Sociedad Nacional de Apicultores”
SUNAT: “Superintendencia Nacional de Aduanas y de Administración Tributaria” TROLOX : 6-hidroxi-2, 5, 7,8-tetrametilcroman-2-ácido carboxílico
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 22 2. OBJETIVOS ... 25 Objetivo geral ... 25 Objetivos específicos: ... 25 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 26 3.1. Própolis ... 26
3.1.1. Composição química da própolis ... 27
3.1.2. Classificação das Própolis ... 29
3.1.3. Origem botânica da própolis ... 30
3.1.4. Propriedades biológicas da própolis: ... 33
3.1.4.1. Atividade antimicrobiana ... 33
3.1.4.2. Atividade Antioxidante ... 34
3.1.4.3. Atividade Anti-inflamatória ... 37
3.1.4.4. Atividade Antitumoral ... 39
3.1.4.5. Atividade Anti-HIV e herpes ... 40
3.2. Apicultura peruana: Situação atual e estudos com a própolis ... 41
3.2.1. Origem da apicultura peruana ... 41
3.2.2. Realidade da apicultura peruana ... 42
3.2.3. Flora melífera e poliníferas e características geográficas do Peru ... 43
3.2.4. Importância econômica da apicultura peruana... 47
3.2.5. Estudos com própolis peruana ... 47
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 49
4.1. Própolis bruta ... 49
4.1.1. Coleta de amostras de própolis ... 49
4.1.2 . Tratamento das amostras de própolis bruta ... 49
4.1.3. Preparo dos extratos etanólicos de própolis (EEP). ... 50
4.2.1. Coletas de amostras de vegetais fontes de própolis ... 50
4.2.2. Preparo dos extratos etanólicos vegetais (EEV) ... 51
4.3. Determinações qualitativas dos compostos fenólicos presentes nos EEP ... 51
4.3.1. Cromatografia em camada delgada de alta eficiência em fase reversa dos EEP. ... 51
4.4. Determinações quantitativas dos compostos fenólicos presentes nos EEP e EEV ... 51
4.4.1. Determinação de compostos fenólicos totais ... 51
4.4.2. Determinação de flavonoides totais ... 52
4.5. Estudo das atividades biológicas da própolis ... 52
4.5.1. Determinação das atividades antioxidantes ... 52
4.5.1.1. Capacidade antioxidante do radical de oxigênio (ORAC)... 52
4.5.1.2. Teste de poder antioxidante de redução férrica (FRAP) ... 53
4.5.2. Testes de atividade antimicrobiana ... 53
4.5.2.1. Preparo dos discos com extratos de própolis ... 53
4.5.2.2. Análise da atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos da própolis ... 53
4.5.2.3. Análise de capacidade mínima inibitória (MIC) dos extratos etanólicos ... 54
a) Micro-organismos... 54
b) Meio de cultura ... 54
c) Preparação de inóculo ... 54
d) Determinação da concentração mínima inibitória ... 55
4.6. Identificação dos compostos químicos presentes nos extratos de própolis e de vegetais ... 56
4.6.1. Espectrometria de massa ambiente com ionização por sonic-spray (EASI-MS) ... 56
4.6.2. Espectrometria de massa em tandem de ionização por eletrospray ESI (-) - MS / MS ... 56
4.8. Análise estatística ... 57
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 58
5.1. Coleta de amostras ... 58
5.2. Preparo do extrato etanólico de própolis (EEP ) e (EEV) ... 58
5.4. Compostos fenólicos totais em EEP, Ks, EEV. ... 61
5.5. Determinação de flavonoides totais ... 63
5.6. Determinação das propriedades antioxidantes ... 65
5.7. Atividade antimicrobiana ... 68
5.7.1. Halo de inibição ... 68
5.7.2. Concentração mínima inibitória (MIC) ... 70
5.8. Identificação botânica e composto químico em amostras de própolis peruanos. ... 73
5.8.1. Espectrometria de massa ambiente com ionização por sonic-spray (EASI-MS) ... 73
5.8.2. ESI (-) - MS/MS ... 92
5.9. Análise de componentes principais (PCA) ... 95
6. CONCLUSÕES ... 98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 100
1. INTRODUÇÃO
A busca de um estilo de vida mais saudável tem se tornado nos últimos anos a principal preocupação da população mundial. Frente a isso, muitos desafios têm sido realizados para suprir a demanda existente. Pesquisas têm focado nos produtos naturais como forma de obtenção de compostos bioativos que não cumpram somente a função nutricional, mas também exerçam atividades biológicas na saúde do consumidor. Surgem assim, os chamados de produtos ou alimentos funcionais, os quais possuem a capacidade de oferecer efeitos positivos sobre a saúde, através de suas atividades antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatória, entre outros. Assim, os produtos naturais têm sido fontes valiosas para o desenvolvimento de novas drogas (NEWMAN et al., 2000). O valor dos produtos naturais está sendo reconhecido e os desafios são identificar novos compostos bioativos e comprovar seus mecanismos de ação (OLDONI, 2007). Os produtos apícolas têm despertado muito interesse das pesquisas científicas, dentro dos quais a própolis vem sendo explorada para fins farmacológicos.
A própolis apresenta um longo histórico quanto ao seu uso terapêutico é conhecida desde a antiguidade na história da medicina, as civilizações chinesas, tibetana, egípcia e greco-romana mostram por meio de seus escritos antigos, centenas de receitas mencionando mel, própolis, larvas de abelhas e às vezes as próprias abelhas como remédios para prevenir e curar as enfermidades (ALENCAR, 2002).
Este material apresenta uma composição química complexa e variada, incluindo ácidos graxos e fenólicos e seus ésteres, ésteres fenólicos substituídos, flavonoides (flavonas, flavanonas, flavonois, dihidroflavonois, chalconas), terpenos, esteroides, álcoois e aldeídos aromáticos, sesquiterpenos, derivados do naftaleno e estilbeno (KAI et al., 2014; LEE et al., 2014; OLDONI et al., 2011; MARCUCCI, et al., 1996). Estudos comprovaram que a composição química da própolis depende da ecologia vegetal de cada região, sendo que a quantidade e qualidade dos flavonoides dependem da variedade vegetal de onde a própolis é coletada além do tipo de abelha (KOO; PARK, 1997). Devido às diferenças geográficas, amostras da Europa e China contêm muitos tipos de flavonoides e ésteres de ácidos fenólicos (BANKOVA et al. 2000). Diferentemente, os maiores componentes das própolis brasileiras
são terpenoides e derivados prenilados do ácido p-cumárico(DAUGSCH et al., 2008; DE CASTRO ISHIDA et al., 2011; MARCUCCI, 1994).
Nos últimos anos, a literatura científica vem relatando as propriedades farmacológicas da própolis de diversos países Europeus e Sul Americanos, tais como atividades antimicrobianas (bactericida, fungicida e virucida), antioxidante, antitumoral, cicatrizante, reparadora tissular, anestésica, contra parasitas intestinais e sanguíneos, antimutagênica e contra doenças cardiovasculares e respiratórias (BANKOVA et al., 2014; BUENO-SILVA et al., 2013; CAMPOS et al., 2014; DARENDELIOGLU et al., 2016; LIMA et al., 2009; MISSIMA et al., 2010; MORAES et al., 2010; NINA et al., 2016; TORLAK; SERT, 2013). A caracterização de todas estas atividades biológicas associadas à tendência de utilização de produtos naturais têm resultado em aumento da demanda de própolis para diferentes aplicações na indústria de alimentos para a elaboração de filmes (DEMITRI et al., 2016) e produtos contendo própolis, como extratos, comprimidos, cápsulas (MENEZES et al., 1997).
Nesse contexto, embora a apicultura peruana seja uma atividade secundária, ela oferece a vantagem de ser basicamente rural, o que permite a produção de produtos apícolas orgânicos e livres de contaminantes químicos sintéticos. O Peru apresenta uma biodiversidade de flora e fauna nativa abundante, favoráveis para a realização da uma apicultura competitiva. No entanto, a apicultura peruana ainda encontra-se em processo de desenvolvimento, sendo necessárias políticas de investimento. A própolis, um dos produtos da colmeia, ainda é pouco conhecida suas propriedades bioativas pela maioria dos apicultores peruanos, assim, a sua importância biológica e as inúmeras vantagens que a sua produção e comercialização poderiam ser divulgados e mais exploradas. No mercado peruano existem diversos produtos a base de própolis, na maioria produzidos sem uma devida padronização química, que poderia garantir a qualidade.
A padronização química é de vital importância para a elaboração de diversos produtos a base de própolis. Devido a sua composição química complexa e variada, dependendo da fonte botânica existente em cada região, seria recomendável realizar a padronização de acordo com os componentes bioativos presentes. Diversas metodologias têm sido utilizadas para caracterizar quimicamente as própolis, dentro das mais recentes encontram-se a espectrometria de massas. Uma das técnicas modernas, elaboradas no
Laboratório ThoMSon, é a EASI-MS, como uma técnica que permite a inserção direta das amostras, obtendo um perfil de compostos, chamado de fingerprints, em que compostos são avaliados de acordo com a sua massa.
Diante do exposto, o presente estudo visa a caracterização química da própolis peruana, e a avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana assim como a identificação dos principais marcadores químicos de própolis nas três regiões estudadas. As informações obtidas ampliam o conhecimento das potencialidades do produto, para que futuramente uma estandardização da própolis peruana seja estabelecida, aumentando as possibilidades de aplicação em produtos alimentícios, farmacêuticos, agregando valor à apicultura peruana e contribuindo para a expansão do mercado apícola.
2. OBJETIVOS Objetivo geral
Caracterizar a composição de fenólicos e flavonoides e avaliar a atividade antioxidante e antimicrobiana, assim como identificar as principais fontes botânicas da própolis peruana.
Objetivos específicos:
Quantificar os teores de compostos fenólicos e flavonoides nas própolis e algumas plantas usando métodos espectrofotométricos.
Avaliar a atividade antioxidante dos extratos etanólicos de própolis e vegetais utilizando os ensaios FRAP e ORAC
Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de própolis e vegetais contra bactérias patogênicas Gram (+) e Gram (-), fungos e leveduras.
Classificar as amostras de extratos etanólicos de própolis de acordo ao perfil químico através de EASI-MS
Identificar os principais marcadores químicos em cada tipo de própolis e classificar em grupos usando EASI-MS e análises de PCA.
Identificar a fonte botânica, através da comparação de compostos químicos presentes na própolis e a possível fonte botânica usando o EASI-MS e ESI-MS/MS.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Própolis
A própolis é uma substância resinosa e balsâmica coletada pelas abelhas obreiras da espécie Apis mellifera de diversas partes da planta, como broto, ápices florais também de exsudados resinosos (BANKOVA, et al., 2000; TORETI, et al., 2013). O material coletado é modificado pelas abelhas, através da adição de secreções próprias e transportados para dentro das colmeias para reforçar a estabilidade estrutural selar as fendas e proteger contra insetos invasores (BANKOVA, et al., 2000). Apresenta uma coloração variada dependendo da fonte botânica onde foi obtida, de acordo com BURDOCK (1998) a cor varia de amarelo- verde até o marrom escuro. Assim temos a própolis verde (Bacharis dracunculifolia), própolis vermelha (Dalbergia ecastophyllum, Clusia sp.) e própolis de cor escura (marrom) (Populus sp.) (BANKOVA et al., 2002; DAUGSCH et al., 2008; PARK et al., 2004). A consistência é altamente influenciada pela temperatura, assim é quebradiça a -20 a 4°C e se torna dúctil e maleável quando aquecido. Apresenta um ponto de fusão variável entre 60-70°C sendo que em alguns casos pode chegar a 100°C (OLDONI, 2007; R. KRELL, 1996). O odor é característico variando de uma amostra a outra (BURDOCK, 1998; MARCUCCI, 1994).
A Figura 1 ilustra a abelha Apis mellifera coletando a resina de folhas jovem de alecrim do campo e depositando-a nas fendas da colmeia. A resina é misturada com secreções ou saliva e cera da abelha para ser transformada em própolis.
Figura 1. Abelha Apis mellifera coletando a resina de folhas jovens de Baccharis dracunculifolia (a). Abelha depositando resinas coletadas para selar fendas na colmeia (b) e (c). Fonte (KUMAZAWA et al., 2003).
3.1.1. Composição química da própolis
A própolis possui uma composição química complexa e variada. No geral, consistem em uma mistura de resinas balsâmicas (50%), ceras (30%), óleos essenciais (10%) e grãos de pólen (5%) e em menor quantidade por microelementos (5%) como minerais (Al3+, Ca2+, Sr2+, Fe2+, Cu2+ e Mn2+) e vitaminas (B1, B2, B6, C e E) (BURDOCK, 1998; HEGAZI, 1978). A composição química da própolis depende diretamente da disponibilidade de materiais vegetais resinosos em diferentes regiões geográficas, é também influenciado por fatores climáticos, estações de ano, e também da genética da abelha (BANKOVA et al.,1998; BANKOVA, et al, 2000; KOO & PARK, 1997).
De acordo com KAŠKONIENĖ et al. (2014), mais de 400 compostos químicos diferentes já foram identificados nas própolis de diversas fontes botânicas e origens geográficas, entre eles estão ácidos fenólicos, flavonoides, terpenos, aldeídos, ácidos orgânicos, ésteres, hidro carbonos, álcoois aromáticos, cetonas, sesquiterpenos, quinonas, cumarinas, esteroides e aminoácidos. Diversos estudos têm levado à diferenciação de dois tipos de própolis com composição química bastante diferenciada, as própolis das regiões temperadas e as própolis das regiões tropicais.
As própolis das regiões temperadas: Europa, América do Norte, Nova Zelândia e as regiões não tropicais da Ásia possuem como principais constituintes os compostos fenólicos, flavonoides, ácidos aromáticos e seus ésteres (BANKOVA, et al,. 2000; FALCÃO et al., 2013; MARCUCCI, 1994) e as própolis da região mediterrânea são ricas em ácidos diterpênicos (BANSKOTA et al., 2000).
BANKOVA et al. (2002) estudaram a composição química de própolis da Bulgária, Itália e Suíça por GC-MS, identificando 80 compostos químicos, dentro das quais destacaram-se os flavonoides e ácidos fenólicos como pinocembrina, pinobanksina 3-O-acetato, crisina, galangina, ácidos fenil éster caféico (CAPE) e ácido ferúlico. A principal fonte botânica da própolis destas zonas são os botões de álamo (Populus sp.) e em algumas regiões do norte de Rússia os botões de Betula verrucosa (BANKOVA, 2005a).
FALCÃO et al. (2013) analisaram própolis de Portugal por LC/DAD/ESI-MS, revelando a presença de compostos fenólicos com diferenças marcantes na concentração. Os autores descreveram dois tipos de própolis a “própolis comum” obtida dos brotos de álamo, e
a “própolis incomum” composta por flavonoides como caemferol glicosilados que não estão presentes nas própolis comuns, sugerindo como possível fonte botânica a Cistrus ladanifer.
KASOTE et al. (2014) avaliaram a composição química de 39 própolis da África do Sul e própolis brasileiras por UPLC-ESI-MS, e verificaram que as própolis africanas apresentaram um perfil químico semelhante às própolis produzidas nas regiões temperadas, com exceção das própolis da região de Gauteng e Cabo Ocidental, que possuíam perfil químico diferente das própolis das regiões temperadas, e das própolis de regiões tropicais (Brasil). Os principais compostos encontrados foram ácido caféico, ácido p-cumárico e quercetina, pinobanksin, crisina, pinocembrina, galangina, pinobanksin 3-O-acetato, tectocrisina.
Por outro lado, as própolis de regiões tropicais, em especial do Brasil, têm apresentado maiores quantidades de compostos fenólicos, destacando-se fenilpropanóides, derivados de ácidos cinâmico, terpenoides e derivados do ácido p-cumárico (CHRISTINE et al., 2007; DE FIGUEIREDO et al., 2017; DUTRA et al., 2014; MARCUCCI et al., 2000; PARK, et al,. 2004; SCHMIDT et al., 2014; PARK, et al, 2002). A própolis vermelha encontrada na região de Alagoas em Brasil, em Cuba, na Venezuela e no México é composta principalmente por isoflavonoides, chalconas, flavonoides, benzofenonas e terpenos prenilados (ALENCAR et al., 2007; DAUGSCH, MORAES, FORT, & PARK, 2008; LOPEZ, 2014; SFORCIN & BANKOVA, 2011).
Recentemente, foram reportados estudos da própolis de outros países de América do Sul, os quais apresentam diferenças na sua composição. As própolis da Argentina foram descritas como ricas em fenóis e flavonoides (AGÜERO et al., 2014; LIMA et al., 2009), A própolis chilena, apresentou ácido caféico (CAPE) e flavonoides (CASTRO et al., 2014; VALENZUELA-BARRA et al., 2015). A própolis boliviana mostrou-se rica em triterpenos pentacíclicos, fenólicos, e principalmente fenilpropanoides prenilados (NINA et al., 2015), enquanto a própolis uruguaia foi reportada como rica em ácidos fenólicos, flavonoides e ácidos carboxílicos aromáticos (KUMAZAWA et al., 2002). A própolis equatoriana mostrou como constituintes principais flavonoides e triterpenos (CUESTA-RUBIO et al., 2017). A existência de própolis com perfil químico variado é influenciada por diversos fatores, dentre eles: condições climáticas, diferenças geográficas, regiões de coleta, genética das abelhas e
principalmente pela fonte botânica fornecedora de resinas (AGÜERO et al., 2011; FALCÃO et al., 2013; KUMAZAWA et al., 2003; PARK, et al,. 2002).
3.1.2. Classificação das Própolis
A classificação da própolis é de vital importância, pois permite estabelecer padrões de qualidade para a própolis obtida em cada região, facilitando sua utilização na indústria farmacêutica assim como suplemento na indústria de alimentos. De forma geral, a própolis é classificada, de acordo a sua origem geográfica, em dois grandes grupos: própolis de climas temperados e própolis de climas tropicais.
As própolis das regiões temperadas como Europa, América do Norte, Nova Zelândia e das regiões não tropicais da Ásia, apresentam perfil químico similares, sendo atribuídos principalmente aos brotos de álamo (Populus sp.) (ALMEIDA et al., 2016; BANKOVA et al., 2002; FALCÃO et al., 2013). Algumas exceções foram encontradas nas própolis da Rússia, atribuindo-se a Betula verrugosa (BANKOVA, 2005a). POPOVA et al., (2009), relataram que as própolis da região mediterrânea (Sicília, Creta e Malta), contem principalmente diterpenos, provavelmente originados de plantas coníferas do género Cupressaceae.
As própolis das regiões tropicais especialmente as de origem brasileira são amplamente reconhecidas e estudadas. Um dos mais importantes trabalhos reportados correspondem a primeira classificação das própolis por PARK; IKEGAKI; ALENCAR, (2000), em que foram analisadas 500 amostras de própolis brasileira produzidas por abelhas da espécie Apis mellifera, das regiões Sudeste, Sul, Centro-Oeste e Nordeste, quanto às características físico-químicas ("UV-scanning", CCDAE-FR e CLAE-FR) e suas propriedades biológicas. Os resultados permitiram classificar a própolis em 12 grupos distintos (Tabela 1). Anos depois estudos realizados ALENCAR et al. (2007) e DAUGSCH et al. (2007) revelaram a própolis vermelha a mesma que é classificada como própolis grupo 13.
Tabela 1. Classificação das própolis brasileira, de acordo com suas características físico-químicas e localização geográfica (PARK; IKEGAKI; ALENCAR, 2000; DAUGSCH, 2007)
Grupos Cor Origem da
própolis Estado
G 1 Amarelo Região Sul Rio Grande do
Sul (RS) G 2 Castanho claro Região Sul Rio Grande do
Sul (RS) G 3 Castanho escuro Região Sul Paraná (PR) G 4 Castanho claro Região Sul Paraná (PR) G 5 Marrom esverdeado Região Sul Paraná (PR) G 6 Marrom avermelhado Região Nordeste Bahia (BA) G 7 Marrom esverdeado Região Nordeste Bahia (BA) G 8 Castanho escuro Região Nordeste Pernambuco
(PE)
G 9 Amarelo Região Nordeste Pernambuco
(PE) G 10 Amarelo escuro Região Nordeste Ceará (CE) G 11 Amarelo Região Nordeste Piauí (PI) G 12 Verde ou Marrom
esverdeado Região Sudeste São Paulo (SP) G 13 Vermelha Região Nordeste Alagoas (AL)
PAREDES GUZMAN (2005), analisou própolis peruanas, por espectrofotometria na região UV-Visível e cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE). Neste estudo o autor classificou as própolis peruanas em três grupos, no entanto, a existência de outros tipos de própolis é altamente provável, principalmente pela diversidade geográfica do país e pela existência de flora diversificada em cada região. A fonte vegetal das própolis peruanas ainda não foram reportadas.
3.1.3. Origem botânica da própolis
A identificação da fonte botânica da própolis é um dos fatores primordiais para o controle da qualidade do produto e para o desenvolvimento do sector apícola. A identificação das espécies vegetais fornecedoras de compostos bioativos permite alocar as colméias a lugares adequados para sua produção, e também possibilita o reflorestamento dessas espécies de vegetação ao redor dos apiários, permitindo uma maior disponibilidade de plantas resinosas, para uma melhor produção de própolis. O conhecimento da flora da região
facilitaria a certificação de origem da própolis, dando um valor agregado na hora de comercializá-los.
Determinar a fonte botânica da própolis é uma tarefa complexa, e duas abordagens já foram amplamente aplicadas: análise comparativa da composição química e análise palinológica (LOPEZ, 2014). Métodos espectroscópicos foram utilizadas para a comparação de dados espectrais dos extratos de própolis com os brotos de várias espécies de plantas (ANĐELKOVIĆ et al., 2016). A espectroscopia no infravermelho próximo (NIRs), aliadas a análise de componentes principais (PCA) foram utilizadas para classificar as própolis coletadas em diferentes regiões geográficas da China (KASOTE et al., 2014).
ALENCAR (2002), identificou a origem botânica das própolis brasileiras por comparação de características físico-químicas, das própolis e a provável fonte vegetal mediante cromatografia liquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR). Neste estudo os autores, identificaram três fontes vegetais para as própolis brasileira (Figura 2), Baccharis dracunculifolia (alecrim do campo - grupo 12), hyptis divaricata (grupo 6), e resinas de Populus (álamo) (grupo 3). Depois estudos realizados pela mesma equipe relataram uma nova própolis denominada de própolis vermelha, coletada a partir do rabo de bugio (Dalbergia ecastophyllum) originária do Estado de Alagoas, permitindo a classificação em 13 grupos (ALENCAR et al., 2007; DAUGSCH et al., 2008).
Figura 2. Apis mellifera coletando própolis a partir do alecrim do campo (Baccharis dracunculifolia) à esquerda (a) e Apis mellifera coletando própolis a partir do rabo de bugio (Dalbergia ecastophyllum) à direita (b).(PARK; ALENCAR; AGUIAR, 2002)
No Brasil, outras fontes vegetais de própolis também foram reportadas como por exemplo Araucaria angustifolia (pinheiro brasileiro) e Eucalyptus citriodora (eucalipto) (BANKOVA et al., 1998; SFORCIN et al.,2005).
SAWAYA (2006) utilizou métodos de espectrometria de massas: MS, ESI-MS/MS, HPLC-ESI-MS e HPLC-ESI- MS/MS para caracterizar quimicamente, tipificar e identificar as fontes botânicas das própolis obtidas por Apis mellifera e abelhas nativas de varias regiões do Brasil, bem como as própolis da Bulgária, Inglaterra, Finlândia, América do Norte e Moçambique. Neste estudo, foi confirmada uma clara correlação entre a planta, Baccharis dracunculifolia, e a própolis verde, corroborando o que previamente a sido foi descrito por PARK et al. (2002) e Araucaria heterophyllae com as própolis do estado de Paraná (Brasil). As própolis de Europa e América do Norte apresentaram compostos similares àquelas presentes em resinas de gênero Populus. SAWAYA (2006) também relatou que a principal fonte vegetal da própolis coletada pelas abelhas nativas Tetragonisca angustula era a planta Schinus terebenthifolius.
As própolis da Europa, América do Norte e oeste da Ásia, foram extensamente estudadas, e muitas pesquisas corroboraram que a principal fonte vegetal das própolis são os exsudados dos botões das árvores da família das Salicáceas, do gênero Populus (conhecida como álamo). Dois tipos de espécies de Populus são abundantes nas regiões de climas temperados, a P. nigra é a mais reportada, e contem flavonoides característicos como, galangina, crisina, pinobanksin 3-O-acetato e pinocembrina (POPOVA et al., 2007; SAVKA et al., 2015). No entanto a P. tremula, abundante na Europa, América do Norte se caracteriza por conter glicerídeos fenólicos (SAVKA et al., 2015).
ANĐELKOVIĆ et al. (2016), utilizaram métodos espectroscópicos de NMR, IR e UV, para estudar 59 amostras de própolis coletadas na Sérvia, Bósnia, Herzegovina e na Bulgária, coletadas de 48 colmeias encontradas em diferentes altitudes, variando de 100 a 1000 m em clima temperado. Neste estudo foi utilizada a comparação de dados espectrais dos extratos de própolis com os extratos de brotos de várias espécies de Populus, para identificar a fonte botânica e correlacionar os compostos químicos de acordo com as amostras de própolis coletadas em diferentes altitudes. Os resultados mostraram que as própolis coletadas acima de 500m de altitude apresentavam predominância de compostos glicerídeos fenólicos
originários dos brotos de P. tremula. No entanto, as própolis coletadas nas regiões localizadas abaixo de 400m de altitude, apresentaram flavonoides originários dos brotos de P nigra e P. euroamericana, e as própolis de regiões situadas entre 400 e 500m apresentaram origem mista, com quantidades variáveis de compostos presentes nos brotos do gênero Populus.
POPOVA et al. (2012), estudaram a própolis de origem mediterrânea por análise de GC-MS, identificando a resina de Cupressus sempervirens, como a principal fonte botânica. A determinação da origem botânica da própolis revelou-se de importância fundamental, já que é o principal fator determinante da sua composição química e, portanto, das suas propriedades biológicas. Assim, conhecer a fonte botânica permite um controle da qualidade e a padronização das amostras de própolis para uma efetiva aplicação farmacológica ou terapêutica.
3.1.4. Propriedades biológicas da própolis:
A própolis é um dos poucos remédios naturais que manteve sua popularidade durante um longo período de tempo na história da humanidade. Devido às suas diversas propriedades biológicas, a própolis tem sido cada vez mais utilizada na indústria farmacêutica (BOISARD et al., 2015; CASTRO, 2008; HEGAZI; ABD EL HADY, 2002; LOPEZ et al., 2015; SHERAZI et al., 2009; TORLAK; SERT, 2013). As principais atividades biológicas atribuídas às própolis mais estudadas serão brevemente detalhadas seguir.
3.1.4.1. Atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana é uma das principais atividades biológicas estudadas na própolis. A capacidade de reduzir ou eliminar a virulência das bactérias são atribuídas aos flavonoides (BANKOVA, 2005b). Os principais flavonoides identificados nas própolis são: pinocembrina (SFORCIN, et al,.2005), pinobanksina, quercetina, naringenina, galangina e crisina (ALDAY-PROVENCIO et al., 2015; TOSI et al,. 2007; VARGAS-SÁNCHEZ et al,.2015), galangina, ácidos caféico e naringina (DEZMIREAN et al., 2017).
A efetividade antimicrobiana da própolis foi estudada com diversos micro-organismos, bactérias, fungos e leveduras. Resultados positivos foram encontrados contra Enterococcus faecali (KOO et al., 2002a), Micrococcus luteus (FARNESI et al., 2009), Candida albicans (BOISARD et al., 2015; CONTI et al., 2013; HEGAZI et al,. 2002; JUG et al., 2014),
Streptococcus mutans (CONTRERAS, 2010; EGUIZÁBAL et al., 2007; KOO et al., 2002b), Staphylococcus aureus (CONTRERAS, 2010; DAUGSCH et al., 2008; GÓMEZ et al., 2004; MARCUCCI et al., 2001; MASSARO et al., 2014; PAREDES-GUZMAN, 2005; SCAZZOCCHIO et al., 2006; SILICI; KUTLUCA, 2005; TORLAK; SERT, 2013) BOISARD et al., 2015; FARNESI et al., 2009; GÓMEZ et al., 2004; JUG; KONČIĆ; KOSALEC, 2014; MARCUCCI et al., 2001; ORSI et al., 2005; TORLAK; SERT, 2013; TOSI et al., 2007) Staphylococcus epidermidis (PARK, CHOI, & SUH, 2015), Escherichia coli (FARNESI et al., 2009; TORLAK; SERT, 2013), C. tropicalis, Salmonella typhimurium (ORSI ET AL., 2005; TORLAK & SERT, 2013), Pseudomonas aeruginosa (FARNESI et al., 2009; JUG et al., 2014; MARCUCCI et al., 2001; NEDJI et al., 2014).
ALENCAR et al. (2007), avaliaram a atividade antimicrobiana da própolis vermelha contra Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Staphylococcus mutans UA159 e a fração de clorofórmio foi a mais ativa com concentração mínima inibitória (MIC) variando de 25 a 50 μg / mL.
CHEN et al. (2017), estudaram a própolis verde de Taiwan, e observaram que houve maior inibição do crescimento de bactérias Gram (+) Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes e Paenibacillus sp. No entanto essa própolis apresentou menor atividade contra bactérias Gram (-) como Escherichia coli. Além disso, essa própolis também mostrou atividade antibacteriana contra S. aureus resistente à meticilina (MRSA).
3.1.4.2. Atividade Antioxidante
Antioxidante é um termo amplamente utilizado na sociedade atual, e pode ser definido como substância que impede a oxidação de outras substâncias químicas por ação do oxigênio (HUANG et al., 2005) e segundo a ANVISA é definida como substância que retarda o aparecimento de alterações oxidativas no alimento, enquanto a FDA define como substâncias utilizadas para preservar alimentos através do retardamento da deterioração, rancidez e descoloração decorrentes da autoxidação.
Esta atividade está relacionada com compostos capazes de proteger um sistema biológico contra os efeitos danosos de processos ou reações que causam oxidação excessiva, envolvendo espécies reativas de oxigênio (ARNAO, 2000). Na área de alimentos os
antioxidantes são amplamente utilizados por conferirem características organolépticas e permitem preservar a qualidade nutricional dos produtos.
Os antioxidantes podem ser diferentes substâncias (vitaminas, minerais, pigmentos naturais, polifenóis e enzimas), que bloqueiam os efeitos dos radicais livres, sendo considerada importante para prevenir a reduzir as enfermidades crônicas (OU et al., 2002). Diversos estudos sugerem que os compostos presentes na própolis auxiliam na prevenção de doenças crônicas, como alguns tipos de câncer (CHAN et al., 2013; KIMOTO et al., 2001; WATANABE et al., 2011), distúrbios metabólicos, doenças inflamatórias e enfermidades neurodegenerativas (HUANG et al., 2007; LAN et al., 2016; SZLISZKA et al., 2013; WANG et al., 2014).
A atividade antioxidante da própolis tem sido atribuída aos flavonoides, principalmente flavonol: quercetina, caemferol, ramnetina, quercetina dimetil ester, galangina, apigenina e crisina (BARBARIĆ et al., 2011; BUSCH et al., 2017; ESPINOSA et al., 2015; PARK et al., 2015). No entanto, os ácidos fenólicos, ácidos diterpenos, terpenoides, também tem demostrado capacidade antioxidante (ALENCAR et al., 2007; MACHADO et al., 2016; PARK et al., 2002). Diversas metodologias analíticas têm sido empregadas para determinar a capacidade antioxidante da própolis (BANKOVA et al.,2017). No entanto, não existe um método oficial padronizado e, portanto, é recomendável testar com diferentes métodos de medição e com várias condições de reação (FRANKEL; MEYER, 2000).
De acordo HUANG et al. (2005), os ensaios utilizados para medir a capacidade antioxidante são basicamente classificados em dois grupos, dependendo do mecanismo de reação: métodos baseados na transferência de átomos de hidrogênio e métodos baseados na transferência de elétrons. Na maioria dos ensaios baseados na transferência de átomos de hidrogênio, a reação é um processo competitivo, no qual o antioxidante e o substrato competem por radicais peroxilos gerados termicamente por meio da decomposição de compostos azoicos (ZULUETA et al., 2009). Os ensaios baseados na transferência de elétron medem a capacidade de um antioxidante reduzir um oxidante, que muda de cor quando reduzido, sendo que o grau de mudança de cor está correlacionado com a concentração de antioxidante na amostra (HUANG et al., 2005; ZULUETA et al., 2009).
Segundo DÁVALOS et al. (2004) o ensaio de ORAC (capacidade de absorção de radical oxigênio), atua capturando o radical peroxila, gerado pela decomposição de AAPH [dicloreto de 2,2’azobis (2-amidinopropano)] na presença de oxigênio atmosférico, reagindo com um indicador fluorescente formando um produto não fluorescente. Na presença de antioxidantes, a fluorescência é preservada. A atividade antioxidante é determinada pela redução da fluorescência (excitação a 485 nm e emissão a 520 nm).
De acordo com OU et al. (2002), no ensaio FRAP, ocorre a redução do ferro, na presença de antioxidantes que atuam como doadores de elétron. O complexo Fe3+-TPTZ [2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina] é reduzido a Fe2+-TPTZ, gerando uma mudança de coloração de azul clara para azul escuro. A atividade antioxidante é medida pelo aumento de absorbância a 593 nm.
De acordo com GÓMEZ-GUILLÉN et al. (2010) no ensaio de ABTS+ o radical ABTS+ (ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico) é estabilizado na presença de antioxidantes doadores de hidrogênio, apresentando uma mudança de cor de verde escura para verde clara. A atividade antioxidante é medida pela redução de absorbância a 734 nm.
O ensaio de eliminação de radicais de DPPH é um dos ensaios mais utilizados para avaliar a capacidade antioxidante em amostras de própolis (BANKOVA et al., 2016). DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) é um radical livre estável que reage com compostos que podem doar um átomo de hidrogênio. Este método baseia-se na eliminação da DPPH através da adição de uma espécie radical ou de um antioxidante que causa a descoloração da solução de DPPH. A atividade é estimada pela diminuição da absorbância em 517 nm gerada pela mudança de coloração violeta para amarela (SHARMA; BHAT, 2009).
ALENCAR et al. (2007), estudaram a própolis vermelha, coletada na região de Alagoas-Brasil. A fração de hexano apresentou a maior concentração de flavonoides totais, demonstrando a melhor atividade sequestrante para o DPPH de radicais livres.
ANDRADE (2017) determinou os compostos bioativos presentes nas própolis brasileira (marrom verde e vermelha) e avaliou a atividade antioxidante pelos métodos DPPH, ABTS+, FRAP e ORAC. Os resultados revelaram elevado potencial antioxidante na própolis vermelha, e uma positiva correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante de
FRAP e ORAC. O autor concluiu que os compostos fenólicos são responsáveis da atividade antioxidante da própolis.
NYAKAYAMA (2004) analisaram própolis de várias origens geográficas e verificaram que os extratos etanólicos de própolis da Austrália, China, Hungria e Nova Zelândia possuem alta atividade de sequestro do radical livre DPPH, enquanto os EEP da China, Argentina, Chile e Hungria demonstraram alta atividade pelo método de β-caroteno (peroxidação lipídica). A atividade sequestrante do composto puro artipilin C, foi em torno de 80%. Da mesma forma, o éster fenólico do ácido caféico (CAPE) isolado de própolis de climas temperados, tem se mostrado um potente inibidor de radicais livres (OZGUNER et al, 2005).
BANSKOTA et al. (2000) observaram que extratos aquosos de própolis do Brasil e da China, apresentaram atividade sequestradora de radicais livres contra o 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) maior que os extratos metanólicos, enquanto extratos metanólicos de própolis da Suécia e Peru exibiram forte atividade sequestradora de radicais livres contra o DPPH. Os mesmos resultados foram obtidos para própolis de Argentina. MORENO et al. (2000). Observaram forte atividade sequestradora contra DPPH em própolis de Tucumán e Santiago.
Estudos realizados por PARK et al. (2000) mostraram que amostras de todos os grupos de própolis analisados apresentam atividade antioxidante acima de 80%, exceto o Grupo 10 (Ceará) que apresentou atividade menor que 80% e o Grupo 9 (Pernambuco) que não apresentou atividade antioxidante. A atividade antioxidante foi analisada pelo método da oxidação acoplada do β-caroteno e ácido linoléico.
3.1.4.3.Atividade Anti-inflamatória
A atividade anti-inflamatória da própolis é bastante reconhecida, principalmente contra doenças do sistema muscular-articular e outros tipos de inflamações, infecções, reumatismos e torções (MARCUCCI, 1994). As pesquisas têm se focado no metabolismo da galangina e o éster fenetil do ácido caféico, ácido araquidônico compostos identificados como componentes majoritários da própolis. Estes últimos apresentaram inibição do desenvolvimento da inflamação induzida por uma ampla variedade de agentes patogênicos (BORRELLI et al., 2002; DOBROWOLSKI et al., 1991).
BUENO-SILVA et al. (2013), estudaram a própolis vermelha do Brasil, e avaliaram as atividades anti-inflamatórias e antimicrobianas dos compostos neovestitol e vestitol isolados da própolis vermelha brasileira. Os resultados mostraram que neovestitol, vestitol e EEP inibiram a migração de neutrófilos em uma dose de 10 mg/kg. A atividade antimicrobiana foi avaliada contra Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Staphylococcus aureus e Actinomyces naeslundii, e foi observado que o neovestitol apresenta uma capacidade mínima inibitória nas faixas de <6,25 a 25-50 μg/mL e a capacidade bactericida mínima de 25-50 a 50-100 μg/mL, enquanto o vestitol apresentou uma capacidade mínima inibitória variando de 25 a 50 a 50-100 μg/mL e capacidade bactericida mínima de 25-50 a 50-100 μg/mL. Ambos os compostos bioativos foram eficazes nos testes anti-inflamatórios e antimicrobianos.
ADELMANN (2005) menciona que metabólitos do ácido araquidônico exercem uma variedade de atividades biológicas, atuando como moduladores de várias doenças imunológicas e inflamatórias, já que as prostaglandinas têm papel fundamental no processo inflamatório. Vários estudos têm comprovado que os metabólitos da ciclooxigenase modulam a proliferação celular, em crescimento de tumores e respostas imunes, enquanto que os metabólitos da lipoxigenase podem influenciar em várias respostas biológicas incluindo quimiotaxia, secreção de hormônios, transporte de íons, estímulo de adesão de células tumorais, desenvolvimento de tumores e regulação do potencial metastático de células tumorais. Deste modo, vários estudos estabelecem os metabólitos do ácido araquidônico como moduladores de patogênese de várias doenças imunológicas e inflamatórias (RAO et al., 1995). SUD’INA et al. (1993) demonstraram que o CAPE, um composto ativo nos extratos de própolis, contribui para a atividade anti-inflamatória da própolis in vivo por inibir a lipoxigenase e por agir como um antioxidante. Sequencialmente ROSSI et al. (2002) relataram que os extratos etanólicos de própolis inibem também a atividade da ciclooxigenase em pulmão de ratos de forma dose-dependente, além disso, entre os compostos isolados testados apenas o CAPE e a galangina tiveram efeito, sendo o primeiro mais eficaz que o segundo.
PARK et al. (2000) estudaram a atividade anti-inflamatória das própolis brasileiras e encontraram que amostras dos grupos 3, 5 e 6 (Paraná), 7 (Bahia), 8 (Pernambuco) e 12 (São Paulo) apresentaram alta atividade quando comparadas com os grupos 1 e 2 (Rio Grande do Sul), 4 (Paraná), 9 (Pernambuco), 10 (Ceará), e 11 (Piauí). Algumas própolis do Brasil e
China foram estudadas e demonstraram possuir efeito anti-inflamatório, sendo que os extratos etanólicos se apresentaram mais potentes que os extratos aquosos. Além disso, foi demonstrado que o método enzimático, utilizando a medida da atividade de hialuronidase, foi superior ao método físico-químico (MIYATAKA et al., 1997).
3.1.4.4. Atividade Antitumoral
Diversos estudos sobre a toxicidade e atividade antitumoral da própolis têm sido descritos na literatura (BURDOCK, 1998;CHAN et al., 2013; CONTI et al., 2013). Os ensaios clínicos realizados mostram que existe uma ação sinérgica entre as atividades biológica e também com a medicação da quimioterapia convencional assim como: atividade antitumoral, proteção do DNA, remoção dos radicais livres, estimulação do sistema imune (MIDORIKAWA et al., 2001; NAGAI et al., 2003; NOVAK et al., 2014).
NOUREDDINE et al. (2017) estudaram a composição química, a atividade antiproliferativa e proapoptótica de própolis do Líbano sobre o ciclo celular em células T leucêmicas de Jurkat, células de glioblastoma U251 e células de MDA-MB-231 de adenocarcinoma de mama. A análise da cromatografia líquida em espectrometria de massa em tandem (LC-MS / MS) revelou o ácido ferúlico, a crisina, a pinocembrina e a galangina como constituintes principais da própolis libanesa. Foi observada redução da viabilidade celular nas células Jurkat expostas ao extrato etanólico e à fração de hexano, enquanto a viabilidade das células U251 e MDA-MB-231 só foram afetadas após a exposição à fração de hexano; as outras frações (fase aquosa, cloreto de metileno e acetato de etilo) não tiveram efeito. O efeito tóxico máximo foi obtido quando as células de Jurkat foram cultivadas com 90 μg/ml tanto do extrato bruto quanto da fração de hexano.
Ácido fenil éster caféico (CAPE), isolado de própolis do álamo mostraram efeito inibitório em células de leucemia humana HL-60 por indução de apoptose (NOVAK et al., 2014) e atividade de citotoxidade de células tumorais (ORŠOLIĆ; BAŠIĆ, 2003;ORŠOLIĆ et al., 2004). A atividade anti-proliferativa de própolis do álamo chinês foi confirmada e dois novos flavonoides foram identificados 2-metil butiroil pinobanksina e 6-cinamil crisina (USIA et al., 2002).
As própolis brasileira obtidas de Baccharis dracunculifolia foram identificados os compostos ácido prenil ρ-cumárico, clerodane, diterpenos e benzo furanos que apresentam
atividade anti-tumoral. O composto propolin C induziu a apoptose em células de melanoma humano (CHEN, 2004). Baccharin e drupanin foram isoladas da própolis brasileira e foi mostrado que elas são potentes supressoras de células tumorais (MISHIMA, 2005). Na própolis vermelha cubana foi identificado o prenil benzofenonas e na própolis de Taiwan foi encontrado prenil flavonas como compostos com atividade da apoptose celular (BANKOVA, 2005b).O Artepilin C, principal composto achado na própolis brasileira, mostrou atividade de indução daapoptose e supressão do crescimento tumoral (SANTOS et al., 2014). A apoptose de células leucêmicas humanas induzidas com artepilin C foi amplamente estudada. KIMOTO, (2001) observou que artepilin C apresentou propriedade protetora contra carcinogênese pulmonar e citotoxicidade para células tumorais. ALENCAR et al. (2007), estudou a propriedades biológicas da própolis vermelha de origem brasileira, os resultados mostraram a atividade citotóxica para as células tumorais com uma IC50 de 7,45 μg/mL.
3.1.4.5. Atividade Anti-HIV e herpes
O síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), o vírus da imunodeficiência humano (HIV), e o vírus da herpes são infecções crônicas que se espalham de forma eficiente e silenciosa como enfermidades de transmissão sexual (NOLKEMPER et al., 2010). Existem muitos avanços no tratamento destas doenças. O mecanismo putativo de ação de agentes anti-HIV de plantas foi descrito (COS et al., 2004). Diversos estudos utilizaram as própolis como fonte para identificar compostos capazes de inibir ou até mesmo eliminar os vírus causadores (GEKKER et al., 2005; ITO et al., 2001). Compostos químicos isolados da própolis brasileira com triterpenóides (ácido morônico e meliferone) mostraram atividade promissora anti-HIV, indicando que a expressão viral pode ser suprimida até um máximo de 98% in vitro usando a própolis (ITO et al., 2001).
GEKKER et al. (2005) estudaram a atividade anti-HIV-1 do própolis em linfócitos CD4 + e culturas de células micróglias. Os resultados mostraram uma inibição máxima de 85 a 98% em 66,6 μg/mL de própolis em culturas de células CD4 + e micróglias, respectivamente. O efeito citotóxico e anti-herpético dos extratos de própolis contra HSV-2 foi analisado em cultura celular. Os resultados revelaram uma citotoxicidade moderada em Células RC-37. A concentração inibidora de 50% (IC50) de extratos de própolis aquosos e etanólicos inibiu em 0,0005% e 0,0004% a formação de placa de HSV-2 e a capacidade de
