TRABALHO DE TESE
O polimorfismo genético intraespecífico e o comportamento
biológico da infecção por Leishmania braziliensis.
Rosana Santos Sousa
Salvador - Bahia 2012
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
Rosana Santos Sousa
O polimorfismo genético intraespecífico e o comportamento
biológico da infecção por Leishmania braziliensis.
Salvador - Bahia 2012
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia, do Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Imunologia. Orientador: Prof. Dr. Nicolaus Albert B. Schriefer
Ficha Catalográfica elaborada pela BUS – Biblioteca Universitária de Saúde da UFBA
S725 Sousa, Rosana Santos
O polimorfismo genético intraespecífico e o comportamento
biológico da infecção por Leishmania braziliensis / Rosana San- tos Sousa, 2012.
111 f. : il.
Orientador: Prof. Dr.Albert Schriefer.
Tese (doutorado) – Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde, 2012.
1. Leishmaniose tegumentar americana. 2. Polimorfismo genético. 3. Leishmania braziliensis. 4. Microarranjo de DNA. I.Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde. II. Schriefer, Albert. III. Título.
Dedico a Deus por me conceder mais essa importante vitória e por me dar a oportunidade de viver essa trajetória, de ter desafios e poder crescer nessa vida cheia de obstáculos.
A minha mãe, Dalva, minha razão de viver, meu pai, José, minha irmã Simone. Minha família que tanto amo.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Nicolaus Albert B. Schriefer, pela aceitação no seu grupo de pesquisa, pela valiosa orientação e competência particular frente a este trabalho. Obrigada pela troca de idéias e de conhecimento, despertando em mim a vontade de trabalhar com pesquisa e fazer ciência. Minha admiração e respeito eternos.
Ao Prof. Edgar Marcelino de Carvalho, chefe do Serviço de Imunologia (SIM), pela oportunidade oferecida para a realização desse trabalho e pela disponibilidade e apoio em atividades desenvolvidas no seu laboratório.
Aos médicos do Serviço de Imunologia que trabalham na área endêmica de Corte de Pedra, pela geração de matéria-prima para os experimentos.
A Dra. Mary Wilson, por disponibilizar o seu Laboratório para a realização dos experimentos de Microarranjos de DNA e pela estimada discussão dos resultados obtidos.
Aos voluntários que participaram do estudo pelo sangue doado, fornecendo as células utilizadas nos experimentos.
Aos meus colegas do SIM, que me ajudaram de alguma maneira na construção deste trabalho, em especial a Kátia Salgado e Angela Giudice, pela expertise no manejo com os parasitos e macrófagos. Obrigada pelo apoio, incentivo e agradável convivência.
Aos amigos Angela Giudice, Anselmo Souza e Thaís Delavechia, pela ajuda, pelo carinho e pela amizade construída a partir da convivência iniciada no laboratório, pela parceria na vida e pelos bons momentos de risadas compartilhados.
As alunas de Mestrado Viviane Magalhães, pela valiosa ajuda na reta final dos experimentos, Juliana Almeida, Lilian Medina e Silvana Silva pela alegria trazida ao convívio no Laboratório.
A minha turma de Doutorado pelos momentos de construção do conhecimento. Aos professores do Programa de Pós-graduação em Imunologia – PPGIm, pela preciosa contribuição para o crescimento do conhecimento.
As secretárias do PPGIm, Dilcéa Reis, Sonia Costa e Juciara Nascimento pelo auxílio em nossos interesses acadêmicos.
Aos meus colegas de profissão e amigos de trabalho pela colaboração durante o desenvolvimento deste projeto.
APOIO FINANCEIRO
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Parasitologia molecular do Serviço de Imunologia do Hospital Universitário Prof. Edgard Santos – HUPES / Universidade Federal da Bahia
Apoio Financeiro NIH R03AI067663-02 NIH P50-AI30639-16
(...) Todo recomeço Toda boa intenção Toda idéia nova Todas as noites que eu não dormi Toda nova informação Tantas saudades do que ainda não vivi Vencer os contratempos Passar mais tempo juntos Consciência e paciência Intensas modificações E a mais completa certeza De que tudo vai dar certo! (Rogério Flausino, Jota Quest)
RESUMO
Diferentes espécies do gênero Leishmania podem ser associadas com as diferentes formas de doença, evidenciando a contribuição do conteúdo genético do parasito sobre as manifestações clínicas e o prognóstico das infecções. A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é caracterizada por um amplo espectro de manifestações clínicas e imunológicas, que envolve a pele e mucosas. Três formas diferentes de LTA resultantes da infecção humana por Leishmania braziliensis - Leishmaniose Tegumentar Localizada (LC), Leishmaniose Cutâneo-Mucosa (LM) e Leishmaniose Disseminada (LD) - podem ser encontradas simultaneamente em Corte de Pedra, área endêmica de L. braziliensis no estado da Bahia. Estudos prévios indicaram que subpopulações (clados) de L. braziliensis geneticamente distintas foram associadas com diferentes tipos clínicos de infecção, sugerindo um alto grau de polimorfismo fenotípico e genético intraespecífico. Leishmania reside preferencialmente em macrófagos nos hospedeiros mamíferos. Nossa hipótese é que L. braziliensis de diferentes clados induzem perfis de expressão gênica distintos nos macrófagos infectados do hospedeiro, que favorecem a sua sobrevivência e que levariam aos vários desfechos clínicos de LTA. Este estudo visa avaliar se cepas pertencentes a subtipos diferentes de L.
braziliensis de Corte de Pedra causam padrões distintos na expressão gênica
de macrófagos após infecção. A infecção in vitro de macrófagos derivados de monócitos (MDM) humanos de doadores sadios foi realizada em paralelo por quatro horas com L. braziliensis de cada um dos diferentes clados - A, B e C, os quais estão associados com LD, LC e LM respectivamente. Utilizando a técnica de microarranjo de DNA, comparamos os padrões globais de expressão gênica entre os macrófagos infectados pelas diferentes cepas e os não infectados. Foram avaliados os níveis de expressão de 47.000 transcritos de sequências funcionalmente caracterizadas de 6.500 genes do genoma humano e os nossos resultados indicam que a maioria dos transcritos permaneceu inalterada e entre os transcritos significativamente alterados (cerca de 500), houve uma repressão causada por todos os isolados de L.
braziliensis no estágio precoce da infecção. Dentre os transcritos para genes
dramaticamente reprimidos temos os que codificam proteínas associadas com funções celulares importantes, como propagação de estímulos, apoptose e metabolismo oxidativo mitocondrial. Poucos transcritos de genes que codificam proteínas envolvidas na resposta ao estresse tiveram a sua expressão induzida. As diferenças entre os três isolados de L. braziliensis foram observadas na magnitude da alteração do que no tipo de transcrito envolvido e de uma maneira geral os isolados derivados das formas metastáticas da doença (LD e LM) induziram uma maior magnitude de repressão do que o isolado proveniente da forma LC. Os achados sugerem que a L. braziliensis estimula a sua sobrevivência através de modulação negativa de genes importantes das MDM do hospedeiro durante o processo de infecção, e que as cepas destinadas à disseminação exercem uma mais profunda repressão do que cepas que permanecem próximas ao sítio cutâneo de inoculação, reforçando a distinção genética entre as formas clínicas de doença.
Palavras-chave: Leishmaniose Tegumentar Americana, polimorfismo genético,
ABSTRACT
Different species from the genus Leishmania have been found to be associated with different forms of leishmaniasis – an observation which highlights how variations in genetic content among these parasites can inform expected clinical outcome of infections. American cutaneous leishmaniasis (ACL) is characterized by a broad spectrum of clinical and immunological manifestations, including involvement of the skin and mucous membranes. Three different forms of ACL result from human infection with Leishmania braziliensis - localized cutaneous leishmaniasis (CL), mucocutaneous leishmaniasis (ML) and disseminated leishmaniasis (DL) - have been found simultaneously in Corte de Pedra, an endemic area of L. braziliensis in the state of Bahia, Brazil. Previous studies indicated that subpopulations (clades) of L. braziliensis were genetically distinct and associated with different types of clinical infection and it suggests that, within the species, there exists a high degree of phenotypic and genetic polymorphisms. Intracellular parasites such as Leishmania selectively reside into macrophages in mammalian hosts. Our hypothesis is that L.
braziliensis from different clades induce distinct gene expression profiles in
macrophages of the infected host, promoting their survival and ultimately leading to the various clinical outcomes of ACL. This study aims to evaluate whether strains belonging to different subtypes of L. braziliensis from Corte de Pedra cause distinct patterns of gene expression in macrophages after infection. An in vitro infection of monocyte-derived macrophages (MDM) from healthy, human donors was performed in parallel for four hours with L.
braziliensis from each of the different clades - A, B and C, which are associated
with DL, CL and ML, respectively. Using the technique of DNA microarray, we compared global patterns of gene expression between macrophages infected by different strains to uninfected macrophages. We assessed the expression levels of 47,000 transcripts sequenced from 6,500 functionally characterized genes of the human genome and our results indicate that the majority of transcripts remained unchanged. Of the transcripts significantly altered (500), there was a suppression caused by all cells infected with L. braziliensis during the early stage of infection. Among the transcripts for genes that were strongly suppressed were those encoding proteins associated with important cellular functions, such as propagation of stimuli, apoptosis and mitochondrial oxidative metabolism. A few transcripts of genes encoding proteins involved in the response to stress were noted to have expression induced. Differences between the three strains of L. braziliensis were observed more in the magnitude of change than in type of transcript involved. In general, isolates derived from metastatic forms of the disease (ML and DL) induced a suppression of greater magnitude than those isolated from the CL form. The findings suggest that L. braziliensis stimulates its survival through down regulation of important genes in host MDM during infection. Likewise, strains with metastatic qualities exert a more profound suppression than strains which remain close to the site of skin inoculation, further emphasizing the genetic distinction among different clinical forms of disease.
Keywords: American Tegumentary Leishmaniasis, genetic polymorphism,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Carga parasitária em MDM infectados por quatro horas, na razão
de 2 parasitos para cada macrófago. 48
Figura 2. Mudanças globais na expressão gênica em macrófagos infectados
com L. braziliensis de diferentes clados. 54
Figura 3. Avaliação por RT-qPCR das expressões de alguns genes que se
mostraram reprimidos ao microarranjo de DNA. 60
Figura 4. Avaliação por RT-qPCR das expressões de alguns genes que se
mostraram induzidos ao microarranjo de DNA 61
Figura 5. Perfis de expressão gênica dos MDM infectados com L.
braziliensis representantes dos clados A, B e C de Corte de Pedra/Ba
obtidos por avaliação da expressão gênica global com microarranjo de DNA 62 Figura 6. Análise de agregação mostrando que macrófagos infectados com isolados de L. braziliensis dos clados A e C apresentam comportamentos
semelhantes nas suas expressões gênicas. 63
Figura 7. Expressão dos genes LRRK2, TLR8, MT1M e HSPA1A avaliada por RT-qPCR em MDM infectados em paralelo com três isolados de L.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Alguns genes de macrófagos derivados de monócitos humanos cuja expressão foi significativamente alterada pela infecção com L.
braziliensis dos clados A, B e C de Corte de Pedra – Ba.
50
Tabela 2. Mudanças na expressão de 10 transcritos em MDM infectados por isolados de L. braziliensis pertencentes a cada clado (A, B ou C). Comparação dos resultados entre os microarranjos de DNA e o RT-qPCR. 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP Adenosina 5’-trifosfato CD4 Marcador de diferenciação 4 CD8 Marcador de diferenciação 8
cDNA DNA complementar
Células Th1 Linfócitos T auxiliares do tipo 1 Células Th17 Linfócitos T auxiliares do tipo 17 Células Th2 Linfócitos T auxiliares do tipo 2
CMSP Células mononucleares do sangue periférico
CO2 Gás carbônico
CR1 Receptor de Complemento 1
CR3 Receptor de Complemento 3
CSF Fator Estimulador de Colônia CTP Nucleosídeo Trifosfato de citidina
DALY Anos de Vida Perdidos Ajustados por Incapacidade
(Disability Adjusted Life of Years)
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico DNase I Desoxirribonuclease I
GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GM-CSF Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos e Monócitos gp63 Glicoproteína 63 de superfície da Leishmania
HBSS Solução salina balanceada de Hank
HEPES 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico
IFN-γ Interferon gama
IL-10 Interleucina 10 IL-12 Interleucina 12
IL-1β Interleucina 1 fração beta IL-23 Interleucina 23
IL-4 Interleucina 4
iNOS Óxido nítrico sintase, isoforma indutível
Jak Janus quinase
kDNA Ácido desoxirribonucléico de cinetoplasto
LC Leishmaniose cutânea localizada
LD Leishmaniose disseminada
LIT Meio de cultura com infusão de fígado e triptose
LM Leishmaniose mucosa
LPG Lipofosfoglicano
LTA Leishmaniose tegumentar americana MDM Macrófago derivado de monócito
mL Mililitro
mRNA RNA mensageiro
µg Micrograma
µL Microlitro
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NF-κB Fator nuclear kappa B
ng Nanograma
NK Liinfócito T Natural killer
NNN Meio de cultura de Nicolle, Novy e McNeal
NO Óxido nítrico
NO2¯ Dióxido de nitrogênio – Nitrito
NO3¯ Nitrato
O2 Oxigênio
O2¯ Ânion superóxido
OMS Organização Mundial da Saúde
qPCR Reação em cadeia da polimerase em tempo real
RNA Ácido ribonucléico
ROS Espécies reativas do oxigênio RPMI Meio de cultura de células
RT-qPCR Reação de transcriptase reversa seguida de PCR em tempo real
SDS Dodecil sulfato de sódio
SFM Sistema Fagocítico Mononuclear
STAT Transdutor de sinal e ativador de transcrição TGFβ Fator transformador de crescimento beta
TLR Toll like receptor
TNF Fator de necrose tumoral
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – Leishmaniose 18
1.2 – O Agente etiológico 19
1.3 – Epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar 21
1.4 – Transmissão e Ciclo biológico 23
1.5 – Aspectos Clínicos e Imunológicos da Leishmaniose Tegumentar 25
1.6 – O hospedeiro. 28
1.7 – Microarranjo de DNA 33
1.8 – Microarranjo de DNA e Leishmania 35
2 – HIPÓTESE 37
3 – OBJETIVOS
Geral 38
Específicos 38
4 – JUSTIFICATIVA 39
5 – DESENHO DE ESTUDO E MÉTODOS 40
Aquisição dos isolados parasitários 40
Recrutamento de voluntários e critério de inclusão e exclusão 40 Infecção de macrófagos humanos derivados de monócitos do sangue periférico (MDM)
41 Avaliação dos perfis globais de expressão / repressão gênica nas células infectadas com diferentes cepas de L. braziliensis por microarranjo de DNA
42
Validação dos resultados dos microarranjos por qPCR de alvos selecionados dentre os transcritos significativamente afetados pelas infecções 44 Análise estatística 46 6 – RESULTADOS 48 7 – DISCUSSÃO 65 8– CONCLUSÕES 72 9 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 73 ANEXOS
Artigo - Effects of Leishmania braziliensis on macrophage gene expression: differences between strains associated with distinct clinical outcomes
1. INTRODUÇÃO
1.1. Leishmaniose
Leishmaniose e suas variantes constituem um grupo de enfermidades que acometem o homem, causadas por várias espécies de protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. Dependendo da espécie infectante envolvida e de outros fatores associados, como a imunidade do hospedeiro, pode se manifestar com eventos clínicos bastante heterogêneos, que variam desde lesões brandas que se curam espontaneamente até lesões destrutivas ou desfigurantes em pele, caracterizando a forma cutânea da doença, ou mesmo disseminar de modo sistêmico pelos órgãos como o fígado, o baço e a medula óssea, consistindo na forma visceral, assumindo assim uma maior gravidade (GRIMALDI JR e col., 1993; CHANG e col, 1999).
Estima-se que aproximadamente 2 milhões de novos casos, entre eles 1,6 milhões de casos de leishmaniose cutânea e 500.000 de leishmaniose visceral, ocorram anualmente no mundo inteiro, resultando em mais de 70.000 mortes, predominantemente pela forma mais grave (visceral), com cerca de 12 milhões de pessoas infectadas (MURRAY e col, 2005; OMS, 2012). Do total de casos de leishmaniose cutânea, 90% ocorrem em apenas oito países: Afeganistão, Argélia, República Islâmica do Irã, Arábia Saudita, Sudão e República Árabe Síria no Velho Mundo, Brasil e Peru no Novo Mundo (SCHALLIG e col, 2002; DESJEUX, 2004; OMS, 2012).
A forma de doença cutânea, ou leishmaniose tegumentar, é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) entre as seis doenças infecto-parasitárias de maior importância em saúde pública, pelo seu alto coeficiente de detecção e capacidade de produzir deformidades, acometendo as regiões tropicais e subtropicais do planeta. Durante os últimos 10 anos, as regiões endêmicas foram se expandindo, proporcionando um aumento acentuado no número de casos registrados da doença. No entanto, historicamente, o impacto deste agravo vem sendo subestimado, e um número substancial de casos é perdido devido à ausência do registro da informação nos sistemas e órgãos
públicos de saúde ou mesmo pelo fato da notificação da doença ser obrigatória em apenas 32 dos 88 países afetados (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
Tal como acontece com muitas doenças endêmicas, que causam alta morbidade, mas baixa mortalidade, a verdadeira importância da leishmaniose permanece em grande parte despercebida, sobretudo porque as pessoas mais afetadas vivem em áreas remotas e o estigma social associado às deformidades e cicatrizes desfigurantes causadas pela doença mantém os pacientes recolhidos. As deficiências e danos relacionados com a doença contribuem para a morbidade associada com a leishmaniose, que através da OMS é dada por um indicador o DALY (Disability Adjusted Life of Years – Anos de Vida Perdidos Ajustados por Incapacidade), cujo índice atualmente se situa em 2,4 milhões. As leishmanioses, portanto, são doenças negligenciadas, que levam a importante redução da produtividade econômica das regiões do país, sendo necessário investir em ações que estejam voltadas para o diagnóstico precoce e tratamento dos casos detectados, e estratégias de prevenção adequadas para o melhor controle da doença diminuindo, assim, os prejuízos gerados e o impacto em saúde pública (DESJEUX, 2004; REITHINGER e col., 2007; OMS, 2012).
1.2 O agente etiológico
O gênero Leishmania pertence à família Trypanosomatidae da qual fazem parte outros membros com semelhante importância médica no que se refere à ocorrência de doença em humanos, como o Trypanosoma cruzi. A primeira observação deste agente etiológico foi feita por Cunninghan em 1885 na Índia. Em 1903, Ross criou o gênero e chamou o parasito de Leishmania
donovani (OUMEISH, 1999; AWASTHI e col, 2004; BASANO e col, 2004). Na
América do Sul, os primeiros relatos de doença cutânea foram feitos em 1909 por Lindenberg, que encontrou o parasito em lesões de indivíduos que trabalhavam em áreas de desmatamentos na construção de rodovias em São Paulo (OUMEISH, 1999; BASANO e col, 2004). No Brasil, Gaspar Vianna em
1911 considerou o parasito diferente da espécie identificada no Velho Mundo e a nomeou Leishmania braziliensis de forma que até a década de setenta todos os casos de leishmaniose eram atribuídos a esta espécie. Com o desenvolvimento das técnicas de análise observou-se a descrição de outras espécies e associação com a doença (OUMEISH, 1999; BASANO e col, 2004).
Considerando a sua morfologia, as espécies do gênero Leishmania apresentam um único flagelo responsável pela locomoção e uma única mitocôndria, que contém uma significante quantidade de DNA e forma uma estrutura chamada cinetoplasto. Por essa razão, esses parasitas pertencem à ordem Kinetoplastida (GRIMALDI e col, 1993; BRINGAUD e col, 1998). A leishmania é um parasito digênico, ou seja, as espécies apresentam duas formas evolutivas principais: a promastigota, forma flagelada, móvel, extracelular e mais frequentemente encontrada no hospedeiro invertebrado, e a amastigota, forma intracelular aflagelada, que pode ser vista nos tecidos dos hospedeiros vertebrados (homem e outros mamíferos suscetíveis) (GRIMALDI
e col, 1993; DE ALMEIDA e col, 2003). É um parasito diplóide e assexuado,
tendo basicamente como forma de reprodução a clonal, onde seu genótipo se propaga de forma total entre os descendentes (BANULS e col, 1999). Isto fortalece a existência de uma grande diversidade específica e intraespecífica, embora não se exclua totalmente a possibilidade de eventos de recombinação sexual (CUPOLILLO e col, 1998; BANULS e col, 1999; ISHIKAWA e col, 2002, SCHRIEFER e col, 2004; IVES e col, 2011).
Uma das características mais marcantes apresentadas pelo gênero
Leishmania, em comparação com os outros gêneros que fazem parte da família Tripanosomatidae, é a grande diversidade de espécies. Desde a descrição
desses parasitos, o número de espécies identificadas vem crescendo continuamente e, desde então, vários esquemas de classificação taxonômica vêm sendo propostos (CUPOLILLO e col, 1998). As espécies até então reconhecidas e associadas com doença em humanos no Velho Mundo pertencem aos complexos L. donovani (L. donovani e L. infantum), responsáveis pela leishmaniose visceral e L. aethiopica, L. major e L. tropica, responsáveis pela leishmaniose tegumentar. Já no Novo Mundo, estas estão
contidas em dois subgêneros: Leishmania e Viannia. As espécies pertencentes ao subgênero Leishmania são: L. (L) mexicana, L. (L) amazonensis, L. (L)
venezuelensis e L. (L) major símile. A L. infantum chagasi embora
anteriormente considerada como membro desse subgênero se destaca como responsável pela leishmaniose visceral, seguida pela L. (L) amazonensis, que é responsável pela leishmaniose cutânea (SILVEIRA e col, 2004; DANTAS-TORRES, 2006). As espécies que pertencem ao subgênero Viannia são: L. (V)
braziliensis, L. (V) peruviana, L. (V) guyanensis, L. (V) panamensis, L. (V) lainsoni, L. (V) naiffi, L. (V) colombiensis e L. (V) shawi (SILVEIRA e col, 2004).
Dentre as espécies do subgênero Viannia, a L. (V) braziliensis tem uma grande importância em nosso meio pelo seu alto grau de polimorfismo genético e fenotípico e pelo seu espectro de manifestações clínicas observadas na leishmaniose tegumentar (SARAVIA e col, 1998; CUPOLILLO e col, 2003; SCHRIEFER e col, 2004). A necessidade de se diferenciar e caracterizar as populações desses parasitos, com o objetivo de melhorar o diagnóstico e de determinar o prognóstico das infecções, tem estimulado o desenvolvimento de estudos voltados para esta finalidade (SINGH, 1997; BANUS e col, 1999).
1.3 Epidemiologia da leishmaniose tegumentar
A leishmaniose do Novo Mundo, ou leishmaniose tegumentar americana (LTA), distribui-se amplamente nas Américas, desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina, abrangendo todos os países exceto o Uruguai e o Chile. No Brasil, a doença é considerada uma das afecções dermatológicas de maior atenção, onde o número de casos tem crescido progressivamente durante os últimos 20 anos em praticamente todos os Estados. Surtos epidêmicos têm ocorrido nas regiões Sudeste, Centro-Oeste, Nordeste e, mais recentemente, na região Amazônica, estando associados ao processo predatório de colonização. Nos últimos anos, o Ministério da Saúde registrou média anual de 35 mil novos casos de LTA em nosso país (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). A incidência anual aumentou de 10,45 casos por 100.000 indivíduos em 1985 para 18,63 casos por 100.000 indivíduos em
2000 (OLIVEIRA e col, 2004). Cerca de 39% dos casos de LTA estão na região Nordeste, sendo a maioria deles pertencentes aos estados do Maranhão, Bahia e Ceará.
A distribuição da leishmaniose em nosso país sofreu mudanças no decorrer dos anos, pois durante muito tempo era considerada uma doença ocupacional de caráter rural que acometia apenas as pessoas que viviam ou trabalhavam no campo e, atualmente, vem aumentando progressivamente o relato de casos que surgem em áreas urbanas e periurbanas, estes atribuídos possivelmente a uma adaptação do inseto vetor a novos ambientes (OLIVEIRA
e col, 2004). Deste modo, as mudanças dos hábitos humanos associados a
alterações do meio ambiente têm contribuído para grandes impactos na prevalência e nos padrões de transmissão, já que os dados disponíveis até então sugerem que alguns dos parasitos e seus vetores possam adaptar-se às mudanças ecológicas como o desmatamento e a urbanização (CUPOLILLO e
col, 1998). As espécies de Leishmania consideradas de importância médica
apresentam características comuns de relevância epidemiológica que contribuem para a sua propagação como: (1) serem restritas às regiões tropical e subtropical do planeta; (2) apresentarem ciclos zoonóticos envolvendo animais selvagens e domésticos; (3) em sua maioria, infectam pessoas residentes em áreas rurais ou que tenham contato com áreas silvestres (CUPOLILLO e col, 1998; OLIVEIRA e col, 2004).
Há pelo menos 20 espécies distintas de Leishmania patogênicas para o homem. Nas Américas, são reconhecidas, até o momento, 11 espécies com importância médica causando a doença em humanos e oito espécies descritas somente em animais. No Brasil foram identificadas sete espécies que se encontram inseridas nos subgêneros Leishmania e Viannia, dentre as quais se destacam: L. (V) braziliensis, L. (L) amazonensis e L. (V) guyanensis. As espécies L. (V) lainsoni, a L. (V) naiffi, L. (V) shawi e L. (V) lindenberg foram encontradas em estados das regiões Norte e Nordeste (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
A L. (L) amazonensis é encontrada em áreas de florestas primárias e secundárias da Amazônia Legal, nos estados do Amazonas, Pará, Rondônia, Tocantins e Maranhão, e também nos estados das regiões Nordeste (Bahia), Sudeste (Minas Gerais e São Paulo), Centro-Oeste (Goiás) e Sul (Paraná) (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007; SILVEIRA e col, 2004).
A L. (V) guyanensis é encontrada principalmente em florestas de terra firme, em áreas que não se alagam no período de chuvas, aparentemente limitada à região Norte (Amapá, Amazonas, Pará, Roraima e Acre) e estendendo-se a outros países como as Guianas, Equador, Peru e Venezuela (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000 e 2007; BASANO e col, 2004).
A L. (V) braziliensis é a mais importante e prevalente espécie causadora de LTA no homem. É encontrada em praticamente todas as regiões endêmicas do Brasil, aparecendo desde o Norte até o Sul, em locais onde o ambiente encontra-se intensamente modificado, com áreas de colonização recente e presença de animais domésticos, bem como naqueles locais que ainda apresentem resquícios da Mata Atlântica (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000 e 2007).
1.4 Transmissão e ciclo biológico
A leishmaniose é uma doença zoonótica, cujo ciclo de vida do parasito acomete hospedeiros vertebrados e invertebrados. Entre os vertebrados, temos os reservatórios silvestres (marsupiais, tatu, tamanduá, dentre outros) e o cão como o reservatório do meio periurbano. O homem pode vir a adquirir a infecção quando se insere em um desses ambientes, e a transmissão acontece em decorrência da propagação do inseto vetor contendo o parasito em ambientes domiciliares e em áreas de peridomicilio. Os vetores da leishmaniose tegumentar são insetos denominados flebotomíneos, pertencentes ao gênero Lutzomyia no Novo Mundo, e Phlebotomus, no Velho Mundo, sendo tais insetos conhecidos popularmente como “mosquito palha”, “tatuquira”, “birigui”, entre outros, a depender de sua localização geográfica. No
Brasil, as principais espécies envolvidas na transmissão da LTA são: Lutzomyia
flaviscutellata, L. whitmani, L. umbratilis, L. intermedia, L. wellcomei e L. migonei (ASHFORD, 2000; DE ALMEIDA e col, 2003; BRASIL, MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2007).
O ciclo biológico de Leishmania se inicia quando as fêmeas dos flebotomíneos parasitadas inoculam formas promastigotas metacíclicas infectantes em um hospedeiro vertebrado suscetível durante seus repastos sanguíneos (AWASTHI e col, 2004). A saliva também inoculada parece exercer papel importante na infecção, através de diversos mecanismos dentre eles a quimiotaxia de macrófagos e monócitos ao local da picada (ROGERS e col, 2002). As formas metacíclicas que são inoculadas pelos flebotomíneos nos hospedeiros vertebrados ativam a via clássica do sistema Complemento sem sofrerem lise, explorando este mecanismo na facilitação da sua interiorização pelos macrófagos (BOGDAN e col, 1998; CHANG e col, 1999; SACKS, 2002). Os parasitos internalizados são capazes de resistir ao ataque de produtos derivados do oxigênio e radicais do nitrogênio, como o óxido nítrico, com o auxílio de moléculas próprias, como o lipofosfoglicano (LPG) e a glicoproteína gp63, que se encontram presentes na superfície de suas membranas (BOGDAN e col, 1998; DE ALMEIDA e col, 2003). À medida que o fagolisossomo é formado, os parasitos se transformam em amastigotas e passam a ser capazes de resistir ao ambiente ácido presente nesta organela. As formas amastigotas recém-transformadas passam a se multiplicar através de um processo de fissão binária e suas sucessivas divisões favorecem o rompimento da célula hospedeira, o que contribui para a liberação dos parasitos e para que macrófagos adicionais se tornem infectados, perpetuando assim a infecção do organismo hospedeiro (AWASTHI e col, 2004).
Por outro lado, a infecção do hospedeiro invertebrado ocorre quando o flebótomo ingere o sangue contendo as células infectadas com formas amastigotas ao realizar o seu repasto sanguíneo em um individuo infectado ou animal reservatório. No aparelho digestivo do inseto, as amastigotas se transformam em promastigotas, que se multiplicam intensamente e passam a colonizar o epitélio digestivo sob a forma de promastigota procíclica, e a faringe
sob a forma infectante metacíclica. Estas são extremamente móveis e se alojam em parte no aparelho bucal do inseto, a partir do qual serão inoculadas em animais vertebrados durante novos repastos sanguíneos (AWASTHI e col, 2004).
1.5 Aspectos clínicos e imunológicos da leishmaniose tegumentar
A doença em nosso meio apresenta-se como uma enfermidade bastante polimórfica, que acomete primariamente a pele e mucosas. O espectro de quadros clínicos pode ser associado a fatores relacionados à resposta imune do hospedeiro, à variabilidade das espécies de parasitos envolvidas e também a fatores ambientais. As três formas resultantes da infecção com L. (V)
braziliensis são: leishmaniose cutânea localizada (LC), leishmaniose mucosa
(LM) e leishmaniose disseminada (LD) (CARVALHO e col, 1994; CARVALHO e
col, 1995).
A leishmaniose cutânea localizada (LC) é a mais comum das formas de manifestação da LTA, podendo também ser causada por parasitos pertencentes ao subgênero Leishmania, além do Viannia. É caracterizada pela presença de uma ou poucas lesões em pele, que se iniciam no sítio de entrada das promastigotas infectantes após a picada do inseto vetor, sendo encontradas principalmente em áreas expostas do corpo como face, braços e pernas. Tais lesões podem ser acompanhadas de intensa adenopatia regional, apresentando-se ulceradas, com bordas elevadas e enduradas. (SILVEIRA e
col, 2004, SCHRIEFER e col, 2004). Os pacientes com LC geralmente
apresentam uma resposta imune do tipo Th1 frente aos antígenos de
Leishmania, o que se verifica pela produção de perfil característico de citocinas
e pela positividade ao teste cutâneo de resposta tardia, a intradermorreação de Montenegro. Esses pacientes apresentam níveis elevados de interferon-gama (IFN-γ), citocina que induz a ativação de macrófagos, e outros fagócitos com elevada atividade antimicrobicida para as formas amastigotas do protozoário (BACELLAR e col, 2002). O estudo histológico das lesões revela riqueza de linfócitos e plasmócitos, e escassez ou mesmo ausência de macrófagos e
parasitos. Quando a infecção não é controlada pelos mecanismos adaptativos da resposta imune celular, a doença pode evoluir para uma forma mais grave e em cerca de 4% dos casos ocorre associação com a leishmaniose mucosa (LM) (MARSDEN e col., 1983).
Na LC, sabe-se que a incapacidade de montar uma resposta imune celular eficaz está associada à evolução clínica e respostas terapêuticas menos favoráveis. Em pacientes imunocomprometidos, como na síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), a LC pode apresentar quadros clínicos atípicos, tendência à disseminação e má resposta aos esquemas medicamentosos usuais (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
A LM é uma doença desfigurante caracterizada por envolvimento da mucosa nasal, oral ou faríngea, concomitante à doença cutânea ativa ou iniciada meses a anos após a resolução da lesão primária em pele. Os indivíduos acometidos apresentam uma forte imunidade celular representada por intensa reação de hipersensibilidade do tipo tardia contra antígenos de
Leishmania, consistindo-se num pólo responsivo caracterizado pela produção
exacerbada das citocinas pró-inflamatórias TNF e IFN-γ. Este exagero na produção das citocinas do tipo Th1 está associado também a uma produção relativamente baixa de IL-10, citocina capaz de modular a resposta e inibir a ativação de macrófagos (CARVALHO e col, 1995; BACELLAR e col, 2002). A perfuração do septo nasal é a complicação mais comum na LM, podendo também haver envolvimento do palato, úvula, faringe, laringe e cordas vocais. A doença pode progredir até lesões desfigurantes e destrutivas da cartilagem nasal, lábios e face, algumas vezes chegando a ser fatal (CHOI e col, 2001). A forma mucocutânea ocorre predominantemente na América do Sul e muitas vezes mostra-se de difícil tratamento (CARVALHO e col, 1994).
A leishmaniose disseminada (LD) é uma forma clínica da LTA causada por L. (V) braziliensis e que vem sendo identificada no estado da Bahia (CARVALHO e col, 1994; TURETZ e col, 2002). Clinicamente distinta da leishmaniose cutânea difusa, a qual geralmente é causada pela L.
atividade rural, caracterizando-se pelo aparecimento de uma única lesão inicial ulcerada em uma extremidade corpórea, seguida, após um período de poucos dias, pelas lesões disseminadas do tipo ulceradas e não ulceradas, distribuídas em diversas áreas do corpo, como a face, tórax, abdome e membros superiores e inferiores dos pacientes, que podem também apresentar febre e astenia. As células da resposta imune dos indivíduos acometidos produzem níveis menores de TNF e IFN-γ, e níveis mais elevados da citocina IL-10 frente à estimulação com antígenos de Leishmania quando comparados aos pacientes com LC (TURETZ e col, 2002).
Para o tratamento da LTA, a droga de primeira escolha ainda é o antimonial pentavalente, que é encontrado sob duas formas: o antimoniato de N-metilglucamina (Glucantime) e o stibogluconato de sódio (Pentostam), sendo que este último não é comercializado no Brasil. Este medicamento está indicado para tratamento de todas as formas de leishmaniose tegumentar, embora as formas mucosas exijam maior atenção, já que os pacientes podem apresentar respostas mais lentas e maior possibilidade de resistência e recidivas. A administração é por via parenteral e a ocorrência de efeitos colaterais pelo seu uso é relatada. A resposta ao esquema terapêutico varia consideravelmente de acordo com a espécie envolvida, a resposta imune do hospedeiro e a forma clínica ou estágio da doença (GRIMALDI e col, 1993).
As drogas de segunda linha na LTA são Anfotericina B e Pentamidina, que também requerem cuidados para a sua administração além da toxicidade associada. A Anfotericina B é um antibiótico que também possui ação leishmanicida, empregado quando não se obtém resposta ao tratamento com antimonial ou na impossibilidade de seu uso, sendo a melhor opção para os pacientes com LM não responsiva à terapia convencional (CHOI e col, 2001; GRIMALDI e col, 1993). Outros medicamentos vêm sendo utilizados quando ocorre a refratariedade na terapêutica da LTA, que estão baseados na imunoterapia, ou seja, no conhecimento de que a patogênese da LTA está fortemente associada com a resposta imune do hospedeiro. Assim, há relatos do uso de GM-CSF, de drogas inibidoras do TNF e de Miltefosina como tratamentos alternativos para os casos de difícil controle.
O diagnóstico precoce da leishmaniose é importante a fim de evitar danos mais graves ao hospedeiro. Ele é feito baseado em critérios clínicos e epidemiológicos, além do critério parasitológico, que busca a confirmação da infecção pela presença do parasito na lesão. Uma melhor compreensão dos fatores que influenciam o curso clínico da infecção por L. (V) braziliensis relacionados ao parasito ou mesmo aqueles desencadeados pela resposta imune do hospedeiro, poderá resultar em novas abordagens que contribuiriam para a prevenção e para o tratamento precoce da LTA.
A implicação de uma única espécie de parasito em mais de uma forma de leishmaniose sugere uma participação da variabilidade intra-específica sobre os desfechos clínicos dessa enfermidade, à semelhança da variabilidade que observamos ao nível de espécies. Gomes e colaboradores descreveram que cepas de L. braziliensis coletadas na região Sudeste do Brasil mostraram-se marcadamente diferentes daquelas coletadas na região Norte do país quando genotipadas (GOMES e col, 1995). Por outro lado, avaliando a estrutura populacional de isolados de L. braziliensis de casos de LTA na região endêmica de Corte de Pedra, no Sudeste do estado da Bahia, Schriefer e colaboradores encontraram uma estrutura multiclonal dos parasitos responsáveis pela doença naquela área geográfica (SCHRIEFER e col, 2004). Além disso, uma contribuição importante desse trabalho foi a detecção de uma associação significante entre subpopulações de L. braziliensis e desfecho clínico de doença humana, onde esta espécie é a principal causa de LC clássica em nossa região e vem sendo o agente etiológico para a maioria dos casos emergentes de LD.
1.6 O hospedeiro
Ao penetrar no hospedeiro mamífero, Leishmania desencadeia uma série de eventos importantes para a ação do sistema imune. Por ser um parasito intracelular, as interações que acontecem nesse momento entre ele e os diferentes tipos celulares da primeira linha de defesa do hospedeiro exercem um papel crítico na composição da resposta imune inata. As
alterações induzidas nas células da resposta imune chegam, muitas vezes, a modificar o fenótipo e a função celular, causando um estado de adaptação ou de ativação (RAVASI e col, 2007). Tais modificações são desencadeadas pela interação de diferentes moléculas presentes na célula hospedeira e no parasito, que interferem nas vias de sinalização intracelular como também pelos sinais gerados a partir de fatores endógenos ou estímulos exógenos do microambiente formado (OLIVIER e col., 2005).
As células que compõem a primeira linha de defesa do hospedeiro mamífero incluem os macrófagos, os neutrófilos, os eosinófilos e as células dendríticas. Ao considerar que os macrófagos constituem o principal e o preferencial tipo celular que é infectado por Leishmania, a sua função é essencial para o desfecho da infecção no hospedeiro. Tanto no homem como em animais silvestres ou domésticos, e seja qual for a espécie de Leishmania envolvida, elas vivem e proliferam em macrófagos e monócitos de vários tecidos, no chamado sistema fagocítico mononuclear (SFM). Esse sistema é uma família de células que compreendem os progenitores da medula óssea, os monócitos do sangue circulante e os macrófagos teciduais, que são especializadas e eficientes na fagocitose e têm um importante papel na detecção e eliminação dos microorganismos patogênicos. A produção de macrófagos ocorre a partir de precursores mielóides na medula óssea, sendo controlada por fatores de crescimento chamados de fatores estimuladores de colônia (CSFs), que compõem o microambiente local (STOUT, 2004; MOSSER
e col., 2008). Ao saírem para a circulação, as células passam a entrar em
contato com diferentes moléculas, as quais têm influência nas características fenotípicas e funcionais que estas passam a assumir desde então.
Estas células mostram heterogeneidade fenotípica, possuindo a capacidade de englobar e matar potenciais patógenos (fagocitose), a capacidade de processamento e apresentação de antígenos, e funções efetoras que são ativadas em resposta a produtos provenientes da imunidade adquirida. Além desse papel na imunidade, os macrófagos contribuem também na homeostase, na vascularização, na progressão de tumores, no reconhecimento e remoção de células sob apoptose, entre outros (VEGA e col.,
2006; KZHYSHKOWSKA e col., 2008; McCONVILLE e col., 2011). A depender de sua localização no microambiente ou do tipo de estímulo ao qual foram expostos, ou seja, da via de ativação, os macrófagos podem ser classificados em macrófagos classicamente ativados ou inflamatórios (M1), que medeiam a defesa do hospedeiro e a imunidade antitumoral, macrófagos alternativamente ativados (M2), que são supressores e regulam a cicatrização de feridas e macrófagos regulatórios, que secretam IL-10 apresentando atividade anti-inflamatória (STOUT, 2004; KZHYSHKOWSKA e col, 2008; GALLI, 2011).
Quando o inseto vetor inocula na pele do hospedeiro suscetível as formas promastigotas infectantes de Leishmania, estas são capazes de escapar do primeiro mecanismo inato de defesa que é a lise mediada pelo sistema complemento até se aderirem e serem englobadas pelo macrófago. Uma vez internalizados, por um processo de fagocitose, os parasitos desencadeiam uma série de alterações morfológicas e bioquímicas no interior da célula e permanecem dentro de um vacúolo parasitóforo chamado de fagolisossoma, que os separa do citoplasma celular (BOGDAN, 2008).
Embora os macrófagos sejam células fagocitárias especializadas no combate a agentes infecciosos, a Leishmania consegue desenvolver diversos mecanismos de defesa capazes de subverter a capacidade microbicida do macrófago, conseguindo sobreviver no ambiente potencialmente tóxico formado e multiplicar-se até a ruptura da célula, quando então são liberadas para infectar outros macrófagos, propagando deste modo a infecção (CUNNINGHAM, 2002; BOGDAN, e col., 1998).
Tal característica se deve em parte à contribuição das moléculas de superfície do parasito, que representam um importante papel no direcionamento da infecção, e a interação dessas moléculas com os receptores celulares específicos. Entre as moléculas de superfície presentes no parasito a mais predominante é a LPG seguida pela gp63. Outras moléculas presas à superfície celular são proteofosfoglicanos, fosfatase ácida, nucleotidase e cisteína proteinases que em conjunto conferem virulência a Leishmania. Os receptores celulares envolvidos nessa interação são o CR1, o CR3, o receptor
para manose-fucose, os receptores para a porção Fc de imunoglobulinas (FcγRI, FcγRII), receptor Toll like (TLR2) e o receptor para fibronectina. Estes receptores representam importante papel na ativação da resposta imune inata (BASU e col., 2005; KZHYSHKOWSKA e col, 2008).
Outro evento muito importante que ocorre na superfície de macrófagos durante a internalização dos parasitos é o desencadeamento de uma combinação de mecanismos oxidativos e não oxidativos visando à sua atividade microbicida. As alterações causadas pelo parasito na membrana de macrófagos ativam uma enzima ligada à membrana, a NADPH oxidase, a qual catalisa a redução do O2 molecular para O2¯, constituindo a explosão
respiratória (burst oxidativo) e a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). A ativação do macrófago demanda um aumento do consumo do oxigênio que, por sua vez, aumenta a resposta oxidativa. Outra via requerida envolve a geração de óxidos de nitrogênio como mediadores da morte intracelular dos parasitas, onde ocorre a síntese de NO, NO2¯ e NO3¯ a partir do
substrato L-arginina, pela ação da enzima óxido nítrico sintase (iNOS), constituindo o segundo principal mecanismo de defesa de macrófagos classicamente ativados (BASU e col., 2005; PLUDDEMANN e col., 2011). O óxido Nítrico (NO) é uma importante molécula biológica produzida por diferentes tipos celulares, tendo um papel importante em vários processos fisiológicos essenciais, como na sinalização celular, podendo participar na fisiopatologia de várias doenças. Esta molécula é importante atuando na regulação da resposta imune durante a infecção por Leishmania, sendo considerado o principal mediador citotóxico e citostático contra patógenos intracelulares (QUEIROZ e col., 1999; DUSSE e col., 2003). Entre os mecanismos independentes de oxigênio (não oxidativos), temos as atividades funcionais proteolíticas e catabólicas inerentes à sua ação de célula fagocítica, com liberação de enzimas armazenadas no interior dos seus grânulos e lisossomas. Estas enzimas lisossomais são peptidases, nucleases, fosfatases, esterases e lipases e levam à destruição dos organismos fagocitados pelos macrófagos (BASU e col., 2005; PLUDDEMANN e col., 2011).
Em contrapartida, Leishmania manipula a célula hospedeira visando à sua sobrevivência. A LPG pode inibir a explosão respiratória, eliminar os radicais de oxigênio e inibir as β galactosidases lisossomais, sendo um determinante molecular essencial do parasito dirigido contra a função efetora antiparasitária da célula hospedeira (BASU e col., 2005). A LPG representa muitos papéis importantes na sobrevivência do parasito e na modulação da resposta imune, e diferenças na sua estrutura e distribuição são importantes para as diferentes propriedades de diferentes estágios de desenvolvimento da
Leishmania, já que varia entre as diferentes espécies e quantitativamente entre
as formas evolutivas (MCCONVILLE e col., 1995; DESCOTEAUX e col., 1999). A glicoproteína gp63 inativa enzimas proteolíticas do hospedeiro e, assim, protege as proteínas do parasita da degradação fagolisossomal. Leishmania
spp. é também capaz de manter um pH intracelular neutro, apesar de ambiente
ácido existente no interior do fagolisossomo aumentando a sobrevida no interior destas células (BOGDAN e col., 1990).
A localização das amastigotas no interior de macrófagos faz com que o controle da infecção seja dependente da resposta imune mediada por células. As células Natural killer (NK) fornecem inicialmente o IFN-γ que orienta os macrófagos ao desenvolvimento de um fenótipo de ativação clássico (M1). Estes macrófagos inflamatórios inatos ativados produzem grandes quantidades de citocinas como TNF, IL-1β, IL-12 e IL-23, o que as tornam importantes no direcionamento das respostas antígeno-específicas de células T auxiliares tipo 1 (Th1) e de células Th17. Por sua vez, o IFN-γ agora produzido pelas células T proporciona uma cascata de amplificação positiva que favorece a expansão da população de células ativadas enquanto também aumenta as suas atividades microbicida e tumoricida (GALLI e col., 2011).
A modulação da resposta imune é uma fase importante para evitar a patologia mediada por célula que observamos na leishmaniose tegumentar causada por L. (V.) braziliensis. Os mecanismos da resposta imune dos macrófagos direcionados contra os parasitos, que são ativados de maneira forte e efetiva, resultando numa intensa resposta inflamatória e numa alta expressão de moléculas reativas no sítio de lesão necessitam de um controle,
o que acontece inicialmente pela produção de citocinas imunossupressivas como IL-10 e TGF-β. Durante a fase mais precoce da leishmaniose cutânea localizada causada por L. braziliensis, baixos níveis de IFN-γ são observados ao passo que os níveis de IL-10 se encontram superiores (KANE e col., 2000; CUNNINGHAM, 2002). A IL-10 desempenha um papel crítico na persistência do parasito in vivo. À medida que a infecção progride, todas as formas clínicas da infecção por L. braziliensis evidenciam uma produção de IFN-γ antígeno específica predominante sobre os níveis de IL-10 (BOGDAN e col., 1991; MOORE e col., 2001). Há relatos de que a IL-10 não só controla a produção de IFN-γ, mas também inibe fortemente a produção de TNF-α, de intermediários reativos de oxigênio (O2¯ e metabólitos), de IL-12 e em menor extensão de
intermediários reativos de nitrogênio (NO e derivados) pelos macrófagos e células dendríticas prejudicando, assim, a atividade antimicrobicida desses tipos celulares (KANE e col., 2000; BOGDAN, 2008).
A persistência das formas amastigotas nas células hospedeiras também leva à alteração da função de processamento e apresentação de antígenos para a célula T principalmente pela inibição da expressão de moléculas MHC classe II (FRUTH e col., 1993; COURRET e col., 2001). As formas promastigotas que não forem internalizadas serão destruídas no meio extracelular pela resposta inata havendo a liberação de partículas antigênicas que serão apresentadas ao sistema imune, gerando assim a resposta imune específica. Os macrófagos participam na apresentação de antígeno e na ativação da resposta imune adaptativa. É provavelmente neste momento que características como intensidade e qualidade da resposta imune são definidas, influenciando, assim, a evolução da doença para cura espontânea, para formas autolimitadas ou para formas progressivas (OLIVIER e col., 2005).
1.7 Microarranjo de DNA
Na busca do entendimento de como uma célula envolvida na resposta imune, por exemplo, responde e se comporta no desempenho de sua função, se torna evidente a necessidade do conhecimento mais detalhado sobre a
atividade de um grande número de genes contidos em seu genoma, assim como do panorama de expressão deste genoma frente a diversas situações biológicas. Após os recentes trabalhos que culminaram no sequenciamento completo de genomas de vários microrganismos, houve a geração de uma quantidade imensa de informações úteis para o desenvolvimento de abordagens globais, possibilitando vasto uso para a obtenção deste conhecimento (BUTTE, 2002).
O estudo da função dos genes, através da medição paralela da expressão de genomas, utiliza muito comumente a metodologia de microarranjos de DNA (microarray, do inglês). As análises de microarranjo se tornaram amplamente utilizadas em biologia molecular, sendo uma técnica que busca medir a expressão de transcritos em larga escala, medindo muitos simultaneamente. Também permite a exploração do genoma e de outros dados funcionais fornecendo informações importantes sobre as funções dos genes e interações dentro e entre as vias metabólicas celulares (BRAZMA e col., 2001). Um microarranjo de DNA, ou DNA-chip, consiste num arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma superfície sólida, revestidas com compostos que conferem carga positiva. Os microarranjos são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucleicos (mRNA na forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de amostras biológicas, as quais são postas para hibridizar com o DNA fixado no arranjo (hibridização por complementariedade de bases). O uso mais frequente dos microarranjos é na determinação da expressão gênica (perfil do transcriptoma). A alta performance desta técnica permite determinar a expressão diferencial de milhares de genes num único experimento. Para a preparação dos microarranjos, utilizam-se robôs altamente precisos que aplicam as diferentes amostras de DNA em diminutos pontos (spots) no centro de uma lâmina de microscópio com a superfície quimicamente preparada (densidade aproximada de 10.000 pontos/cm2). Cada ponto representa um segmento gênico em particular. Quanto mais pontos no microarranjo, mais abrangente ele será na análise do trancriptoma (WEERARATNA e col., 2004).
A tecnologia dos microarranjos tem impulsionado de maneira importante a pesquisa de genômica funcional dos diferentes organismos, desde bactérias até o homem, incluindo situações normais e patológicas (câncer, doenças autoimunes, doenças degenerativas entre outras). Esta técnica apresenta várias vantagens sobre outros sistemas empregados para esta finalidade, pois permite medir simultaneamente a presença em larga escala de genes específicos e seus padrões de expressão em uma varredura do genoma. Porém, este tipo de metodologia é relativamente cara e perde em precisão, pois gera uma grande quantidade de dados que terminam necessitando da execução de outras técnicas mais refinadas para validação desses resultados (KATO-MAEDA e col., 2001).
1.8 Microarranjo de DNA e Leishmania
Vários estudos vêm demonstrando que a sobrevivência de Leishmania
spp. está associada com modificações na expressão gênica de células do
hospedeiro, como os macrófagos (RODRIGUEZ e col., 2004; ZHANG e col., 2010). Alguns deles buscavam a análise do perfil transcricional da expressão gênica, mas sempre avaliaram de maneira isolada, não permitindo uma comparação entre os diferentes estágios de ativação celular e, portanto, o comportamento global da célula frente a um único estímulo, como, por exemplo, a infecção por parasitas intracelulares (ZHANG e col., 2010; PROBST
e col., 2012). A análise do perfil transcricional da expressão gênica de maneira
global através da tecnologia do microarranjo de DNA é uma ferramenta frequentemente utilizada em tempos atuais para estudar as interações entre hospedeiro e patógeno, principalmente através da identificação de genes que podem estar envolvidos na patogenicidade, ou mesmo do ponto de vista da resposta do hospedeiro à infecção. (KATO-MAEDA e col., 2001).
Em um estudo Blader e colaboradores analisaram as mudanças globais que ocorrem quando um protozoário parasita intracelular infecta uma célula hospedeira de mamífero, utilizando o modelo de infecção por Toxoplasma
infecção, verificou-se que vários genes que estão envolvidos em diversos processos celulares, incluindo o metabolismo, a transcrição de proteínas alvo e a apoptose foram modulados, o que acontece de maneira semelhante com
Leishmania spp. (BLADER e col., 2001). Já Ettinger e colaboradores utilizaram
a análise da expressão gênica usando o microarranjo de DNA para investigar um modelo de infecção precoce com macrófagos humanos desafiados por parasitos da espécie L. chagasi, e observaram também uma modulação negativa para muitos transcritos que levava a uma inibição do fenótipo clássico de ativação celular. Em contraste, quando eles analisaram estas mesmas células após a adição de células T autólogas à cultura observaram a expressão de genes relacionados com a ativação da resposta imune do tipo Th1 e uma indução de elementos com atividade modulatória (IL-10, TGF-β), caracterizando uma resposta adaptativa (ETTINGER e col., 2008).
Assim, para determinar se haveria diferenças na expressão gênica de células do hospedeiro quando infectados com distintos isolados de uma mesma espécie de parasito (L. braziliensis) foi utilizado o microarranjo de DNA. Esse estudo tem como objetivo identificar possíveis padrões distintos de expressão gênica entre células infectadas com parasitos isolados de pacientes com diferentes apresentações de LTA.
2. HIPÓTESE
A hipótese desse trabalho é que isolados de L. braziliensis pertencentes a diferentes clados, isto é, apresentam conteúdos genéticos diferentes, induzem a expressão de diferentes perfis de genes em células da resposta imune, como os macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico, e estes padrões distintos teriam um papel nos desfechos clínicos em hospedeiros humanos infectados.
3. OBJETIVOS
3.1 GERAL
Distinguir cepas pertencentes às diferentes subpopulações de L.
braziliensis associadas com forma clínica de doença (LC, LM e LD), através de
diferenças em seus comportamentos biológicos pela avaliação da indução dos padrões de resposta específicos em células imunes infectadas, os quais devem ser em parte responsáveis pelos vários desfechos da LTA.
3.2 ESPECÍFICOS
Comparar os perfis globais de expressão gênica em macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humanos, provenientes de doadores sadios, infectados em paralelo com isolados dos diferentes clados de
L. braziliensis (LC, LM e LD) de Corte de Pedra/Ba.
Detectar diferenças no padrão de expressão (indução / repressão) de genes em macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humanos dos doadores sadios infectados com os isolados representantes dos diferentes clados e as células não infectadas.
Avaliar os alvos que deverão apresentar comportamentos diversos entre os clados através de técnicas moleculares tais como qPCR.
4. JUSTIFICATIVA
Em estudo anterior realizado por Schriefer e colaboradores, foi descrita uma população multiclonal entre isolados de L. braziliensis provenientes da área endêmica para LTA de Corte de Pedra/Bahia. Nesse estudo, foi também encontrada uma associação estatisticamente significante entre desfecho clínico da LTA e genótipo parasitário (SCHRIEFER e col., 2004). Essas observações indicam que a variabilidade intraespecífica desses microorganismos exerce um papel importante na determinação da forma de doença, semelhante ao que ocorre na forte relação entre espécie de Leishmania e forma de leishmaniose (MARSDEN e col., 1985; AZULAY e col., 1995; SARAVIA e col., 1998 - 2002; SCHRIEFER e col., 2004). Reforçando, esse raciocínio, estudos experimentais indicam que L. braziliensis isoladas de pacientes de diferentes formas de leishmaniose se comportam diferentemente em modelos animais (e.g. KAHL e
col., 1991; INDIANI DE OLIVEIRA e col., 2004).
Com o estudo proposto estamos dando os primeiros passos na compreensão dos mecanismos biológicos responsáveis pelas associações epidemiológicas entre cepa parasitária e forma de LTA. Os dados que são reportados nesta tese também nos permitem uma melhor compreensão da interação entre a célula hospedeira humana e a L. braziliensis, nos permitindo um entendimento acerca dos mecanismos envolvidos no estabelecimento de uma infecção. Os macrófagos uma vez sendo infectados com diferentes cepas de L. braziliensis sofreriam eventos precoces distintos, e estes, influenciariam as respostas inatas e posteriormente adaptativas que condicionariam a imunidade ao parasito, a imunopatogênese e ao desfecho clínico da LTA.
O fato de avaliarmos, paralelamente, os padrões globais de expressão gênica que foram significativamente alterados pela infecção por isolados distintos de L. braziliensis em macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico (MDM) de um mesmo doador humano sadio nos permitirá detectar os efeitos diferenciais causados pelas cepas parasitárias nas células infectadas, sem o confundimento introduzido pela variabilidade genética dos hospedeiros.
5. DESENHO DE ESTUDO E METODOS
Obtenção dos isolados parasitários.
Os isolados de L. braziliensis foram obtidos de pacientes com LC, LM e LD, diagnosticados no Posto médico de Corte de Pedra – Bahia, por meio de aspiração de lesões durante as consultas iniciais, sendo provenientes de casos humanos distintos. Os aspirados foram então colocados em meio de cultura específico LIT/NNN, e em condições de aeração e temperatura adequadas (25°C) por 7 a 30 dias para cultivo dos parasitos. Após a observação da presença de formas promastigotas viáveis no LIT/NNN, o material era então transferido para o meio de cultura líquido Schneider (SCHNEIDER Insect Extract Medium, SIGMA), suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado (Gibco BRL, division of Invitrogen, GAITHERSBURG, USA), 2% de urina masculina humana e o antibiótico gentamicina 50 µg/ mL (Gibco BRL, division of Invitrogen, GAITHERSBURG, USA), e incubado até que os parasitos atingissem fase logarítmica tardia de crescimento (uma suspensão de aproximadamente 1x107 a 1x108 células/mL). Então, os parasitos eram estocados e congelados em DMSO a –180°C. Para a obtenção das promastigotas utilizadas nas infecções dos MDM, os estoques de isolados selecionados foram descongelados, cultivados em Schneider até atingirem 107 células / mL (fase estacionária) e tratados como descrito anteriormente. Foram selecionados para o desenvolvimento do trabalho até três isolados de L.
braziliensis de cada clado associado à LC, LM ou LD (B, C e A,
respectivamente), correspondendo ao total de nove amostras.
Recrutamento de Voluntários e Critério de Inclusão e Exclusão
Voluntários sadios doaram o sangue que foi empregado como fonte de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) e, consequentemente, como fontes de macrófagos. Adultos sadios com idades entre 21 e 65 anos, que não tivessem sido expostos à infecção por Leishmania, foram recrutados da comunidade em Salvador/Bahia. Indivíduos com doenças agudas ou crônicas, ou que estivessem em uso de medicações foram excluídos. A
quantidade de sangue coletada de cada doador variou entre 120 e 180 mL. Foram recrutados, ao longo do tempo para este estudo, em torno de 20 voluntários, já que houve dificuldades para a obtenção de células suficientes, bem como de condições experimentais apropriadas para responder os nossos objetivos ao longo da fase experimental deste trabalho.
Infecção de Macrófagos humanos derivados de monócitos do sangue periférico (MDM).
Para a infecção dos MDM, apenas um doador foi empregado por ensaio, para que as únicas diferenças entre os grupos experimentais fossem as cepas de L. braziliensis usadas nas infecções. As células mononucleares do sangue periférico foram obtidas dos voluntários sadios de Salvador/Bahia que não residiam em regiões endêmicas para a infecção por L. braziliensis. As CMSP foram separadas a partir de 120 a 180 mL sangue total por gradiente de Ficoll-Hypaque. As células foram lavadas, ajustadas para 2 a 4x106 células / mL de meio RPMI suplementado com 2mM L-glutamina, 10 mM HEPES, 20% de soro autólogo humano (doador específico) e 50 U/mL de Penicilina / Estreptomicina [meio RP-10] (Gibco BRL, division of Invitrogen, GAITHERSBURG, USA). Então as células foram mantidas em placas de Teflon (Savillex Corporation) a 37°C e 5% de CO2 por seis dias. Nessa fase, os monócitos presentes entre as
CMSP se diferenciam em macrófagos, servindo como fonte de células para a infecção. Após os seis dias de incubação, as CMSP foram lavadas com solução HBSS 1x, contadas e ajustadas para 5x106 células/mL. Então, a suspensão foi distribuída em placas de cultura de 6 poços, que foram incubadas por um período de 4 horas para facilitar a aderência dos MDM. As células não aderentes foram removidas por lavagem, restando apenas as MDM em cultura, que foram incubadas por 16 horas a 37ºC e 5% de CO2. Cada uma
das três cepas de L. braziliensis representantes dos clados A, B e C foi adicionada a dois poços contendo os MDM em paralelo. Os parasitos foram adicionados às MDM na proporção de 2:1 (leishmania:MDM), a partir de suspensões que se encontravam em fase estacionária de crescimento, nas infecções in vitro. Células controle receberam meio de cultivo RP-10 sem
