Rev. Bras. Anestesiol. vol.67 número6

REVISTA

BRASILEIRA

DE

ANESTESIOLOGIA

www.sba.com.br

ARTIGO

CIENTÍFICO

Pré-condicionamento

com

dexmedetomidina

protege

contra

lesões

induzidas

por

lipopolissacarídeos

em

células

epiteliais

alveolares

humanas

Lei

Zhang

,

Xian-Jin

Zhou

,

Li-Ying

Zhan

,

Xiao-Jing

Wu

,

Wen-Lan

Li

,

Bo

Zhao

,

Qing-Tao

Meng

e

Zhong-Yuan

Xia

a_{WuhanUniversity,RenminHospital,DepartmentofAnesthesiology,Wuhan,Hubei,China}

b_{WuhanUniversity,RenminHospital,LaboratoryofAnesthesiologyandCriticalCareMedicine,Wuhan,Hubei,China} c_{TongjiUniversity,FirstMaternityandInfantHospital,DepartmentofAnesthesiology,Shanghai,China}

Recebidoem17demarçode2016;aceitoem27defevereirode2017 DisponívelnaInternetem18deagostode2017

PALAVRAS-CHAVE

Dexmedetomidina; Lipopolissacarídeos;

Pré-condicionamento;

Lesãopulmonar

aguda;

Célulasepiteliais alveolares

Resumo

Justificativaeobjetivos: Dexmedetomidina(DEX)demonstrouterefeitopré-condicionantee tambémefeitosprotetorescontralesãoorganizada.Nesteestudo,comcélulasA549(células epiteliaisalveolareshumanas),investigamosseopré-condicionamentocomDEXproporcionaria protec¸ãocontralesãopulmonaraguda(LPA)invitro.

Métodos: CélulasA549foramaleatoriamentedistribuídasem quatrogrupos(n=5):controle, DEX, lipopolissacarídeos (LPS) e D-LPS (DEX+LPS). Administramos soluc¸ão de PBS (tampão fosfato-alcalino)ouDEX.Após2hdepré-condicionamento,omeiofoirenovadoeascélulas desafiadascomLPSpor24hnosgruposLPSeD-LPS.Emseguida,malondialdeído(MDA), supe-róxidodismutase(SOD),Bcl-2,Bax,caspase-3eemA549foramtestados.Apoptosetambémfoi avaliadanascélulas.

Resultados: Emcomparac¸ãocomogrupoLPS,opré-condicionamentocomDEXreduziua apop-tose(26,43%±1,05%vs.33,58%±1,16%,p<0,05)emcélulasA549,oqueestácorrelacionado coma diminuic¸ãode MDA (12,84±1,05vs. 19,16±1,89nmol.mg−1 _{de proteína,p<0,05) e} aumentodaatividadedeSOD(30,28±2,38vs.20,86±2,19U.mg−1_{deproteína,p<0,05).O} pré-condicionamentocomDEXtambémaumentouoníveldeBcl-2(0,53±0,03vs.0,32±0,04,

p<0,05)ediminuiuoníveldeBax(0,49±0,04vs.0,65±0,04,p<0,05),caspase-3(0,54±0,04

vs.0,76±0,04,p<0,05)ecitocromoc.

Conclusão:Opré-condicionamentocomDEXtemefeitoprotetorcontraLPAinvitro.Os poten-ciaismecanismosenvolvidossãoinibic¸ãodamortecelularemelhoriadaantioxidac¸ão. ©2017SociedadeBrasileiradeAnestesiologia.PublicadoporElsevierEditoraLtda.Este ´eum artigoOpen Accesssobumalicenc¸aCCBY-NC-ND(

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

∗_{Autorparacorrespondência.}

E-mail:674612814@qq.com(Z.Y.Xia). http://dx.doi.org/10.1016/j.bjan.2017.07.003

KEYWORDS

Dexmedetomidine; Lipopolysaccharides; Preconditioning; Acutelunginjury; Alveolarepithelial cell

Dexmedetomidinepreconditioningprotectsagainstlipopolysaccharides-induced injuryinthehumanalveolarepithelialcells

Abstract

Backgroundandobjectives: Dexmedetomidine (DEX) has demonstrated the preconditioning effectandshownprotectiveeffectsagainstorganizeinjury.In thisstudy,usingA549(human alveolar epithelial cell) cell lines, we investigated whether DEX preconditioning protected againstacutelunginjury(ALI)invitro.

Methods:A549wererandomlydividedintofourgroups(n=5):controlgroup,DEXgroup, lipo-polysaccharides(LPS)group,andD-LPS(DEX+LPS)group.Phosphatebuffersaline(PBS)orDEX wereadministered.After2hpreconditioning,themediumwasrefreshedandthecellswere challengedwithLPSfor 24hontheLPSandD-LPSgroup.Thenthemalondialdehyde(MDA), superoxide dismutase(SOD), Bcl-2, Bax,caspase-3 andthe cytochromec intheA549 were tested.Theapoptosiswasalsoevaluatedinthecells.

Results:ComparewithLPSgroup,DEXpreconditioningreducedtheapoptosis(26.43%±1.05% vs.33.58%±1.16%,p<0.05)intheA549,whichiscorrelatedwithdecreasedMDA(12.84±1.05 vs. 19.16±1.89nmol.mg−1 _{protein, p<0.05) and increased SOD activity (30.28±2.38 vs.} 20.86±2.19U.mg−1 _{protein, p<0.05). DEX preconditioning also increased the Bcl-2 level} (0.53±0.03vs.0.32±0.04,p<0.05)anddecreasedthelevelofBax(0.49±0.04vs.0.65±0.04,

p<0.05),caspase-3(0.54±0.04vs.0.76±0.04,p<0.05)andcytochromec.

Conclusion: DEXpreconditioning has aprotective effectagainst ALI invitro. The potential mechanismsinvolvedaretheinhibitionofcelldeathandimprovementofantioxidation. ©2017SociedadeBrasileiradeAnestesiologia.Publishedby ElsevierEditoraLtda.Thisisan openaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense(

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduc

¸ão

A lesão pulmonar aguda (LPA) e sua forma mais grave, a síndromedo desconforto respiratório agudo(SARA), são umacondic¸ãorelativamentecomumempacientescríticos, associada a uma alta taxa de morbidade e mortalidade e caracterizada por edema pulmonar com alto teor de proteínae insuficiência respiratóriahipoxêmicagraveque podem ser o resultado de muitos insultos clínicos, inclu-sive sepse e pneumonia.1---3 _{Embora haja uma intensa}

pesquisa e uma melhor compreensão dafisiopatologia de LPA/SARA, não há tratamentos farmacológicos específicos que comprovem seus benefícios. Portanto, as taxas de morbidade e mortalidade permanecem significativas em 35%---40%.3---5

Há relatos de que o pré-condicionamento oferece protec¸ãoefetivacontraLPApormeiodeestímuloprévio.6,7

Atualmente,opré-condicionamentotemsidoamplamente estudado na prática clínica por seu potencial de ofere-cerumaoportunidadeúnicadeexercerefeitosprotetores. Hojesabemosqueaprotec¸ãopodeserprovocadadeforma maissegurapormuitos fármacos,comodexmedetomidina (DEX).8,9

OusodeDEXcomosedativoécomumemcontextos clí-nicos. Recentemente, pesquisadoresdescobriram que DEX tempotencialparaimitaroefeitodopré-condicionamento emostrouefeitosprotetorescontralesõesorganizadas cau-sadasporlipopolissacarídeos(LPS).10,11_{Essaevidênciaindica}

queDEXpodeterefeitoprotetorcontraLPA.Nesteestudo, usamosomodelodelesãoA549induzidaporLPSpara

simu-larLPAinvitro,investigamosseopré-condicionamentocom

DEXproduziriaprotec¸ãocontraLPA.Tambéminvestigamos osefeitosdopré-condicionamentocomDEXnamorte celu-lar e na func¸ão da antioxidac¸ão para obter uma melhor percepc¸ãodo(s)mecanismo(s).

Material

e

métodos

Culturacelularetratamentos

Célulashumanasdelinhagemepitelialalveolar(A549)foram obtidasdoChinaCenterforTypeCultureCollection(CCTCC, WuhanUniversity,Wuhan,China).AscélulasA549foram cul-tivadasemmeioRPMI-1640suplementadocomsorobovino fetal(10%),glutamina (2mmol.L), penicilina(100U.mL−1₎

e estreptomicina (100mg.mL−1_{) e mantidas em ambiente}

úmidoa37◦C eCO₂a5%.

AsA549nafaselogarítmicadecrescimentoforam seme-adasem umaplaca de 96poc¸os(2×103_{). Apósa cultura}

duranteanoite,essascélulasforamrandomicamente sepa-radasemquatrogruposdetratamentodiferentes:osgrupos DEX (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd., Jiangsu, China) eD-LPSreceberam DEX(10␮g.mL−1_{)e osgrupos controle}

e LPS (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EUA) receberam o mesmovolumedesoluc¸ãotampão-fosfatosalina(PBS).Após duas horas de exposic¸ão ao agente farmacológico, cada placa de poc¸os foi lavada e as células foram desafiadas com LPS (50␮g.mL−1_{) por 24 horas nos grupos LPS e}

Mensurac¸ãodaformac¸ãodemalondialdeído(MDA) edaatividadedesuperóxidodismutase(SOD)

Onível de formac¸ão de MDA e a atividadede SOD foram determinadoscomomarcadoresdeestresseoxidativocom kitscomercialmentedisponíveis(JianchengBiologicProject Co.,Nanjing,China).Aconcentrac¸ãodeproteínafoi deter-minadacomokitdeanálisedeproteínaBCA(BestBioCo., Shanghai,China),deacordocomoprotocolodofabricante.

Westernblotting

Ascélulasforamhomogeneizadaseaconcentrac¸ãode pro-teínadosobrenadantefoideterminadacomométodoBCA. O sobrenadante com 50␮g de proteína foi separado por SDS-PAGEe transferido paraumamembrana de nitrocelu-lose.Osanticorposprimáriosincluíramcaspase-3,Bcl-2,Bax (SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,EUA)e␤-actina (Abcam,Cambridge,MA,EUA).Amembranafoientão incu-bada com umanticorpo secundário anticoelho conjugado comHRP(1:20.000;Pierce)porumahoraeo‘‘borramento’’

(blotting)foidesenvolvidocomumkitdedetecc¸ãode

qui-mioluminescênciaSuperSignal(Pierce).Oimunoblottingfoi visualizadocomumprocessadorderaiosX Kodak102

(East-manKodak,Rochester,NY,EUA)eanalisadocomoprograma QuantityOne-4.2.3(Bio-Rad,Hercules,CA).

Ensaiodeliberac¸ãodocitocromo-c

Conformedescritoanteriormente,12 _{ascélulasA549 foram}

fixadascomparaformaldeídoa4%por15minutos, permeabi-lizadascomTritonX-100a0,1%por10minutosebloqueadas

com3%desorodissolvidoem PBSpor30minutosem tem-peraturaambiente. As células foramentão sondadascom anticorpoanticitocromo-c(1:100;SantaCruzBiotechnology) duranteanoitea4◦_{C.AscélulasforamlavadascomPBSduas}

vezeseincubadascomanticorposecundárioconjugadocom FITC(1:200; Biovision,China) por duas horas noescuro a 37◦_{C.Apósalavagem,asimagensdascélulascoradasforam}

obtidascomummicroscópiodefluorescência.

Detecc¸ãodeapoptoseporcitometriadefluxo

Comumkitdedetecc¸ãodeapoptosedeanexina(AnnexinV

--PE/7-AADApoptosisDetectionKit---BioVision,MA,EUA),as célulasapoptóticasforamavaliadasviaanálisedacitometria de fluxo (FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).13

Osdadosforamanalisadoscom oprograma CellQuest(BD Biosciences).

Análiseestatística

Os dados de cinco experimentos independentes foram expressos em média±EPM. Anova e o teste de Student--Newman-Keuls (SNK) foram feitos para determinar a significância estatística. Diferenc¸as significativas foram estabelecidasemp<0,05.

A

60

50

40

30

20

25

20

15

10

5

0 10

0

Controle DEX

SOD (U.mg

–1 proteína)

MDA (mmol.mg

–1 proteína)

LPS D-LPS

Controle DEX D-LPS

∗ #

∗ #

∗

∗

B

LPS

Figura1 (A)Atividadede SODem A549.(B)Níveisde MDA

em A549.Controle, semlesões;DEX, dexmedetomidina;LPS, lipopolissacarídeos; D-LPS, DEX+LPS. Valores expressos em média+EPM,n=5paracadagrupo.*_{p<0,05vs.grupocontrole} e#_{p<0,05vs.grupoLPS.}

Resultados

EfeitosdeDEXsobreoestresseoxidativoemA549

Em comparac¸ãocom o grupocontrole, osLPS diminuíram a atividadede SODem A549 (46,34±2,24U.mg−1 _de

pro-teínavs.20,86±2,19U.mg−1_{deproteína,p<0,05)(fig.1A)}

eaumentaramaformac¸ãodeMDA(7,68±0,92nmoL.mg−1

deproteínavs.19,16±1,8nmoL.mg−1_{deproteína,p<0,05)}

(fig. 1B). Esse efeitofoi significativamente atenuado pelo pré-condicionamentocomDEX(30,28±2,38U.mg−1_de

pro-teína e 12,84±1,05nmoL.mg−1 _{de proteína, p<0,05 vs.}

grupoLPS).

EfeitosdeDEXsobreaexpressãodeBcl-2, Baxecaspase-3

Em comparac¸ão com o grupo controle, os LPS dimi-nuíram o nível de Bcl-2 (0,79±0,03 vs. 0,32±0,04,

A

Bcl _Caspase-3

Controle DEX LPS D-LPS Controle DEX LPS D-LPS

Bax

Bcl-2

∗

∗ ∗

∗# ∗#

∗#

Bax

Nível relativo Caspase-3

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Controle Controle

DEX LPS DEX LPS

D-LPS D-LPS

Ação-β Ação-β

B

D

C

Figura2 (A)Imagemrepresentativade Bcl-2eBax.(B)Níveisde Bcl-2eBax.(C) Imagemrepresentativade caspase-3.(D)

Níveldecaspase-3.Controle,semlesões;DEX,dexmedetomidina;LPS,lipopolissacarídeos;D-LPS,DEX+LPS.Valoresexpressosem média+EPM,n=5paracadagrupo.*_{p<0,05vs.grupocontrolee}#_{p<0,05vs.grupoLPS.}

Controle

Citocromo-c

DAPI

DEX LPS D-LPS

Figura3 Sec¸õesrepresentativasdocitocromo-c.Controle,semlesões;DEX,dexmedetomidina;LPS,lipopolissacarídeos;D-LPS,

DEX+LPS.Afluorescênciaverdemostraocitocromo-ceafluorescênciaazul(DAPI)mostraoDNA.Ampliac¸ãooriginal400×.

significativamenteatenuadopelopré-condicionamentocom DEX(0,54±0,04,p<0,05vs.grupoLPS).

EfeitosdeDEXsobrealiberac¸ãodecitocromo-c

Ocitocromo-c doespac¸o intermembranarmitocondrial no citoplasmaéumpassocríticonaprogressãodavia apoptó-ticaintrínseca.Nogrupocontrole,ocitocromo-capresentou nível bem pouco detectável, enquanto LPS resultou em aumentos significativos. Esse efeito dos LPS foi atenuado pelopré-condicionamentocomDEX(fig.3).

EfeitosdeDEXsobreapoptose

Emcomparac¸ãocomogrupocontrole,osLPSaumentarama porcentagemdecélulasapoptóticasemA549(1,57%±0,52%

vs.33,58%±1,16%,p<0,05)(fig. 4Ae4B).Esse efeitofoi significativamenteatenuadopelopré-condicionamentocom DEX(26,43%±1,05%,p<0,05vs.grupoLPS).

Discussão

Este estudo demonstrou que o pré-condicionamento com DEX diminuiu significativamente a lesão induzida por LPS em A549. Os principais achados são os seguintes: (1) o pré-condicionamentocomDEXreduziuaformac¸ãodeMDA e aumentou a atividade de SOD em A549; (2) o pré--condicionamentocomDEX aumentoua relac¸ãoBcl-2/Bax ediminuiuosníveisdecaspase-3ecitocromo-c;(3)o pré--condicionamentocom DEXatenuou a apoptoseem A549. Essesdadosfornecem a primeira evidência deque o pré--condicionamentocomDEXatenuaalesãoemcélulasA549 causadaporLPS.

Estudos relataram que o estresse oxidativo desempe-nha um papel importante na lesão induzida por LPS.14,15

A

B

Controle

LPS

D-LPS

DEX

100 ₁₀1 100

101

7-AAD

7-AAD

7-AAD

7-AAD

102 103 104

100 101 102 103 104

100 101 102 103 104

102 ₁₀3 ₁₀4

100 ₁₀1 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 100 ₁₀1

40

∗

∗# 35

30

25

20

15

10

5

0

Controle DEX

Células apoptóticas (%)

LPS D-LPS 102 ₁₀3 ₁₀4

100 100 101 102 103 104

101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4

Figura4 (A)Imagemrepresentativadacitometriadefluxo.(B)Ograudeapoptosecelular.Controle,semlesões;DEX,

dexmede-tomidina;LPS,lipopolissacarídeos;D-LPS,DEX+LPS.Valoresexpressosemmédia+EPM,n=5paracadagrupo.*_{p<0,05vs.grupo} controlee#_{p<0,05vs.grupoLPS.}

comprometimentodaestruturanormaldamembranaelesão tecidualoxidativa.16 _{Emcontraste,SODéconsideradauma}

importanteenzimaantioxidanteintracelularcommúltiplas func¸õesbiológicas.OaumentodaenzimaantioxidanteSOD podeindicaracapacidadecelulardeeliminac¸ãoeextinc¸ão de radicais livres.17,18 _{Estudos anteriores também}

relata-ram que DEX impediu as reac¸ões de peroxidac¸ão com o aumentodeSOD,masdiminuiu oMDAnostecidos.19,20 _No

experimento,nossosresultadosdemonstraramobviamente queopré-condicionamentocomDEXresultouemaumento daatividade deSODediminuic¸ão deMDAemA549. Essas descobertassugeremque opré-condicionamentocomDEX

poderiaexercerprotec¸ãocontraodanooxidativoinduzido porLPSemA549emodularassimalesãoedisfunc¸ãocelular. Váriasevidênciasindicaramoenvolvimentodoestresse oxidativonosmecanismospatológicossubjacentesda apop-toseinduzidaporLPSemA549.21,22_{Comosugeridoemnossos}

eventoscelulares. Em estudosrecentes, descobriu-seque Bcl-2 fornece protec¸ão contra lesões induzidas por LPS em alguns órgãos, inclusive A549.23,24 _{Em contraste, Bax}

exibeac¸õesproapoptóticas. Quandohá superexpressãode Bax, canais ouporospodemser formadospara permitir a liberac¸ãodefatorescomoocitocromo-c dasmitocôndrias parapropagaraapoptose.25_{Portanto,arelac¸ãodas}

proteí-nasBcl-2/Baxéprovavelmentecríticaparaasobrevivência celular após a lesão.24 _{No presente estudo, os resultados}

indicaramque DEXaumentouaexpressãodeBcl-2e dimi-nuiuaexpressãodeBaxe levouaumaumentodarelac¸ão Bcl-2/Bax.

Aliberac¸ãodecitocromo-ceaativac¸ãodacaspase-3são umpontocrucialnacascataapoptóticaepodemser regula-daspelarelac¸ãoBcl-2/Bax.26_{Estudosanterioresmostraram}

queagerac¸ãoexcessivadeoxidac¸ãopodecausaraliberac¸ão de citocromo-c e a ativac¸ão de caspase-3. O processo podeserdeprimidopelaBcl-2.Ocitocromo-cliberadoe a caspase-3ativadaclivamajusanteosalvoscelulares críti-cosenvolvidosnacondensac¸ãodecromatina,fragmentac¸ão do DNA e destruic¸ão do citoesqueleto, expressam assim as dramáticas alterac¸ões morfológicas da apoptose.25-27

Demonstrou-se que os LPS são uma das formas de indu-zir a liberac¸ão de citocromo-c e a ativac¸ão de caspase-3 emA549.28_{Nopresenteestudo,osdadostambémmostram}

quea liberac¸ãodecitocromo-c ea ativac¸ão decaspase-3 aumentaramsignificativamenteapósaadministrac¸ãodeLPS emA549,em linhacomosestudosanteriores.Alémdisso, observamosquealiberac¸ãodecitocromo-ceaativac¸ãode caspase-3foramdeprimidaspelopré-condicionamentocom DEX.

A apoptoseé umprocessofundamental damorte celu-larqueocorrepormeiodaativac¸ãodeviasdesinalizac¸ão distintaseenvolveumaregulac¸ãodeformadecrescenteda relac¸ãoBcl-2/Baxeliberac¸ãodecitocromo-ceativac¸ãode caspase-3invitro.28,29 _{Comoresultadofinal,ascélulassão}

destruídaseformamórgãosapoptóticos.30_LPSmostrou

ini-ciar essa cascata apoptóticaem A549.24 _{Com ummodelo}

deLPAin vitro,nossosdadosdemonstramreduc¸ão

signifi-cativadaapoptoseapósopré-condicionamentocomDEX,o quecorrelacionoucomaregulac¸ãodeformacrescenteda relac¸ão Bcl-2/Baxedepressão daativac¸ãode caspase-3e liberac¸ãodecitocromo-c.

Contudo,nossoestudodescritivotemalgumaslimitac¸ões óbvias que precisam ser abordadas, tais como um único momento de coleta de amostra, o breve período de observac¸ãoeafaltadecorrelac¸ãocomasmensurac¸ões clíni-casdeLPA.Alémdisso,apenasinvestigamosaconcentrac¸ão de DEX, que é muito grande para a prática clínica. Em comparac¸ãocomaclínica,umagrandedose égeralmente usadaemlaboratório.31,32_{Emexperimentos,algunsestudos}

relataramatéousodedosesmaisaltas.Essespodemestar relacionadosadiferentesespécimes.31,32 _{Arelac¸ãoentrea}

doseeoefeitopermaneceobscura.Portanto,estudos rela-cionadosàrelac¸ãodose-efeitoprecisamdeumaexplorac¸ão maisabrangentedomodelo.

Sumário

Nossosdadosmostramqueopré-condicionamentocomDEX pode efetivamente atenuar a lesão induzida por LPS em

A549.Osefeitosprotetorespodemenvolverumareduc¸ãodo estresseoxidativoedamortecelularinduzidaporLPS.Esses resultadosexperimentaissugeriramDEXpodesereficazno tratamentodeLPAinduzidoporLPS.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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